Krooninen sairaus

tiivistelmä

Mitoosi kinesiiniin-5 moottori proteiineja ristisidosyhdisteiden ja työnnä erilleen antiparallel kara mikrotubulushaarojen, mikä suorittaa olennaisia ​​tehtäviä mitoosi kara dynamiikkaa. Erityisiä estäminen niiden toiminnon monastrol kaltaisia ​​pieniä molekyylejä on tutkittu kliinisissä tutkimuksissa syöpähoidon, vain osittain menestystä. Näin ollen, strategioita, jotka parantavat tehokkuutta monastrol-, kuten syöpälääkkeiden tarvitaan. Nykyisessä tutkimuksessa selvitimme välistä herkkyyttä monastrol ja esiintyminen mitoosi luisumista useissa ihmisen solulinjoissa. Huomasimme, että listalla herkkyys monastrol, mistä herkin vähiten herkkä, on: AGS HepG2 Lovo Du145≥HT29. Osoitamme korrelaatio herkkyys tietyn solun-line monastrol ja taipumus saman solun line tehdään mitoottisia liukumisen. Huomasimme myös, että monastrol resistenttien HT29, pitkittynyt monastrol hoidot lisäävät mRNA ja proteiini tasoilla kromosomin matkustajaproteiiniin surviviinin. Sitä vastoin surviviinin määrää ei lisätä tässä käsittelyssä on monastrol herkkien AGS soluja. Olemme lisäksi osoittavat, että yli-ilmentyminen surviviinin on monastrol herkkien AGS solujen vähentää mitoosi liukumisen ja lisää vastustuskykyä monastrol. Lopuksi osoitamme, että lyhyissä altistuminen monastrol, Si RNA hiljentäminen surviviinispesifisten ilmaisun vähentää solujen elinkelpoisuutta sekä AGS ja HT29. Tuloksemme viittaavat siihen, että tehokkuus syövän hoitoon, joilla on erityisiä kinesiinin-5: n estäjät voidaan parantaa moduloimalla ekspressiotasot surviviinin.

Citation: Asraf H, Avunie-Masala R, Hershfinkel M, Gheber L ( 2015) Mitoottisilla liukuma ja ilmentäminen surviviinin liittyvät erilaiseen herkkyyteen Human Cancer Cell-Lines on kinesiiniin-5 Inhibitor Monastrol. PLoS ONE 10 (6): e0129255. doi: 10,1371 /journal.pone.0129255

Academic Editor: Qiliang Cai, Fudanin yliopiston Kiina

vastaanotettu: toukokuu 16, 2014; Hyväksytty: 06 toukokuu 2015; Julkaistu: 02 kesäkuu 2015

Copyright: © 2015 Asraf et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään

Data Saatavuus: kaikki asiaankuuluvat tiedot ovat paperi.

Rahoitus: Tätä työtä tukivat osittain Startup Fund, Terveystieteiden tiedekunta, Ben-Gurionin yliopisto, myönnetään MH ja LG; Israelin tiedesäätiön avustuksen 165/2013 awarder LG (https://www.isf.org.il/english/) ja Israelin tiedesäätiö myönnä. 891/2014 myönnetty MH (https://www.isf.org.il/english/). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

mitoosi kinesiiniin-5 moottori proteiineja (BimC /Kif11 /Eg5 /N-2) suorittaa säilytetyn toimintoja mitoosisukkulan dynamiikkaa. Löydettiin 1990-luvun alussa, nämä olivat ensimmäiset kinesiinien jolle mitoosi roolit on osoitettu useissa organismien [1-5]. Kinesiinin-5 moottorit toimivat homotetramers kaksi paria katalyyttisen moottorin domeenien sijoitettu vastakkaisille puolille käsipaino kaltainen tetrameerisen kompleksin [6, 7]. Tällä kaksisuuntainen rakenne, kinesiiniin-5 moottorit voivat silloittamiseksi ja liukua erilleen antiparallel kara mikrotubuleiksi [8-11], mikä hoitavat tehtäviään kehräkokoonpanon [1-5] ja Anaphase kara pidentymisen [12-19].

