Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

säilyttäminen MikroRNA formaliiniin-kiinnitetyille ja parafiiniin upotetut (FFPE) kudoksen tekee niistä erityisen käyttökelpoisia biomarker tutkimuksia. Hyödyllisyys pienten RNA sekvensointi microRNA ilmentymisen profilointiin FFPE näytteissä vielä määritelty.

Methods

Yhteensä RNA eristettiin de-paraffinized ja proteinaasi K-käsiteltyjen FFPE yksilöt (15- 20 vuotta vanha) 8 ihmisen keuhkon adenokarsinooma kasvainten affiniteettikromatografialla silikakolonneissa. MikroRNA RNA valmisteita kvantitoitiin Illumina HiSeq 2000 sekvensointialustamme kanssa sekvensointi kirjastot valmistettu kanssa TruSeq Small RNA Näytteen valmistelu Kit (versio 2.0) saada parittomia lukee 50 b pienten RNA-fragmentteja. MikroRNA myös kvantitoitiin käyttäen Agilent Human miRNA (release 16,0) mikrosiruja joka tunnistaa 1205 kypsä MikroRNA ja kvantitatiivisella käänteistranskriptio (RT) -PCR määritykset.

Tulokset

Between 9,1-16.900.000 lukee saatiin pieniä RNA sekvensoinnilla uuttaa RNA-näytteet. Näistä vain 0,6-2,3% (keskiarvo = 1,5%) oli MikroRNA. Sekvensointimenetelmä havaittu 454-625 MikroRNA /näyte (keskiarvo = 550) verrattuna 200-349 (keskiarvo = 286) MikroRNA havaita mikrosirulla. Vuonna Spearman korrelaatio analyysit, keskimääräinen korrelaatiokerroin 126 MikroRNA havaittiin kaikissa näytteissä sekä menetelmiä oli 0,37, ja 0,5 63 MikroRNA. Korrelaatio analyysit sequencing- ja RT-PCR-pohjainen mittaukset, kertoimet olivat ,19-0,95 (keskiarvo = 0,73) ja 0,7 vastaavasti 7 9 tutki MikroRNA. Keskimääräinen välinen rinnakkaisten Spearmanin korrelaatiokertoimen jaksotusta tuloksesta oli 0,81.

Johtopäätökset

Pienet RNA sekvensointi voidaan käyttää saamaan microRNA profiileja FFPE kudosnäytteiden kanssa suorituskyky on samanlaiset ominaisuudet kuin mikrosirujen huolimatta pirstoutumista ribosomien ja RNA: iden, joka vähentää menetelmän informatiivinen kapasiteettia. Tarkkuus menetelmää voidaan mahdollisesti parantaa lisäämällä sekvensointi syvyys ja /tai heikentävien FFPE kudoksen RNA: t ribosomi-RNA-fragmentteja.

Citation: Buitrago DH, Patnaik SK, Kadota K, Kannisto E, Jones DR, Adusumilli PS (2015) Pieni RNA sekvensointi varten Profilointi MikroRNA Long-Term Preserved Formaliinifiksoidusta ja parafinoidut ei-pienisoluinen keuhkosyöpä kasvain näytteet. PLoS ONE 10 (3): e0121521. doi: 10,1371 /journal.pone.0121521

Academic Toimittaja: Soheil S. Dadras, University of Connecticut Health Center, Yhdysvallat |

vastaanotettu: 27 elokuu 2014; Hyväksytty: 03 helmikuu 2015; Julkaistu: 26 maaliskuu 2015

Copyright: © 2015 Buitrago et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään

Data Saatavuus: kaikki asiaankuuluvat tiedot kuuluvat paperin ja sen tukeminen Information tiedostoja.

Rahoitus: kirjoittajien laboratoriossa työtä tuetaan avustuksilla National Institutes of Health (R21 CA164568-01A1, R21 CA164585-01A1, R01 CA136705-06, U54 CA137788, P30 CA008748, ja P50 CA086438-13), US Department of Defense (PR101053 ja LC110202), ja William H. Goodwin ja rouva Alice Goodwin, Commonwealth Foundation for Cancer Research, ja Experimental Therapeutics Center of Memorial Sloan Kettering Cancer Center. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kaksi yhteistyössä laatijat käsikirjoituksen (PA ja SKP) ovat PLoS ONE toimituskunta jäsenet. Tämä ei muuta tekijöiden noudattaminen PLoS One toimituksellisia sääntöjä ja kriteereitä.

