Krooninen sairaus

tiivistelmä

MikroRNA (miRNA) on keskeinen rooli mahasyövän etenemisen ja etäpesäkkeiden. Tässä tutkimuksessa tutkittiin miten miRNA-135a alussa mahasyövässä (EGC) sisältäen imusolmukkeesta (LN) etäpesäke. Tutkimme korrelaatio miRNA-135a ilmaisun ja kliinisiin tuloksiin 59 potilailla, jotka leikattiin EGC. Käyttäen mahasyöpä solulinjoissa, teimme toimiva ja kohdegeenin analyysit. miRNA-135a ilmentyminen säädellä vähentävästi 33,9%: lla potilaista. Nämä potilaat oli merkitsevästi pitemmälle (TNM stage≥IB, 35,0% vs. 12,8%, p = 0,045) ja korkeampi LN etäpesäkkeiden (30,0% vs. 5,1%, p = 0,014) kuin ne, joilla säätely ylöspäin miRNA-135a ilme. Monimuuttuja-analyysissä, alas-säätely miRNA-135 oli itsenäinen riskitekijä LN etäpesäkkeiden (oikaistu riskisuhde, 8,04; 95% luottamusväli, 1,08-59,81; p = 0,042). Toiminnalliset analyysit käyttäen mahasyövän solulinjoja osoittivat, että miRNA-135a tukahdutetaan solujen elinkykyä, epiteelin-mesenkymaalitransitioon, soluinvaasiota, ja muuttoliike. ROCK1 oli tavoite miRNA-135 ja sen ilmentyminen korreloi käänteisesti kuin miRNA-135a. ROCK1 ilmentyminen oli lisääntynyt EGC potilailla, joilla LN etäpesäkkeitä kuin niissä ilman LN etäpesäke. Tuloksemme vahvistavat kasvain esti roolia miRNA-135a, ja osoittaa sen rooli LN etäpesäkkeitä in EGC. miRNA-135a ja sen kohdegeenin

ROCK1

voi olla uusia terapeuttisia sekä varoituksia tavoitteita EGC.

Citation: Shin JY, Kim YI, Cho SJ, Lee MK, Kook MC, Lee JH, et ai. (2014) MicroRNA 135 vaimentaa imusolmukemääritysmenetelmä Etäpesäke kautta Down-asetus ROCK1 Early syöpään. PLoS ONE 9 (1): e85205. doi: 10,1371 /journal.pone.0085205

Editor: Masaru Katoh, National Cancer Center, Japani

vastaanotettu: 28 lokakuu 2013; Hyväksytty: 23 marraskuu 2013; Julkaistu: 21. 2014

Copyright: © 2014 Shin et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus rahoittivat avustusta 1110532-3 National Cancer Center, Korea. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: HA on PLoS One toimituskunta jäsen ja tämä ei muuta kirjoittajien sitoutumista kaikki PLoS ONE politiikan tietojen jakamista ja materiaaleja.

Johdanto

Mahasyöpää edelleen toiseksi yleisin syy syövän kuolleisuus kaikkialla maailmassa, vaikka yleisyyden ja kuolleisuus kehittyneissä maissa [1 ].

alueilla, kuten Koreassa ja Japanissa, jossa seulonta mahasyövän suoritetaan laajalti, varhainen havaitseminen on usein mahdollista. Koska korotettuun varhainen havaitseminen mahasyöpä voi johtaa parannetun ennusteen, intressit parantaa potilaiden elämänlaatua ja hyödyntämällä vähän invasiivisia hoitoja ovat lisääntyneet. Potilailla, joilla on mahalaukun syövän, imusolmuke (LN) etäpesäke on yksi tärkeimmistä ennustetekijöitä, ja esiintyvyys on LN etäpesäke alussa mahasyövässä (EGC) alueella 5 20% [2] – [4].

gastrectomy kanssa LN leikkelyn pidetään vakiohoito mahasyövän; kuitenkin 80-95% potilaista, joilla EGC eivät vaadi LN leikkelyn jos mahasyövän on täysin leikataan vähemmän invasiivisia hoitoja, kuten endoskooppinen resektio [5] – [7] tai vähän invasiivisia leikkaus (

esim

, yksinkertainen kiila resektio tai sentinellilinnun LN navigointi kirurgia) [8] – [10]. Vaikka tutkimukset biologinen ennustetekijöitä ja ennakoivan markkereita LN etäpesäke EGC on tehty, ei ennakoiva työkaluja olemassa nodal etäpesäke EGC todella.

Useat tutkimukset ovat raportoineet, että syvyys invaasio, kasvaimen koon ja imusuonten invaasio ovat liittyvä LN etäpesäke EGC [4], [11]. Kuitenkin useimmat näistä tekijöistä on määritetty sen jälkeen, kun lopullinen patologinen tutkimus resektoitiin kudosten, joka ei ole käyttökelpoinen määritettäessä hoitostrategia.

