Krooninen sairaus

tiivistelmä

Tavoitteet

servikovaginaalisten nestettä (CVF) voidaan pitää mahdollisena biomarkkereita sairauksien alemman naisen synnytyskanavassa. Nestettä voidaan helposti kerätä, mikä tarjoaa uusia mahdollisuuksia, kuten kehittää itsensä testejä. Tavoitteena oli tunnistaa CVF proteiini biomarkkeri kohdunkaulan syövän tai sen syövän vaiheessa.

Methods

ero proteomiikka Tutkimus perustettiin käyttäen CVF näytteitä terveiltä ja precancerous naisia. Label-vapaa spektrin laskenta sovellettiin määrällisesti proteiini runsaus.

Tulokset

proteomianalyysi paljasti 16 ehdokasta biomarkkerit joka

alfa-aktiini-4

(p = 0,001) ja

pyruvaattikinaasin isoentsyymin M1 /​​M2

(p = 0,014) olivat lupaavin. Tarkastaminen

alfa-aktiini-4

ELISA (n = 28) osoitti, että tämä ehdokas biomarkkereiden syrji näytteitä terveiltä ja molemmat matalan riskin ja korkean riskin HPV-tartunnan saaneiden naisten (p = 0,009). Lisäanalyysissä pituus- näytettä (n = 29) osoitti, että

alfa-aktiini-4

tasot korreloivat virus pysyvyys ja selvitys, jossa on syrjintä on noin 18 pg /ml.

Johtopäätökset

Tuloksemme osoittavat, että CVF on erinomainen proteiinin lähde biomarkkereita havaitsemiseksi alemman naisen sukuelimet sairauksista ja että

alfa-aktiini-4

peräisin CVF on lupaava ehdokas biomarkkereiden varten precancerous tilasta kohdunkaulansyöpä. Jatkotutkimukset koskien herkkyys ja tämän biomarkkereiden osoittaa hyödyllisyytensä parantamiseksi nykyisten seulontaohjelmiin ja /tai sen käyttö kohdunkaulan syövän itsetestaus testi.

Citation: Van Raemdonck GAA, Tjalma WAA, Coen EP, Depuydt CE, Van Ostade XWM (2014) tunnistaminen Protein biomarkkereita Kohdunkaulan syöpä Ihmisperäisiä servikovaginaalisten Fluid. PLoS ONE 9 (9): e106488. doi: 10,1371 /journal.pone.0106488

Editor: Rakesh N. Veedu, The University of Queensland, Australia

vastaanotettu: 24 maaliskuu 2014; Hyväksytty: 01 elokuu 2014; Julkaistu: 12 syyskuu 2014

Copyright: © 2014 Van Raemdonck et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Data Saatavuus: Tällä kirjoittajat vahvistavat, että kaikki tiedot taustalla olevat havainnot ovat täysin saatavilla rajoituksetta. Kaikki asiaankuuluvat tiedot ovat paperi- ja sen tukeminen Information tiedostoja.

Rahoitus: GVR apuraha Institute for Science and Technology (https://www.iwt.be/english/welcome) (hanke nr . 093132). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Christophe Depuydt vakuuttaa, että hän on työnantaja Sonic Healthcare Benelux, Emiel Vloorstraat 9, 2020 Antwerpen, Belgia ja että hänen parhaan tiedon, ei eturistiriitoina, eikä taloudellinen, ammatillinen tai henkilökunnan, välillä hänen toimintaansa Sonic Healthcare Benelux ja tämä käsikirjoitus [pone-D-14-13187] ( ”Identification of proteiinin biomarkkereita kohdunkaulan syövän käyttäen ihmisen servikovaginaalisten neste ”). Tämä ei muuta tekijöiden noudattaminen PLoS One politiikkaa jakaa tietoja ja materiaaleja.

Johdanto

ihmisen papilloomaviruksen (HPV) on vastuussa lähes kaikista kohdunkaulan syövistä [1]. Vaikka yli 150 tämän viruksen muunnokset olemassa, vain tietyn genotyypin, kuten HPV 16, 18, 33, 45 ja 58 tunnetaan korkean riskin tyyppejä (HR-HPV) [2]. Matalan riskin HPV-tyypit (LR-HPV), lähinnä HPV 6 ja 11, harvoin aiheuttaa sukupuolielinten kasvaimia; ne kuitenkin aiheuttavat Condylomata acuminata (kondylooman) [3]. Pysyvät HPV onkoproteiinia lauseke (E6 /E7) HPV tartunnan epiteelin tyvisoluihin deregulates solunjakautumisen [4]. Yliekspressio näiden virusten geenien aiheuttaa vapauttaminen soluproliferaation, aineenvaihduntaa, apoptoosin, erilaistumista ja genomin epästabiilisuuden, jotka kaikki voivat johtaa peräkkäisissä vaiheissa kohdunkaulan intraepiteelisiin neoplasia (CIN1, 2 ja 3) tai squamous intraepiteelisiin leesioita (low -laadun SIL ja korkea-asteen SIL). Noin 85% kaikista seksuaalisesti aktiivisia henkilöitä on alttiina HPV, ja suurin osa HR-HPV-infektioita ovat virion tuottavat (joka on ajallisesti rajoitettu) viittaa siihen, että sen lisäksi, että viruksen genotyyppi, useat kofaktoreita liittyvät läheisesti pysyvyys viruksen onkoproteiineja ja muutosta kohdunkaulan limakalvon pahanlaatuisen kudoksen [5], [6].

