Krooninen sairaus

tiivistelmä

DNA: n metylaatio on tärkeä rooli syövän synnyssä ja palautuvuus tämän epigeneettiset muutos tekee mahdolliseksi terapeuttiseksi kohde. Tähän mennessä DNA metyylitransferaasin estäjien (DNMTi) eivät ole osoittaneet kliinistä tehoa eturauhassyöpään, jossa yksi suurimmista esteistä on kyvyttömyys seurata lääkeaineen kokeen aikana. Koska korkean taajuuden ja spesifisyyden

GSTP1

DNA: n metylaation eturauhassyövässä, me tutkimme,

GSTP1

on käyttökelpoinen merkkiaine DNMTi hoidon tehon. LNCaP eturauhassyövän soluja käsiteltiin 5-atsa-2′-deoksisytidiini (5-atsa-CDR) joko yksittäinen korkea annos (5-20 uM), joka toinen päivä (0,1-10 uM) tai päivittäin (0,005-2,5 uM). Päivittäinen hoito 5-atsa-CdR oli optimaalinen, joilla on merkittäviä solujen proliferaatio saavutettiin annoksilla 0,05 uM tai enemmän (p 0,0001) ja solukuoleman induktioon 0,5 uM (p 0,0001). Sitä vastoin hoito yksittäinen korkea-annos on 20 uM 5-atsa-CdR inhiboi soluproliferaatiota, mutta ei pystynyt indusoimaan solukuolemaan. Demetylaation

GSTP1

havaittiin annoksilla 5-atsa-CdR joka indusoi merkittävää solujen proliferaatio (≥0.05 uM). Re-ilmentyminen GSTP1 proteiinin havaittiin vain annoksilla 5-atsa-CDR (≥0.5 uM), jotka liittyvät solukuoleman induktioon. Hoito LNCaP-solujen vakaampi DNMTi, Zebularine vaaditaan ainakin 100 kertaa suurempi annos (≥50 uM) proliferaation inhiboimiseksi ja oli vähemmän tehokas indusoimaan solukuoleman, mikä vastasi puute GSTP1 proteiinin uudelleen ilmentymisen. Olemme osoittaneet, että

GSTP1

DNA: n metylaation ja proteiinin ekspressio tila korreloi DNMTi hoitovaste eturauhassyöpäsoluissa. Koska

GSTP1

metyloituu lähes kaikissa eturauhasen syöpiä, tuloksemme takaa sen testaus markkerina epigeneettiset hoidon vasteen tulevaisuudessa kliinisissä tutkimuksissa. Olemme päätellä, että DNA: n metylaation ja proteiinin ilmentymisen tilan

GSTP1

ovat hyviä indikaattoreita DNMTi tehosta.

Citation: Chiam K, Centenera MM, Butler LM, Tilley WD, Bianco-Miotto T ( 2011) GSTP1 DNA metylointi ja Expression tila osoittaa 5-atsa-2′-Deoksisytidiini Teho ihmisen eturauhassyöpä solut. PLoS ONE 6 (9): e25634. doi: 10,1371 /journal.pone.0025634

Editor: Irina Agoulnik, Florida International University, Yhdysvallat

vastaanotettu: 07 maaliskuu 2011; Hyväksytty: 08 syyskuu 2011; Julkaistu: 28 syyskuu 2011

