Krooninen sairaus

tiivistelmä

Tulehdus näyttelee suora rooli peräsuolen syöpä (CRC) eteneminen; kuitenkin molekyylimekanismeja vastuussa tästä vaikutus on epäselvä. Tulehdus indusoitiin syklo-oksigenaasi 2 (COX-2), entsyymiä, jota tarvitaan tuotannon Prostaglandiini E2 (PGE

2), voivat edistää paksusuolen syövän vähentämällä ilmentyminen tuumorisuppressorigeenin ohjelmoidun solukuoleman 4 (PDCD4). Kuten PDCD4 on myös suora kohde onkogeenin mikroRNA-21 (miR-21) tutkimme suhde COX-2 ja miR-21 reittejä peräsuolen syövän etenemisessä. Geeniekspressioprofiili kasvaimen ja pariksi normaali limakalvo 45 CRC potilaista osoittivat, että säätely ylöspäin COX-2 ja miR-21 kasvainkudoksessa korreloi huonompi Dukes ’vaiheessa. In vitro tutkimukset koolonadenokarsinoomasoluissa paljasti, että hoito selektiivisen COX-2-estäjä NS398 merkittävästi vähentynyt miR-21 tasoa (p = 0,0067) ja nousi PDCD4 proteiinin tasot (p 0,001), kun taas käsittely PGE

2 ylä- säännelty miR-21 lauseke (p = 0,019) ja alassäädetty PDCD4 proteiinia (p 0,05). Nämä havainnot osoittavat, että miR-21 on osa COX-2 tulehdus polku ja että tämän reitin edistävää pahenemista taudin vaiheessa peräsuolen syövän indusoimalla kertyminen PGE

2 ja lisäämällä ilmentymistä miR-21 mistä seuraa vaimennussäätely tuumorisuppressorigeeniä PDCD4.

Citation: Peacock O, Lee AC, Cameron F, Tarbox R, Vafadar-Isfahani N, Tufarelli C, et ai. (2014) tulehdus ja MiR-21 Keinot Toiminnallisesti vuorovaikutuksessa downregulate PDCD4 kolorektaalisyövässä. PLoS ONE 9 (10): e110267. doi: 10,1371 /journal.pone.0110267

Editor: Kalpana Ghoshal, Ohio State University, Yhdysvallat

vastaanotettu: 15 heinäkuu 2014; Hyväksytty 10 syyskuuta 2014; Julkaistu: 13 lokakuu 2014

Copyright: © 2014 Peacock et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Data Saatavuus: Tällä kirjoittajat vahvistavat, että kaikki tiedot taustalla olevat havainnot ovat täysin saatavilla rajoituksetta. Kaikki asiaankuuluvat tiedot ovat paperi- ja sen tukeminen tiedot.

Rahoitus: tuettiin lahjoituksena Derby peräsuolen syövän Fund. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

peräsuolen syöpä on kolmanneksi yleisin syy syöpään liittyvät kuolemat maailmanlaajuisesti [1]. Noin puolet kaikista potilaista on diagnosoitu kolorektaalisyöpä lopulta kuolee kunnossa [2]. Viiden vuoden elossaolo on noussut noin 50-55%, mikä johtuu pääasiassa aiempaan diagnosointiin ja parempaan räätälöinti hoitojen [3]. Kuolema peräsuolen syöpä voidaan estää varhaisessa vaiheessa sairauden havaitsemista, mutta valitettavasti se on usein havaitaan pitkälle kun ennuste on huonompi [4]. Ennusteen peräsuolen syöpä potilailla liittyy tautiin vaiheeseen aikaan diagnoosin.

Tarkka ”laukaista” kehittämiseen peräsuolen syöpä on vielä tuntematon. Vuonna 1990, sarja morfologinen vaiheet tunnetaan normaali limakalvo-adenooma-adenokarsinooma sekvenssin peräsuolen syövän vuoksi geneettiset muutokset on ehdottanut [5]. Kuitenkin monet geneettisiä tapahtumia johtaa kehitystä Satunnaista kolorektaalisyövän; mikään yksittäinen tapahtuma esiintyy kaikissa syövissä ja sen vuoksi yksikään kuvio on sovellettavien kasvain [6]. Siksi ymmärrys erityisiä geneettisiä tapahtumia, jotka esiintyvät peräsuolen syövän synnyn voi olla merkittäviä vaikutuksia diagnoosi, ennuste ja mahdollisesti geeniterapian tulevaisuudessa.