Johdanto

MikroRNA ovat yksijuosteisia, ei-koodaavat RNA: t 18-25 nukleotidin pituisia, jotka toimivat epigeneettiset sääntelyviranomaisten estämällä proteiinin käännös tai houkuttelemasta hajoaminen lähetti-RNA (mRNA) transkriptien että ne kohdistuvat [1, 2]. MikroRNA ovat mukana erittäin tärkeää biologisissa prosesseissa, kuten solujen proliferaatiota, erilaistumista, ja apoptoosin [3], ja dysregulaatio MikroRNA on osoitettu taudin alkamisen ja etenemisen ihmisen erilaisten maligniteettien [4-8]. Luonnehdinta mikroRNA ilmaisun on ollut hyötyä luokitusta, diagnoosi ja prognoosi useiden maligniteettien [9-12].

Tissue yksilöt ovat säilyneet kautta fiksaatio formaliinilla ovat arvokas resurssi jälkikäteen tutkimuksiin. Koska sen yksinkertaisuus ja edullisia, valtavia määriä kliinisistä näytteistä rutiininomaisesti arkistoidaan jälkeen formaliinin kiinnitys. Toisin kuin mRNA: t, MikroRNA säilyttää hyvin formaliinikiinnitetyt kudosta, koska niiden erittäin lyhyt pituus [13, 14]; Tämä mahdollistaa tällaisten kudosten microRNA mittauksia kliinisiä ja tutkimustarkoituksiin. MicroRNA profiilit formaliinilla kiinnitetyt ja parafinoidut (FFPE) kudokset ovat verrattavissa saatu sovitetun, makean pakastetut kudosnäytteistä (esimerkiksi [15, 16-19]), mikä korostaa soveltuvuus FFPE yksilöt tarvittaessa resursseja microRNA ilme analyysit. Monet tutkimukset biologinen rooli sekä biomarkkerina hyödyllisyyttä MikroRNA on sen seurauksena suoritetaan käyttämällä FFPE näytteitä (esim [20, 21]).

Hybridisaatio mikrosiruja käytetään rutiininomaisesti globaali microRNA ilmentymisen profilointi FFPE näytteitä. Pieni RNA sekvensointi on tullut uutta teknologiaa microRNA ilmentymisen profilointiin. Se tarjoaa etuja suuri herkkyys ja spesifisyys, havaitseminen sekä uusia ja tunnettuja MikroRNA, tunnistaminen mikroRNA sekvenssipolymorfismeja ja editointi, ja yksinkertaisempia tietojen normalisointi strategiat vertaamalla näytteitä [22]. Kun kustannukset riittävän informatiivisia RNA sekvensoinnilla määrityksiä lähenee mikrosiruja ja parannuksia käyttäjäystävällisyyttä ja luotettavuutta menetelmiä RNA sekvensointia data-analyysi, pieni RNA sekvensointi on todennäköisesti käytetään yleisemmin kuin mikrosiruja lähitulevaisuudessa. RNA FFPE näytteissä on muunnettu kemiallisesti kautta silloittumisen vuoksi formaldehydiä ja se on merkittävästi hajanainen [23] hapettamalla ilmalta, endogeenisen ribonukleaasit kiinnityksen aikana, ja käyttää korkeita lämpötiloja aikana parafiini-embedding prosessi. RNA: n hajoamista tapahtuu myös sen eristäminen FFPE näytteistä, johon liittyy pitkäaikainen altistuminen korkeille lämpötiloille (55 ° C-70 ° C). Pieniä palasia ribosomien RNA: iden (rRNA) ja mRNA: t, jotka johtuvat niiden hajoamisen kilpailla endogeenisen pieniä RNA: iden (esim MikroRNA) aikana RNA sekvensoinnilla. Esimerkiksi Sangerin DNA-sekvensointi cDNA kloonattiin FFPE kudoksen RNA osoittaa, että yli 80% 18-25 nukleotidin kokoinen pieni RNA: iden FFPE kudoksessa ovat fragmentit, rRNA: ita ja siirto-RNA: t [24]. Huolimatta näistä haittavaikutuksista formaliinia kiinnitys, on teoreettisesti mahdollista profiloida MikroRNA vuonna FFPE kudoksissa jos RNA sekvensointi suoritetaan riittävä syvyys. Siksi pyrimme tutkimaan mahdollisuutta pienten RNA sekvensointi kvantifiointiin MikroRNA in FFPE näytteissä. Kun aloitimme tämän työn, oli vain yksi julkaistun tutkimuksen, joka oli yrittänyt käsitellä tätä kysymystä [25].