Copyright: © 2011 Chiam et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat avustuksia National Health ja Medical Research Council (627185; WDT, LMB, TBM), US Department of Defense (W81XWH-04-1-0017, WDT, LMB), Cancer Australia /Eturauhassyöpä Foundation of Australia ( 627229; LMB, WDT), Eturauhassyöpä Foundation of Australia Equipment Grant (EG0809, WDT, LMB, TBM), W. Bruce Hall Cancer neuvoston SA Research Fellowship (TBM), ja Syöpä neuvoston SA Senior Research Fellowship (LMB). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Eturauhassyöpä on yksi yleisimmin diagnosoitu uros syövistä länsimaissa. Nykyinen hoitomuotojen kliinisesti paikallinen tauti kuuluu kirurginen poistaminen eturauhanen (eturauhasen) ja /tai sädehoidon kanssa tai ilman androgeenien puute hoitoa (ADT). Koska löytö, vuonna 1940, että eturauhasen syöpä on riippuvainen miessukuhormonit [1] aluksi kastraatio ja sittemmin erilaisia ​​ADT, joko yksin tai yhdistettynä androgeenireseptorin (AR) antagonistit, ovat olleet tärkein hoito metastasoituneen sairaus. Alun pituus vaihtelee kasvaimen taantumisesta, useimmat metastasoivaa eturauhassyöpää syövät edetä on ”kastraatio kestävä” vaiheessa, että ei reagoi ADT. Tällä hetkellä vain niukasti hoitomahdollisuuksia kastraatio kestävä eturauhassyövän ja näin ollen on olemassa pakottava tarve kehittää uusia hoitoja.

On vakiintunut, että epigeneettisellä muutokset ovat yleisiä tapahtumia Karsinogeneesin lukien eturauhassyöpä, joka voi johtaa poikkeavaan ilmentymistä kriittisten geenien kuten tuumorisuppressoreilla ja onkogeenit. Toisin DNA mutaatiot, epigeneettiset muutokset ovat kemiallisesti palautuvia agentit tunnetaan epigeneettisellä inhibiittorit ja ovat siten mahdollisia terapeuttisia kohteita. Esimerkkejä epigeneettiset-inhibiittorit, jotka ovat osoittaneet menestys terapeuttisina aineina ovat DNA-metyylitransferaasin estäjien (DNMTi), 5-atsa-sytidiinin (5-atsa-CR tai Vidaza) ja sen tehokkaampi analoginen 5-atsa-2′-deoksisytidiini (5- atsa-CdR tai desitabiinista). 5-atsa-CR ja 5-atsa-CdR ovat nukleosidi DNMTi kehitetään aluksi syövän kemoterapeuttiset aineet, joita tällä hetkellä käytetään hoidettaessa myelodysplastista oireyhtymää (MDS) [2]. Demetyloiva toimia 5-atsa-CR ja 5-atsa-CdR luottaa niiden kyky sisällyttää replikoituvaan DNA: han ja kovalenttisesti sitoutuvat DNMT1 entsyymin peruuttamattomalla tavalla, joka johtaa DNMT1 proteiinien hajoaminen [2], [3]. Kuten DNMT1 ylläpitäminen vaatii DNA: n metylaatio replikaation aikana, hajoaminen DNMT1 johtaa myöhemmin menetys DNA: n metylaatio.

Aberrant ilmentymistä epigenetic muokkaamalla osallistuvien entsyymien säätelyyn DNA: n metylaation on havaittu kaikissa vaiheissa eturauhassyövän etenemiseen [4], [5], [6]. Global tasot 5-metyylisytosiinia ja epigeneettiset muokkaamalla osallistuvien entsyymien DNA: n metylaatio (ts DNMTs) ennustaa todennäköisyyttä sairauden etenemisen eturauhasen syöpä. Tämä havainto viittaa siihen, että DNA: n metylaatio saattaa olla tärkeä etenemisen eturauhasen syöpä, ja siksi DNMTi olisi pidettävä mahdollisena hoitovaihtoehto [7], [8], [9]. Vaikka