on ollut viime aikoina elpyminen mielenkiinnolla välistä syy-yhteyttä tulehdus ja syöpään. Epidemiologiset tutkimukset ovat osoittaneet, että krooninen tulehdus voi altistaa yksilön eri syöpätyyppien [7]. On arvioitu, että 15%: sta 20% kaikista syöpäkuolemista maailmanlaajuisesti sidoksissa taustalla krooniset infektiot ja tulehdusvasteesta tällaiset henkilöt [7]. On näyttöä eläinkokeista ja havaintoja ihmisissä että päivittäinen aspiriini voi olla tehokas estämään useita yleisimmistä syövistä [8], [9]. Tämä on vahvistettu äskettäin seurantatutkimuksia potilaiden rekrytoitiin alunperin satunnaistettua tutkimusta päivittäisten aspiriinia verrokkiin ehkäisyssä verisuonitapahtumien [10] – [12]. Näissä tutkimuksissa kohdentaminen aspiriinia johti 40% vähennys syöpäkuolemista yli 5-vuotiaille lähtien [11] ja vähentää pysyvästi syöpään liittyvä kuolema 20 vuoden seurannassa [10], [12]. Havainnoivat tutkimukset ovat myös osoittaneet, että aspiriinin käyttöön liittyy alentunut etäinen etäpesäke ja toistuminen yhteistä adenokarsinooman [13] – [15], mikä viittaa siihen, että tulehdus voi olla tärkeä rooli etenemistä sekä syövän kehittymiseen.

yksi mahdollinen syy havaitut chemo ennalta ehkäiseviä vaikutuksia aspiriinin peräsuolen syöpä on sen kyky vähentää kasvaimen kehitystä syklo 2 (COX-2) [16]. On yhä enemmän näyttöä yhdistää proinflammatoristen entsyymi COX-2 kanssa kehittymistä ja etenemistä peräsuolen syöpä. COX-2 indusoituu paksusuolen epiteelin aktiivinen tulehduksellinen suolistosairaus (IBD) [17] ja sen ylössäätöä johtaa kohonneet prostaglandiinin (PG), erityisesti PGE

2, joka on alavirtaan välittäjäaine COX-2 ja edistää monet karsinogeenisia polkuja kuten solujen lisääntymisen, apoptoosin estämisestä ja angiogeneesin [18]. Tämä edistää krooninen tulehduksellinen prosessi orchestrating kasvaimeen tukeva microenvironment edelleen yhdistää tulehdus syövän syntymistä.

Mekanistinen kytkös tulehdus ja syöpä ei ole vieläkään täysin selvä. Lisääntyvä todistusaineisto viittaa siihen, että mikro-RNA: t (miRNA) osallistuvat säätelyyn tulehduksellisten prosessien ja ovat väärin säädellystä in tulehdustiloja [19], kuten haavainen paksusuolen tulehdus [20]. Siksi miRNA säätelyhäiriötä on potentiaalinen molekyylimekanismiksi tulehduksellinen väyliä välittäjänä syövän kehittymisen ja etenemisen [21]. Erityisesti ekspressiotasot miR-21 kasvatetaan aktiivista tulehdusta haavainen paksusuolen tulehdus, joka saattaa liittyä lisääntynyt syöpäriskiä kehitystä tämän ehdon [22]. Up-regulation miR-21 on myös raportoitu muissa tulehtunut valtioissa lukien allergiset hengitysteiden tulehdus [23], tulehduksellinen ihosairaudet [19] ja

Helicobacter pylori

liittyy mahasyövän [24]. miR-21 on hiljattain osoitettu olevan aito onkogeeni pre-B-solulymfooma [25] ja sen havaittiin olevan yli-ilmentynyt useimmissa kasvaintyypeissä [26]. miR-21 on voimakas stimulaattori kudoksen ja verisuonten invaasio kolorektaalisyövässä ja nämä vaikutukset näkyvät osittain välittyy sen kyky estää käännös yhden miR-21 kohdegeenien, ohjelmoitua solukuolemaa 4 (PDCD4) [27]. Viime aikoina tutkimus on myös osoittanut merkittäviä alas-säätely PDCD4 aktiivisessa IBD verrattuna aktiivinen IBD, joka myös korreloi säätely ylöspäin miR-21 [28], jotka edelleen tukevat välinen yhteys tulehduksen, miR-21 ja syövän syntymistä.

tavoitteena oli tutkia, onko funktionaalinen vuorovaikutus välillä on COX-2 (tulehdusta entsyymin lisääntynyt ekspressio CRC) ja miR-21 (onkogeeninen miR yliekspressoituu CRC) johtavia reittejä downregulation kasvaimen vaimennin PDCD4 kolorektaalisyövässä ei liity edelliseen krooninen tulehduksellinen sairaus.

Materiaalit ja menetelmät

Ihmiskudokset

Tämä tutkimus sai eettinen hyväksyntä Derbyshire Research eettinen komitea kokoelma peräsuolen syövän kudoksen ja vastaaviin normaaleihin limakalvo potilailta, joille tehtiin kirurginen resektio peräsuolen syövän elo-joulukuussa 2010 Royal Derby Hospital, Derby, UK.

