Krooninen sairaus

tiivistelmä

Kohdun limakalvon syöpä on yleisimmin diagnosoitu gynekologiset pahanlaatuisen maailmanlaajuisesti; vielä kasvaimen mikroympäristössä, erityisesti fibroblastien, jotka ympäröivät syöpäsolut, on huonosti ymmärretty. Perustimme neljä primääriviljelmien fibroblasteja ihmisen kohdun limakalvon syöpä kudoksiin (syöpään liittyvän fibroblastit, valuuttalisiin) käyttäen vasta-konjugoitua magneettihelmi eristäminen. Nämä suhteellisen homogeeninen fibroblastiviljelmät ilmaistaan ​​fibroblastien merkkiaineita (CD90, vimentiinistä ja alfa-sileän lihaksen aktiini) ja hormonaaliset (estrogeeni ja progesteroni) reseptoreihin. Esikäsitelty väliaine kerättiin valuuttalisiin indusoi annoksesta riippuvan leviämisen sekä primääriviljelmissä ja solulinjat kohdun limakalvon syövän

in vitro

(175%) verrattuna ei-käsitellyissä soluissa, toisin kuin normaalien kohdun limakalvon fibroblastisolulinja (51%) (

P

0,0001). Näitä vaikutuksia ei havaittu fibroblastiviljelmässä peräisin hyvänlaatuinen endometriumhyperplasia kudoksissa, mikä osoittaa spesifisyyttä valuuttalisiin in vaikuttavat kohdun limakalvon syövän solujen lisääntymistä. Määrittämään taustalla oleva mekanismi ero fibroblasti vaikutuksia, vertasimme aktivoituminen PI3K /Akt ja MAPK /Erk reittejä kohdun limakalvon syövän solujen käsittelyn jälkeen normaali fibroblasts- ja valuuttalisiin-elatusaine. Western blot-analyysi osoitti, että geenien molempien fosforyloidun Akt-muotoja ja Erk olivat merkittävästi alassäädetty normaaleissa fibroblasteissa-käsiteltyjä soluja, mutta oli säädelty /ylläpidetään valuuttalisiin-käsitellyissä soluissa. Hoito erityisiä estäjät LY294002 ja U0126 päinvastaiseksi valuuttalisiin välittämä solujen lisääntymistä (

P

0,0001), mikä viittaa siihen, sillä rooli näiden reittien moduloinnissa endometriumsyöpään solujen lisääntymistä. Rapamysiini, joka kohdistuu alavirran molekyylin PI3K koulutusjakso (mTOR), myös tukahdutti valuuttalisiin aiheuttaman soluproliferaation apoptoosin käynnistymiseen. Sytokiini profilointi analyysi paljasti, että valuuttalisiin erittävät korkeampi makrofagin kemoattraktanttia proteiini (MCP) -1, interleukiini (IL) -6, IL-8, RANTES ja verisuonten endoteelin kasvutekijä (VEGF) kuin normaalien fibroblastien. Tuloksemme viittaavat siihen, että toisin kuin normaalien fibroblastien, valuuttalisiin voi ilmetä pro-kasvaimia aiheuttavasta vaikutuksesta etenemisessä kohdun limakalvon syöpä, ja PI3K /Akt ja MAPK /Erk signalointi voi edustaa kriittisen sääntelyviranomaisten kuinka kohdun limakalvon syövän solut reagoivat niiden mikroympäristön.

Citation: Subramaniam KS, Tham ST, Mohamed Z, Woo YL, Mat Adenan NA, Chung I (2013) Cancer-Associated Sidekudosmuodostussolujen edistää leviämisen endometriumsyöpätapausta Cells. PLoS ONE 8 (7): e68923. doi: 10,1371 /journal.pone.0068923

Editor: John W Glod, Robert Wood Johnson Medical School, Yhdysvallat

vastaanotettu: 08 helmikuu 2013; Hyväksytty: 3 kesäkuu 2013; Julkaistu: 26 heinäkuu 2013

Copyright: © 2013 Subramaniam et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ rahoittaa yliopiston Malaya Research Grants RG336 /11HTM (Chung), UM HIR /Mohe /MED-12 (Chung) ja HIR-Mohe E-00025-20001 (Mohamed). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

kohdun limakalvon syöpä (EY) on kuudenneksi yleisin diagnosoitu syöpä naisilla maailmanlaajuisesti noin 288000 uutta tapausta ja 50327 kuolemista tapahtuu maailmanlaajuisesti vuosittain [1]. Se on yleisin gynecologic syöpään Yhdysvalloissa arviolla 47100 uutta tapausta diagnosoitiin vuonna 2012 [2]. Merkittävää ilmaantuvuus ja kuolleisuus EY ovat nousseet kehittyneissä maissa ja kehitysmaissa ja sen odotetaan nousevan edelleen kasvaessa väestön ikääntyminen ja lihavuuden [3]. Vaikka viiden vuoden eloonjääminen EY on 85%, osajoukko kohdun limakalvon kasvaimet näytteille aggressiivista fenotyyppi, jolle on ominaista korkea histologinen luokka, alue- lymphovascular invaasio ja etäpesäkkeiden. Ennuste tällaisia ​​kasvaimia on suhteellisen huono, viiden vuoden eloonjääminen vaihtelee 16-66% [4].