on useita syitä, miksi kehittää diagnostinen määritys, joka perustuu servikovaginaalisten neste (CVF), varhaisen havaitseminen kohdunkaulan syövän olisi hyödyllistä. Aluksi nykyinen seulonta-analyysejä ei ole optimaalinen. Koska korkea esiintyvyys kohdunkaulan syöpä, naisilla vuotiaita 25 ja 65 ovat usein seulotaan Pap (anicolaou) tahroja, testi joka perustuu havaitsemiseen morfologiset muutokset kohdunkaulan limakalvon soluista. Valitettavasti alhainen testin herkkyys voi johtaa kohdunkaulan syövän diagnosoitu myöhäisessä vaiheessa [7]. Tiedot satunnaistetut tutkimukset osoittavat, että HPV-DNA-seulonta on herkempi kuin sytologia, mutta spesifisyys on pienempi, mikä väistämättä johtaa ylihoito sillä noin 80% HPV positiivisten potilaiden spontaanisti poista virus [3]. Lisäksi colposcopic tutkimus on työvoimavaltaista, vaikea automatisoida ja alttiita välistä ja niiden sisäistä tarkkailija vaihtelu [8]. Käyttöönotto Uuden biomarkkereiden joka auttaa parantamaan herkkyys ja nykyisten seulontaohjelmien on siis enemmän kuin tervetullut. Toinen syy on sovellettavuutta CVF diagnoosin. Koska neste voi helposti kerätä yksittäisten tuella erikoislaitteita [9], nopea ja yksinkertainen testi pohjalta mittatikku määritys, suorittaa nainen itse, voitaisiin kehittää. Tällainen itsetestaus voitaisiin ottaa käyttöön esim. luonnonvaroiltaan rajoitettu väestöryhmissä, joissa epätasainen taakka kohdunkaulan syövän esiintyy usein. Itse asiassa on arvioitu, että vain 5% naisista vähän resursseja maihin seulotaan sopivasti kohdunkaulansyövän [10]. Puute terveydenhuollon infrastruktuurin ja taloudelliset kustannukset ovat tärkeimmät syyt, miksi sytologia perustuvia ohjelmia ei ole toteutettu. Koska vaihtoehtoisia menetelmiä tällä hetkellä tutkitaan näillä alueilla, käyttö CVF-pohjainen itsediagnostiikkatoiminto testi voidaan harkita. Lisäksi itse testejä voitaisiin myös käyttää seurantatutkimuksissa rokotusohjelmien jälkeen vaikutus rokotusten seksuaalisesti aktiivisia naisia ​​on epävarma [11]. Lisäksi nykyinen rokotteita vain osoite neoplasian aiheuttavia genotyyppien HPV16 ja -18 viittaa siihen, että ihanteellisissa olosuhteissa, vain enintään 70% kaikista kohdunkaulan syövistä voidaan ehkäistä [7], [12]. Niinpä ainakin tulevina vuosikymmeninä, huolellisen arvioinnin rokotusohjelmat on erittäin suositeltavaa ja yksinkertainen itsediagnostiikka testi voisi auttaa paljon vastaamaan tähän kysymykseen.

Aiemmin useat proteomiikka tutkimukset suoritettiin tunnistaa biomarkkerit varten (varhainen) havaitseminen kohdun neoplasiaa. Eri tutkimuksissa precancerous ja tervettä kohdunkaulan kudos verrattiin ja Lee

et al.

Tutkinut

in vitro

osuus onkoproteiinia E7 kehittämiseen kohdunkaulan neoplasian käyttäen HPV-tartunnan solulinjassa [ ,,,0],13] – [20]. Useat markkereita, jotka liittyivät dysregulation normaalin solusyklin, kuten p16, Ki67 ja sykliini E karakterisoitiin. Nämä havainnot ovat parantaneet ymmärrystä HPV aiheuttaman syövän synnyn mutta toistaiseksi ne kaikki osoittivat alhainen herkkyys ja /tai spesifisyys ja sen vuoksi ei voitu käyttää klinikalla.

biomarkkereiden löytö ja validointi, kehon nesteiden ovat parempia kuin kudosnäytteet koska seuraavat edut ovat ominaisia ​​useimmille kehon nesteiden: (1) helppo saatavuus; (2) välttäminen näytteenotto riskejä; ja (3) moninkertainen näytteenotto potentiaalia [21]. Tänään, plasma on kaikkein analysoitiin biologisen nesteen etsittäessä biomarkkereita ja se on jo käytetty kohdunkaulan syövän tutkimukseen [22], [23]. Kuitenkin plasma koskettaa lähes kaikkia elimissä, mikä plasma biomarkkerit vähemmän erityinen, koska on vaikea määrittää, mistä elin ne ovat peräisin [21].