in vitro

kokeiluja ja eläinmalleissa on osoitettu, että 5-atsa-CdR on anti-kasvain toimintaa useissa syövissä kuten eturauhassyöpä [10], [11], [12], [13], [14 ], kliiniset kokeet 5-atsa-CdR hoitoon kiinteitä kasvaimia eivät ole onnistuneet takia huumeiden liittyvien haittavaikutusten, kuten myelosuppressio, pahoinvointi ja oksentelu [15], [16], [17]. Lisäksi myrkyllisyys kysymyksiä, tehokkuutta toimitus ja oton 5-atsa-CDR kasvainkudoksessa, on epävarmuutta optimaalinen annos-aikataulu tietyn kasvaimen tyypit [18]. Tähän mennessä vain yksi pieni vaiheen II tutkimus, jossa 5-atsa-CdR eturauhassyövässä on julkaistu noin kymmenen vuotta sitten [16]. Vaikka on olemassa jatkuva kliinisissä tutkimuksissa 5-atsa-CdR eri kiinteitä kasvaimia, mikään näistä tutkimuksista ovat syöpää erityisiä eivätkä ne kuuluvat eturauhassyöpä (National Institutes of Health, USA, clinicaltrials.gov).

In vitro

tutkimuksissa vaikutusten tutkiminen 5-atsa-CdR eturauhassyövässä solulinjoissa (katso taulukko S1) ovat käyttäneet erilaisia ​​hoito-ja erilaisia ​​määritelmiä matala ja korkea 5-atsa-CdR annoksina, mikä vaikeuttaa vertailla välillä tutkimusten ja määritellä optimaalinen hoito-ohjelma, kuten annoksesta aikataulu, eturauhassyövän. Yllättäen hyvin harvat

in vitro

tutkimuksissa (taulukko S1A) ovat tutkineet vaikutuksia 5-atsa-CdR proliferaatioon ja selviytymisen eturauhassyöpäsolujen, vaan ovat tutkineet vaikutusta 5-atsa- CdR geenien ilmentymisen, jotta voidaan tunnistaa ehdokas epigeneettiseltä geenien (taulukko S1B).

tämän tutkimuksen tavoitteena oli tutkia annoksesta riippuvaa vaikutusta 5-atsa-CdR eturauhasen syöpäsolujen näköalalla tarjoaa perustan kehittää optimaalinen 5-atsa-CdR hoitomenetelmän eturauhassyövän. Tutkimme myös suhteellisesta myrkyllisyydestä 5-atsa-CDR: n ja Zebularine LNCaP-eturauhassyöpäsoluissa. Zebularine on sytidiinianalogi, joka on samankaltaisia ​​toimintoja 5-atsa-CDR demetyloivan aineena, mutta se on vähemmän toksinen, ja on vakaampi puoliintumisaika (~508 tunnin ajan 37 ° C: ssa, pH 7) kuin 5-atsa-CDR ( 12 tuntia 37 ° C: ssa, pH 7) [19], [20]. Tunnistaminen hyvä merkkiaine DNMTi tehon kliinisiin kokeisiin, aivan kuten mittaamalla seerumin PSA tasoilla tehon seurantaan ADT [21], olisi mahdollisuus tukea kliinistä eturauhassyövän hoito potilailla, joita hoidettiin epigenetic hoitoihin. Tehokkuuden tutkimiseksi 5-atsa-CDR: n ja Zebularine eturauhassyöpäsoluissa, tutkimme DNA: n metylaation ja ilmentymisen tila glutationi-S-transferaasin P1 (

GSTP1

) geenin.

GSTP1

on hypermetyloitunut lähes kaikissa ihmisen eturauhasen syöpiä ja sen promoottori DNA: n metylaatio taso pystyy erottamaan eturauhasen hyvänlaatuinen liikakasvu ja eri laatuja eturauhasen adenokarsinooma [6], [22], [23], [24] , [25]. Vaikka nykyiset tutkimukset ovat keskittyneet käyttämällä

GSTP1

mahdollisena markkerina varhaiseen havaitsemiseen eturauhassyöpä, ehdotamme, että arvioitaessa DNA metylaatio

GSTP1

promoottorialueen sekä ilmaus GSTP1 , on potentiaalia olla hyödyllinen väline määritettäessä DNMTi tehon eturauhassyöpää.