Noin 90% EY tapaukset ovat satunnaisia ​​ja luokitellaan tyypin 1 ja tyypin 2 mukaan niiden etiologian ja kliininen käytös [5]. Type 1 EY edustaa suurinta osaa satunnaisia ​​tapauksia, osuus 70-80% uusista tapauksista [5]. Tyyppi 1 syöpiä, lähinnä endomet- histologian, ovat usein matala-asteinen kasvaimista suotuisa ennuste. Nämä syövät esiintyy usein PTEN, K

ras

ja beeta-kateniinin mutaatioiden ja lisääntyneen ilmentymisen estrogeenireseptorin [6]. On ehdotettu, että liiallinen estrogeenin altistuminen voi johtaa epätyypillisiin endometriumhyperplasia (EH), hyvänlaatuinen kunnon proliferatiivisia kohdun limakalvon rauhasen [7,8]. Lisäksi epätyypillinen EH on vahvasti sidoksissa invasiivisen EY jopa 62% koepala kohdun yksilöitä, mikä viittaa siihen, että epätyypilliset EH voidaan suoriin edeltäjä endomet- tyypin 1 EY [9]. Kuitenkin tärkein syy hoidon epäonnistumiseen sekä tyypin 1 ja 2 kohdun limakalvon syöpiä on kaukainen leviäminen primaarikasvainten (etäpesäke) [10]. Mekanismi johtaa tämä aggressiivinen muutos on vielä määriteltävä. Kuitenkin tutkimukset muissa elimissä viittaavat siihen, että ympäröivä fibroblastit voi olla tärkeä rooli syövän etenemistä [11,12].

naisen synnytyskanavassa, fibroblastit voivat edistää epiteelisolujen kehitys ja erilaistuminen [13,14]. Ne vastaavat soluväliaineen remontin ja tuottaa parakriinisiä kasvutekijöitä, jotka ohjaavat solujen lisääntymistä, eloonjääntiä ja kuoleman [15]. Itse asiassa, osuus syöpään liittyvän fibroblasteissa (valuuttalisiin) etenemisen eri syöpätyyppien on tutkittu, esimerkiksi eturauhassyövän [16-18], haimasyöpä [12], pään ja kaulan alueen syöpä [19] ja rintojen syöpä [20]. Näissä kasvainmuodosta, valuuttalisiin parannettu kasvainsoluproliferaation, invaasiota ja chemoresistance. Lisäksi valuuttalisiin myös ajatellaan olevan merkittävä rooli moduloinnissa kasvainangiogeneesissä, immuunisolujen infiltraatio ja metastasoituneen kolonisaatio [21-23]. Osallistuminen fibroblastien etenemisen EY, kuitenkin suhteellisen alle-tutkittu.

Characterization of fibroblastien tekijöitä kohdun limakalvon syöpä, kun taas harvat ovat pääasiassa patologinen analyyseihin. Hepatosyyttikasvutekijää ja cMET ilmentyminen korreloi merkitsevästi korkeampi vaiheisiin EY, vaikka ei ollut ennustetekijöiden of elinajan [24]. Toisessa tutkimuksessa havaittiin, että CXCR4: n ilmentyminen oli merkitsevästi suurempi kasvaimia lihasten tunkeutumisen indikaattori etäpesäkkeiden [25]. Mielenkiintoista on, että käyttämällä ensisijaista viljelmiä kohdun limakalvon kudoksissa, Arnold et al osoittivat, että eritystä normaalin kohdun limakalvon fibroblastisoluista inhiboivat Ishikawa-soluja, ihmisen EC-solulinja [26]. Tämä havainto tuki lisäksi Zhao ryhmä, jossa he ehdottivat, että tällaiset antiproliferatiivinen vaikutus voi johtua esto PI3K signaloinnin [27]. On kuitenkin vielä tiedetä valuuttalisiin EY: n omaavat kasvaimen vastainen omaisuuden normaalin limakalvon fibroblastien, tai pro-kasvain ominaisuus kuten valuuttalisiin peräisin muissa elimissä.

Näin ollen tässä tutkimuksessa, me perustanut useita ensisijainen ihmisen kohdun limakalvon fibroblastisolujen peräisin EY kudoksista, tutkia vaikutukset valuuttalisiin EY: n soluproliferaatioon. Olemme lisäksi osoitti, että toisin kuin normaalissa kohdun limakalvon fibroblastien valuuttalisiin edistänyt EY solujen lisääntymistä, osittain moduloimalla PI3K /Akt ja MAPK /Erk signalointireittejä. Testasimme myös käyttöön rapamysiinin, joka on mTOR inhibiittorin, mahdollisena terapeuttisena aineena estämään valuuttalisiin-välitteisen soluproliferaation. Tutkimus tarjoaa uutta näyttöä valaisemaan pro-tuumorigeenisen roolia fibroblastien kasvainten synnyssä EY.

Materiaalit ja menetelmät

Kemikaalit ja reagenssit

U0126 ja LY294002 saatiin Cell Signaling Technology (MA, USA), ja rapamysiini (sirolimuusi) hankittiin Clearsynth Labs (Mumbai, Intia).