Kaikki potilaat diagnosoidaan peräsuolen syöpä keskusteltiin Royal Derby Hospital peräsuolen monitieteellinen Meeting jälkeen radiologisia lavastus, ja ne katsotaan sopii resektoimalla parantava tarkoitus olivat oikeutettuja pääsemään. Kirjallinen suostumus otettiin ja potilas ei pysty tai ei halua tarjota tietoisen suostumuksen jätettiin tutkimuksesta, koska olivat peruuttamista suostumusta missään vaiheessa.

Cell Culture

HCA-7 solulinja saatiin Health Protection Agency Culture Collection (HPACC, Porton Down, UK). Soluja viljeltiin Dulbeccon modifioidussa Eagle Media (DMEM) (GIBCO, Paisley, UK), johon oli lisätty 10% naudan sikiön seerumia (Fisher Scientific, Loughborough, UK), 2 mM L-glutamiinia (Sigma-Aldrich, Poole, UK), penisilliiniä ( 50 yksikköä /ml) ja streptomysiiniä (50 ug /ml) (Sigma-Aldrich). Soluja viljeltiin 75cm

3 purkautuneet pulloihin (TSZ Scientific, Framingham, MA, USA) kostutetussa yrityshautomoiden 37 ° C: ssa 5% CO

2 (Sanyo, Osaka, Japani).

Cell Line Transfektiot ja hoitoja

solut ympättiin 500000 solua /kuoppa 6-kuoppaiselle levylle ja niitä inkuboitiin 37 ° C: ssa, 5% CO

2, kunnes ne saavuttivat 70% konfluenssin.

mir-21-inhibitiokokeet, solut transfektoitiin miR-21-estäjä (100 nM) tai negatiivisen salattu ohjaus (100 nM) (miRIDIAN, Dharmacon Lafayette, CO, USA), käyttäen Dharmafect 2 lipidiä transfektioreagenssia (Dharmacon Lafayette, CO, USA) valmistajan ohjeiden mukaisesti.

COX-2-inhibition, soluja käsiteltiin seerumittomassa alustassa, joka sisälsi ohjaus (0,1% DMSO) tai 100 uM NS398 (selektiiviset COX-2-estäjän, Cayman Chemical, Michigan , USA) 72 tunnin ajan. Prostaglandiini E

2 (PGE

2) käsittely, soluja kasvatettiin 24 tunnin ajan seerumittomassa väliaineessa, joka sisälsi DMSO: ta ajoneuvon yksin tai 1 uM PGE

2 siten, että lopullinen DMSO-konsentraatio sekä olosuhteissa oli sama (0,1%). Yhdistetyn miR-21 inhibition ja PGE

2 hoitoa, PGE

2 lisättiin viljelmään 48 tunnin kuluttua miR-21-estäjä transfektion ja soluja viljeltiin vielä 24 tunnin ajan.

RNA analyysit

Yhteensä-RNA uutettiin käyttäen TRI-reagenssia valmistajan ohjeiden protokollan (Sigma-Aldrich) ja kvantitoitiin käyttäen Nanodrop spektrofotometrillä (Thermo Fisher Scientific, Wilmington, DE, USA).

miR -21 tutkimukset, yhteensä 6 ng kokonais-RNA: ta käytettiin kääntää puhtaaksi miR-21 ja RNU44-ohjain cDNA jälkeen TaqMan miRNA-protokollan (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA), käyttäen hiusneula alukkeita suunnattu miR-21 ja RNU44 kontrollina lämpösyklilaitteessa (GeneAmp PCR System 9700, Applied Biosystems), 30 minuutin ajan 16 ° C: ssa, 30 min 42 ° C: ssa, 5 min 85 ° C: ssa. Reaaliaikainen kvantitatiivinen polymeraasiketjureaktio suoritettiin sitten käyttäen miRNA erityisiä-TaqMan-koettimella määritykset (miR-21, ID 000397; RNU44, ID 001094; Applied Biosystems), joka Chromo4 lämpösyklilaitteessa (Bio-Rad Laboratories LTD, Hemel Hempstead, UK). miR-21 ekspressiotasot normalisoituivat RNU44 ja lasketaan käyttäen 2

-ΔΔCt menetelmä [29] käyttämällä kaupallisesti saatavilla normaalia paksusuolen RNA kalibroijana.

COX-2

ja

PDCD4

analyysit, 30 ng kokonais-RNA muutettiin cDNA sattumanvaraisia ​​heksameerejä käyttäen TaqMan suuren kapasiteetin cDNA käänteistranskriptiolle protokolla (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Reaaliaikainen PCR: t suoritettiin valmistajan ohjeiden on Chromo4 reaaliajassa cycler (Bio-Rad Laboratories Ltd) käyttäen kaupallisesti saatavissa 20x TaqMan määritykset (Applied Biosystems) ja

PDCD4

(Hs00377253_m1) ja

COX 2

(PTGS2 – Hs00153133_m1), rinnalla ohjaus geenit

GAPDH

(Hs02258991_g1),

PGK1-

(Hs00943178_g1) ja

HPRT

(Hs01003267_m1). Kokeita solulinjoissa, kvantitointi mukaisesti suoritettujen MIQE (Vähintään Tietoa julkaiseminen Quantitative Real-Time PCR Kokeet) suuntaviivat [30] suhteen geometrinen keskiarvo viitteen geenien

GAPDH

,

PGK1-

,

HPRT

käyttäen genex ohjelmistoa (MultiD Analysis, Göteborg, Ruotsi). Vähäisen näytteen määrät, ihmisen kudoksissa ilmentyminen kvantifioitiin suhteen

GAPDH

yksin kuin edellä miR-21 analyysit.