ihmisen kinesiinin-5 HsEg5 yliekspressoituu erilaisia ​​kiinteitä kasvaimia, mikä viittaa sen rooli tuumorigeneesissä [20, 21]. Koska olennainen mitoosi toiminnot kinesiinin-5 moottorit karan dynamiikkaa, ja koska mitoosin on hyväksytty Faasispesifisten syövän hoitoon intervention [22, 23], uskottiin yleisesti, että tietty esto kinesiinin-5 moottorit voitaisiin mahdollisena syövän hoitoon. Monastrol oli ensimmäinen raportoitu erityisiä estäjä ihmisen kinesiiniin-5, tunnistettu näytön pieniä molekyylejä, jotka aiheutti mitoosi pidätys vaikuttamatta mikrotubulusdynamiikan ja muut solutoiminnoille [24]. Koska löytö monastrol, useita kymmeniä molekyylien raportoitu allosteerinen inhibiittoreina HsEg5, jossa on vaihtuva potencies [23, 25]. Suurin osa näistä molekyyleistä ovat spesifisiä ihmisen HsEg5, koska ne sitoutuvat allosteeriseen, silmukka 5: n katalyyttisen domeenin kinesiinin liittyvät moottorit (katsaus [23, 26, 27]), joka vaihtelee pituuden ja sekvenssin kesken kinesiiniin homologit [28, 29]. Ihmisen solut käsiteltiin monastrol ja monastrol kaltaiset molekyylit pidätys mitoosin vaurioitunut monopolar karat [24, 30] ja niitä mitoosi solukuolemaa [31]. Joissakin tapauksissa monastrol käsitellyt solut löytyy G1 kaltainen vaiheen takia mitoottisiin luiston [32]. Jälkimmäinen ilmiö sallii solujen edetä seuraavaan G1 vaiheeseen ilman jakamalla niiden DNA: n läsnä ollessa karan vaurioita (tarkistetaan [33, 34]). Seuraavat mitoosi luistoa, solut voivat kuolla apoptoosin aiheuttaman tietyn tarkistuspisteen valvoo DNA-pitoisuus solujen poistumisen mitoosia, joka tunnetaan nimellä ”tetraploidy tarkastuspiste” [33, 35].

Useita erityisiä HsEg5 inhibiittorit ovat tulleet kliinisissä tutkimuksissa syöpälääkkeiden [36-38]. Huolimatta toistettavissa sytotoksinen vaikutus kudosviljelmiin, nämä kliinisissä tutkimuksissa vähän menestystä (katsaus [27, 39]). Yksi ehdotetuista syitä tähän tehottomuuteen on epätäydellinen tietämys mitoosi pidätys polkuja ja sen seurauksena, kyvyttömyys tunnistaa molekyylikomponentit jotka voidaan kohdistaa lisäksi kinesiiniin-5 estäjät parantaa niiden tehokkuutta syöpähoidon [27, 39] .

tämän kysymyksen, nykyisessä tutkimuksessa selvitimme herkkyyttä monastrol ja esiintyminen mitoosi luisumista useissa ihmisen solulinjoissa. Olemme havainneet, että on olemassa korrelaatio herkkyys tietyn solun-line monastrol ja taipumus saman solun line tehdään mitoottisia liukumisen. Olemme edelleen tutki surviviinin ilmentymiseen, antiapoptoottisena kromosomi matkustaja proteiinia, joka on osoitettu olevan useita mitoottisiin rooleja (tarkistetaan [40-43]). Olemme havainneet, että käsittely monastrol indusoi ekspression lisääntymisen Surviviinin monastrol-resistentit solut, mutta ei soluissa, jotka ovat monastrol-herkkiä. Johdonmukaisesti, me osoittavat, että yli-ilmentyminen surviviinin on monastrol-herkkien solujen vähentää mitoosi liukumisen ja lisääntynyt monastrol kestävyys. Lopuksi osoitamme, että osittainen vaiennettu surviviinin ilmentymisen Si RNA vähentää solujen elävyyttä seuraava lyhyt altistuminen monastrol. Siten meidän tiedot viittaavat siihen, että yhdistettyä esto HsEg5 ja modulaatio surviviinispesifisten ilmaisun voi parantaa tehoa syöpähoidon by kinesiiniin-5: n estäjät.

Materiaalit ja menetelmät

Soluviljely, elinkelpoisuus, transfektio, ja monastrol hoito

AGS ja LoVo-soluja kasvatettiin DMEM /F-12 (HAM) 1: 1, HT29 DMEM, DU145-soluja RPMI 1640, johon oli lisätty 1% natriumpyruvaattia, ja HepG2-soluja MEM -Eagle Earle keskipitkän. Kaikki alustat täydennettiin 10% naudan sikiön seerumia, 2 mM L-glutamiinia ja 1% antibiootti-antimykoottia, joka sisälsi 10 yksikköä /ul penisilliiniä, 10 ug /ul streptomysiiniä ja 1250 yksikköä /ml nystatiinia. Media reagenssit hankittiin Beit Haemek, Israel. Solujen elinkelpoisuus tutkittiin käyttäen natrium-2,3-bis (2-metoksi-4-nitro-5-sulfofenyyli) -2H-tetratsolium-5-karboksanilidi suola (XTT, Sigma, Israel), jälkeen tavanomainen menettely [44], tai trypaanisini määritys [30]. Elinkelpoisuutta kokeissa jopa 3-päivää käyttäen XTT määritystä ~ 4×10

3 solua maljattiin kuoppaa kohti 96-kuoppalevyillä. Solujen lukumäärä läsnä monastrol normalisoitiin solujen lukumäärää, kun läsnä on pelkästään DMSO. Kokeita käyttämällä 12 ja 24 monastrol hoito, ~ 1.5×10