Ethics selvitys

tutkimus hyväksynyt eettinen komitea University malaya Medical Centre (viitenro 865,19). Kirjallinen suostumus saatiin kaikilta osapuolilta.

Ihmiskudokset ja solulinjoissa

kudoksille neljästä kohdun limakalvon syöpää ja yksi hyperplasian kudosta saatiin naisilla, joille leikkaus poistaa kasvain osa kohdun limakalvon. Noin 1 g kudosten kuljetettiin laboratorioon media, joka koostuu RPMI 1640 (Life Technologies, NY, USA) täydennettynä 10% naudan sikiön seerumia (FBS) (Life Technologies, NY, USA) ja 1% penisilliini /streptomysiiniä (Life Technologies , NY, USA). Kudokset jauhettu kokoon 1 mm

3 ja sitten pilkottiin 2 mg /ml kollagenaasi II EY kudoksia ja kollagenaasi I liikakasvun kudoksen (Worthington, New Jersey, USA) on pyöritin 1 tunnin ajan 37

° C. Post ruoansulatusta, kudokset pestiin ja viljeltiin RPMI1640-alusta täydennettynä 10% FBS: ää ja 1% penisilliini /streptomysiinillä, 37

° C. Viljelmiä ylläpidettiin median vaihtaa 72 tunnin välein ja Saharan viljeltiin saavutettuaan konfluenssiin. Ihmisen kohdun limakalvon syöpä solulinjoja, ECC-1 (CRL-2923) ja HEC-1-A (HTB 112) ja ikuisti ihmisen normaalia kohdun fibroblastisolulinjan, T-ihmisalkion kantasoluihin (CRL-4003) hankittiin American Type Culture Collection (Bethesda , MD, USA) ja viljeltiin median mukaan valmistajan protokollaa.

eristäminen ensisijaisen epiteeli- ja stroomasolujen

Kaikki viljeltiin primäärisiä soluja saatu kirurgisen kudoksista tehtiin stroomasolujen eristäminen käyttäen anti -fibroblast magneettinen mikrohelmien (Miltenyi Biotech, Köln, Saksa). Lyhyesti, 1×10

6 solua sentrifugoitiin 300x

g

10 minuuttia. Sitten solupelletit suspendoitiin uudelleen 100 ul: aan puskuria, joka sisälsi lopullinen konsentraatio 0,5% naudan seerumin albumiinia ja 2 mM etyleenidiamiinitetraetikkahappoa liuotetaan pH 7,2, kalsiumin ja magnesiumin, fosfaatilla puskuroitua suolaliuosta, ja niitä inkuboitiin 20 ul: lla ihmisen anti-fibroblastien mikrohelmien vasta-aine (Miltenyi Biotec, CA, USA) 1 tunnin ajan. Sitten solut erotettiin käyttämällä MiniMACS ™ soluerottajaan (Miltenyi Biotec, CA, USA). Sitten eristetyt solut edelleen viljellä media edellä. Epiteelisolujen väestön myös talteen käyttäen samanlaista menetelmää, käyttämällä ihmisen CD326 (EpCAM) magneettiset mikrohelmet vasta-aine (Miltenyi Biotec, CA, USA).

Virtaussytometrianalyysi

Viljellyt solut trypsinoitiin ja 1×10

6 yksisoluinen suspensio blokattiin 10% normaalia vuohen seerumia (Biowest, Nuaille, Ranska) ennen värjäämällä AlexaFluor 647 (AF647) konjugoitua ihmisen epiteelisolun adheesiomolekyylin (EpCAM) ja PE-konjugoidulla ihmisen CD90-vasta-aineita (Biolegend, San Diego, USA). Isotyyppikontrolleja käytettiin AF647 hiiren IgG2b, κ ja PE hiiren IgG1, κ, vastaavasti. Värjäys sitten analysoitiin BD FACSCanto II virtaussytometrillä ja tulokset näytettiin käyttäen FACS DiVa ohjelmistoa (BD Bioscience, Kalifornia, USA).

kvantitatiivinen reaaliaikainen polymeraasiketjureaktio (qRT-PCR) B

Yhteensä RNA uutetaan viljellyistä soluista käyttäen TRIzol (Invitrogen, Kalifornia, USA) ja 1 ug RNA muunnettiin cDNA käyttäen dynamo cDNA synteesi kit (Finnzymes, Vantaa, Suomi). Sekvenssin alukkeita käytetään havaitsemaan epiteelisolujen markkereita (EpCAM, E-kadheriinin, sytokeratiini 8) ja fibroblastisolu- markkereita (alfa-sileän lihaksen aktiini (α-SMA) ja vimentiinin) on lueteltu taulukossa 1. qRT-PCR suoritettiin käyttäen ABI StepOne Plus (Applied Biosystem, Kalifornia, USA) 35 sykliä käyttämällä 5x HOT FIREPol EvaGreen qPCR Mix (Solis Biodyne, Tartu, Viro), 10 pmol /ul eteen ja taakse aluketta, 10 ng /ul cDNA templaattina ja PCR luokan H

2O. Määritykset suoritettiin vähintään kolmena kappaleena, ja keskiarvot laskettiin, suhteellisten ekspressiotasojen käyttäen ΔΔC (t) menetelmä. Ilmentymistasot ensin normalisoitiin siivouspalveluista GAPDH-geenin. Seuraavaksi geeni-ilmentymisen testattiin epiteelisolujen verrattiin vastaavaan mRNA-tasolla havaittiin edustavan fibroblastisolujen (T-ihmisalkion kantasoluihin), ja vastaavasti ne geenit, jotka on raportoitu ilmaistu fibroblastisoluja verrattuna niiden vastaaviin mRNA-tasolla edustavasta epiteelisolujen ( ECC-1).