Materiaalit ja menetelmät

Ethics selvitys

Tämä tutkimus suoritettiin kanssa hiljaista ja tietoinen suostumus osallistujien ja hyväksynyt Institutional Review Board of Memorial Sloan Kettering Cancer Center (MSK) in New York, NY (IRB numero WA0269-08).

kasvain näytteet

FFPE yksilöitä 8 hoito-naiivi yksinäinen patologinen vaiheessa I keuhkoadenokarsinooma kasvaimia resektoitiin at MSK tammikuusta 1995 joulukuu 1999 käytettiin. 8 kasvaimet olivat joukko vaiheen I keuhkoadenokarsinooma tapauksia, joita on aiemmin kuvattu [26, 27]. Valssattujen 4 um ja 20 um paksuus saatiin näytteistä varten RNA. 4 um leikkeet värjättiin hematoksyliinillä ja eosiinilla histologista arviointia alle BX51 mikroskoopilla (Olympus, Tokio, Japani), jotta RNA uutettiin kudoksesta 70% kasvain sisällöstä.

RNA ja kvantifiointiin

Kokonais-RNA eristettiin 4 osia, tai noin 3 mm

3 kunkin kasvaimen, käyttäen affiniteetti- sentrifugointi- pylväästä-pohjainen korkea Pure FFPE RNA: n eristäminen Kit (Roche, Indianapolis, USA). RNA kvantitoitiin kautta absorbanssi spektrofoto- Nanodrop 2000 väline (Thermo Scientific, Waltham, USA) ja kautta RiboGreen väriaineen fluoresenssin Qubit fluorometriä (Life Technologies, Carlsbad, USA). Integrity RNA arvioitiin käyttäen elektroforeesilla Eukaryootti Yhteensä RNA Pico siru Bioanalyzer 2100 (Agilent, Santa Clara, USA). RNA alikvootteja säilytettiin -80 ° C: ssa.

Microarray määritys MikroRNA

kahdeksan RNA-näytteet analysoitiin kahtena kappaleena ja erillisissä microarray kokeiluja varten kaksi rinnakkaista. Agilent SurePrint G3 Human miRNA 8x60k (release 16,0) mikrosirujen alustalla [28] käytettiin. Tämä alusta voi havaita 1205 ihmisen ja 287 ihmisen viruksen kypsä MikroRNA. Kullekin näistä MikroRNA ja ohjaus RNA: t, mikrosirulla on 1-4 erilaista DNA-koettimet 40-60 b; kukin näistä syntetisoitiin microarray klo 10-40 paikoista 30 um halkaisijaltaan. RNA: ta (120 ng) leimattiin 3 ’, 5’-sytidiini bisfosfaatin kanssa syaniiniväriaine kiinnitetty 3-fosfaatti ja ne hybridisoitiin 45 ui microarray 20 tuntia 45 ° C: ssa kierto 1/3 Hz, käyttämällä reagensseja ja menetelmiä varustettu Agilent miRNA Complete Labeling ja Hybridisaatio Kit. Sen jälkeen hybridisaation jälkeinen pesu, mikrosirujen objektilasit skannattiin Agilent G2505C microarray skanneri ja tietoja kuvien uutettiin käyttäen Agilent Feature Extraction (versio 9.5.3). Raaka microarray aineisto talletetaan NCBI Gene Expression Omnibus arkiston [29] (hakunumero GSE57835).