5 solua per kuoppa maljattiin 24-kuoppaisille levyille. Hoidon monastrol suoritettiin 24 maljaamisen jälkeen, jolloin 70-80% konfluenssiin saavutettiin. Ilmentävien plasmidien GFP-tagged surviviiniperäisten ja GFP-vektorilla oli lahja Dr. Dario C. Altieri [45]. Cell transfektio suoritettiin käyttäen JetPEI transfektioreagenssia (Polyplus transfektio, Tal Ron, Israel). Stabiili transfektio saavutettiin kasvattamalla soluja alustassa, joka sisältää G418: 3 mg /ml (Sigma, Israel) useiden viikkojen ajan, kunnes 80% soluista sisälsi GFP-fluoresenssin signaalia. Monastrol (Tocris, UK) pitoisuudet on esitetty kunkin kokeen. Vertailun välillä monastrol herkkiä AGS ja monastrol kestävä HT29, eri pitoisuutta monastrol käytettiin vertailukelpoisten fenotyypit: 100gM 150 pm sekä monastrol varten AGS ja HT29, vastaavasti. Perustuen kuviossa 1, alhainen pitoisuus monastrol olisi johtanut puute vaikuttaa HT29, kun taas runsaasti monastrol olisi johtanut kuolemaan AGS solujen, kummassakin tapauksessa ei salli analyysin fenotyypin. Ohjaus kokeet suoritettiin läsnäollessa DMSO.

Solut AGS, HepG2, Lovo39, DU145, ja HT29 solulinjoista, merkitty vasempaan alakulmaan kunkin paneelin, inkuboitiin enintään kolme päivää erilaisilla pitoisuudet monastrol, osoitettu oikealla (0, 20, 50, 100, ja 150 pm). Määrä elinkelpoisia soluja (% kontrollista) määritettiin XTT-määrityksellä mitokondrioiden toimintaan. Pisteet ja pylväät edustavat keskimäärin ja SEM 3-4 itsenäisen kokeen. * P 0,05: määrä elinkelpoisia DU145 solujen seuraavat 2 hoitopäivän 20 tai 50 uM monastrol verrattuna elinkelpoisia HT29 identtisesti käsitelty (punainen ja sininen ympyrä). Tulokset osoittavat, että eri solulinjat ovat eri herkkiä monastrol, jossa herkkyys ranking: AGS HepG2 Lovo Du145≥HT29.

immuunivärjäytyminen

havainnollistamiseksi mikrotubulusverkon tukirangan ja DNA, soluja viljeltiin peitinlaseilla, kiinnitettiin 4% paraformaldehydillä 30 min ajan, ja läpäiseviksi 2 min 0,3% Triton-x-100 4% paraformaldehydillä. Näytteet pestiin PBS: llä, joka sisälsi 0,1% BSA: ta (Sigma, Israel). Peitelaseja inkuboitiin rotan anti-tubuliinin YOL1 /34 ja sen jälkeen Alexa 488 konjugoidulla anti-rotta sekundäärinen vasta-aine. DNA värjättiin DAPI (0,07 ug /ml). Solut havaittiin Olympus BX51 mikroskoopilla.

Solusyklianalyysiä

Kelluva ja kiinnittyneet solut kiinnitettiin 70% etanolilla ja varastoidaan -20 ° C: ssa vähintään 7 päivää. Solut kerättiin sentrifugoimalla ja suspendoitiin uudelleen 0,1% Triton-X-100 ja 30 ug /ml RNaasi A: ta, tyyppi I-A (Sigma, Israel) huoneenlämpötilassa 40 min. Nuclear DNA värjättiin 15 ug propidiumjodidilla PBS-liuosta ja DNA-pitoisuus mitattiin virtaussytometrialla (BD Biosciences, UK). Cell mittasuhteet sub-G0 /G1, G0 /G1, S ja G2 /M-vaiheisiin analysoitiin käyttäen sopivia ohjelmistoja. Jokaisesta näytteestä, 10000 solua mitattiin.