MikroRNA (miRNA) ovat pieniä ei-proteiinia koodaavan RNA: t. Tutkimukset ovat osoittaneet, että muutokset ilmentyminen miRNA myötävaikuttaa patogeneesiin syöpien, mukaan lukien ne, ruoansulatuselimistön [12] – [15].

miRNA on myös osoitettu olevan käyttökelpoinen erottamaan syövän ja normaaleissa kudoksissa [ ,,,0],16], [17]. Lisäksi miRNA ilmaistaan ​​eri tavoin kussakin vaiheessa mahasyövän syövän synnyn [18]. miRNA-27 [19] ja ZEB1 säädelty miRNA-200 perhe [20] ovat osoittaneet liittyvän vaiheeseen epiteelin-mesenkymaalitransitioon (EMT) mahasyövän. Siksi miRNA voi liittyä prosessi LN etäpesäkkeiden EGC. Joukossa miRNA miRNA-135a on osoitettu olevan kasvaimen tukahduttava miRNA, ja sen ilmentyminen säätyy alas useissa syövissä kuten munuaissolukarsinooma [21] ja lymfooma [22]. Puolestaan ​​yliekspressio tai palauttaminen miRNA-135a edistää apoptoosin ja hillitsee kasvainsolujen kautta kohdegeenien c-Myc [21] ja JAK2 [22], tässä järjestyksessä. Eräässä

in vitro

tutkimuksessa miRNA-135a tukahdutetaan muuttavien ja invasiivisia toimintoja mahalaukun syöpäsolujen [23]. Kuitenkin kasvain tukahduttava roolia miRNA-135a mahasyövän on epäselvä.

Tämän tutkimuksen tavoitteena oli tutkia korrelaatio miRNA-135a ilmaisun ja kliinisiin tuloksiin vuonna EGC-potilailla LN etäpesäke.

Materiaalit ja menetelmät

Ihmisen kudosnäytteitä ja kliiniset tiedot

Fifty-yhdeksän aikuista potilasta diagnosoitu EGC National Cancer Center, Korea, tammikuusta 2011 huhtikuu 2013 otettiin takautuvasti sisällytetty Tämä tutkimus. Näitä potilaita hoidettiin avoimessa tai laparoscopy-avusteinen gastrectomy kanssa D1 + tai enemmän LN leikkelyn. Laajuus LN leikkely seurannut suositusten Japani mahasyövän Association [24]. Näyttämö leikkauksen jälkeen arvioitiin mukaisesti 7

painos American sekakomitean Cancer TNM pysähdyspaikan järjestelmä [25]. Ihmisen kudoksissa, mukaan lukien sekä mahasyövän ja vastaaviin normaaleihin kudoksiin kunkin potilaan jäädytettiin välittömästi nestemäisessä typessä ja säilytettiin -80 ° C: ssa. Vuodesta tarkistamisen lääketieteellisen kaavioita, ennusteeseen viittaavia ominaisuuksia kuten ikä, sukupuoli,

Helicobacter pylori

tila, kasvainten ominaisuuksiin, vaihe, ja tila LN etäpesäkkeiden saatiin ja analysoitiin. Tietoon kirjallinen suostumus saatiin kaikki potilaat ja tutkimuksen hyväksyi Institutional Review Board of National Cancer Center, Korea (NCCNCS-11-445).

Soluviljely ja transfektio

ihmisen normaali mahan epiteelisolulinja HFE145 [26], [27] oli lahja tohtori Hassan Ashktorab ja Duane T. Smoot (Howard University, Washington, USA) ja kaupallisesti saatavilla mahasyövän solulinjoissa AGS, YCC2, MKN28, KATOIII, SNU1 , SNU5, SNU16, SNU216, SNU601, SNU638, SNU668, ja SNU719 saatiin Korea Cell Line Bank (KCLB, Seoul, Korea). Kaikkia solulinjoja pidettiin yllä RPMI 1640 väliaineessa, joka sisälsi 10% naudan sikiön seerumia (FBS) ja 1% antibiooteilla (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Niistä mahasyövän solulinjoissa, MKN28 ja SNU668 solulinjat valittiin, koska ne harvoin näihin miRNA-135a, ja YCC ja KATOIII solulinjat valittiin, koska niillä on merkittävä perustason ilmentyminen miRNA-135 (kuvio 1A). Transfektiot kanssa miRNA-135a matkii (Mirvana ™ miRNA jäljittelee, Ambion, Austin, TX, USA), joka on miRNA-135a estäjä (Mirvana ™ miRNA estäjä, Ambion, Austin, TX, USA), ja ROCK1 siRNA (5′-UGAUGCAAAGAUUGUACUC- 3 ”UGBioneer, Seoul, Korea) vuonna SNU668, YCC2, MKN28, ja KATOIII solulinjat tehtiin käyttäen Lipofectamine RNAiMAX ja Lipofectamine 2000 reagenssit (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) mukaan valmistajan ohjeiden. MKN28, SNU668, YCC2, ja KATOIII solulinjat kerättiin kahden päivän kuluttua transfektiosta ja erilaisten analyysien tehtiin.