Pienet RNA sekvensoinnilla

Yksi ug RNA: ta käytettiin tuottamaan pienen RNA sekvensoinnilla kirjasto käyttäen reagensseja ja menetelmien kanssa TruSeq Small RNA Sample Prep Kit version 2 (Illumina, San Diego, USA). Lyhyesti, T4 RNA-ligaasia käytettiin ligatoimiseksi RA5 ja RA3 RNA-oligonukleotidien 5 ’ja 3’-päissä RNA, vastaavasti. Adapteri ligoitiin RNA käänteistranskriboitiin käyttäen RTP-aluketta ja tuloksena cDNA monistettiin 11 syklin PCR, joka käyttää RP1 ja indeksoitu RP1 alukkeita. PCR-tuotteiden 140-160 bp eristettiin elektroforeesilla 6% Novex Tris-boraatti polyakryyliamidigeelillä (Life Technologies). Laatu syntyy pieniä RNA sekvensointi kirjasto varmistettiin käyttämällä Agilent Suuri herkkyys DNA-analyysi Kit Bioanalyzer 2100 väline. Quadruplexed sekvensointi kirjastot tuottaa yhden lopussa lukee 50 b suoritettiin Illumina HiSeq 2000 välineen avulla HiSeq klustereiden ja sekvensointi reagenssit (versio 2.0). Illumina HCS (versio 1.4.8), RTA (versio 1.12.4.2), ja CASAVA (versio 1.8.2) ohjelmistoa käytettiin pohja-kutsuvan ja sukupolven raaka, Demultipleksoitu sekvensointi tietoja FASTQ muodossa. Raaka-sekvensointi tiedot on talletettu NCBI Sequence Lue Archive [30] (hakunumero SRP047429).

Käänteinen transkriptio (RT) -PCR-määritykset pieniä RNA: ita,

Lyhyesti, 50 ng RNA: ta oli käänteiskopioitua 15 ui käyttäen microRNA-oligonukleotidi; reagenssit ja menetelmät tarjotaan TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit (Life Technologies). CDNA (1,33 ui) käytettiin templaattina reaaliajassa PCR: 40 sykliä ja 15 ui, joka suoritettiin kolmena rinnakkaisena on 7900HT kone (Life Technologies), jossa denaturaatio 15 s 95 ° C: ssa ja yhdistetään hehkutus ja laajennus 60 s 60 ° C: ssa. SDS-ohjelmiston (versio 2.4, Life technologies) käytettiin laskemiseen kvantifiointiin sykli (C

q) arvot automaattisella lähtötilanteessa ja kynnys havaitsemiseen. DNA-oligonukleotidit varustettu TaqMan MicroRNA RT-PCR-määrityksissä [31] kanssa tunnusnumerot 397, 509, 1097, 398, 526, ja 2340 (Life Technologies), käytettiin määrittämään ihmisen kypsän MikroRNA

miR-21-5p

–

205-5p

, –

146b-5p

, –

22-3p

, –

223-3p

, ja-

423-5p

, vastaavasti. Aikuinen MikroRNA

miR-16-5p

, –

210-3p

, ja-

486-5p

mitattiin käyttämällä mukautettuja määrityksiä, jotka suunniteltiin perustuen periaatteeseen TaqMan microRNA RT-PCR-määrityksissä ja sittemmin validoitu (viitteet [31, 32] ja S1 taulukko). Kaikki RT-PCR määritykset suoritettiin yhdessä kokeessa ja data-set raaka C

q arvot normalisoitiin käyttämällä maailman keskilämpötila menetelmä [33].

Jalostus ja analysoi microarray tietojen

Raaka tietoja kaikista mikrosiruja käsiteltiin yhdessä käyttäen AgiMicroRna Bioconductor paketti [34] (versio 2.10.0) R (versio 3.0.2). Lyhyesti, ja kohti optimaalisen työnkulun tunnistettu mikromatriisi platform [35], vankka multi-chip keskiarvo (RMA) menetelmää [36] ensimmäisen kerran käytettiin koetin-set yhteenvetoa ilman taustakorjauksen; data poikki paneelit sitten normalisoitui kanssa quantile menetelmällä. Yksi harha mikrosiru tunnistettiin tarkastelu normalisoidun dataa suhteellisia log ilmaisua, valvomattoman hierarkkinen klusterointi muun-array korrelaatio, ja pääkomponentti tontteja; raaka microarray data uudelleen käsitelty jälkeen ilman harha. Kypsät microRNA tunnusnumerot (MIMAT ID) ja MikroRNA havaittavissa microarray alustan saatiin miRBase microRNA sekvenssin arkiston [37] (versio 20). Arvo IsGeneDetected lippu, joka deermined jonka Agilent Feature Extraction ohjelmisto, käytettiin määrittämään onko MikroRNA havaittiin alustan.