CVF saadaan servikovaginaalisten pesuja, emätintupoissa tamponeja tai laitteella itsensä näytteitä [9], [24] ja on seuraavia etuja yli plasma: (1) se omaa alapuolisen nesteen tilavuus /elin-suhde verrattuna plasma, jolloin suurempi herkkyys; ja (2) se koskettaa vähemmän elinjärjestelmissä, mikä todennäköisesti lisää spesifisyyttä merkkiaineiden [21], [25]. Tässä tutkimuksessa keskitymme tunnistamiseen ehdokas biomarkkereita kohdunkaulan neoplasian vertaamalla proteiinikoostumus yksittäisten CVF näytteitä terveistä ja precancerous (LSIL ja HSIL) naisia. Tuloksemme osoittavat, että

alfa-aktiini-4

(ACTN4) on lupaava ehdokas biomarkkeri syövän vaiheessa kohdunkaulan syövän ja että tämä CVF proteiini on erittäin hyvin kehittämiseksi diagnoosin testi.

Materiaalit ja menetelmät

Tutkimusasetelma ja näytteiden keräämistä

Kaikki potilaat suostuivat osallistumaan kirjallista suostumusta ja hyväksyi tutkimuksen eettinen komitea Antwerpenin yliopistosairaalan (rekisterinumero : B30020108372). Tutkimuksittain potilaiden tunnistuskoodeista jaettiin ja lähetetään siten, että potilas luottamuksellisuus oli säilynyt.

Kaikki näytteet tässä tulevaisuuteen, sokaissut, kohorttitutkimus tehtiin samalla gynekologi (WAAT). Mikäli epänormaaleja Papa-tulokset (johtuen HPV-infektio tai väärän positiivisen tuloksen), sekä terveillä ja precancerous potilasta rutiininomaisesti alistetaan colposcopic tutkimus, menettely, joka sisältää huuhtelu emättimeen 5% etikkahappoa. Sen jälkeen colposcopy tämä pesunesteen (joka sisältää servikovaginaalisten neste) heitetään tavallisesti pois, mutta kerättiin Proteomiikan analyysiä. Lisäksi kohdunkaulan sytologia näytteet kerättiin tänä colposcopic tutkimista sen määrittämiseksi, sytologian ja HPV- statuksesta kuten aikaisemmin on kuvattu käyttäen tyyppikohtaisia ​​PCR [26]. Kaikki BD-SurePath nestepohjaisia ​​sytologian näytteet lähetettiin patologian laboratorioon (RIATOL, Department of Molecular Diagnostics, Sonic Healthcare Benelux, Antwerpen, Belgia) käsittelyä varten. Perustuen yhdistelmä colposcopic tulosten sytologiasta tulos ja HPV genotyypityksen, terve ja syöpää edeltävien naisia ​​voitiin tunnistaa luotettavasti. Valitsimme näytteet peräisin 6 terve (normaali colposcopy /sytologia ja HPV-negatiiviset; ryhmä A) naisia ​​ja 6 precancerous (epänormaali colposcopy /sytologian ja HR-HPV positiivisia; ryhmä B) yksilöitä (taulukko 1). Kaikki näytteet olivat peräisin postmenopausaalista ( kolmen vuoden kuluttua viimeisen kuukautiset) naisten samanikäisiä (59 +/- 13 vuotta). Potilaat, jotka käyttivät lääkkeitä suljettiin pois tutkimuksesta. Lisäksi potilaat, jotka osoittivat näkyviä merkkejä gynekologiset infektiot (esim tippuri) tai kärsi HIV-infektion jätettiin samoin. Perustuu servikovaginaalisten nesteen näytteitä, potilaat seulottiin Trichomonas vaginalis. Aikana proteomic analyysit, terve ja syöpää edeltävien CVF näytteet aina analysoitiin pareittain minimoimiseksi teknistä variaatioita LC-MS /MS-alustalla.

proteomiikan analyysi

Keräämisen jälkeen servikovaginaalisten pesut (25-40 ml) välittömästi kuljetettiin jäillä laboratorioon ja säilytettiin -80 ° C: ssa. Sentrifugoinnin jälkeen supernatantti konsentroitiin lyofilisoimalla lopulliseen tilavuuteen noin 200 ui. Proteiininäytteet (1 mg /näyte) erotettiin ja fraktioitiin ensimmäisessä ulottuvuudessa käänteisfaasi (RP) proteiini C4-HPLC-kolonnia. Entsymaattisesti trypsiinillä tehtiin ja tuloksena peptidit kussakin fraktiossa erotettiin toisen ulottuvuuden RP-C18 mikro-kapillaari-HPLC-järjestelmällä. Massaspektrometrinen analyysi suoritettiin käyttäen MALDI-ToF /ToF väline. Tuloksena MS /MS Spectra kustakin näytteestä seulottiin vastaan ​​ihmisen Swiss-Prot-tietokannan (versio: 57,1) käyttäen MASCOT hakukoneen. Analyysi, saatu aineistot suoritettiin, kuten aiemmin on kuvattu [25]. Tarkempia tietoja löytyy Document S1 ja kuvio S1.