Gene

Alukkeet

Lähde

EpCAMForward5′-AATGTGTGTGCGTGGGA-3 ’[79] Reverse5′-TTCAAGATTGGTAAAGCCAGT-3’E-cadherinForward5′-TTTGTACAGATGGGGTCTTGC-3′ [80] Reverse5 ”-CAAGCCCACTTTTCATAGTTCC-3’Cytokeratin 8Forward5’-CTGGTGGAGGACTTCAAGAAC-3 ’[81] Reverse5′-GACCTCAGCAATGATGCTGTC-3’αSMAForward5′-GACGAAGCACAGAGCAAAAGAG-3′ [82] Reverse5′-TGGTGATGATGCCATGTTCTATCG-3’VimentinForward5’-TGGCACGTCTTGACCTTGAA-3 ’[83 ] Reverse5’-GGTCATCGTGATGCTGAGAA-3’Table 1.

alukkeet sekvenssit

käytetään qRT-PCR.

CSV Lataa CSV

valmistaminen fibroblastisolujen-elatusaine

fibroblastisoluja kylvetään ja viljeltiin täydellisessä median 24 tuntia, ennen kuin niitä viljeltiin väliaineessa, joka sisälsi 2% FBS: ää seuraavien 72 tunnin aikana. Elatusaine kerättiin Amicon Ultra sentrifugisuodattimet (Merck Milipore, Massachusetts, USA) sentrifugoimalla 5000-kertaisesti

g

4

° C: ssa 1 tunti. Proteiini konsentroitua alustaa kvantifioitiin käyttäen Bradford (Biorad, CA, USA).

Metyyli-tiatsolyyli tetratsolium (MTT)

leviämisen epiteelisolujen arvioitiin metyyli-tiatsolyyli tetratsolium (MTT) testata. Lyhyesti, solut siirrostettiin täydelliseen mediaan 1-3 x10

3 solua /kuoppa 96-kuoppaisille levyille. 24 tunnin kuluttua kylvön jälkeen solut käsiteltiin joko täydellinen, media, jossa on 2% FBS: ää, fibroblasti-elatusaine ja /tai estäjien 72 tuntia. Lopussa hoidon, 20 ui MTT-liuosta (5 mg /ml) lisättiin kuhunkin kuoppaan. Seuraavat 4 tunnin inkubaation 37

° C, 100 ui 10% natriumdodekyylisulfaattia lisättiin liuottamaan formatsaanikiteet kiteet vielä 4 tuntia inkuboinnin jälkeen 37

° C. Absorbanssi mitattiin spektrometrillä 575 nm viitaten 650 nm.

Yhteensä proteiiniuutto ja Western blotting

ECC-1-solut ympättiin 1×10

4 solua /kuoppa 6- kuoppalevyille täyteen kasvatusliuokseen. 24 tunnin kuluttua kylvön jälkeen solut käsiteltiin joko täydellinen, media, jossa on 2% FBS: ää, fibroblastit-elatusaine ja /tai estäjien 72 tuntia. Proteiini lysaatit kerättiin raaputtamalla solut kylmään hajotuspuskuriin, joka sisälsi lopullinen pitoisuus 0,1% Triton-X, 0,1% SDS, 50 mM Tris, 150 mM NaCl, 1 x fosfataasi ja 1x proteaasin estäjiä. Proteiini kvantifioitiin käyttämällä Bradford (Biorad, CA, USA). Noin 20 ug proteiinia erotettiin 10% natriumdodekyylisulfaattia polyakryyliamidigeelielektroforeesilla ennen siirretään polyvinylideenidifluoridi kalvo. Käytetyt vasta-aineet olivat kanin anti-ihmis-Akt, fosfo-Akt: n, Erk, fosfo-Erk ja β-aktiini (Cell Signaling Technology, USA). Blotit visualisoitiin käyttämällä ECL prime western blotting detektointireagenssia (Amersham, GE Healthcare Lifesciences, Ruotsi) käyttäen geeliä asiakirjajärjestelmä (Biospectrum 410, UVP) ja Vision Works LS ohjelmisto (CA, USA) B

Entsyymi-immunologinen määritys (ELISA) B

tasot fosforyloitua-Akt ja fosforyloitu-Erk ECC-1-solut käsiteltiin 1 ug /ul väliaine T-ihmisalkion kantasoluihin ja valuuttalisiin kvantitoitiin käyttämällä ELISA sarjat (Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA). Lyhyesti, 96-kuoppaisia ​​levyjä päällystettiin laimennetulla sieppaava vasta-aine yön yli, ennen kuin esto ja inkubaation solulysaateista 2 tunnin ajan. Laimennettu toteamisvasta-ainetta, inkuboitiin 1 tunnin ajan ennen inkubointia johdetun vasta-aineen vielä 30 minuuttia. TMB-substraattia lisättiin sitten kuhunkin kuoppaan 15 minuuttia värin kehittämiseksi ennen kuin päätetään STOP ratkaisu. Absorbanssi luettiin 450 nm aallonpituudella käyttäen spektrometriä (Tecan Systems, CA, USA). Esitetyt tulokset olivat keskimäärin vähintään kolme toistoa normalisoitunut lukemat ECC-1-soluja käsiteltiin väliaineessa, joka sisälsi 2% FBS: ää.