mRNA-analyysi

Tasot sykliini B, surviviini, ja aktiini viitteenä geenin määritettiin reaaliaikaisella PCR: llä (RT-PCR) kokonais-RNA: uutetaan soluista käsiteltiin monastrol. Kokonais-RNA uutettiin RNeasy Mini Kit (Qiagen, Saksa), DNAaasi (Qiagen, Saksa) hoito poiston varmistamiseksi genomista DNA: ta. CDNA-templaatti valmistettiin 1 ug RNA-näytteet, käyttäen kääntöpuoli cDNA Synthesis Kit, kuten valmistaja on kuvannut (Thermo Scientific). Kvantitatiivista reaaliaikainen PCR malleja laimennettiin 1:16 ja alistettiin Taqman reaaliaikaista PCR menettelyä käyttäen absoluuttista Blue QPCR Kit (Thermo Scientific). Alukkeiden ja koettimien (Solaris) PCR-monistukseen ja tuotteiden koko olivat seuraavat: surviviini (95 bp) forward-alukkeen 5′-TTTCTCAAGGACCACCGCAT-3 ’, käänteinen aluke 5′-ATGAAGCCAGCCTCGGCCAT-3′, koetin 5’-CACCCCGGAGCGGATGG-3 ’; Sykliini B (86 bp) forward-alukkeen 5’-ATCTGAGACAACTTGAGGAAG-3 ’, käänteinen aluke 5′-GATGGCTCTCATGTTTCCAG-3′, koetin 5’-GGTCGGGAAGTCACTGG-3 ’; Actin (134 emäsparia) forward-alukkeen 5’-TGGAGAAAATCTGGCACCAC-3 ’, käänteinen aluke 5′-GGTCTCAAACATGATCTGG-3′, koetin 5’-ACCGCGAGAAGATGACC-3 ’. Reaktiot suoritettiin ABI-PRISM7500 sekvenssin ilmaisinta (Applied Biosystems, Darmstadt, Saksa). Standard pyöräily edellytykset tätä välinettä käytettiin. Hehkutus lämpötila oli 60 ° C: ssa kaikki geenit. Kunkin näytteen tasot sykliini B ja surviviini normalisoitiin viite-geeni (aktiini) tasot. Reaaliaikainen PCR tulokset ovat keskimäärin kolme eri kokeissa.

Protein tason analyysi suoritettiin käyttäen Western blot (WB) menettely, kuten aikaisemmin on kuvattu [30], käyttäen anti-ihmis surviviini-vasta-ainetta (R monastrol levitettiin 24 seuraava pinnoitus. Solut transfektoitiin siSurvivin tai salattu (SC) siRNA-rakenne (40 nM, Sigma-Aldrich), siRNA transfektio suoritettiin käyttäen lipofektamiini 2000 reagenssin valmistajan protokollaa. Kohdesekvenssi Surviviiniproteiinin siRNA oli: 5 ’GGACCACCGCAUCUCUACA 3 ”tai salattu 5’ GCCCAGAUCCCUGUACGU 3 ’. 12h ja 24h tuntia transfektion solut laskettiin käyttäen trypaanisini.

Tilastollinen

sarakkeet ja baareja kaikki luvut edustavat keskimääräistä ± SEM. Merkitystä eroja keskiarvoja määritettiin käyttämällä Studentin

t

-testi. * P 0,05; ** P 0,01.

Tulokset

tarkastella tekijöitä, jotka vaikuttavat herkkyyttä eri solujen monastrol, ensin tunnettu tämä herkkyys viidessä eri solulinjoissa: AGS mahalaukusta adenokarsinooma [46 ], HepG2 päässä maksasyövän [47], LoVo paksusuolen adenokarsinooma [48], Du154 eturauhasen syöpä [49], ja HT29 paksusuolen adenokarsinooma [50]. Solut altistettiin pitkäaikainen hoito monastrol jopa kolme päivää. Kullakin aikavälillä, määrä elävien solujen tutkittiin mitokondrioiden toiminnan määritys käyttämällä 2,3-bis (2-metoksi-4-nitro-5-sulfofenyyli) -2H-tetratsolium-5-karboksanilidi suola (XTT) [44 ]. Tuloksemme osoittavat, että, kuten odotettua, lukumäärä elinkelpoisten solujen vähentynyt pitkäaikaisessa hoito monastrol kaikissa solulinjoissa. Kuitenkin elinkelpoisten solujen prosentuaalinen eri solulinjoissa hoidon jälkeen monastrol monipuolinen. Esimerkiksi käsittelemällä 100gM on monastrol kaksi päivää johti ~ 80%: n lasku määrän AGS ja HepG2-soluissa, ~ 60%: n lasku useissa Lovo solujen, ja vain noin 30%: n lasku DU145 ja HT29 (kuvio 1, vihreä ympyrä). Olemme myös löytäneet pienen mutta toistettavissa ero elinkelpoisuus DU145 ja HT29 käsitelty monastrol. Esimerkiksi: prosenttia elinkelpoisten DU145-solujen käsitellään 20 tai 50 uM monastrol varten 2 päivää on merkittävästi pienempi kuin samalla käsiteltyjen HT29. Perustuen elinkelpoisuutta tiedot (kuvio 1), loimme sijoitus herkkyys monastrol, mistä herkin vähiten herkkä, kuten: AGS HepG2 Lovo Du145≥HT29.