Materiaalit ja menetelmät

mittaaminen solujen elinkelpoisuuden

LNCaP ja PC3 ihmisen eturauhasen syöpä soluja ( American Type Culture Collection, ATCC) ylläpidettiin RPMI 1640, jota oli täydennetty 5%: n tai 10% naudan sikiön seerumia (FBS). 5-atsa-CDR: n ja Zebularine (Sigma, A3656 ja Z4775) liuotettiin dimetyylisulfoksidiin (DMSO) ja Hankin puskuroitu suolaliuos vastaavasti. Yhtenäisen ja joka toinen päivä hoidon 5-atsa-CDR-solut ympättiin kolmena rinnakkaisena 24-kuoppalevyillä tiheydellä 2,5 x 10

4 solua per kuoppa 1 ml: ssa RPMI-väliainetta. 5-atsa-CdR päivittäin hoitoon ja Zebularine hoito, solut ympättiin kolmena rinnakkaisena 12-kuoppalevyillä tiheydellä 1 x 10

4 solua per kuoppa 1 ml: ssa RPMI-väliainetta. Solujen annettiin kiinnittyä 241h tai 48 h, kun solujen konfluenssiin oli saavutettu ja sen jälkeen inkuboitiin elatusaineessa, joka sisälsi 5-atsa-CdR pitoisuuksina 0-20 uM tai Zebularine pitoisuuksina 50-1000 pM. Myöhemmin tai muita hoitoja, tuore 5-atsa-CDR- tai Zebularine laimennettuna media lisättiin soluihin. Media sisältäviä vastaavia aineita olivat juuri valmistettu 10 mM 5-atsa-CdR ja 70 mM Zebularine varastot ennen hoidon. Solut trypsinoitiin ja laskettiin hemosy- määritettyyn ajankohtina hoidon aloittamisen jälkeen ja solujen elinkelpoisuus arvioitiin trypaanisinivärin syrjäytymisen kuten aikaisemmin on kuvattu [26]. Data ilmaistaan ​​keskiarvona +/- SE kolmen kuopan, ja ne edustavat ainakin kahden itsenäisen kokeen.

immunoblottauksella

LNCaP-soluja siirrostettiin 6-kuoppaisille levyille tiheydellä 2 x 10

4 solua per kuoppa 2 ml: ssa RPMI-väliainetta, joka sisälsi 10% FBS: ää. Solujen annettiin kiinnittyä 24 tunnin ajan, ennen kuin väliaine vaihdettiin väliaineeseen, joka sisälsi käsittelyt. Solut hajotettiin lisäämällä radioimmunosaostuskokeella lyysipuskuria (10 mM Tris-HCL, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% Triton X-100), joka sisältää mini-täydellinen proteaasi-inhibiittori pelletit (Roche). Lysaatit (15-30 ug) suoritettiin elektroforeesi 5%: n tai 12% polyakryyliamidigeeleillä, siirrettiin nitroselluloosamembraanille (Amersham Biosciences), ja blokattiin 5% rasvatonta maitojauhetta TBS: ssä, joka sisälsi 0,05% Tween 20: tä yli yön. Immunodetektio suoritettiin erityisiä ensisijainen vasta-aine laimennettuna 1% rasvatonta maitojauhetta TBS sisälsi 0,05% Tween 20: tä. GSTP1 vasta-ainetta (Chemicon, AB8902) käytettiin laimennoksena 1:5000 ja inkuboimalla yön yli 4 ° C: ssa. Hsp90-vasta-ainetta (Santa Cruz Biotechnology) käytettiin laimennoksena 1:1000 ja 30 min huoneenlämpötilassa inkuboinnin jälkeen. Piparjuuriperoksidaasi-konjugoidulla anti-kaniini-vasta-ainetta (DAKO, E0432) käytettiin laimennoksena 1:2000 ja 30 min huoneenlämpötilassa inkuboinnin jälkeen. Tulokset tehtiin näkyviksi Hyperfilm (GE Healthcare) käyttäen tehostettua kemiluminesenssidetektiolla (GE Healthcare).