Entsyymi immunosorbenttimääritys

Vahvista LC-MS /MS tuloksia, entsyymi immuuni sorbentin (ELISA) tehtiin for

alfa-aktiini-4

(ACTN4) ja

pyruvaattikinaasin isoentsyymin M1 /​​M2

(PKM2) mukaan valmistajan ohjeiden. Ihmisen ACTN4 ELISA-kittiä (Cusabio Biotech Co. LTD.) Ja ihmisen PKM2 ELISA-kittiä (USCNK Life Science Inc.) käytettiin määrittämään ACTN4 ja PKM2 kohdunkaulan emättimen pesuja terveistä (n = 16) ja HPV-tartunnan (n = 12) naisilla (sekä ennen ja jälkeen vaihdevuosien). Lisäksi useat pitkittäinen näytteitä (n = 29) testattiin myös näitä kahta ehdokasta biomarkkereita.

Tilastot

onko eroa proteiinin runsaus oli merkittävä, normalisoitu spektrit runsaus tekijät (NSAF arvot ) tehtiin tilastollinen testaus. Koska valitut proteiinit on tunnistettu useita näytteitä, ja siten myös sisälsi useita NSAF-arvot, ei-parametriset Mann-Whitneyn U-testiä käytettiin. Lisäksi chi-neliö testi suoritettiin, jolloin taajuus kaikkien tunnistettujen proteiinien analysoitiin onko tiettyjen proteiinien olivat enemmän tai yksinomaan havaittu enemmän tietyin edellytyksin. Parittomia Studentin t-testejä suoritettiin analysoimaan tuloksia ELISA. Kaikki tilastolliset testit suoritettiin käyttämällä Statistical Package of Social Science (SPSS version 18).

Tulokset

Differential tutkimuksen luonnehdinta kohdunkaulan syövän biomarkkereiden

tunnistamiseksi differentiaalisesti runsas proteiinit, 12 näytettä jaettiin kahteen ryhmään ja ne analysoidaan yksittäin käyttäen analyyttistä proteomiikka alusta (taulukko 1). Ryhmä A koostuu 6 näytettä terveiltä yksilöiltä, ​​kun taas B-ryhmän koostui 6 näytteitä precancerous yksilöitä. Proteomiikka-analyysi johti 846 ja 825 tunnisteiden A-ryhmän ja B-ryhmän, vastaavasti, jotka edustavat 371 (ryhmä A) ja 341 (ryhmä B) ei-tarpeeton proteiineja (kuvio 1). Keskiarvo päällekkäisyys kaikkien näytteiden ryhmästä A oli 54% ja B-ryhmän oli 53% (taulukko S1).

terve proteomiin 371 proteiineja tunnistettiin samalla 341 ainutlaatuista proteomeja varten precancerous proteomiin. Limittäisen sarja 238 proteiineja löytyy sekä proteomeja.

puolikvantitatiivinen analyysi suoritettiin myös perustuu merkkivapaalla NSAF menetelmällä (taulukko S2). Sekä ryhmissä NSAF arvot proteiinien läsnä ainakin 5 6 näytteitä keskenään verrattuna. Vaihtelua proteiini runsaasti näytteiden välillä ilmaistiin variaatiokertoimena (CV). Keskiarvonilmaisimella CV-arvo on 60% (alhaisin: 19%; korkein: 134%) saatiin A-ryhmän (terve), kun taas keskimääräinen CV 52% (alhaisin: 14%; korkein: 99%) oli havaittavissa B-ryhmän .

tunnistaminen eri tavoin runsas proteiinien

tunnistaminen ehdokas biomarkkerit, jotka korreloivat syövän vaiheessa kohdunkaulan syövän, terve ja syöpää edeltävien CVF proteomeja verrattiin. Laadullinen analyysi tehtiin välillä 371 tunnistettu proteiinien terveen ryhmän ja 341 tunnistustiedot, precancerous ryhmää, mikä johti 238 tai 67% päällekkäisiä proteiineja. Proteiinien tunnistamiseen tilastollisesti merkitsevä ero esiintymisen, kaikki tunnistuksiin tehtiin tilastollinen testaus käyttäen Pearson chi-neliö testi. Proteiinit, joiden p-arvo ≤0.05 on listattu (taulukossa 2). Näistä laskelmista, ACTN4 tunnistettiin kaikissa näytteissä precancerous potilaista mutta ei näytteissä terveistä potilaista. Lisäksi ACTN4 oli ensisijaisesti tunnistaa perustuen useita ainutlaatuisia peptidejä, joiden keskimääräinen MASCOTilla proteiini pisteet 162 (taulukko S3). Ero runsaasti tämän proteiinin varmistettiin lisäksi ELISA: lla (katso alla).