(A) miRNA-135a ilmaisun tutkittiin reaaliaikainen PCR-analyysi, on säädellä vähentävästi mahasyövän solujen tavanomaiseen verrattuna mahan limakalvon soluista (HFE 145 solua). (B) Suhteellinen miRNA-135a ilmentyminen kasvainkudoksen viitaten normaaliin kollegansa reaaliaikaisella PCR-analyysi mukaan potilaan vaiheeseen.

* Potilaat, joilla kehittyneempien syöpä vaiheessa (vaihe IB tai enemmän) ovat merkittävästi alassäädetty miRNA- 135a ekspressiotasot kasvainkudoksissa verrattuna tasolle potilailla, joilla on vähemmän pitkälle (vaihe IA) syöpä (keskiarvo 9,97 vs. 2,30, p = 0,009). (C) Suhteellinen miRNA-135a ilmentyminen kasvainkudoksen viitaten normaaliin kollegansa reaaliajassa PCR-analyysi mukaan LN etäpesäkkeiden tila. Potilaat, joilla LN etäpesäkkeitä näytä merkittävästi alassäädetty miRNA-135a ekspressiotasot kasvainkudoksissa (verrattuna vastaaviin normaaleissa kudoksissa) kuin potilailla, joilla ei LN etäpesäke (keskiarvo 9,63 vs. 0,61, p = 0,002). * 7

th American sekakomitean Cancer TNM pysähdyspaikan.

RNA ja miRNA kvantifiointiin

Yhteensä RNA eristettiin 13 solulinjoista ja 59 mahasyövän potilaiden kudoksiin, vastaavasti, käyttämällä TRIzol (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) kohti valmistajan protokollaa. Taqman Universal PCR Master Mix reagenssit Kit (Applied Biosystems, Tokio, Japani) käytettiin. Monistus ja havaitseminen suoritettiin käyttäen 7900HT Sequence Detection System (Applied Biosystems, Tokio, Japani) ja 40 sykliä denaturointi 95 ° C: ssa (15 sekuntia) ja pariutumis /pidennys 60 ° C: ssa (60 sekuntia). Tämä edelsi käänteiskopioinnilla 50 ° C: ssa 30 minuutin ajan ja denaturointi 95 ° C: ssa 10 minuutin ajan. Kvantitoimiseksi kypsä miRNA, TaqMan MicroRNA Määritykset sarjat (Applied Biosystems, Tokio, Japani) käytettiin havaitsemiseen miRNA-135 ja ohjaus miRNA (RNU6B).

Western blot-analyysi

Protein oli uutetaan 13 solulinjoista ja 59 EGC potilaiden kudosnäytteistä käyttämällä RIPA puskuria (Biosesang, Seoul, Korea) sisältää proteaasiestäjäseostabletit (Sigma, St. Louis, MO, USA) valmistajan protokollan. Seuraavaksi Western blottaus suoritettiin käyttäen anti-ROCK1 ja anti-β-aktiini (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA) vasta-aineita. Signaalit detektoitiin ECL prime kit (GE Healthcare, Piscataway, NJ, USA) kohti valmistajan ohjeiden mukaisesti.

soluproliferaatiomääritykset

Soluproliferaatio mitattiin käyttämällä MTT-määritystä. Solut maljattiin 96-kuoppaisille viljelylevyille (3 x 10

3 solua per kuoppa), ja transfektoitiin miRNA-135 jäljittelee kahden päivän inkuboinnin jälkeen. Sen jälkeen, 200 ui MTT: tä (0,5 mg /ml, Sigma, St. Louis, MO, USA) lisättiin kuhunkin kuoppaan. Neljän tunnin lisäinkuboinnin, MTT liuokset heitetään pois, 200 ui DMSO: ta (Amresco, Solon, OH, USA), lisättiin kuhunkin kuoppaan, ja levyä ravisteltiin varovasti. Absorbanssi mitattiin ELISA-lukijalla (Moecular Devices, Sunnyvale CA, USA) testi aallonpituudella 570 nm.

Solusyklianalyysiä

Solut maljattiin 60π viljelymaljoille ja transfektoitiin miRNA -135a jäljittelee tai miRNA matkii negatiivinen kontrolli (Mimics-NC). Nämä solut kerättiin trypsinisaatiolla ja kiinnitettiin 70% etanolilla vähintään kahden tunnin ajan -20 ° C: ssa. Solupelletit pestiin kylmällä fosfaattipuskuroidulla suolaliuoksella, ja inkuboitiin 30 minuuttia huoneen lämpötilassa PI /RNaasi Värjäys Buffer (BD Biosciences, San Diego, CA, USA). Värjäyksen jälkeen näytteet analysoitiin FACScan-virtaussytometrillä (BD Biosciences, San Jose, CA, USA) ja 10000 tapahtumaa kerättiin näytettä kohti. Tiedot virtaussytometrillä analysoitiin käyttämällä Cell Quest -ohjelmistoa (Becton Dickinson, San Jose, CA, USA).