Jalostus ja analyysit RNA sekvenointitulosten

Trimmomatic [38 ] (versio 0.32) käytettiin leikata lukee sovittimen ja huonolaatuista emäkset näillä kriteereillä, jotta: (1) poistaa luku- segmenttien Hyväksytty sekvenssit sovittimia ja alukkeita käytettiin sekvensointiin kirjaston valmistelua; (2) poista johtava /perään emäksiä Phred

33 pohja-laatupisteet 3; (3) käyttäen liukuvan ikkunan 4 emäkset, poista 5 ’liitinpohjaan jos keskimääräinen Phred

33 pisteet 4 tukiasemaa oli 15; ja (4) kokonaan hävitä lohkottu lukee 16 jäljellä emäksiä. Määrittämiseksi kypsä microRNA ilme, miRExpress [39] (versio 2.0) käytettiin kartoittamaan jalostettu lukee ihmisen ennalta microRNA ja kypsä microRNA sekvenssit (miRBase release 20). Oletusasetukset miRExpress käytettiin prosessin aikana (100% identtisyys luetun ja pre-microRNA sekvenssin linjaus, lukea pituus ≥80% kypsä mikroRNA pituus, ja ≤4 extra johtava /perään tukikohdat read verrattuna kypsyä microRNA järjestyksessä ). Yhteenvetona count arvot lukee kyseisen kartoitettu yhden kypsän microRNA mutta useita ennalta MikroRNA, pyöristetty keskiarvo tai mediaani ennalta mikroRNA-kartoitusta laskee käytettiin kun maksimiarvo on 50%: n tai ≥50% vähintään, vastaavasti. Kootut raaka kypsä microRNA count Aineisto normalisoidaan sitten poikki näytteitä rajatun keskiarvo M-arvot (TMM) normalisoinnin menetelmää, esitettyjä särmäysautomaatin Bioconductor paketti [40] (versio 3.2.4). Voit selvittää biotyyppien RNA (esim mRNA, rRNA, microRNA jne), että sekvensointi lukee edustettuina, subread-align toiminto Subread aligner ohjelmisto [41] (versio 1.4.4) käytettiin yhdenmukaistaa jalostettuihin lukee-kanssa multi-kartoitus on sallittu ja aukottomat genomin indeksiin ihmisen genomiin (Ensembl GRCh37.75 primaarisidoksilla). FeatureCounts toiminto [42] on Subread käytettiin sitten, multi-päällekkäistä sallittu, tunnistaa RNA: t ”biotyyppi että sekvensointi lukee edusti kautta tarkastelu merkinnät genomin paikoista että lukee oli kartoitettu. Ensembl n GRCh37.75 geeni annotation tietoja 25 eri gene_biotype määreet käytettiin.

Muut

analyysit että mukana vertailun toistojen, normalisoitu microarray, ja normalisoitu ja log

2-muunneta (offset = 0,1) sekvensointi tietoja lisäksi käsitellään muuttujien Combat toimintaa SVA Bioconductor paketti [43] (versio 3.6.0) säädä erän vaikutus erillisten microarray tai sekvensoinnilla kokeita käytetään rinnakkaiskokeista. Korrelaatio analyysit, normalisoitu microarray- ja sekvensointi-pohjainen microRNA mittaukset olivat log

2-muunnetaan ja RT-PCR-pohjainen normalisoitu C

q mittaukset MikroRNA olivat negatiivisia-muuttunut. Prism-ohjelmiston (versio 6.0c, GraphPad, La Jolla, USA) käytettiin piirtämistä tietoja.

P

-arvo 0,05 liittyi tilastollista merkittävyyttä. RT-PCR-määrityksissä ja tietojen analyysit suoritettiin Roswell Park Cancer Institute, Buffalo, USA; kaikki muut työt valmistui MSK.