DNA metylointianalyysi

Kun solujen elinkelpoisuuden arviointi, loput LNCaP-solut kerättiin genomista DNA: n eristämiseksi käyttäen TES (10 mM Tris-HCI: ää pH: ssa 8, 0,1 M NaCl, 1 mM EDTA) -puskurissa, proteinaasi K ja 20% SDS, kuten aiemmin on kuvattu [27]. DNA (1-2 ug näyte) oli bisulfiitin muokatun MethylEasy ™ DNA bisulfiittimutaqeneesi Muutos Kit (Human Genetic allekirjoitukset Pty Ltd) mukaan valmistajan protokollaa. Yhteensä 25 ul tai 50 ui PCR-reaktioseos koostui 3-5 ui bisulfiitti muunnettua DNA: ta ja 2,5 yksikköä HotstarTaq DNA-polymeraasia (Qiagen).

GSTP1

metylaatiospesifistä polymeraasiketjureaktion (MSP) [28] ja yhdistetyt bisulfiittimodifiointi rajoituksista Analysis (COBRA) [29] alukkeet ostettiin GeneWorks (South Australia, Australia).

GSTP1

MSP alukesekvenssit olivat, kuten aiemmin on kuvattu [24], ja kaikki alukesekvenssit Tässä tutkimuksessa käytetty on esitetty kuviossa S1. Hehkutus lämpötilat vastaavien alukkeet olivat: 40 sykliä 64,3 ° C: ssa metyloitu

GSTP1

MSP-alukkeita; 45 sykliä 61,6 ° C: ssa metyloimaton

GSTP1

MSP-alukkeita; 45 sykliä 56.8 ° C: ssa

GSTP1

COBRA alukkeita. PCR tuotteet

GSTP1

COBRA analyysit pilkottiin restriktioentsyymeillä BstUI ja Hhal (New England BioLabs). PCR-tuotteet visualisoitiin agaroosigeelielektroforeesime- kanssa AlphaImager 2200 geeli asiakirjajärjestelmä (San Leandro).

Tilastollinen

Yksisuuntainen varianssianalyysi (ANOVA) ja post-hoc Dunnet n useiden vertailun testiä käytettiin vertaamaan solujen elinkelpoisuuden hoitojen välillä ja ajoneuvon hallinnan, kun yksi aikapisteessä arvioitiin. Kaksisuuntainen ANOVA post-hoc Bonferronin testiä käytettiin vertaamaan solujen elinkelpoisuuden hoitojen välillä ja ajoneuvon hallinnan, kun useita ajankohtina arvioitiin. Analyysit suoritettiin GraphPad Prism 5 ohjelmisto (GraphPad Software, Inc., CA USA) ja tilastollinen merkitsevyys asetettiin p 0,05 (kaksipuolinen).

Tulokset

Daily 5- atsa-CdR hoitoa tarvitaan indusoimaan optimaalisen proliferaation esto ja solukuoleman induktioon LNCaP-eturauhassyöpäsoluissa