Mitoottista liukumista on ilmiö, jonka joka läsnä mitoosi vaurioita, solujen edetä G1 vaiheeseen seuraavan syklin ilman jakamalla niiden DNA [31, 33, 34, 51]. Tutkimme seuraavaksi, onko vastus tietyn solulinjan monastrol liittyy sen taipumus läpikäydä mitoosi liukumista, kun läsnä on lääkettä. Luonnehtia mitoosi lipsumista, käsittelimme solut monastrol 48 h pitoisuuksina, jotka johtivat vähintään solujen eloonjäämisen ja tutkittiin morfologia mikrotubulusten solun tukirangan immunovärjäyksellä (kuvio 2A ja 2B) ja solukierron jakelu virtaussytometrialla (kuvio 2C). Solut pidätettiin mitoosin mukaan monastrol on aiemmin osoitettu olevan monoastral karat [24, 30]. Huomasimme, että seuraavien 48 h monastrol hoidon kaksi morfologioita soluista oli ilmeinen: G1 kaltainen tai monoastral mitoosi soluissa (kuvio 2A). Määrä normaalien mitoottisten solujen tai solujen tunnistamaton morfologioita oli vähäinen. Tuloksemme osoittavat, että seuraavat 48 h hoidon monastrol, erilaisten solulinjojen näytteillä eri prosentuaalista solujen monoasters. Esimerkiksi suurin osa elossa AGS solut näyttivät kuin G1 kaltaisia ​​suuria soluja yhden ytimet (kuvio 2A). Prosenttiosuus monoasters näissä soluissa oli hyvin pieni, ~ 7% (kuvio 2B). Olemme havainneet, että sekä AGS ja HepG2 solulinjoja, jotka ovat herkkiä monastrol, esillä pieni prosenttiosuus monoasters ( 10%), ja suuri osa G1-kaltaisten solujen, seuraavat 48 h monastrol jälkeen (kuvio 2B). Toisaalta, LoVo, DU145, ja HT29 solulinjat, jotka ovat vastustuskykyisempiä monastrol, näyttelytila ​​huomattavasti nykyistä suurempi osuus, 20-30%, on monoastral karan (kuvio 2B), mikä osoittaa, että suuri osa näistä soluista pidätettiin mitoosin. Analyysi Faasispesifisten jakelu paljasti, että seuraavien 48 h hoidon monastrol, huolimatta eron prosenttiosuus mitoosi solujen monoasters, kaikki tutkittiin solujen riveistään suuri osa soluista kaksinkertainen DNA-pitoisuus (kuvio 2C, kaksoisnuolta ). Tämä osoittaa, että vaikka jotkut solut näyttivät tyypillinen G1 kaltainen mikrotubulusten tukirankansa solut oli kaksinkertaistunut DNA sisältöä, eli sille on mitoosi luistoa ilman DNA jako. Tuloksemme siis viittaavat siihen, että on olemassa yhteys herkkyyttä monastrol ja taipumus läpikäydä mitoottisiin liukuminen: monastrol-resistenttien solujen pitää mitoosi pidätyksen ollessa pitempi, kun taas monastrol-herkkien solujen tehdään mitoottisiin luistamisen.

(A ) AGS ja HT29-soluja käsiteltiin 48 h 100 uM ja 150 pm ja monastrol, vastaavasti. Tubuliinia tukirankansa visualisoitiin seuraavat kiinnittäminen immunovärjäyksellä, DNA värjättiin DAPI. Seuraavat 48 h monastrol hoidon, suurin osa AGS solut näyttivät yhtä suuri, G1-kaltaisia ​​soluja ytimellä (keltaiset nuolet), kun taas suuri osa HT29 pidätettiin mitoosia monoasters (vihreät nuolet). (B) vaikutus pitkäaikainen hoidon monastrol prosenttiosuuksiin monoasters eri solulinjojen, alareunassa näkyvän. Soluja käsiteltiin monastrol, käsitelty immunovärjäämistä, ja prosenttiosuus monoasters määritettiin pisteyttämällä 200-300 solua jokaisen solun verkossa. Pylväät ja pylväät edustavat keskiarvoja ja SEM 3 riippumattomasta kokeesta * P 0,05 verrattuna AGS soluihin. (C) Distribution of solusyklin vaiheissa määritettiin virtaussytometrialla puuttuessa (kontrolli) tai läsnä ollessa monastrol. Cell-linjat on merkitty päälle. Yhden ja kahden hengen nuolet edustavat huiput 2n ja 4n DNA sisältöä vastaavasti.