tunnistaminen ja mittaus sytokiinimäärien

sytokiinejä, joita normaalit fibroblastit (T -HESC) ja syöpään liittyvän fibroblasteissa (valuuttalisiin of EC6, 7 ja 11) mitattiin käyttäen Raybiotech Quantibody Human Cytokine Array (Raybiotech, Georgia, USA) valmistajan protokollan. Lyhyesti, elatusaine valmistettiin 72 tuntia viljeltiin fibroblastien kuten edellä on kuvattu. 100 ug proteiinia kustakin fibroblasti eritystä lisättiin vastaaviin array hyvin ja inkuboitiin yön yli 4 ° C: ssa. Kukin kuoppa pestiin, inkuboitiin saatettua vasta-aineen cocktail 2 tuntia huoneen lämpötilassa, pestiin uudelleen, ennen kuin lisättiin Cy3-konjugoitu streptavidiini. Lisäksi seuraavat pesun, fluoresenssi signaali mitattiin käyttäen Agilent High Resolution Microarray Scanner (C-malli), ja raaka-signaalin tiedot poimittiin TIFF kuva GenePixPro 6.1 ennen analysoitiin Q-Analyzer. Sytokiinitasoja kustakin fibroblastien eritystä verrattiin väliaineessa, joka sisälsi 2% FBS (kontrolli). Tiedot esitetään kunkin näytteen olivat keskimäärin fluoresenssin intensiteetti neljästä array kaivoista.

Tilastollinen

Tilastollinen analyysi oli arvioitu erot valvonta- ja koeryhmän suoritettiin käyttäen Studentin

t

-testi IBM SPSS Statistics 20.

P

-arvo 0,05 pidettiin tilastollisesti merkitsevä.

tulokset

eristäminen syöpään liittyvien fibroblastien soluja ihmisen kohdun limakalvon syöpä kudoksiin

Muodosta primaarifibroblastin soluja kohdun limakalvon kudoksista, ihmisen kohdun limakalvon syöpä (EY) kudoksiin (EC6, 7, 11 ja 14) pilkottiin kollagenaasin, seuraa solun eristäminen käyttäen magneettisia helmiä konjugoitu anti-fibroblastien vasta-aine. Sillä EC6 ja EC14, negatiivisesti valitut solut altistettiin sitten anti-CD326 konjugoitujen magneettisten helmien väkevöimiseen epiteelin vastine. Eristetty epiteeli- ja fibroblastisolujen nimettiin ”Ep ’ja’ Fib”, vastaavasti. Kuten kuviossa 1, oli selvä ero morfologia välillä epiteelisolujen (eC6-Ep ja EC14-Ep) ja fibroblastisolujen (EC6-Fib, EC7-Fib, EC11-Fib, EC14-Fib). Epiteelisolujen näytteillä nousi terälehti muotoinen morfologia ja taipumus kasvaa yhdyskunnissa, kun taas stroomasolut näkyy pitkänomainen kara-muotoinen ominaisuuksia.

hematoksyliinillä eosiini (H ja E) värjäys kudosten ja vaiheen kontrasti kuvia perustettu primäärisiä soluja eristettiin kohdun limakalvon syöpä: EC6 (A), EC14 (B), eC7 (C) ja EC11 (D). Suurennos: 100x. Sen jälkeen nämä digestoitiin kollagenaasin ja viljeltiin, ennen epiteeli- ja fibroblastisolu- eristäminen käyttäen CD326 (EpCAM) ja anti-fibroblastien leimatun magneettisiin helmiin.

puhtauden määrittämiseksi eristetyn epiteeli- ja fibroblastisoluviljelmissä me värjätään solut molemmilla epiteelin merkki, Alexa Fluor 647-konjugoitu EpCAM ja fibroblastien merkki, PE-konjugoiduilla CD90-vasta-aineita. Ihmisen kohdun limakalvon adenokarsinooman syöpäsolun linja, ECC-1 osoitti korkea ilmentyminen EpCAM (98%), kun taas ihmisen normaali kohdun limakalvon fibroblastisolulinjan, T-ihmisalkion kantasoluihin osoitti korkean ilmentymisen CD90 (74%) (kuvio 2A, D). Värjäys isotyypin vasta-aineen valvontaa osoitti minimaalista sitoutumista, mikä osoittaa spesifisyyden primaaristen vasta-aineiden (tuloksia ei ole esitetty). Epiteelisolujen eristetty eC6 ja 14 (eC6-Ep ja EC14-Ep) osoittivat kohtalaista ilmentymistä EpCAM (55%) ei ollut näyttöä CD90 ilmaisun, joka osoittaa, että tämä epiteelin viljelmä ole saastuneet fibroblastisoluja (kuvio 2B, C). Sen sijaan fibroblastisolut eristetty EY kudoksista (EC6-Fib, EC7-Fib, EC11-Fib, ja EC14-Fib) oli negatiivinen EpCAM ilmaisun, mutta erittäin positiivinen fibroblastien merkki CD90 (75-81%), mikä osoittaa, että eristetty fibroblastisolut olivat suhteellisen puhdas ja epiteelisolujen saastumisen (kuvio 2E-H). Kaikki ensisijainen käytetyt solut olivat alle passage 10 postitse kulttuurin läheiseen fenotyypin ensisijaiseen kudoksiin.