Lisäksi, semi-kvantitatiivinen vertailu suoritettiin sen määrittämiseksi, ovatko tietyt proteiinit, jotka havaittiin sekä terveitä ja syövän vaiheessa ryhmät olivat ilmentyvät eri. NSAF-arvot vastaavat proteiineja tilastollisesti testattiin käyttämällä Mann-Whitneyn U-testiä. Ainoastaan ​​proteiinit, joiden tilastollinen merkitsevyys p≤0.05 on listattu (taulukossa 3). Tämä laskelma johti neljä proteiineja, jotka oli ominaista huomattava ero runsaasti molempien olosuhteissa. Vain yksi proteiini,

haptoglobiini

, osoitti downregulation syövän vaiheessa kunnossa, kun taas kolme muuta proteiineja,

ATP nopaliinisyntaasin alayksikön beta

,

anneksiini A2

ja PKM2 olivat upregulated. PKM2 ja

anneksiini A2

osoitti alimman p-arvon (0,01 ja 0,03, vastaavasti) ja havaittiin 5 6 näytteitä precancerous ryhmästä. Koska erittäin vaihteleva proteiinit eivät sovellu ehdokas biomarkkereiden, vaihtelu runsaus näiden proteiinien laskettiin. CV-arvot 40% ja 29% terveen ja precancerous ryhmä PKM2 vastaavasti tämä proteiini sopii paremmin ehdokkaaksi biomarkkerina verrattuna

anneksiini A2

, joka oli arvot 77% ja 48%, vastaavasti.

tarkastaminen ehdokkaan biomarkkerit

ELISA suoritettiin tarkistaa ero profiilit ACTN4 ja PKM2. Terve (n = 16) ja HPV-tartunnan näytteet (sekä HR-HPV onkogeenisiä (n = 8) ja LR-HPV ei-onkogeenisiä näytteitä (n = 4)), jotka eivät sisälly edelliseen kokeessa testattiin käyttäen kaupallisesti saatavia pakkauksia (taulukko 4).

tasot ACTN4 olivat merkittävästi korkeampia näytteissä HR-HPV- tartunnan saaneiden yksilöiden verrattuna näytteisiin terveiltä, ​​ei-HR-HPV-tartunnan saaneilla potilailla (p = 0,023), joka vahvistaneet LC-MS /MS tuloksia. Merkillistä, näyte yksi, peräisin ei-HR-HPV tartunnan potilas, näyttää olevan Peränpitäjänä koska suuri ACTN4 pitoisuus 85,6 pg /ml (katso keskustelu). Lisäksi LR-HPV-tartunnan saaneilla potilailla oli korkeammat ACTN4 pitoisuuksia verrattuna ei-HPV-infektio (p = 0,052), mutta jonkin verran pienempiä arvoja verrattuna HR-HPV-infektiopotilailla (p = 0,114). Vertailu ACTN4 tasot HPV-tartunnan (sekä HR ja LR-infektiot) verrattuna ei-tartunnan näytteiden (terveillä potilailla) osoitti merkittävää eroa, jossa on p-arvo 0,009 (kuvio 2). Korkeimmat ACTN4 pitoisuus terveen ryhmän (paitsi harha) oli 17,3 pg /ml, kun taas pienin pitoisuus, HR-tartunnan saaneiden ryhmässä oli 30,6 pg /ml. Pienin pitoisuus ACTN4 LR-tartunnan saaneiden ryhmässä oli 21,3 pg /ml, joka on korkeampi kuin korkein arvo terveen ryhmän. Näiden havaintojen perusteella, kynnys 18 pg /ml voidaan asettaa korkein arvo ACTN4 ei-tartunnan kunnossa. Ei lineaarinen korrelaatio löytyi viruskuormaa ja absoluuttinen pitoisuus ACTN4, joka olettaa, että ACTN4 ei ole vain markkeri HPV-infektio vaan pikemminkin precancerous vaiheessa.

pitoisuus ACTN4 varten terveiden yksilöiden (n = 16), HR-HPV-infektiopotilailla (n = 8) ja LR-HPV-infektiopotilailla (n = 4). Tilastollinen testaus ACNT-4 tasoa terveiden ja HR-HPV-tartunnan saaneilla potilailla johti p-arvo 0,023 ja terveillä vs. LR-HPV on p-arvo 0,052. Kun HR ja LR-HPV-tartunnan saaneilla potilailla ryhmiteltiin HPV infektiota sairastavilla potilailla, p-arvo 0,009 havaittiin välillä ei-tartunnan (terve potilasta) ja tartunnan ryhmiä.