Trans-suodatin muuttoliike ja invaasion määritykset

Solut transfektoitiin miRNA-135a matkii miRNA-135a-inhibiittorit, ROCK1 siRNA, ja ROCK1 siRNA negatiivinen kontrolli (scRNA) yhden päivän ja siirretään sitten ylempään kammioon transwell päällystetty 0,5 mg /ml tyypin I kollageeni (BD Bioscience, Bedford, MA, USA) ja 1:15 laimennus Matrigel (BD Bioscience, Bedford, MA, USA). RPMI 1640, jossa oli 10% FBS: ää ja 1% antibiooteilla (Gibco BRL, Grand Island, NY, USA) lisättiin alempaan kammioon ja levyä oli inkuboitu 20 tunnin ajan. Siirtyminen ja tunkeutuvat solut kvantitoitiin käyttäen hematoksyliinillä ja eosiinilla värjäystä.

Euroopan lusiferaasireportteriplasmidin rakennelmien

Villityypin 3 ’UTR: ROCK1 sisältävien sitoutumiskohtia miRNA-135a monistettiin käyttämällä gDNA maasta SNU668 solujen mallina. Korreloitu mutantti konstruktioita luotiin mutatoimalla siemen alueilla miRNA-135 sitoutumiskohtia. Sekä villityypin ja mutantti-3 ’UTR kloonattiin alavirtaan lusiferaasigeenin on pGL3-kontrollivektorin. Konstruktit varmistettiin sekvensoimalla.

lusiferaasianalyysissä

Luciferase määritykset suoritettiin SNU668 ja YCC2 soluja. SNU668 ja YCC2 solut transfektoitiin kunkin plasmidien (tyhjä vektori [mock], ROCK1 3 ’UTR villityypin [WT], ja ROCK1 3’ UTR-mutantti [MUT], kuin miRNA-135 sitoutumiskohdan) yhdessä miRNA- 135a jäljittelee miRNA-135a-inhibiittorit, ja negatiivinen kontrolli RNA 24-kuoppalevyillä. Kaksi päivää transfektion jälkeen solut kerättiin ja lyysattiin. Lusiferaasi määritykset suoritettiin lysaatit käyttäen Luciferase Assay Kit (Promega, Madison, WI, USA). Lusiferaasiaktiivisuudeksi normalisoida p-galaktosidaasi.

immunohistokemiallinen värjäys

immunohistokemiallinen (IHC) värjäys suoritettiin edustavien 20 tapausta ROCK1 matala ja korkea ilmaisun ryhmiä. Antigeeni haku suoritettiin lämpökäsittely 30 minuutin ajan pH 8,0 Tris-EDTA-puskuriin (CC1, Ventana Medical System, Tucson, AZ, USA) 95 ° C: ssa. Tissue laseja inkuboitiin 42 ° C: ssa 30 minuutin ajan anti-ROCK1 mAb (ab134181, klooni EPR638Y, kani monoklonaalisia, 1:5,000; Abcam, Cambridge, MA, USA). Negatiiviset kontrollit käytettiin identtisesti immunisoimattomista kaniinin IgG. Tulokset tulkittiin kokenut patologi (MC Kook).

Tilastollinen

Scale tiedot esitetään keskiarvo ± keskihajonta (SD). Chi-square tai Fisherin testejä ja U-testi käytettiin vertaamaan kategorinen muuttujat ja jatkuvia muuttujia, vastaavasti. Pearsonin korrelaatiokerroin oli käyttää vertailtaessa geeniekspressiomalli välillä miRNA-135a ja ROCK1. Monimuuttujafunktiokehitettiin logistinen regressiomalli käytettiin määrittämään itsenäinen liittyvät tekijät LN etäpesäkkeitä. Kovariaatit jotka olivat merkittäviä käyttäen chi-neliö tai Fisherin testit (

P

0,05) merkittiin logistiikkaregressiomallin. Kaikki tulokset analysoitiin käyttämällä STATA 12,1 (Stata Corp, College Station, TX, USA).

P

arvo on alle 0,05 pidettiin tilastollisesti merkitsevä.

Tulokset

miRNA-135a ilmentymisen arvot liittyvät etenemiseen ja LN etäpesäkkeiden EGC

Aiemmassa tutkimuksessa on osoitettu, että miRNA-135a ilmentyminen säätyy alas mahasyövän solulinjoissa [23]. Käyttämällä qRT-PCR, Huomasimme myös, että miRNA-135a ilmentyminen säätyy alas erilaisissa mahasyövässä solulinjoissa verrattuna normaaliin mahalaukun epiteelisolulinja (kuvio 1A).