Protein analysoi

Protein uuttamisen ja kvantifiointiin olivat suoritettiin, kuten aiemmin on kuvattu [31]. Western-blottaus suoritettiin käyttäen loading kontrolli anti-beeta-aktiini-vasta-aine (1:1000 laimennus; Abcam, Cambridge, UK) yhdistelmänä anti-PDCD4-vasta-ainetta (1:500 laimennus, Sigma-Aldrich) tai anti-COX-2 (1 :1000 laimennus; Abcam). Anti-kani-IgG-vasta-konjugoitu alkaliseen fosfataasiin käytettiin sekundaarisena vasta-aineena (1:30,000 laimennus; DAKO, Ely, UK) havaitsemiseksi primaarisen vasta-aineen sitoutumisen. Immunokompleksit visualisoitiin tehostetulla kemiluminesenssilla käyttämällä ECL -kittiä (Bio-Rad) mukaan valmistajan protokollaa. Chemidoc järjestelmää käytettiin kaapata kuvia ja Määrä One (Bio-Rad) ohjelmistoa käytettiin kvantifiointiin yhtyeiden intensiteettiä.

Elisa Analysis

PGE

2 tasossa mitattiin media HCA-7 käsiteltyjen ja käsittelemättömien solujen avulla PGE

2 Elisa havaitseminen kit (Cayman Chemical, Ann Arbor, Michigan USA) mukaan valmistajan ohjeiden. Levyt luettiin lautasella photocytometer 450 nm (Wallac 1420 Victor, Perkin-Elmer, Waltham, MA, USA).

Tilastollinen analyysi

Tilastollinen analyysi suoritettiin käyttäen GraphPad Prism versio 5.03 ( GraphPad Software, La Jolla, CA, USA). Kolmogorov-Smirnov testi osoitti kaikki kudosnäytteen tiedot ovat ei-parametriset ja kaikki solulinja tiedot ovat muuttujien. Siksi potilaan tiedot ilmaistaan ​​medians ja alue, kun taas solulinja tiedot ilmoitetaan keskiarvona ja keskivirhe keskiarvon. Wilcoxonin allekirjoitettu-rank-testiä (tulospareille); Mann-Whitney U-testi (pariton) ja Kruskall-Wallisin testiä käytettiin vertaileva analyysi potilaan tiedot. Parittaiset t-testiä (pariksi data); t-testin (parittomia) ja ANOVA testiä käytettiin vertaileva analyysi solulinjan tiedot.

Tilastollinen merkittävyys määritettiin p≤0.05 sekä potilaan ja solulinjan tiedot.

Tulokset

lisäys miR-21 suoraan liittyy kasvaa COX-2: n mRNA tasojen CRC potilailla

Me tehdään meidän tutkimuksen ensisijainen peräsuolen syövän kudoksen ja pariksi normaali limakalvo kerättiin elo-joulukuussa 2010 45 valittavia potilaalla on satunnaisia ​​tapauksia CRC. Prospektiivisesti ylläpidetään tietokanta asuttuja potilaan demografiset, neoadjuvant hoitojen ja kasvainten ominaisuuksiin. Kasvain histopatologia oli luokiteltu kansallisen vähimmäismäärää tietoja ja peräsuolen syövän suunnitellut Royal College of patologi, UK [32]. Yksikään potilas ei kuulu tai vetäytyneet tutkimuksesta ja kukaan ollut hyvänlaatuinen sairaus. Mediaani-ikä oli 69 (vaihteluväli 51-88) vuotta ja suurin osa oli miehiä potilaista. Neljä potilasta, joilla peräsuolen syöpä, jotka saivat neo-adjuvanttia kemosädehoidon otettiin myös perustuu aiempiin tutkimuksiin, jotka osoittavat, että ilmentyminen miR-21 vastaa välillä säteilevän ja ei-säteilevän kudoksen [33]. Kaikilla potilailla oli täydellinen resektio ja histologia vahvistanut kaikki kasvaimet olivat adenokarsinoomat. (Taulukko S1 ja S2 File S1) B