Virtaussytometrianalyysi ensisijaisen epiteeli- ja fibroblastisolujen eristettiin endometriumsyöpään kudoksista tehtiin leimauksen jälkeen solut CD326-vasta- konjugoidun kanssa AlexaFluor647 ja CD90-vasta-konjugoitu PE. Epiteelin kohdun limakalvon solulinja, ECC-1 (A), ensisijainen epiteelisolut EC6-Ep (B) ja EC14-Ep (C), normaali kohdun limakalvon stroomasolulinja, T-ihmisalkion kantasoluihin (D) ja primaarifibroblastin soluja, EC6-Fib ( E), EC7-Fib (F), EC11-Fib (G) ja EC14-Fib (H).

Molecular luonnehdinta kohdun limakalvon primääriviljelmien

edelleen karakterisoimiseksi eristetty epiteeli- ja fibroblastisoluja, suoritimme kvantitatiivinen RT-PCR-ekspression määrittämiseksi useiden epiteeli- ja fibroblastien markkereita. Epiteelin EC6-Ep ja EC14-Ep solut osoittivat korkean ilmentymisen EpCAM, sytokeratiinista 8 ja E-kadheriinin, joilla on alhainen ilmaus vimentiinista ja α-SMA (kuvio 3A, B). Ilmaisu taso näkyy normalisoitui tasoon GAPDH. Sen sijaan neljä fibroblastisolut eristetään endometriumsyöpään kudoksista (EC6-Fib, EC7-Fib, EC11-Fib ja EC14-Fib) osoittivat suuremman ilmentymä vimentiinista ja α-SMA, joilla on alhainen ilmentyminen EpCAM, E-kadheriinin ja sytokeratiinia 8 (kuvio 3A-C). Nämä tiedot osoittivat, että olimme onnistuneet eristämään suhteellisen puhtaana epiteelisolujen kanssa fibroblasti kollegojensa endometriumsyövän kudoksiin.

Yhteensä RNA alistettiin kvantitatiivisen tosiaikaisen PCR-analyysi epiteelin markkereita (EpCAM, sytokeratiini 8, E -cadherin), fibroblastien markkereita (alfa-sileän lihaksen aktiini (αSMA), vimentiinistä) (A-C), estrogeenireseptorin 1 ja 2 (ER1, 2), progesteronireseptori (PR), progestiinia liittyvä kohdun limakalvon proteiinia (Paep) ja matriksimetalloproteinaasi 1 ja 9 (MMP-1, 9) (D-F). Data, keskiarvo; virhepalkkien S.E.M. Esitetyt tiedot edustavat kolmen erillisen kokeen.

Lisäksi olemme myös päättäneet, että sekä epiteeli- ja fibroblastisolujen EY: kudoksista ilmaisi eriasteista estrogeenin ja progesteronin reseptoreihin (ER1, ER2 ja PR) (Kuva 3D-F), johdonmukainen sen havainnon, että EY ovat hormonien reagoivia kasvaimia. Mittasimme mRNA ilmaus kolmeen yhteisesti erittyvien proteiinien kohdun limakalvon, progestiinia liittyvä kohdun limakalvon proteiini (Paep) ja matriksimetalloproteinaasi 1 ja 9 (MMP-1, 9) näissä soluissa. Kuten on esitetty kuviossa 3D-F, Paep lähinnä ilmaisseet fibroblastit, ja suurempi MMP-1-ekspressiota havaittiin verrattuna MMP-9 sekä epiteeli- ja fibroblastisolujen. Yhdessä meidän tiedot viittaavat vahvasti siihen, että nämä ensisijainen epiteeli- ja fibroblastisoluja säilyttäen

in vivo

fenotyypit.

Differential vaikutuksia kohdun limakalvon fibroblastien eritys endometriumin syöpäsolujen

oli aiemmin osoitettu, että eritteiden normaalin kohdun limakalvon fibroblastisoluja oli kasvua estävä, että kohdun limakalvon syöpä-solulinjasta, Ishikawa-soluja [26]. Johdonmukaisesti, elatusaine normaalista kohdun limakalvon fibroblasti T-ihmisalkion kantasoluihin solulinja inhiboivat ECC-1 ja HEC-1A, annoksesta riippuvalla tavalla (kuvio 4A, B). 2 ug /ul, havaitsimme merkittävää 51% ja 69% kasvun inhibitio in ECC-1 ja HEC-1A, vastaavasti. Vastaavasti, ensisijainen kohdun limakalvon syöpä soluja, EC6-Ep ja EC14-Ep olivat myös kasvua inhiboivat T-ihmisalkion kantasoluihin elatusaine (EC6-Ep: 60%; EC14-Ep: 67%) (kuvio 4C, D).