Down-regulation of anti-apoptoottisen proteiinin surviviiniperäisten aiemmin osoitettu lisäävän mitoosi lipsuminen läsnäollessa karan vahinkoa [52] . Meillä on siis oletettu, että altistumisen aikana monastrol, surviviinin ilmentymiseen vaihtelee välillä monastrol-herkkä ja kestävä soluja. Tämän hypoteesin testaamiseksi, vertasimme mRNA: ta ja proteiinia tasot surviviinille monastrol kestävä HT29 ja monastrol-herkkien AGS-soluissa (kuvio 3). Sallia muutosten mittaamiseksi proteiinin taso ennen apoptoosin [30], käsittelimme solut monastrol lyhyempiä aikoja, 12h ja 24h. Arvioida mitoosi tilan tutkittiin solujen, seurasimme mRNA (kuvio 3A) ja proteiini (kuvio 3B ja 3C) tasot mitoosi proteiinin sykliini B. Olemme havainneet, että seuraavan 24 hoidon monastrol HT29-aineilla kohonneeseen sykliini B verrattuna 12h hoidon, mikä osoittaa, että ne pidätetty mitoosin (kuva 3). Toisaalta, vuonna AGS soluissa, sykliini B tasot olivat jo lisääntyivät 12h hoidon monastrol ja sykliini B tasolla ilmeni taipumusta supistuvan 24h, 0,05 P 0,1 (kuvio 3). Tämä viittaa siihen, että hoito monastrol 24 h jo aiheuttaa osittaisen mitoosi luisumista AGS soluissa kun HT29 ylläpitää mitoottisiin pidätykseen. Tutkiminen surviviiniperäisten mRNA (kuvio 3A) ja proteiini (kuvio 3B ja 3C) tasot paljasti, että HT29 ”tasot surviviinispesifisten kasvoi 24 hoidon monastrol, mikä viittaa siihen, että surviviini mukana ylläpitää mitoosi pidätyksen. Toisaalta, että AGS soluissa mRNA-tasoja surviviinispesifisten pysyi ennallaan 24 verrattuna 12 h hoidon monastrol. Lisäksi AGS soluissa, keskimäärin proteiinia tasot surviviinispesifisten alenivat 24 verrattuna 12h monastrol hoitoa, vaikka tämä ero ei ollut tilastollisesti merkitsevä (kuvio 3B ja 3C, oikea paneeli). Nämä tulokset viittaavat siihen, että kohonneet surviviinille tietyssä solulinjassa korreloivat vastus tämän solun-linjan monastrol hoitoon.

HT29 ja AGS soluja käsiteltiin monastrol 12 h ja 24 h ja käsiteltiin mRNA analyysi RT-PCR (A) ja proteiini taso analyysi WB (B ja C). 150 pm ja 100 um monastrol käytettiin HT29 ja AGS soluja, tässä järjestyksessä. A ja C, pylväät ja palkit osoittavat keskimääräistä ja SEM-arvot 3-4 erillisen kokeen. Kussakin kokeessa tasot sykliini B (vasemmalla) ja surviviinin (oikealla), osoitti yläosassa, kun läsnä on monastrol normalisoitiin ohjaus saatujen arvojen kanssa pelkästään DMSO. * P 0,05; ** P 0,01; a-0,05 P 0,1 verrattuna 12h monastrol hoitoa. (B) edustaja WB analyysi sykliini B ja Surviviiniproteiini ilmentymisen AGS (vasemmalla) ja HT29 (oikealla) käsiteltyjä soluja monastrol 12 tuntia ja 24, merkitty pohjassa. Equal Proteiinilisäyksen oli seurata, että ilmaus aktiini (alempi paneeli). (+) Monastrol; (-) DMSO.

Sen tutkimiseksi, onko kohonneet ekspressiotasot surviviinin suoraan yllä kestävää mitoosi pidätys, me transfektoitiin monastrol herkkiä AGS-soluja plasmidilla, joka koodaa villityypin Surviviiniproteiini fuusioitu GFP ( pSurvivin, [45]), ja loi polyklonaalisella pysyvästi transfektoitu AGS cell line (katso materiaalit ja menetelmät). GFP-proteiinia ekspressoivien vektoria käytettiin kontrollina. AGS ilmentävät solut pSurvivin plasmidissa todettiin 5,2 ± 0,9 (SEM, n = 4) kertainen surviviinin ilmentymistä (kuvio 4A, alhaalla). Seuraavat sukupolven stabiilisti transfektoitujen solulinjojen, soluja käsiteltiin 100 uM monastrol ja käsitellään tubuliinin immunovärjäystä, elinkelpoisuuden ja solusyklin-analyysillä (kuvio 4A-4D). Olemme havainneet, että seuraavan 24 tunnin hoidon monastrol prosenttiosuus mitoosi solujen pidätettiin monoasters merkittävästi lisääntynyt surviviiniperäistä ilmentävien solujen verrattuna AGS soluihin, jotka ekspressoivat ainoastaan ​​vektorilla (kuvio 4A ja 4B). Nämä tiedot osoittavat, että surviviinin yli-ilmentyminen lisää kykyä AGS solujen ylläpitämiseksi mitoosi pidätyksen läsnä ollessa karan aiheuttaman vaurion monastrol. Analyysi solusyklin vaiheen jakauma osoittaa, että seuraavat 12h hoidon monastrol, prosenttiosuus surviviiniperäistä ilmentävien AGS soluja kaksinkertainen (4n) DNA-pitoisuus on huomattavasti suurempi verrattuna soluihin, jotka ekspressoivat ainoastaan ​​vektorilla (kuvio 4C, 12h), joka osoittaa, että surviviini indusoi jatkuvan mitoottisiin pidätykseen. Tärkeää on, seuraavat 24 hoidon monastrol löysimme eroa prosentteina solu- populaation kanssa 4n DNA sisällön välillä soluja, jotka ilmentävät surviviini ja ne, jotka ilmentävät vektori vain (kuvio 4C, 24). Silti seuraavat 24 hoidon monastrol, oli merkittävä lisääntyminen solujen monoasters in surviviiniperäistä ilmentäviä soluja, osoittaa solut ovat mitoosi pidätys, verrattuna soluihin, jotka ekspressoivat ainoastaan ​​vektorilla, joka tehtiin mitoottisia liukumisen ja oli tarkoitettu soluun syöttämällä (kuvio 4A ja 4B). Siten meidän tiedot osoittavat, että ilman surviviinin yli-ilmentymisen, AGS solut läpikäyvät mitoosi liukumista ja solukuolemaa hoidon jälkeen monastrol, kun taas yli-ilmentyminen surviviinin indusoi mitoosi pidätys, todennäköisesti pelastaa soluja. Lisäksi, sopusoinnussa ehdotettu anti-apoptoottisen funktion surviviinin [45, 53], olemme havainneet, että surviviinin yli-ilmentyminen on AGS-solujen määrä nousi elinkelpoisuuden näiden solujen seuraavien 24 h ja 48 h hoito monastrol (kuvio 4C).