Lisäksi lupaavimmat puolikvantitatiivinen ehdokas, PKM2, todennettiin kaupallisella ELISA kit. Tätä analyysiä varten, samalla 28 näytteitä käytettiin; kuitenkin, LC-MS /MS-tulokset ole vahvistaneet (tuloksia ei ole esitetty).

Sitten analysoimme ACTN4 pitoisuudet vielä 29 pituussuunnassa näytteet (eli näytteet saman potilaan eri ajankohtina pistettä) kohteesta 9 potilaalla. Kunkin potilaan vähintään kolme pituus- näytteen arvioitiin (kuva 3). Näistä yhdeksästä potilaasta, viisi potilasta selvitetty viruksen, kahdella potilaalla oli pysyviä HPV-infektio, yksi potilas sai uuden HPV-infektio ja yksi potilas oli terve. Vaikka potilaiden määrä ryhmää kohti ovat pieniä, nämä näytteet voivat auttaa meitä vahvistamaan havaintomme. ACTN4 ELISA suoritettiin useita näytteitä tunnistaa korrelaatioita viruksen profiilien ja ACTN4 tasoilla yksi potilas. Kuitenkin lisäksi virustiitteri, myös odotettavissa genotyypin ja aika tartunnan vaikuttaa ACTN4 ilmaisun koska eri virustyypistä on eri karsinogeenisia kapasiteettia ja kohdunkaulan syöpä kehittyy yleensä jälkeen sitkeä HR-HPV-infektio [2]. Äskettäin on osoitettu, että kehittäminen kohdunkaulan precancer (kohdunkaulan epiteelin sisäinen neoplasia Asteen kolme; CIN3) edeltää tasainen kasvu viruskuorma tietyn HR-HPV-tyypille, kun taas nopea räjähdysmäisesti kasvava kuormitus selvitetään normaalisti sisällä 6 18 kuukautta ja liittyy yleensä huonolaatuista sytologisten poikkeavuuksia [27]. Nämä tekijät huomioon seuraavat kaksi suuntausta ei havaittu kokeissa: (1) potilaat, joilla oli alkuvaiheen infektio (potilas 1) tai tyhjennetään virus (potilaat 2, 6, 7 ja 9) oli lisäämällä tai laskeva ACTN4 tasoilla, vastaavasti, ja potilaat, joilla ei ole tai matala infektiot (potilas 5) tai jatkuva infektiot (potilaat 4 ja 10) oli stabiili alhainen tai korkea ACTN4 tasolla, vastaavasti; ja (2) on jatkuva infektio (potilaat 1, 4 ja 10) ACTN4 kertynyt.

vertailu ACTN4 tasoilla genotyyppi ja virusmäärä pituussuunnassa näytteissä 9 eri potilailla. Samanlaisia ​​genotyypit on esitetty samat värit. Vasemmalla puolella virusmäärä (in kopiomäärä /solu) näkyy laitteen logarithmical mittakaavassa kun taas oikealla puolella pitoisuus ACTN4 ilmaistaan ​​pg /ml. Y-ax ilmaisee ajan (ilmaistu päivinä), kun taas potilaita seurattiin. Musta katkoviiva havainnollistaa ACTN4 kynnyksen 17,3 pg /ml. ACTN4 tasot määritettiin ajankohtina jolloin CVF näyte oli saatavilla.

Keskustelu

kuvaavat CVF proteomiin terveitä ja syöpää edeltävien potilaiden

Tässä tutkimuksessa CVF proteomi 12 (6 terve ja 6 precancerous) yksittäiset näytteet karakterisoitiin tunnistaa ehdokas proteiinia biomarkkereiden havaitsemiseksi syövän vaiheessa kohdunkaulan syövän. Analyysi Näiden 12 näytettä suoritettiin sekä laadullisesti (läsnä /poissa) ja semikvantitatiivinen tasolla. Määrä proteiinia tunnistusten kullekin näytteistä on hyvin yhteneväinen aiemmin suoritettu proteomic tutkimuksia CVF [28].

määrän määrittämisessä päällekkäisiä proteiinien välisten näytteiden kuluessa ryhmä osoitti merkittäviä eroja. Vain 10% kaikista proteiineista havaittiin kussakin näytteessä molemmista ryhmistä. Tämä ryhmä koostuu pääasiassa proteiineja, jotka ovat ominaisia ​​CVF proteomin, joka perustuu niiden sijaintia ja biologinen funktio. Siksi vaadimme näitä proteiineja ”ominaisuus proteiinit”. Kuitenkin huomattava määrä tunnisteita, kuten solunsisäisiä proteiineja, ovat vähemmän tyypillisiä CVF proteomin. Tämä havainto voidaan selittää prosessien kuten häiriintyminen epiteelisolukerroksen näytteenoton aikana ja irtoaminen kuolleiden epiteelisolujen. Siksi ryhmä näitä tunnisteiden ”ei-ominaisuus” proteiineja. Näiden tulosten perusteella, jotka ovat yhteisiä lähes jokaisen kattavan CVF proteomiikka tutkimuksessa, voidaan tehdä ero ”ydin proteomiin” usein tunnistetun CVF proteiineja ja ”muuttuva proteomiin”, joka sisältää ei-ominaisuus CVF proteiinit [28] .