Käyttäen reaaliaikaisella RT-PCR tutkimme ilmaus

COX-2

ja miR-21 kasvainkudoksissa verrattuna normaaliin limakalvolle meidän kohortissa CRC potilailla. Suhteellinen ilmentyminen miR-21 oli merkitsevästi säädellään ylöspäin CRC kudoksessa verrattuna vastaaviin normaaleihin limakalvo (p 0,0001, Wilcoxonin parittaista allekirjoitettu rank-testi, Fig. 1A). Lisäksi ekspressiotasot miR-21 korreloivat yleisesti käytetty kliininen-patologiset ominaisuudet CRC (taulukko 1). Korkeampi ilmentymä miR-21 kasvainkudoksissa korreloi merkitsevästi huonompi Dukes vaiheessa (p 0,0001, Kruskall-Wallisin testiä, Fig. 1 B), imusolmuke etäpesäke (p 0,0001, U-testi, Fig. 1 C) , ja syvyys kasvaimen invaasion (pT vaiheessa; p 0,0001, U-testi, Fig. 1 D). Nämä havainnot ovat yhtäpitäviä aikaisempien raporttien [34], [35], ja vahvistavat, että miR-21 on säädellään ylöspäin CRC yhä ekspressiotasoja korreloivat lisääntynyt taudin vakavuuteen.

sarake bar kaavioita osoittavat mediaani ja viikset osoittaa IQR Mir-21 ilme. Huomaa, että merkittävä kasvu miR-21 ilmentymistä havaitaan kasvaimissa, mikä lisää edelleen pahenemista vaiheessa imusolmuke osallistuminen ja syvyys hyökkäystä. Tilastollinen merkittävyys laskettiin käyttäen Wilcoxonin-rank testi A Kruskall-Wallis testi B, ja U-testi C ja D.

suhteellinen ilmentyminen

PDCD4

oli merkitsevästi säädellä vähentävästi CRC kudoksissa verrattuna vastaaviin normaaleihin limakalvo (p 0,0001, Wilcoxonin parittaista allekirjoitettu rank-testi, Fig. 2A). Kuitenkaan ollut mitään korrelaatiota

PDCD4

ilmentymistä kasvain kudosten ja Dukes ’vaiheessa, jossa ilmaisun Dukes’A vaihe on jo merkittävästi vähentynyt verrattuna normaaliin kudokseen ja enää laskua nähty edenneessä vaiheessa ( kuva 2B). On epätodennäköistä, että havaitut downregulation

PDCD4

RNA-tasolla aiheuttaa miR-21, koska tämä mikro-RNA pyrkii estämään PDCD4 mRNA käännös sijaan aiheuttaa sen hajoamisen tai transkription repression [27]. Koska kaikki potilaat tutkituista suorittaa pahanlaatuiset kasvaimet osoitettua Dukes ’vaiheessa, tiedot viittaavat siihen, että aikana eteneminen maligniteetin kasvavia määriä miR-21 johtaa inhibitioon käännöksen jo alentuneesta

PDCD4

mRNA. Etiikka rajoitteet esti meitä analysoimalla PDCD4 proteiinin tasot näiden potilaiden vahvistaa tämän hypoteesin ja meidän toistui että

in vitro

tutkimuksissa saada mekanistisiin oivalluksia (katso seuraava kohta).

Yhdistetty suhteellinen ilmentyminen PDCD4 ja COX-2 analysoitiin primaarikasvaimen versus täsmäsi vieressä normaali limakalvo (n = 45, A ja C vastaavasti), ja tavanomaisessa (N) ja kasvaimen (T) kudoksia Dukes A (n = 9), B (n = 23) ja C (n = 13) vaiheissa (B ja D vastaavasti). Pylväs pylväsdiagrammi osoittaa mediaani ja viikset osoittaa IQR mRNA ilmaisun. Tilastollinen merkittävyys laskettiin käyttäen Wilcoxonin-rank testi A ja C; Kruskall-Wallis testi B ja D. Huomaa, että

PDCD4

on vaimentua kasvaimen vs. normaali, mutta eroja ei nähty jäljellä ilmentyminen kasvaimissa eri herttuoiden vaiheissa. Sen sijaan

COX-2

taso kasvaa kasvainten ja sairauteen vaiheessa.

Mielenkiintoista, suhteellinen ilmentyminen

COX-2

mRNA oli merkittävästi säädellään ylöspäin tuumorikudoksista verrattuna niiden vastaaviin normaaleihin limakalvo (p 0,0001, Wilcoxonin parittaista allekirjoitettu rank-testi, Fig. 2C). Lisäksi samalla tavalla mitä havaittiin miR-21, suhteellinen ilmentyminen

COX-2

mRNA kasvainkudoksissa korreloi merkitsevästi huonompi Dukes vaiheessa (p 0,0001, Kruskall-Wallisin testiä, Fig. 2D) . Koska miR-21 ja tulehdus ovat molemmat on osoitettu vähentävän PDCD4 proteiinin tasot [27], [36], joka on mahdollinen tulkinta Näiden havaintojen on, että kasvu miR-21 ja

COX-2

voi olla toiminnallisesti liittyviä ja että ne voivat johtaa downregulation PDCD4 yhteisellä reitin.