tehokkuuden tutkimiseksi eri 5-atsa-CdR hoito-ohjelmat, teimme soluproliferaatiota ja elinkelpoisuuden määritykset LNCaP syöpäsolujen ja verrataan seuraavasti: yksi hoitokerta, toinen päivä hoitoja ja päivittäin hoitoja. Verrattuna kontrollin (kantaja), kerta-annoksena 5-atsa-CdR ehkäistä tehokkaasti LNCaP eturauhas- syöpäsolujen lisääntymistä kaikilla käytetyillä pitoisuuksilla (5-20 uM) (kuvio 1A, Päivä 4: p 0,001 5 uM ja p 0,0001 kaikille annosta), mutta ei aiheuttanut merkittävää solukuolemaa 6 päivää hoidon jälkeen (kuvio 1 B). Kun 5-atsa-CdR lisättiin joka toinen päivä (vaihtoehtoinen hoitopäivän), pienempiä annoksia 5-atsa-CdR (0,1, 0,5 ja 2,5 uM) verrattuna käytetyt annokset yhden hoitoaikataulussa aiheutti huomattavan annosriippuvaisen inhibition solujen lisääntymisen verrattuna vehikkelillä käsiteltyihin LNCaP-soluja (kuvio 1 C, Päivä 4 ja 6: p 0,0001 kaikilla annoksilla). Vain annokset 5-atsa-CdR 2,5 uM tai enemmän indusoi merkittävän solukuoleman verrattuna, että ajoneuvon käsiteltyjen solujen (kuvio 1D, Päivä 6: p 0,001 2,5 uM ja p 0,0001 10 uM). Sen sijaan päivittäinen hoito 5-atsa-CdR saavuttanut merkittävää proliferaation esto pienemmillä pitoisuuksilla (0,05 pM) (kuvio 2A, Päivä 6: p 0,05 0,05 uM, p 0,001 kaikissa annosten 0,5 uM tai enemmän, 8. päivä : p 0,05 0,01 uM ja p 0,001 kaikissa annoksilla 0,05 uM tai enemmän) ja lisääntynyt solukuoleman LNCaP (kuvio 2B, Päivä 8: p 0,001 annosta 0,5 uM tai enemmän) verrattuna vastaaviin annoksina joka toinen päivä. Annoksesta riippuvaa proliferaation esto saavutettiin 5-atsa-CdR päiväannoksia 0,05 uM tai enemmän tuloksena 62%: n vähennys solujen määrä verrattuna vehikkelillä käsiteltyihin soluihin ja täydelliseen estymiseen leviämisen annoksilla 0,5 uM tai enemmän (kuva 2A ja 2E, p 0,0001). Annoksina, jotka aiheuttivat täydellisen uudiskasvun estäminen, oli myös merkittävä kasvu solukuoleman, on noin 3-kertainen, verrattuna vehikkelikontrolliin (kuvio 2B ja 2F, p 0,0001).

LNCaP eturauhas- syöpäsolut (2,5 x 10

4 solua per kuoppa 24-kuoppaisilla levyillä) käsiteltiin kasvavia annoksia 5-atsa-CDR (5-20 uM) annettiin (A-B) kerran päivänä 0 tai (C- D) kasvavia annoksia 5-atsa-CdR (0,1-10 uM) täydennetään joka toinen päivä enintään 6 päivää. (A) ja (C) solut laskettiin säännöllisin väliajoin käyttäen hemosytometriä, ja elävien solujen lukumäärä arvioitiin trypaanisinisen väriaineen syrjäytymistä. (B) ja (D) kuolleiden solujen määrä ilmaistaan ​​prosentteina kokonaismäärästä solujen laskettiin. Tietoja kerta-piste edustaa keskiarvoa +/- SE rinnakkaisesta kuopasta. * Kaksisuuntainen ANOVA: p 0,0001 (A), (C) ja (D) (10 uM); p 0,001 (D) (2,5 uM) verrattuna ajoneuvon ohjaus (veh) viimeisenä päivänä hoidon.