Kuitenkin korrelaatio miRNA-135a ilmaisun ja kliinisiin tuloksiin mahasyövän ei ole tutkittu. Siksi mittasimme miRNA-135a ekspressiotasot ensisijainen mahasyövän ja niiden vastaavia tasoja normaaleissa kudoksissa 59 potilaalla on EGC. Alas- ja ylös-säätely geenien tuumorikudoksissa suhteen normaaleissa kudoksissa määritettiin suhde kasvaimen normaaliin kudokseen geenin ekspressiotasoja 1,0 ja 1,0, vastaavasti.

vastoin tulosta on

in vitro

kokeessa vain 20 (33,9%) 59 potilaalla on EGC näytteillä alas-säätely miRNA-135a ilme. Nämä potilaat osoittivat merkitsevästi pitemmälle (TNM stage≥IB, 35,0% vs. 12,8%, p = 0,045; raakaa odds ratio [OR], 2,11; 95% luottamusväli [CI] 1,08-4,10) ja korkeampi LN etäpesäkkeiden (30,0% vs. 5,1%, p = 0,014; raakaöljyn OR, 2,73; 95% CI, 1,50-4,98) kuin ne, joilla säätely ylöspäin miRNA-135 lauseke (taulukko S1). Herkkyys ja spesifisyys miRNA-135a ilmentymistilanne ennustamiseksi LN etäpesäkkeiden olivat 75,0% ja 72,5%, tässä järjestyksessä. Lisäksi potilailla, joilla on pitemmälle (kuvio 1 B) tai LN etäpesäkkeiden (kuvio 1 C), oli huomattavasti pienempi suhteessa kasvaimen normaaliin miRNA-135a ekspressiotasot kuin ne, joilla on vaihe IA tai ilman LN etäpesäke. Monimuuttujafunktiokehitettiin regressioanalyysimme osoitti myös, että miRNA-135a alassäätöä oli itsenäisesti liittyy LN etäpesäkkeitä (säädetty OR, 8,04; 95% CI, 1,08-59,81; p = 0,042; taulukko 1). Yhdessä nämä havainnot viittaavat siihen, että alas-säätely miRNA-135a ilmentyminen voi liittyä mahalaukun syövän etenemisessä lukien LN etäpesäkkeitä.

miRNA-135a estää mahalaukun syövän solujen elinkykyä, EMT, muuttoliike, ja invaasio

Jotta voitaisiin edelleen tutkia yhdistyksen välillä miRNA-135a ja kliinisiin tuloksiin, suoritimme toiminnalliset analyysit solujen elinkelpoisuuden, solusykliä, EMT, muuttoliike, ja hyökkäyksen mahasyövässä solulinjoissa. Yliekspressio miRNA-135a by miRNA-135 jäljittelee suppressoi merkittävästi solujen elinkelpoisuuden (kuvio 2A) ja lisäsi subdiploid osa SNU668 soluja, solu- linja, joka harvoin ilmaisee miRNA-135 (kuvio 2B), mikä viittaa siihen, lisääntynyt apoptoosi mahalaukun syövän soluja. Kuitenkin tukahduttaminen miRNA-135a by miRNA-135a estäjien aiheuttama ei lisää solujen elinkelpoisuuden eikä subdiploid murto väheneminen YCC2 soluissa, solulinjassa, joka ilmentää merkittävää miRNA-135 (kuvio 2A ja 2B). Olemme myös tutkineet yhdistyksen välillä miRNA-135a ilmaisun ja EMT mahalaukun syöpäsoluja, koska miRNA-135a alassäätöä oli itsenäinen riskitekijä LN etäpesäke EGC potilailla (taulukko 1). Lisääntynyt ilmentyminen miRNA-135a liittyi tukahduttaminen EMT ja osoitti kasvua ilmaus E-kadheriinin ja tukahduttaminen molempien N-kadheriinin ja Slug in SNU688 soluissa. Sen sijaan esto miRNA-135a ilmentyminen johti aktivointi EMT lukien tukahduttaminen E-kadheriinin ilmentymisen ja säätely ylöspäin Sekä N-kadheriinin ja Slug ilmentymisen YCC2 soluissa (kuvio 2C). Arvioinnissa toiminnallisia seurauksia, yliekspressio miRNA-135a by miRNA-135a jäljittelee merkittävästi tukahdutti migraation ja invaasion kyvyt SNU668 mahalaukun syöpäsolujen (kuvio 2D). Toisaalta saarto miRNA-135a by miRNA-135a-inhibiittorit huomattavasti maahanmuuttoa ja hyökkäys YCC2 mahalaukun syöpäsolujen (kuvio 2E). Kaiken kaikkiaan tuloksemme ehdotti, että miRNA-135a on kasvain tukahduttava säädin mahasyövän lisääntymistä ja etäpesäkkeiden.