HCA-7-solut ovat sopiva järjestelmä analysoimiseksi suhdetta miR-21 ja COX-2 yliekspressio CRC

jotta voitaisiin edelleen tutkia mahdollisuuksia toiminnallinen suhde COX-2 ja miR-21 alas-säätely PDCD4 CRC me uusiutunut kohteena on

in vitro

soluviljelmäjärjestelmässä. Valitsimme ihmisen koolonin adenokarsinoomasolulinja HCA-7, joka on eristetty Dukes B kasvain [37], koska se on korkea endogeenisten tasojen COX-2 [38] ja hoidon jälkeen COX-2-estäjän NS398 lisää ekspressiota

PDCD4

[39]. Sen määrittämiseksi, onko HCA-7-solut ovat hyvä järjestelmä, jossa tutkia välinen toiminnallinen suhde miR-21: n ja COX-2 polkuja, ensin sen selvittämiseksi, ovatko miR-21 ilmentyy ja on vastuussa

PDCD4

downregulation näissä soluissa. Jotta nämä käytimme RT-PCR tutkia tasot miR-21 hoitamattomien HCA-7 soluissa tai soluissa, joita käsiteltiin 100 nM on miR-21-estäjän tai scramble ohjaus perustuu julkaistu teos osoittaa, että tämä pitoisuus on ei-sytotoksinen ja tehokas estävä tutkimuksissa [40].

Huomasimme, että miR-21 ilmentyy korkeilla tasoilla HCA-7-soluissa ja nämä tasot eivät vaikuta käsittelemällä scramble pieniä RNA: t, mutta ne laskivat merkittävästi (p 0,0001 , pariton t-testi), kun 72 tuntia hoidon tietyn miR-21 pieniä RNA-inhibiittoria (Fig. 3A). Ei ole merkittäviä eroja PDCD4 mRNA-tasot on havaittu kvantitatiivisen RT-PCR-menetelmällä tahansa hoidon olosuhteissa (Fig. 3B); sitä vastoin lisääntynyt merkittävästi (p = 0,002, pariton t-testi) in PDCD4 havaittiin proteiinin tason Western blot MIR-21-estäjä käsitellyissä soluissa verrattuna hoitamattomiin tai scramble kontrolli käsitellyissä soluissa. Nämä havainnot ovat yhdenmukaisia ​​miR-21 toimii estämään translaatiota PDCD4 mRNA sijaan suuntaa hajoamista ja vahvistavat, että miR-21 on rooli PDCD4 downregulation in HCA-7-soluissa. Näin ollen sekä COX-2 ja miR-21 polkuja edistää downregulation PDCD4 in HCA-7-soluissa, mikä tekee niistä sopivia järjestelmä, jossa tutkia, onko toiminnallinen suhde välillä kahden reitin.

jälkeen 72 tuntia transfektiosta merkittävä lasku miR-21 tasot ovat nähtävissä ainoastaan ​​transfektoiduissa soluissa miR-21-estäjä (A).

PDCD4

mRNA-tasot eivät vaikuttaneet estämällä miR-21 (B). Western blot-analyysi PDCD4 (C yläpaneelissa edustavan blot) osoittaa merkittävää kasvua proteiinin tasot transfektoitujen solujen inhibiittori verrattuna hoitamattomiin tai sekoituskoodin kontrolli käsitellyissä soluissa, kun määrällisesti suhteellisen beeta-aktiini-proteiinin (Bact), kuten lastaus- ohjaus (C alapaneeli). Pylväs pylväsdiagrammi osoittaa keskiarvoa ja viikset osoittaa standardin keskivirhe (SEM). Tilastollinen merkitsevyys laskettiin käyttämällä paritonta t-testiä. Kokeet toistettiin kolme kertaa ja analysoitiin kahtena kappaleena. Käsittelemättömät = soluja kulttuuri tiedotusvälineissä; ryntäily = solut transfektoitu scramble RNA-inhibiittorit; miR-21-estäjä = soluja käsitelty miR-21 RNA estäjä.

suhde miR-21 ja COX-2 in vaimennussäätely PDCD4 in HCA-7-soluissa

tutkia edelleen toiminnallista vuorovaikutusta miR-21: n ja COX-2 polkuja, ensin analysoidaan COX-2: n mRNA ja proteiini tasot HCA-7-soluissa 72 tunnin kuluttua hoidon miR-21-estäjä verrattuna sekoituskoodin ohjaus ja käsittelemättömien solujen. Mitään eroa COX-2: n ilmentymisen havaittiin ole mRNA eikä proteiini- tasolla (p = 0,62 ja p = 0,83 vastaavasti, pariton t-testi), joka osoittaa, että COX-2 ei ole tavoite miR-21 (Fig. S1 File S1).

seuraavaksi käsitellään HCA-7-solujen 100gM NS398, tietyn COX-2-estäjän raportoitu olevan ei-sytotoksinen ja tehokas tässä pitoisuudessa soluviljelmissä [41], tai ajoneuvon yksinään (0,1% DMSO). COX-2 on keskeisessä asemassa aikana tulehduksen alkuvaiheet muuntaminen arakidonihapon prostaglandiineja myös prostaglandiini E (PGE