(A-D) AGS-solut transfektoitiin stabiilisti plasmidilla, jotka ekspressoivat GFP (vektori) tai plasmidilla, joka koodaa yliekspressio surviviini-GFP (pSurvivin). Soluja käsiteltiin 100 uM monastrol ja käsitellään mikrotubulusten immunovärjäyksen (A ja B), solusyklin-analyysillä (C), ja elinkelpoisuus testi (D). (A) Kuvat ovat mikrotubulusten solun tukirangan vuonna AGS soluissa kuljettavat tyhjän vektorin tai pSurvivin, alareunassa näkyvän. Soluja käsiteltiin 100 uM monastrol 24 tuntia. G1 kaltaisia ​​soluja (keltaiset nuolet) ja mitoosi soluissa (vihreä nuoli) havaitaan. Koska mitoosi-solut ovat pyöreitä, niiden polttotaso on erilainen kuin tasainen G1 kaltaisia ​​soluja. Kuvien (A) keskittyvät G1 soluihin ja siksi monoasters mitoosissa ei nähdä näitä kuvia. Niinpä mitoosi soluissa näkyä kirkkaina aloilla (vihreät nuolet). Bottom: surviviini WB analyysi lisääntyvien AGS-solujen läsnä ollessa (+) tai puuttumista (-) on pSurvivin yliekspression plasmidi. (B) kvantifiointi% mitoosi soluiksi kuvia, kuten on esitetty (A). Gray-vektorilla; blue-pSurvivin. Pylväät ja pylväät edustavat keskiarvoja ja SEM kolmen itsenäisen kokeen, jossa on yhteensä 200-300 solut laskettiin. ** P 0,01 verrattuna vektorilla. (C) Vakaasti transfektoidut AGS soluja käsiteltiin monastrol 12 h ja 24 h (merkitty ylhäällä) ja käsitellään Faasispesifisten jakelu analyysi virtaussytometrialla. Yhden ja kahden hengen nuolet edustavat huiput 2n ja 4n DNA-sisältöä vastaavasti. Suluissa prosenttiosuutta solujen kaksinkertainen (4n) DNA-pitoisuus. (D) elinkelpoisuus stabiilisti transfektoitujen solujen läsnä ollessa 100 uM monastrol 24 h ja 48 h. Gray-vektorilla; Blue-pSurvivin. Useita elävien solujen määritettiin XTT-määrityksellä mitokondrioiden toimintaan. Elinkykyisten solujen osuus laskettiin suhteessa ohjata kokeiluja pelkästään DMSO. Pylväät ja pylväät edustavat keskimääräistä ja SEM 3 riippumattoman kokeen. * P 0,05 verrattuna vektorilla. (E) AGS ja HT29 transfektoitiin ohimenevästi surviviinista (tummanvihreä) tai salattu (SC, vaaleanvihreä) Si RNA-sekvenssi. 12h transfektion AGS ja HT29-soluja käsiteltiin 100 ja 150 pm monastrol vastaavasti 12 tuntia ja 24 (merkitty pohjassa). Solujen elinkelpoisuus määritettiin trypaanisini. Elinkykyisten solujen osuus laskettiin suhteessa ohjata kokeiluja pelkästään DMSO. Pylväät ja pylväät edustavat keskimääräistä ja SEM 2-4 itsenäisen kokeen muotoon kolmena rinnakkaisena. * P 0,05; ** P 0,01; a-0,05 P 0,1, verrattuna salattu Si RNA-sekvenssi.