Tulokset ja keskustelu

uutettu kokonais-RNA FFPE yksilöt resektoidun vaiheen I keuhkoadenokarsinooma kasvaimia. RNA eristettiin käyttäen piidioksidimatriisi sisältävän spin sarakkeet noin 3 mm

3 FFPE kudoksen (n = 8), yön yli digestion proteinaasi K RNA saannot vaihtelivat 8,0-59,7 ug, kuten kvantitoitiin absorbanssilla 260 nm: ssä, mutta 6,1-34,6 ug, koska määrällisesti kanssa RiboGreen väriainetta. Tämä on enemmän spesifisyyttä RNA kuin se tekee DNA: ta (Fig. 1A), ja se viittaa siihen, että läsnä on DNA-valmisteissa, kuten on todettu muiden [32]. Kuten odotettua, geelielektroforeesi määrityksellä Bioanalyzer väline osoitti, että RNA: ta eristettiin FFPE yksilöt oli erittäin hajonnut (Fig. 1 B), jossa arvot RNA eheyden vaihtelevat 1,9-2,5 [44].

. Korrelaatio mittausten RNA: n saanto (ug) saatiin käyttämällä absorbanssia 260 nm: ssä tai fluoresenssin RiboGreen väriaine (n = 8). Linjat identiteetin ja lineaarinen regressio (pienimmän neliösumman menetelmällä) ja arvot ja 95%: n luottamusvälit Pearsonin kerroin (

r

) ja kulmakerroin lineaarisen regression (

m

);

P

-arvot myös huomattava. B. elektroforeto- 8 RNA-näytteet (

–

H

). Näytteet ajettiin Agilent Eukaryootti Kokonais-RNA Pico siru Bioanalyzer 2100. koot molekyylipainomarkkerit ja RNA eheyden numerot on merkitty.

Sequencing kirjastot muodostettiin 1 ug kutakin kokonais-RNA näytteistä liittämällä adapteri RNA: iden 5 ’ja 3’ päissä, ja sen jälkeen käänteistranskriptiolla ja PCR: llä käyttäen Illumina TruSeq Small RNA Sample Preparation Kit. Kirjastot koon valittu sekvensointi RNA-fragmentit 15-25 nukleotidia. Sekvensointi suoritettiin Illumina HiSeq 2000 alusta saada yhden lopussa lukee 50 emästä. Välillä 9,1 ja 16,9 miljoonaa lukee saatiin kullekin 8 näytettä (keskiarvo = 13,2 milj; SD = 3,5 miljoonaa taulukko 1). Kun lukee käsiteltiin poistamiseksi nukleotidisekvenssejä sovittimia käytetään kirjaston valmistelua ja emäkset huonolaatuinen, 67.6-% 83,4% (keskiarvo = 76,8; SD = 4,5) ja lukee voitaisiin kartoittaa vasten hg19 viittaus ihmisen genomin kokoonpano (Ensembl GRCh37.75 primaarisidoksilla). Yli 90%: n yhdistetty lukee linjassa vastaan ​​puhtaaksi genomin alueita. Kuitenkin vain 0,14% -0,53% (keskiarvo = 0,29; SD = 0,13) ja lukee kartoitettu loci for MikroRNA, kun taas 49,4% -54,6% ja 34,8% -39,3% kartoitettu alueille, jotka koodataan rRNA ja mRNA: t, vastaavasti (taulukko 1). Siten, vain hyvin pieni murto-osa (noin 0,1% -0,5%) ja pieniä RNA: ita on 15-25 nukleotidia, jotka eristettiin FFPE kudosnäytteet olivat MikroRNA; ylivoimainen enemmistö oli rRNA ja mRNA fragmentteja.