verrattuna keskimääräinen CV arvot yhteisten tunnisteiden välillä kolme teknistä näytteitä (25%) [25], keskimääräinen CV arvot proteiinin runsautta terve ja precancerous näytteet (60% ja 52%, vastaavasti) olivat huomattavasti korkeammat. Tämä tulos oli odotettu, koska toisin kuin teknisten rinnakkaisnäytteiden näytteet eivät olleet identtisiä. Kaikissa näytteissä, proteiinit, joilla on korkea yksilöiden välisten erojen havaittiin (jopa 134%), kun taas mitatusta keskiarvosta CV-arvo ”ominaisuus proteiinit” oli 38%. Nämä tulokset ovat samankaltaisia ​​kuin muut proteomic tutkimuksia kehon nesteiden. Esimerkiksi Yamakawa

et al.

[29] havaittu keskimääräinen CV-arvo 63%, että siemen plasma Proteome, ja mukaan Anderson

et al.

[30], keskimääräinen CV arvo sarjan plasman proteiineihin oli noin 45%.

tunnistaminen eri tavoin runsas proteiinien

tarkastella ero runsas proteiineja, tarra-vapaa spektrin laskenta-menetelmä suoritettiin. Koska tämä menetelmä mahdollistaa vain puoliksi kvantitatiivinen analyysi, erinomainen vaikutukset ensin tutkitaan nämä antavat tavallisesti kaikkein luotettavimpia tuloksia. Siksi meidän ensimmäinen nähden proteiineja, joissa niiden läsnäolo tai puuttuminen on precancerous ryhmässä oli ominaisuutta tietyllä kunnossa. Tilastollinen testaus (chi-neliö testi) johti 12 proteiineja, joilla on huomattava ero ilmaantuvuus (p 0,05), joista 6 proteiineja yksinomaan tunnistettu syöpää edeltävät näytteet (taulukko 2). Merkittävin proteiini oli ACTN4 (Acc No: O43707), joka tunnistettiin kaikissa precancerous näytteissä, mutta yksikään terveiden näytteiden (p = 0,001). Varsinkin SCCA-1, käytetään usein plasman biomarkkerina kohdunkaulansyövän [31], tunnistettiin myös, vaikkakin korkeammalla p-arvo (p = 0,046).

ACTN4 on kriittinen osa solun tukirangan ja on mukana muodostumista solu-solu-kiinnikkeistä [32]. On osoitettu, että inhibitio tiettyjen kalvoon sitoutuneiden adheesiomolekyylien aiheuttama pahanlaatuisiin johtaa vähenemiseen solu-solu-adheesion lujuus ja säätelyä ACTN4 [33]. Joka perustuu pudotus tutkimus ACTN4 käyttäen rintasyöpäsolujen, Khurana

et al.

Osoitti, että ACTN4 oli mukana ohjausmekanismia solujen kasvua [34]. Lisäksi sytoplasmisen kerääntymisen ACTN4 liittyi useita maligniteetteja ja sen yhteydessä on huono ennuste [35], ja kertyviä genomisen vahvistuksen ACTN4 liittyi muodostumista munasarjojen adenokarsinoomat [36]. Myös RNAi-välitteinen downregulation ACTN4 osoitti yhdistyksen välillä yli ilmaus ACTN4 ja aggressiivinen fenotyypin suun okasolusyöpä [37]. Äskettäin proteiinin havaittiin liittyä useisiin tekijöihin vaihtelevalla toimintoja, ehdottaa muita rooleja tämän proteiinin lisäksi aktiini sääntelyä [38]. Todellakin, Khurana

et al.

Tunnistanut LXXLL motiivi, joka oli vastuussa vuorovaikutuksen ACTN4 estrogeenireseptorin kanssa ja co-aktivaattorien [39]. Viimeaikaiset tutkimukset HPV siirtogeenisen hiiren mallia todisteita siitä, että estrogeeni ja sen ytimen reseptorin edistää kohdunkaulan syövän yhdistettynä HPV-onkogeenien [40]. Sen vuoksi houkuttelevaa spekuloida, että ACTN4 on rooli tässä tärkeä vaikutus.