(A) ylös-säätely miRNA-135 aiheuttama miRNA-135a matkii estää mahalaukun syöpä solujen elinkelpoisuutta SNU668 solulinja, solulinja, joka harvoin ilmentää miRNA-135 (p = 0,012), kun taas miRNA-135a-inhibiittorit harvoin vaikuttaa solujen elinkelpoisuutta YCC2 solulinjassa, solulinja, joka olennaisesti ilmentää miRNA-135a. (B) ylös-säätely miRNA-135a by miRNA-135a jäljittelee kasvattaa subdiploid osa DNA, määritettynä virtaussytometrialla analyysi, mikä viittaa lisääntynyt apoptoosin SNU668 soluissa. (C) läsnä ollessa miRNA-135a jäljittelee, RT-PCR-analyysi osoittaa, että SNU668 solut ovat kasvaneet mRNA: n ilmentymisen ja E-kadheriinin ja estää mRNA: n ilmentymisen sekä N-kadheriinin ja Slug. Toisaalta, kun läsnä on miRNA-135a-inhibiittorit, YCC2 solut osoittavat vähentynyt mRNA: n ilmentymisen ja E-kadheriinin ja lisääntynyt mRNA: n ilmentymisen sekä N-kadheriinin ja Slug RT-PCR-analyysillä. (D) yli-ilmentyminen miRNA-135a käyttäen miRNA-135a matkii suppressoi merkittävästi maahanmuutto- ja invaasion SNU668 soluja. (E) esto miRNA-135a käyttäen miRNA-135a-inhibiittorit lisää merkittävästi muuttavien ja invasiivisia solujen YCC2 soluja. Esitetyt tulokset ovat keskiarvoja ± SD vähintään kolmen kokeen. NC, negatiivinen kontrolli.

ROCK1 on tavoite geeni miRNA-135a mahasyövän

Valaistaan ​​mekanismeista vaikutuksia miRNA-135a kliiniseen tulokseen, etsimme otaksuttu tavoitteet käyttämällä TargetScan 6.2 tietokantaan. 718 säilytetty tavoitteet, valitsimme tavoitteensa korkeimmat pisteet, joiden alassäätöä voi lisätä sen syöpäsolujen proliferaatiota, migraatiota ja invaasiota. Olemme havainneet, että ROCK1 voi olla kohdegeenin miRNA-135a, koska inhibitio tai poistaminen ROCK1 on raportoitu edistämään apoptoosia ja tukahduttaa muuttoliike, invaasio, ja syöpäsolujen lisääntymistä mukaan lukien mahasyöpä [28] – [30]. TargetScan analyysi paljasti, että 3′-UTR-sekvenssin ROCK1 on yksi mahdollinen sitoutumiskohta miRNA-135 (kuvio 3A). Vahvistaa, onko ROCK1 on tavoite miRNA-135a, lusiferaasianalyysissä suoritettiin. Lusiferaasi 3’UTR konstruktioita kuvattu menetelmissä osassa olivat kotransfektoitiin SNU688 soluihin miRNA-135a matkii ja osaksi YCC2 solujen miRNA-135a-inhibiittorit. Meillä on myös rakennettu ROCK1 3’UTR MUT mukaan pistemutaatio C → G mahdollista sitoutumiskohtaa (kuvio 3A). Suhteellinen lusiferaasin aktiivisuus ROCK1 3’UTR WT lisääntyi merkitsevästi, kun läsnä on miRNA-135-inhibiittorit (kuvio 3B). Käänteisesti tämä aktiivisuus väheni huomattavasti, kun läsnä on miRNA-135 matkii (kuvio 3C). Mahasyövän solulinjoissa, miRNA-135a ja ROCK1 osoittivat vastustajan ilme kuvio. Western blot-analyysi osoitti, että ROCK1 ilmentyminen alassäädetty läsnäollessa miRNA-135a jäljittelee, ja säädelty läsnäollessa miRNA-135a-inhibiittorit (kuva 3D ja 3E). Yhdessä nämä tulokset osoittavat, että miRNA-135a estää ROCK1 ilmentyminen suoraan kohdentamalla sen 3’UTR.

(A) 3 ’UTR sekvenssi ROCK1 on yksi mahdollinen sitoutumiskohta miRNA-135a, määritettynä TargetScan analyysi. 3 ’UTR rakentaa varten ROCK1 WT ja MUT on esitetty. (B) läsnä ollessa miRNA-135a-inhibiittorit, suhteellinen lusiferaasiaktiivisuus ROCK1 3 ’UTR WT on merkittävästi lisääntynyt verrattuna ROCK1 3’ UTR MUT in SNU668 solujen (p = 0,035). (C) Päinvastoin, kun läsnä on miRNA-135a jäljittelee suhteellinen lusiferaasiaktiivisuus ROCK1 3 ’UTR WT on merkittävästi vähentynyt (p = 0,043), kun taas suhteellinen lusiferaasiaktiivisuus ROCK1 3’ UTR MUT ei ole vähentynyt YCC2 solulinjassa. (D) Western blot-analyysi osoittaa, että yli-ilmentyminen miRNA-135a käyttäen miRNA-135a matkii tukahduttaa ROCK1 proteiinin ilmentymistä MKN28 ja SNU688 mahasyövän soluja, jotka ovat solulinjat, jotka harvoin ilmaista miRNA-135a. (E) esto miRNA-135a liittyy lisääntynyt ROCK1 proteiinin ilmentymistä YCC2 ja KATO III mahasyövän soluja, jotka ovat solulinjat, jotka olennaisesti ilmaista miRNA-135a. Esitetyt tulokset ovat keskiarvoja ± SD vähintään kolmen kokeen. WT, villityypin; MUT, mutantti; NC, negatiivinen kontrolli.

ilmentyminen ROCK1 korreloi käänteisesti kuin miRNA-135 potilailla, joilla EGC

analyysi 59 potilaalla on EGC osoittivat, että ekspressiotasot ROCK1 oli merkitsevästi negatiivinen korrelaatio kuin miRNA-135 (r = -0,697, p 0,001; kuvio 4A). Lisäksi potilailla, joilla säätely ylöspäin miRNA-135a ilme oli merkittävästi alhaisempi ROCK1 proteiinin ilmentymisen kuin ne, joilla on alas-säätely miRNA-135 (kasvaimen normaaliin suhde, 0,81 vs. 1,55, p 0,001; kuvio 4B) .