MicroRNA ekspressioprofiileja poimittiin pienten RNA sekvensointi tietoja käyttämällä miRExpress työkalulla [39]. MiRExpress kartoitettu 0,6% -2,2% käsitellyn sekvensointi lukee kypsä ihmisen MikroRNA. Per miRBase microRNA sekvenssitietokantaan julkaisu 20 (kesäkuu 2013), 2620 ihmisen kypsän MikroRNA tiedettiin [37]. Kaikkiaan 1021 MikroRNA havaittiin (kartoitettiin lue count ≥1) kesken 8 näytettä, jossa 454-625 havaitaan näytettä kohti (keskiarvo = 550; SD = 69), ja 283 havaittiin kaikissa näytteissä. Validoida pieniä RNA-sekvensoinnilla-pohjainen microRNA mittauksia, kvantitatiivinen RT-PCR-määrityksissä käytettiin määrittämään 9 valittu mielivaltaisesti MikroRNA että katsottiin havaittu, että sekä microarray ja pienten RNA-sekvensoinnilla alustojen kaikissa 8 RNA-näytteet. Vuonna Spearmanin korrelaatiota analyysit mikroRNA, jotka on saatu RT-PCR: llä ja pieni RNA sekvensointi, korrelaatiokertoimet olivat 0,19-0,95 (keskiarvo = 0,73; SD = 0,24). Kertoimen arvo oli 0,7 7 9 MikroRNA (taulukko 2), mikä osoittaa, vaatimaton tarkkuus RNA sekvensointi menetelmällä. Arvioida tekninen toisinnettavuuden mikroRNA ilmentymisen profilointi kautta sekvensointi menetelmää, 2 8 RNA-näytteille tehtiin pieniä RNA-sekvensoinnilla on kahtena kokeessa. Välinen jäljitellä Spearmanin korrelaatiokertoimet kahtena microRNA mittaukset 2 näytteistä oli 0,75 ja 0,88 (Fig. 2).

MikroRNA 2 näytteissä (

ja

B

) on profiloitu kahtena kappaleena sekä pienten RNA sekvensointi ja mikrosirujen alustoille. Scatter-kuvaajat kuvaavat inter-toisinto korrelaatio normalisoitujen microRNA mittauksia. Kumulatiivinen osa MikroRNA X-akselia pitkin (

musta

), ja arvot Pearsonin korrelaatiokerroin mikroRNA mittausten liukuvan ikkunan pitkin X akselia kooltaan 51 puolivälissä ikkuna (

harmaa

) on myös esitetty.

kvantifiointi MikroRNA kautta hybridisaatio RNA: DNA-koettimista mikrosiruja on nykyään tavallinen menetelmä maailmanlaajuinen microRNA profilointia FFPE kudoksiin. Analysoida perusteellisemmin suorituskykyä pienten RNA sekvensointi menetelmä, mittasimme MikroRNA 120 ng kutakin 8 FFPE kudoksen RNA-näytteet käyttäen Agilent 8x60k Human miRNA microarray-alustaa, joka pystyy havaitsemaan 1205 ihmisen kypsän MikroRNA. Kaikkiaan 368 MikroRNA havaittiin (IsGeneDetected lippu arvo = 1) kesken 8 näytettä, jossa 200-349 havaitaan näytettä kohti (keskiarvo = 286; SD = 45) ja 175 havaittiin kaikissa näytteissä. Näistä 175 MikroRNA, 126 havaittiin myös kaikissa 8 näytettä, joita pienten RNA sekvensointi menetelmä. Vuonna vertailuja RNA sequencing- ja microarray-pohjainen microRNA Mittausten keskiarvo Spearmanin korrelaatiokertoimen 126 MikroRNA oli 0,37 sekä 63 MikroRNA oli 0,5. Korrelaatio FFPE kudoksen microRNA mittaukset saadaan pieniä RNA sekvensoinnilla ja mikrosirujen alustat ovat vahvistaneet muut ryhmät [45-47].

Microarray-pohjainen microRNA määritykset tehtiin jäljennöksiä varten 7 8 RNA-näytteet. Mitataan keskimääräinen välinen rinnakkaisten Spearmanin korrelaatiokertoimen 0,81, havaittu pieni RNA sekvensointi menetelmä, välisten rinnakkaisten korrelaatiokertoimet varten microarray alustan olivat +0,98-,99 välillä (keskiarvo = 0,99, SD = 0,01). Kuitenkin Spearmanin korrelaatiota analyysit mikroRNA, jotka on saatu RT-PCR: llä ja mikrosirujen määrityksissä, korrelaatiokertoimet olivat -0,36-0,84 (keskiarvo = 0,22; SD = 0,55) ja ne olivat pienemmät kuin havaittiin RNA sekvensointi perustuvan mittauksen (Taulukko 2). Näin ollen vaikka pieni RNA sekvensointialustamme havaitaan suurempi määrä MikroRNA tarkempi kuin mikrosirun alusta, sen tarkkuus ei ollut yhtä hyvä. Taulukossa 3 on yhteenveto suoritusarvot joka havaittiin 2 microRNA profiloinnin alustoja käytetään tässä raportissa.