perusteella semikvantitatiivinen NSAF-menetelmällä, proteiinit valitaan niiden ero ilmentymisen välillä kaksi ehtoa. Tilastollinen testaus (Mann-Whitney U) johti neljän proteiineja, joilla on merkittävä (p 0,05) ero runsaasti (taulukko 3). Vaikka nämä neljä proteiineilla tilastollista merkitsevää eroa tänä tietojenkeruuvaiheessa, vahvistuskoodi vaihe tarvitaan vahvistaa nämä tulokset. Kun sekä p-arvo ja lukumäärä läsnäolo- otettiin huomioon,

anneksiini A2

ja PKM2 olivat lupaavimpia (p 0,03), koska molemmat havaittiin vähintään 9 12 yksittäisten näytteiden, joiden kolme kertainen kiihdytyssäätely varten verisyövän esiaste (taulukko 3). Huolimatta tunnistaminen

nnexin A2

lähes jokaisessa näytteessä (11/12 näytettä), jolla on hyväksyttävä ero runsaasti (p = 0,03), välinen yksittäiset vaihtelut (CV 77%) terveen -ryhmä myi paljon suurempi kuin PKM2 (35%). Siksi PKM2 (Acc No: P14618) valittiin tarkastettavaksi ELISA.

PKM2 on glykolyyttistä entsyymi, joka osallistuu energiahuollon solun. Tämä proteiini on kaksi isoformia, joka on alkionkehityksen isoformi (M2), joilla on kohonnut entsymaattinen aktiivisuus ja aikuisen isoformi (M1). Äskettäin osoitettiin, että pahanlaatuisia muutoksia solujen HR-HPV onkogeenien E6 ja E7 aiheutti PKM siirtyminen M1 M2 [41]. Tämä valitsin aiheuttaa siirtyminen normaalista solujen aineenvaihduntaa koholla Glykolyysivaiheen, joka hyödyttää kasvua ja kasvain kasvainsolujen [42]. Valitettavasti emme pystyneet vahvistamaan eron PKM2 pitoisuuksina välillä CVFs terveistä ja precancerous yksilöitä, vaikka kaksi ELISA eri toimittajilta käytettiin. On mahdollista, että semikvantitatiivista spektrin laskenta menetelmä voi olla altis liikaa vaihtelua. Vaihtoehtoisesti olemme aiemmin havaittu, että CVF matriisi ei ole paras mahdollinen joidenkin ELISA kokoonpanoja ja tämä voi olla totta, että kaksi PKM2 ELISA-määritykset.

tarkastaminen alfa-aktiini-4 tasoa

Alpha-aktiini-4, lupaavimmat ehdokas biologisten merkkiaineiden, tarkastettiin 57 ylimääräistä CVF näytettä (28 yksittäistä näytettä ja 29 pitkittäinen näytettä) ELISA, numero, joka varmasti täyttää löytö /verifiointivaiheeseen proteiinia biomarkkereiden [43] . ELISA Tulokset osoittivat, että pitoisuus ACTN4 on kohonnut HPV tartunnan saaneilla potilailla verrattuna ei-tartunnan saaneilla potilailla, mikä vahvistaa LC-MS /MS tuloksia. Kuitenkin infektio LR-HPV (HPV-6 ja HPV-11) johti korkeampiin ACTN4 pitoisuuksina CVF. Vaikka pitoisuudet ACTN4 mitataan CVFs LR-HPV-tartunnan saaneista ihmisistä ovat korkeammat kuin ei-tartunnan saaneet yksilöt, ei merkittävää eroa runsaasti tason havaittiin (p = 0,052). Koska nämä havainnot perustuvat analyysiin näytteiden vain neljä yhden LR-HPV-infektiota sairastavilla potilailla, lisää tämäntyyppisen näyte on arvioitava ennen johtopäätöksiä voidaan tehdä. Yksi ei-tartunnan potilas osoitti harha-arvo 85,6 pg /ml ACTN4. Tämä potilas ei ole aiemmin havaittu HR-HPV-infektio, mutta kliininen tiedosto osoitti iskeemisen sydänsairauden ja esiintyvyys rintasyöpä. Näin ollen on mahdollista, että tämä kohonnut pitoisuus ACTN4 johtuu hoidon tai LR-HPV-infektio muiden kuin HPV-6: n tai HPV-11. Siksi laaja validointi tämän markkerin suuremman määrän näytteitä, mukaan luettuina potilaat kärsivät muista sairauksista ja infektioiden (HIV, herpes, bakteeri vaginosis,

Chlamydia

jne), on seuraava askel onko ACTN4 sopii diagnoosia varten. Näissä tutkimuksissa voitaisiin asettaa kynnyksen 18 pg /ml syrjiä näytteitä terve vs. HPV-tartunnan saaneista ihmisistä.

Vaikka ACTN4 tasoa ei numeerisesti korreloinut viruskuormat, nouseva ja laskeva trendi voisi selvästi havaittu potilailla, joilla on joko aloitettu infektio tai tyhjennetään virus. Havaitsimme myös, että infektiot pidemmällä aiheutti kertymistä merkkiaineen.