(A) miRNA-135 ilmentyminen mitattiin reaaliaikaisella PCR-analyysillä. ROCK1 proteiini taso arvioitiin käyttämällä western blot analyysiä ja kvantifioidaan densitometrinen menetelmällä. 59 Potilailla, joiden mahasyöpä, ilmaus ROCK1 osoittaa merkittävästi negatiivinen korrelaatio kanssa, miRNA-135 (r = -0,697, p 0,001). (B) Western blot-analyysi osoittaa, että potilailla, joilla alassäädetty miRNA-135a ilme on huomattavasti suurempi ROCK1 proteiinin ilmentyminen kasvainkudoksissa verrattuna ilmentymisen vastaaviin normaaleissa kudoksissa (p 0,001).

ROCK1 on liittyvä LN etäpesäke EGC ja osallistuu mahasyövässä solumigraatioon ja invaasiota tukahdutti miRNA-135a

edelleen arvioimista yhdistyksen välillä ROCK1 ilmaisun ja kliinisiin tuloksiin vuonna EGC, olemme analysoineet malleja ROCK1 ilmaisun viite että LN etäpesäkkeiden tilan mukana potilaita. Potilaat, joilla LN etäpesäkkeitä oli merkitsevästi enemmän ilmaus ROCK1 proteiinin kuin ilman LN etäpesäkkeiden (kasvaimen normaaliin suhde, 1,86 vs. 0,93, p = 0,007; Kuva 5A). Lisäksi tasot ROCK1 IHC värjäys olivat samanlaisia ​​kuin ROCK1 ilmaisun western blot-analyysi (

eli

, potilailla, joilla ei LN etäpesäke oli heikko IHC värjäyskuviot [Kuva 5B], mutta ne, joilla LN etäpesäkkeitä oli vahva positiivinen IHC värjäytyminen [Kuva 5C]).

(A) Western blot-analyysi 59 varhaisen mahasyöpäpotilaista osoittaa, että potilailla, joilla LN etäpesäkkeitä on huomattavasti suurempi ROCK1 proteiinin ilmentymisen kuin potilailla, joilla ei LN etäpesäke (p = 0,007). Edustavia mikroskooppisia kuvia tuumorisektioiden kanssa immunohistokemiallisella värjäyksellä (alkuperäinen suurennos x 100) osoittavat, että (B) varhainen mahasyöpäpotilaista ilman LN etäpesäke ole ROCK1 ilmentymistä tuumorikudoksissa, mutta (C), joilla on LN etäpesäkkeitä on vahva ROCK1 ilme sisällä ydin- kalvo ja sytoplasmassa tuumorikudoksissa. (D) ROCK1 siRNA suppressoi merkittävästi muuttoliikkeen (p 0,001) ja invaasio (p = 0,002) in SNU668 mahalaukun syöpäsoluja. (E) ROCK1 proteiinin ilmentyminen lisääntyy käsittelemällä miRNA-135a-inhibiittorit ja laski käsittelemällä ROCK1 siRNA, ja siihen liittyy lisääntynyt miRNA-135a tason YCC2 mahasyövän soluja, mikä viittaa siihen, että ROCK1 proteiinin ilmentyminen kuviot ovat käänteisesti verrannollisia näiden miRNA-135a ilme. (F) Kun YCC2 soluja käsitellään miRNA-135a-inhibiittorit, soluinvaasiota ja muuttoliike ovat samankaltaisia ​​tai jopa lisääntynyt verrattuna kontrolleihin. ROCK1 siRNA tai yhdistetty ROCK1 siRNA ja miRNA-135a estäjät vähentävät solujen vaeltamiseen (p = 0,003) ja invaasio (p = 0,017). Nämä viittaavat siihen, että ROCK1 kompensoi tukahduttava vaikutus sekä maahanmuuton ja invaasio, joka indusoi miRNA-135a. Esitetyt tulokset ovat keskiarvoja ± SD vähintään kolmen kokeen. LN, imusolmuke; NC, negatiivinen kontrolli.

Lopuksi tutkia tukahdutetaan muuttoliikettä ja invaasiota kykyjä myönnettyjä Mirna-135a ylössäätöä havaittu mahasyövässä solulinjoissa johtuivat ROCK1 säätelyä ylöspäin, me suoritettu muuttoliike ja invaasio, joissa käytetään mahasyövän jotka transfek- erityisiä ROCK1 siRNA. ROCK1 siRNA tukahdutti vaeltavia ja invasiivisia toimintoja SNU668 soluissa (kuvio 5D). Vuonna YCC2 solut kotransfektoitiin miRNA-135a-inhibiittorit ja ROCK1 siRNA (kuvio 5E), maahanmuutto ja invaasio määritykset osoittivat, että esto ROCK1 siRNA vaimensi merkittävästi parantaa muuttavien ja invasiivisia vaikutukset miRNA-135a alassäätö by miRNA-135a estäjät (Kuva 5F).