Kaiken havaintomme osoittaa toteutettavuus pienten RNA sekvensointia varten microRNA profilointiin FFPE kudoksen RNA huolimatta sen vaarannu laatua ja eheyttä. Vaikka vain 1,54% 12,1 miljoonaa pientä RNA sekvensoinnilla luettu FFPE kudokset oli todettu olevan 550 tunnettua MikroRNA tässä tutkimuksessa määrä MikroRNA joka havaittiin ja kvantitoitiin oli enemmän kuin että mikrosirulla alustan (taulukot 1 ja 3). Spearman korrelaatiokertoimet mittauksissa saatu jaksotusta ja mikrosirujen alustoja puolet 126 MikroRNA jotka havaittiin kaikissa näytteissä sekä alustoilla oli 0,5. Korrelaatio analyysit sequencing- ja RT-PCR-pohjainen mittaukset yhdeksän MikroRNA jotka tutkittiin, kertoimet olivat 0,7 7 (taulukko 2). Tekninen toisinnettavuuden pienten RNA sekvensointi menetelmä oli kuitenkin suhteellisen huono verrattuna microarray-menetelmällä (keskimääräinen välinen jäljitellä Spearmanin korrelaatiokertoimet 0,81 ja 0,99, vastaavasti, taulukko 3). On mahdollista, että tarkkuus sekvensointi menetelmää voitaisiin parantaa lisäämällä sekvensointi syvyyttä saada suurempi määrä lukee ja hyödyntämällä menetelmiä heikentävistä rRNA RNA-valmisteita [48-50] tai vähentämään edustustaan ​​sekvensointi kirjastossa käyttäen strategioita, kuten myrkkyä pohjamaali ”esto [24].

Vain yksi tutkimuksen [25] oli ilmoittanut, että mahdollisuutta käyttää pieniä RNA sekvensointia varten microRNA profilointiin FFPE kudoksen RNA kun aloitimme on kuvattu tässä paperi. Sittemmin viimeisen vuoden aikana, ainakin 5 muut tutkimukset ovat osoittaneet, että RNA sekvensointi voidaan tarkasti profiilin MikroRNA in FFPE näytteistä (S2 taulukko) [45-47, 51, 52]. Nämä tutkimukset suoritetaan useimmiten solulinjoista ja ihmisen FFPE kudosten 2-9 vuotias ovat osoittaneet, että microRNA ekspressioprofiileja saadaan pieniä RNA sekvensoinnilla ovat hyvin yhtäpitävät välillä FFPE ja makean pakastetut kudokset [25, 47, 51, 52], ja että pieni RNA sekvensointi ja mikrosirujen alustoille tuottaa samankaltaisia ​​microRNA profiilit FFPE kudosten [25, 47]. Havainnot Näiden ja meidän tutkimuksia suoritetaan NSCLC näytteitä 15- 20-vuotias siis osoittavat, että pienet RNA sekvensointi voidaan käyttää saamaan microRNA profiileja FFPE kudosnäytteiden kanssa suorituskyky on samanlaiset ominaisuudet kuin mikrosirujen.

tukeminen tiedot

S1 Taulukko. Custom TaqMan microRNA käänteistranskriptio (RT) -PCR määritykset ihmisen kypsän MikroRNA

miR-210-3p

ja

miR-486-5p

.

Doi: 10,1371 /journal.pone. 0121521.s001

(DOCX)

S2 Taulukko. Kuusi tutkimuksissa on arvioitu RNA sekvensoinnilla profilointiin MikroRNA in formaliinilla kiinnitetyt, parafiiniin upotetut kudokset.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0121521.s002

(DOCX) B

Kiitokset

Kiitämme Alex Torres on Torakaaliikirurgia Palvelua MSK hänen editointiavun.