2) ja säätely ylöspäin COX-2 kolorektaalisyövässä on osoitettu liittyvän huomattavaan kasvuun tuotantoon PGE

2 [42]. Käyttäen Elisa tason mittaamiseksi PGE

2 löydettiin merkittävä lasku (p = 0,006, pariton t-testi) median käsiteltyjen solujen NS398 verrattuna käsittelemättömiin soluihin tai solut, joita käsiteltiin vehikkelillä, sopusoinnussa inhibition COX 2 katalyyttinen aktiivisuus (Fig. S2 File S1).

ottaa perustettu hoidon tehoa me mitataan suhteellista ilmentymistä miR-21 ja voisimme havaita merkittävä lasku miR-21 seuraavat NS398 hoito 72 tuntia (p 0,01, pariton t-testillä, Fig. 4A). Sitä vastoin hoito HCA-7-solujen NS398 ei muuttanut ilmentymistä PDCD4 mRNA: ta (p = 0,74, pariton t-testi) (Fig. 4B), havainto, joka on toisin kuin aiemmin raportoitu 1,5-kertainen säätelyä PDCD4 mRNA seuraavista kohtelu HCA-7-solujen NS398 [39]. Ero voi johtua käytetyistä menetelmistä: jälkimmäisessä tutkimuksessa analysoitiin PDCD4 mRNA: n ilmentymisen Northern blot ja määrällisesti sitä suhteellisen GAPDH, kun taas tutkimuksessamme olemme mitanneet mRNA tasot käyttäen kvantitatiivista RT-PCR ja normalisoitu data käyttämällä geometrinen keskiarvo kolme viite geenit (GAPDH, PGK ja HPRT) mukaisesti sen MIQE suuntaviivojen [30] (ks menetelmät). Meidän reaaliaikaista PCR tiedot viittaavat siihen, että NS398 hoito johtaa lasku GAPDH tasolla (Kuva. S3 File S1) ja tämä muutos johtaisi ilmeiseen kasvuun PDCD4 tasojen jos GAPDH käytettiin ainoana viitteenä geeni. Siksi päättelemme, että NS398 käsittely ei aiheuta muutoksia PDCD4 transkriptio korko tai mRNA vakautta; kuitenkin sopusoinnussa havaittu väheneminen miR-21, merkittäviä ylössäätöä in PDCD4 proteiinin ilmentymisen (p 0,001, pariton t-testi) havaittiin NS398 käsitellyissä soluissa verrattuna hoitamattomiin tai pelkästä soluja (Fig. 4C). Nämä tulokset osoittavat, että alas-säätely PDCD4 COX-2 ei ole seurausta vähentynyt PDCD4 mRNA-synteesin tai vakautta, vaan että COX-2 voi toimia edistämällä lisääntyminen miR-21, joka vuorostaan ​​estää käännös PDCD4 mRNA.

jälkeen 72 tuntia hoidon merkittävä lasku miR-21 tasoa nähdään NS398 käsitellyissä soluissa (A).

PDCD4

mRNA-tasot eivät vaikuta NS398 hoito (B). Western blot-analyysi PDCD4 (C yläpaneelissa edustavan blot) osoittaa merkittävää kasvua proteiinin tasojen NS398 käsitellyissä soluissa verrattuna käsittelemättömiin tai pelkkää vehikkeliä (DMSO) käsiteltyjen solujen, kun määrällisesti suhteellisen beeta-aktiini-proteiinin (Bact) kuin lastaus ohjaus (C alapaneeli). Pylväs pylväsdiagrammi osoittaa keskiarvoa ja viikset osoittaa standardin keskivirhe (SEM). Tilastollinen merkitsevyys laskettiin käyttämällä paritonta t-testiä. Kokeet toistettiin kolme kertaa ja analysoitiin kolmena kappaleena. Käsittelemättömät = soluja viljeltiin väliaineessa; DMSO = soluja viljellään alusta täydennettynä 0,1% DMSO ajoneuvo; NS398 = soluja viljeltiin väliaineessa, jota oli täydennetty NS398 valmis DMSO: hon lopulliseen pitoisuuteen 100 uM NS398 ja 0,1% DMSO: ta.