ECC-1 (A) ja HEC-1A (B) solulinjojen ja EC6-Ep (C) ja EC14-Ep (D) ensisijainen endometriumsyöpään solut testattiin elatusainetta valmistettiin syöpään liittyvän fibroblastit (EC6-Fib , EC7-Fib, EC11-Fib ja EC14-Fib) ja normaalin kohdun limakalvon fibroblastisolulinjassa (T-ihmisalkion kantasoluihin) 72 tuntia. Solujen elinkelpoisuus tutkittiin käyttäen MTT-määritystä ja normalisoitiin ohjaus- (Media, joka sisältää 2% FBS). Valuuttalisiin ovat keskiarvoja ja kaikki neljä syöpään liittyvän fibroblasteja testattu. Data, keskiarvo; virhepalkkien S.E.M. *,

P

0,005 ;. **,

P

0,0001. Esitetyt tiedot edustavat kolmen erillisen kokeen.

määrittämiseksi ja vaikutusten vertailemiseksi valuuttalisiin eritteistä kohdun limakalvon syövän soluissa, me korjattuna väliaine 72 tuntia viljellään fibroblastisoluja, ja sitten käsiteltiin ECC-1 ja HEC-1A ihmisen kohdun limakalvon syövän solulinjat 72 tuntia. Mielenkiintoista, elatusaine syöpään liittyvien fibroblastit (EC6-Fib, EC7-Fib, EC11-Fib ja EC14-Fib) aiheuttama erottuvalla vaikutus: kasvaimet sekä ensisijaisen kohdun limakalvon syövän solut (eC6-Ep ja EC14-Ep) ja kaupallinen kohdun limakalvon syövän soluja (ECC-1 ja HEC-1A) on merkittävästi parannettu annoksesta riippuvalla tavalla (kuvio 4A-D). Suurempaa vaikutusta nähtiin ECC-1 ja HEC-1A solulinjojen kuin primaariviljelmissä, eC6-Ep ja EC14-Ep. Niistä valuuttalisiin, EC-11-Fib osoitti eniten kasvua edistävät vaikutukset, jotka vaihtelevat 135%: sta 274%: n kasvu verrattuna käsittelemättömiin soluihin. Kun nämä yksittäiset CAF vaikutuksia yhdistettiin (merkitty valuuttalisiin), oli merkittävä ero prosentin solukasvun valuuttalisiin ja T-ihmisalkion kantasoluihin 2 ug /ul hoitoon (

P

0,05) (kuvio 4A -D).

sulje pois sitä mahdollisuutta, että valuuttalisiin-kasvua edistäviä vaikutuksia johtuivat meidän soluviljelymenettelyistä, me eristetty fibroblasteista epätyypillinen hyperplasia kudos, hyvänlaatuinen kohdun limakalvon kunnossa, käyttäen samanlaista lähestymistapaa. Eristetty fibroblastit (EH-Fib) osoitti samanlaista fibroblastisia morfologia

in vitro

, ja ilmaisi korkea CD90 (65%) (kuva 5A-C). Käyttäen elatusaine näistä soluista, tutkimme niiden vaikutukset soluproliferaatioon sekä syöpäsolun linjat (ECC-1 ja HEC-1A) ja ensisijaisen epiteelisolut (eC6-Ep ja EC14-Ep). Kuten kuviossa 5D, EH-Fib elatusaine ei vaikuttanut leviämisen ECC-1 ja HEC-1A soluissa. Kuitenkin, kun testattiin ensisijainen epiteelisoluissa eC6-Ep ja EC14-Ep, EH-Fib esti kasvua annoksesta riippuvaisella tavalla, ja keskimäärin 69% 2 ug /ul pitoisuus (kuvio 5D). Tämä data viittaa siihen, että kasvua edistävät vaikutukset by valuuttalisiin on erityinen, ja ei johdu valinta kokeellista menettelyä.

hematoksyliinillä ja eosiinilla (A) ja vaiheen kontrasti kuvan (B) fibroblastisolujen eristetty ihmisen epätyypillinen hyperplasia kudos (EH-Fib); Suurennos, 100x. (C) Virtaussytometrianalyysi EH-Fib värjätään epiteelin merkki CD326-Alexa Fluor 647 ja fibroblasti merkki CD90-PE. (D) Solujen elinkelpoisuus määritys vaikutusten määrittämiseksi EH-Fib elatusaine kohdun limakalvon syövän solulinjoissa (ECC-1 ja HEC-1A) ja ensisijaisen epiteelisolut (EC6-Ep ja EC14-Ep) 72 tunnin kuluttua hoidosta. Data, keskiarvo; virhepalkkien S.E.M. *,

P

0,01. Esitetyt tiedot edustavat kolmen erillisen kokeen.

aktivoituminen PI3K /Akt ja MAPK /Erk väyliä syöpään liittyvän fibroblasti-välitteisen endometriumsyöpään soluproliferaatiota