tutkia edelleen välisen yhteyden solun elinkelpoisuuden monastrol hoitoon ja ilmaisun surviviinispesifisten, me osittain vaiennetaan surviviinin ilmentymisen Si RNA ( Kuva 4E). Salattu RNA-sekvenssin, toimi kontrollina. Tarkastelu mRNA-tasojen surviviinin RT-PCR vahvisti, että vaikka lyhytaikaista transfektiota salattujen RNA-sekvenssin ei aiheuttanut muutosta mRNA-tasojen surviviinin, transfektio surviviini Si RNA aiheutti noin 70% ja 50-60%: n lasku surviviinin mRNA-tasot AGS ja HT29-soluja, vastaavasti (ei esitetty). Olemme havainneet, että seuraavat 12h altistumisen monastrol, osittainen hiljentäminen surviviinin ilmentymisen vähentänyt elinkelpoisuus AGS ja HT29-solujen 50-60%, verrattuna soluihin, jotka on transfektoitu salattu RNA-sekvenssi (kuvio 4E). Vaikka monastrol herkkä AGS-solut osoittivat vain taipumus (0,05 P 0,1), The monastrol kestävä HT29-solut osoittivat selkeästi vähentynyt merkittävästi elinkelpoisuuden osittaisen eloon jäänyt hiljentäminen (P 0,05), mikä osoittaa, että surviviini tarvitaan elinkelpoisuuden ja kestävyys monastrol. Sen jälkeen 24h hoidon monastrol, elinkelpoisuus monastrol herkkien AGS solujen pienennettiin edelleen transfektoiduissa soluissa surviviinipeptidillä Si tai salattu RNA (kuvio 4E). Vuonna monastrol kestävä HT29, osittainen hiljentäminen surviviinin ilmentymisen indusoi lisääntynyt elinkelpoisuuden verrattuna salattu RNA-sekvenssin, joka osoittaa, että on olemassa sopeutumismekanismit näissä soluissa osittain alentuneiden tasojen surviviiniin. Yhdessä meidän tiedot osoittavat, että noustessa surviviinin aikana mitoosi pidätys liittyy solujen elinkelpoisuus, joka on ainakin osittain liittyy sen kyky aiheuttaa pitkittyneen mitoottisiin pidätys hoidon aikana monastrol.

Keskustelu

Tutkimukset viime vuosikymmenen aikana ovat osoittaneet, että kun soluja käsitellään antimitoottisena lääkkeet kuten kinesiiniin-5 erityisiä estäjät, kaksi pääasiallista skenaariota voi tapahtua: solut voivat joko ylläpitää mitoosi pidätyksen ja kuolevat mitoosi apoptoosin [30, 31], tai jatka seuraavaan G1 vaiheessa mitoosi luistoa ja apoptoosin [33, 34]. Jälkimmäisessä tapauksessa, solut tuhoutuvat nopeasti apoptoosin aiheuttaman ”tetraploidy tarkastuspiste” [33, 35]. Tässä skenaariossa, solut, jotka käyvät läpi mitoosi lipsumista helpommin, kun läsnä on monastrol joutuu alttiiksi apoptoosin indusoiman tetraploidy tarkistuspisteen ja näin ollen herkempiä monastrol. Kuitenkin tetraploidy tarkastuspiste havaittiin olevan riippuvainen tuumorisuppressoriproteiinia p53 [51, 54]. Näin ollen, solut odotetaan olevan herkempiä monastrol, jos niille tehdään mitoosi liukumisen ja ilmentävät villityyppistä p53: a. Itse solulinjojen tutkittu tässä tutkimuksessa ilmaista molemmat versiot p53-proteiinin: p53 on villityyppinen in AGS [55], HepG2 [56], ja LoVo [57] solulinjoissa, kun se on mutatoitunut HT29 [58] ja DU145 [49] soluja. Meidän havainto, että listalla herkkyys monastrol on AGS HepG2 Lovo Du145≥HT29 tukee ajatusta, että solut ovat herkempiä kinesiiniin-5-inhibiittorit, jos ne yleensä tehdään mitoottisiin liukumista ja kuljettaa villityyppisen p53-alleelin. Taipumus tehdään mitoottisiin liukumista sinänsä ei ole suoraan riippuvainen p53: koska LoVo kuljettavat solut WT p53 [57] tehdään mitoosi lipsumista samassa määrin kuin HT29 ja Du125 soluja, joihin liittyy p53 [49, 58 ] (kuvio 2B ja 2C). Kuitenkin lisääntynyt solukuolema tapahtuu LoVo soluihin WT p53 mahdollistaa aktivointi ”tetraploidy tarkistuspiste”.

Kun mitoosi lipsumista tapahtuu p53 mutatoitunut soluja, jatka leviämisen ilman asianmukaisesti jakamalla DNA.

In vivo

, tämä voi johtaa mutaatioiden vähentävien sytotoksista /syövänvastainen aktiivisuus kinesiinin-5-inhibiittorit [22, 27, 39]. Siten yksi strategioista tehostaa antimitoottisten syöpälääkkeet voidaan aiheuttaa pitkäaikainen mitoottisiin pidätys ilmentävien syöpien mutatoitunut versioita p53.