Yhdessä nämä tulokset viittaavat siihen, että ROCK1 liittyy LN etäpesäke EGC potilailla, ja että tämä johtuu lisääntyneestä ROCK1 ilmaisun yhteydessä miRNA-135a alassäätöä. Siksi ROCK1 voi osallistua miRNA-135a-tukahdutetaan mahasyövässä etäpesäke.

Keskustelu

Tässä tutkimuksessa olemme huomanneet, että miRNA-135a oli tuumoria tukahduttavan rooleja mahasyövässä. Potilailla, joilla EGC, alas-säätely miRNA-135 oli itsenäinen riskitekijä LN etäpesäke. Mahalaukun syöpäsoluja, säädelty miRNA-135a tukahdutti mahasyövän tukahduttamalla solujen lisääntymistä, EMT, ja etäpesäkkeitä. Lisäksi olemme tunnistaneet uuden tavoite geenin miRNA-135a, ROCK1, joka liittyi LN etäpesäkkeitä mahasyövän.

Jos potilaalla on EGC, arviointi LN etäpesäkkeiden ennen hoitoa on tärkeä askel määritettäessä hoidon strategioita. Vähemmän invasiivisia hoitoja, kuten endoskooppinen resektio [5] – [7] tai sentinellilinnun LN valikkoon leikkaus [9], [10] voi olla mahdollista EGC potilailla, joilla ei LN etäpesäke. Nämä hoitomuodot ovat parantaneet potilaiden elämänlaadun suhteen myöhään komplikaatioita standardin kirurgisia hoitoja, kuten vastaisten oireyhtymä, laihtuminen, ja refluksi liittyviä oireita [31]. Siksi tarkempi ja herkkä biomarkkereiden tarvitaan ennustaa tilan LN etäpesäkkeiden sairastavilla potilailla EGC. Esillä olevassa tutkimuksessa, miRNA-135a alassäätöä oli itsenäinen tekijä LN etäpesäke, ja ennustaminen arvo miRNA-135a ilmentymistilanne oli suhteellisen korkea, herkkyys 75% ja spesifisyys 73%. Vaikka lisävalidointia tutkimuksia tarvitaan, nämä tulokset osoittivat, että mittaus miRNA-135a tasolle ennen määritettäessä hoitosuunnitelma EGC potilaat voivat olla hyödyllinen testi ennustamiseen LN tila.

Mielenkiintoista, miRNA-135a on raportoitu olevan kasvain ehkäisevästä ja onkogeenisten. Yli-ilmentymisen miRNA-135a on liittynyt tukahduttaminen kasvaimen leviämisen ja kasvun munuaissolusyövässä [21] ja voimistunutta apoptoosia ja paremmin taudista vapaan eloonjäämisen lymfooman [22]. Sen sijaan miRNA-135a oli mukana peräsuolen syövän etenemisessä [32] ja lisääntynyt rintasyövän solumigraatioon ja invaasiota [33]. Esillä olevassa tutkimuksessa, miRNA-135a osoitettiin olevan kasvain tukahduttava miRNA, joka on yhtä mieltä seurausta aiemman tutkimuksen [23]. Erityisesti, korkeampi ilmentyminen miRNA-135a tukahdutti useita vaiheita mahasyövän kuten solujen lisääntymisen, migraation ja invaasion. Lisäksi olemme havainneet, että miRNA-135a voisi tukahduttaa EMT, joka on raportoitu liittyvän aloittamiseen monivaiheisessa prosessissa syövän synnyn ja edistäminen etäpesäkkeiden [34], [35]. Ennen tässä tutkimuksessa, yhdistyksen välillä miRNA-135a ja EMT ei ole tutkittu, vaikka aikaisemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että miRNA kuten miRNA-27 [19], miRNA-200 perhe [20], miRNA-7 [36] ja miRNA-1228 [37] tukahduttaa EMT omilla kohdegeenien mahasyövän. Yhdessä miRNA-135a on kasvain tukahduttava miRNA mahasyövän.

Aiemmassa tutkimuksessa analysoidaan 353 ihmisen mahasyövän kudosten osoitti, että ilmentyminen malleja miRNA ovat erilaisia ​​ja että jotkut miRNA liittyivät etenemiseen ja ennusteeseen mahalaukun syöpä [14]. Tutkimuksessa miRNA-135a luokiteltiin onkogeenisessä miRNA mahasyövän perustuu tuloksiin DNA-siru analyysejä. Kuitenkin äskettäin [23] ja Tutkimuksessamme miRNA-135a toimi tuumorisuppressorina huolimatta korkeasta potilaalla on miRNA-135a säätelyä ylöspäin.