Valaistaan ​​mekanismin taustalla kasvua edistävät vaikutukset valuuttalisiin eritys EY, määritimme aktivoituminen PI3K /Akt ja MAPK /Erk, kaksi suurta eloonjäämisreittejä osallisina kohdun limakalvon syöpään. Yhdenmukaisia ​​aiempien tutkimuksen [27], käsittely normaalien fibroblastien T-ihmisalkion kantasoluihin-elatusaine lyhensi fosfo-Akt ja fosfo-Erk proteiinin ilmentymistä ECC-1-soluissa, kuten on esitetty Western blot ja ELISA-määritykset (kuvio 6A, B). Sen sijaan, fosfo-Akt-proteiinia tason kohtalaisesti koholla, kun ECC-1-soluja käsiteltiin EC6-Fib, EC7-Fib, EC11-Fib ja EC14-Fib (Kuva 6A, B). Lisäksi, valuuttalisiin-käsitelty ECC-1-soluissa osoitettiin myös lisääntynyt taso fosfo-Erk, verrattuna saaneilla ohjaus media (kuvio 6A, B).

(A) Western blot -analyysi phosphorylated- Akt (Ser473) ja -Erk proteiinin ilmentymistä ECC-1 soluissa, sen jälkeen käsiteltiin joko normaali kohdun limakalvon fibroblasti T-ihmisalkion kantasoluihin soluja tai syöpään liittyvään fibroblastisoluja (EC6-Fib, EC7-Fib, EC11-Fib ja EC14-Fib). Densitometrian analyysi verrattuna suhteellisen ilmentymistason p-Akt ja p-Erk niiden kokonaisproteiinin tasolla. (B) kvantitatiivinen analyysi fosforyloitua-Akt (Ser473 ja Thr308) ja fosforyloitua-Erk tasolla ECC-1-soluissa, kun käsiteltiin joko T-ihmisalkion kantasoluihin tai valuuttalisiin, verrattuna soluihin, jotka käsiteltiin kontrolli (väliaineessa, joka sisälsi 2% FBS: ää). ECC-1 (C) ja EC6-Ep (D) soluja käsiteltiin joko PI3K reitti estäjä (LY294002) tai Erk-reitin estäjä (U0126), kun läsnä syöpään liittyvien fibroblasteja elatusaine (1 ug /ul) ja 72 tuntia. Esitetyt tiedot ovat solujen elävyyden jälkeen normalisoitu ohjaus (media, joka sisälsi 2% FBS). Data, keskiarvo; virhepalkkien S.E.M. *,

P

0,05; **,

P

0,0001. Esitetyt tiedot edustavat kahta toisistaan ​​riippumatonta koetta.

tutkimiseksi edelleen toiminnallista roolia PI3K /Akt ja MAPK /Erk väyliä valuuttalisiin välittämän solujen lisääntymistä, me seuraavaksi käsitellään ECC-1 ja EC6-Ep solut PI3K estäjä (LY294002) ja Erk estäjä (U0126) läsnäollessa eC6-Fib ja EC11-Fib elatusaine 72 tuntia. Sekä LY294002 ja U0126 merkittävästi vähentää valuuttalisiin-välitteisen soluproliferaation näissä soluissa (

P

0,0001) (kuvio 6C, D). Erityisesti U0126 aiheutti suurempaa kasvua estävä vaikutus EY soluissa käsitelty EC11-Fib elatusaine. Vaikutukset LY294002 ja U0126 inhiboimaan kohdun limakalvon syövän solujen proliferaatiota vasta ilmeistä läsnä valuuttalisiin erityksen media, koska nämä inhibiittorit minimaalisesti vaikuttaa solujen lisääntymisen hallinnassa media (kuvio S1). Nämä inhibiittorit myös aiheutti samanlaisia ​​vaikutuksia muihin EY soluihin, HEC-1A ja EC14-Ep (Kuva S1). Nämä tiedot viittaavat siihen, että aktivoinnin tilan PI3K /Akt ja /tai MAPK /Erk reitit voi olla keskeinen asia, jonka fibroblasteista sekä normaali- että syöpä säätelevät kohdun limakalvon syöpä solujen lisääntymisen.

Arvioimme lisäksi, onko rapamysiini, joka on tunnettu PI3K loppupään estäjä, voi olla kliinisesti käyttökelpoinen kääntämään valuuttalisiin välittämä EY solujen lisääntymistä. Kun läsnä on EC11-Fib elatusaine, hoitoon rapamysiinin 72 tuntia tehokkaasti inhiboi ECC-1 ja EC6-Ep-solujen lisääntymisen (

P

0,0001) (Fig. 7A, B). Korkeimmalla tutkitulla annoksella (2 uM), rapamysiini vähensi ECC-1 solut 180% (väliaine hoito yksinään) 40% (väliaine ja rapamysiini hoito) (

P

0,0001), kun taas vähäinen inhibitio havaittiin, kun soluja viljeltiin ohjaus media (7A, B). Samanlainen tulos havaittiin vaikutuksia rapamysiinin muihin EY soluihin, HEC-1A ja EC14-Ep (kuva S2). Käyttämällä anneksiini V merkintöjä, olemme edelleen todenneet, että rapamysiini esti valuuttalisiin välittämä EY soluproliferaatiota

kautta

apoptoosin induktio (kuvio 7C-E). Hoito ECC-1 1 ug /ul EY11-Fib elatusaine 72 tuntia ei vaikuttanut merkitsevästi prosenttiosuutta apoptoottisten solujen;