COX-2 aktivointi miR-21 HCA-7-soluissa välittävät PGE

2

Koska rooli COX-2 on prostaglandiinien tuotantoa tutkia mekanismia taustalla aktivointi miR-21 COX-2 käsittelimme HCA-7-soluja 1 uM PGE

2 24 tuntia, koska tämä pitoisuus osoitettiin toimivat tehokkaasti näissä soluissa [38]. Huomasimme, että miR-21 ilmentyminen oli merkitsevästi sääteli (p = 0,019, pariton t-testi) in PGE

2 käsitellyissä soluissa verrattuna ajoneuvoon (0,1% DMSO) käsiteltyjen tai käsittelemättömien solujen (Kuva. 5A). Ei muutoksia PDCD4 mRNA havaittiin PGE

2 käsitellyissä soluissa (kuvio. 5B); kuitenkin merkittävä lasku (p 0,05, pariton t-testi) in PDCD4 proteiinipitoisuuden havaittiin joka samansuuntainen lisääntyminen miR-21 (Fig. 5C). Yhdistetty hoito PGE

2 ja miR-21-estäjä toi tasot miR-21 alas tasolle verrattavissa käsittelemättömissä soluissa (kuvio. S4 File S1), ja hoito aspiriinia johti myös lasku asennuspalveli- 21 tasoa (Kuva. S5 File S1). Nämä tiedot viittaavat siihen, että COX-2 ajettu downregulation PDCD4 tässä mallissa järjestelmä on lähinnä PGE

2 indusoi ylössäätely miR-21.

24 tunnin kuluttua hoidon merkittävä kasvu miR-21 tasoa nähdään PGE

2 käsiteltyjen solujen (A).

PDCD4

mRNA ei vaikuta PGE

2 hoitoa (B). Western blot-analyysi PDCD4 (C yläpaneelissa edustavalta blot) osoittaa merkittävää vähenemistä proteiinin tasot PGE

2 käsitellyissä soluissa verrattuna hoitamattomiin tai pelkästä (DMSO) käsiteltyjen solujen, kun määrällisesti suhteellisen beta aktiini-proteiinin ( Bact) latauskontrollina (C alapaneeli). Pylväs pylväsdiagrammi osoittaa keskiarvoa ja viikset osoittaa standardin keskivirhe (SEM). Tilastollinen merkitsevyys laskettiin käyttämällä paritonta t-testiä. Kokeet toistettiin kolme kertaa ja analysoitiin kahtena kappaleena. Käsittelemättömät = soluja viljeltiin väliaineessa; DMSO = soluja viljellään alusta täydennettynä 0,1% DMSO ajoneuvo; PGE

2 = viljeltyjen solujen alusta täydennettynä PGE

2 valmistettu DMSO: hon lopulliseen pitoisuuteen 1 uM PGE

2 ja 0,1% DMSO.

Keskustelu

dysregulaatio miRNA on tunnustettu askel synnyssä monia syöpätyyppejä, mukaan lukien CRC. miR-21 on miRNA usein yläreguloituja CRC, jonka lisääntynyt ilmentyminen arvot liittyvät huonompi hoitotulosten CRC [34]. Olemme varmistaneet, että yli-ilmentyminen miR-21 korreloi merkittävästi huonompi patologinen lavastus meidän CRC potilaan kohortin (Fig. 1), joka koostuu potilaista, joilla oli kasvain määritettyä Dukes vaiheessa viittaa tärkeä rooli miR-21 syövän invaasio ja levittämistä.

Harvat mahdollisten alavirran tavoitteet säätelee miR-21 on vahvistettu, ja näihin kuuluvat ohjelmoidun solukuoleman 4 (PDCD4) tuumorisuppressorigeeniä joka estää neoplastisen transformaation [43]. Viimeaikaiset tutkimukset ovat osoittaneet asteittaisen pienentymisen PDCD4 ilmaisun normaalista limakalvosta, ja polyyppi, peräsuolen kasvain [33]. Mielenkiintoista merkittävä kasvu miR-21 havaittiin CRC verrattuna normaaliin, mutta ei niiden välillä adenomatoottisia polyyppejä ja normaali, vaikka lasku PDCD4 ilmentyminen oli ilmeistä tässä siirtymävaiheessa [33]. Meidän kohortti havaitsimme lasku PDCD4 mRNA-tasot on kasvainten suhteen normaaleissa kudoksissa, mutta ei muutoksia tauti eteni Dukes vaiheessa (Fig. 2A). Yhdessä nämä havainnot viittaavat siihen, että siirtyminen normaalista hyperproliferaatiota downregulation PDCD4 saattaa johtua sääntelyn tasolla transkription ja /tai RNA: n ja proteiinin vakautta. Kuitenkin siirtyminen maligniteetin miR-21 estoa käännös PDCD4 proteiinin tasojen jo alentuneesta

PDCD4

mRNA tulee vallitsevaksi, mikä edistää edelleen etenemistä pahanlaatuisuuteen. Siksi määritetään ylävirran tekijät vaikuttavat miR-21 ilmentyminen on välineenä selvittääkseen, onko ja miten miR-21 myötävaikuttaa maligniteetin eteneminen ja tarjota mahdollisia terapeuttisia kohteita.

Koska meidän kohortissa CRC potilaiden säätelyä asennuspalveli- 21 on positiivisesti että COX-2: n mRNA ja huonompi patologinen lavastus (Fig. 1 ja 2B), me arveltu, että miR-21 säätelyyn ylöspäin CRC voidaan epäillä liittyvän tulehdusreaktion. Taulukko S2.