(A-B) LNCaP ja (C-D) PC3 eturauhassyövän solut (1 x 10

4 solua per kuoppa 12-kuoppalevyille) käsiteltiin kasvavia annoksia 5-atsa-CDR (,005-+2,5 uM) täytetään päivittäin enintään 8 päivää. (A) ja (C) solut laskettiin säännöllisin väliajoin käyttäen hemosytometriä, ja elävien solujen lukumäärä arvioitiin trypaanisinisen väriaineen syrjäytymistä. (B) ja (D) kuolleiden solujen määrä ilmaistaan ​​prosentteina kokonaismäärästä solujen laskettiin. (E) ja (F) suhteellinen solujen elävyys sen jälkeen 6 tai 8 hoitopäivän 5-atsa-CdR ilmoitettiin olevan elävien solujen prosenttimäärän verrattuna ajoneuvon ohjaus (veh) ja suhteellinen solukuolemaa taitteeseen prosenttia kuolleita soluja verrattuna ajon ohjaus. Tietoja kerta-piste edustaa keskiarvoa +/- SE kolmen rinnakkaisen kammion ainakin kahdesta kokeesta. * Kaksisuuntainen ANOVA: p 0,05 (A) (0,01 uM); p 0,001 (A) (0,05-2,5 uM), (B) ja (D) (0,5 uM); p 0,0001 (C) ja (D) (1, 2,5 uM) verrattuna ajoneuvon ohjaus (veh) viimeisenä päivänä hoidon.

Effects of 5-atsa-CdR eturauhassyöpään solujen elinkelpoisuus on riippumaton AR

Voit selvittää vaikutukset 5-atsa-CdR LNCaP-soluissa olivat riippuvaisia ​​toimiva AR, päivittäinen hoito aikataulua, suoritettiin myös PC3-soluissa, joilta puuttuu toiminnallinen AR. Kun käsiteltiin 5-atsa-CdR annoksilla 0,005-2,5 uM, oli samanlainen annoksesta riippuvan inhibition proliferaation ja solukuoleman induktioon PC3-soluissa, kuten oli LNCaP-soluissa (kuvio 2A-D). Kun taas noin 3-kertainen solukuoleman induktio havaittiin 0,5 uM 5-atsa-CdR molemmissa solulinjoissa (kuvio 2F), ja PC3-soluissa, pienempiä annoksia 5-atsa-CDR (0,005 uM ja 0,01 uM) johti merkittävään vähenemiseen solumäärä (p 0,0001, kuvio 2E), ja tämä tapahtui aikaisemmin pisteen (4 päivää) verrattuna LNCaP (6 päivää) käsiteltiin identtisesti (kuvio 2A ja 2C). Koska 5-atsa-CdR nojautuu jakamalla solujen sisällyttämistä tekisivät sen vaikutukset, ero kaksinkertaistui aika välillä 2 solulinjoista, noin 24 tuntia PC3-soluissa verrattuna 48 tuntia LNCaP, voi selittää lisääntynyt teho on 5 -aza-CDR PC3 solujen elinkykyä. Androgeenin riippumaton proliferaation esto ja solukuoleman induktio 5-atsa-CdR eturauhassyöpäsoluissa vahvistettiin edelleen solujen elinkelpoisuuden määritykset suoritettiin LNCaP viljeltiin steroidi-köyhdytettyä väliaineessa (kuva S2).

pitkittynyt 5-atsa-CdR käsittely johtaa samanlainen solukuoleman riippumatta hoito-ohjelma

karakterisoimiseksi edelleen eroja toinen päivä ja päivittäinen hoito-ohjelma, joka on korkein toinen päivä hoidon (10 uM) ja korkein päivittäinen hoidon (2,5 uM) verrattiin laajennettu kasvukäyrä (kuvio 3). LNCaP eturauhassyövän solut käsiteltiin ajoneuvon ohjaus- tai 5-atsa-CdR täydennetään joka toinen päivä tai päivittäin, kuten edellä. Solujen elinkykyä ja solukuolemaa arvioitiin sen jälkeen, kun 6 päivää hoidon jälkeen. Yhdet Sitten solut saivat edelleen 5-atsa-CdR täydennetään joka toinen päivä tai päivittäin päivään 12 (merkitty 10 uM-12d tai 2,5 uM-12d, kuvio 3), kun taas toinen joukko soluja, sai väliainetta, joka sisälsi ajoneuvon ohjaus ( merkitään 10 uM-6d tai 2,5 uM-6d; kuvio 3). 6 päivän jälkeen hoidon, sekä toinen päivä ja päivittäinen hoito-aiheuttama kasvun hidastuminen verrattuna ajoneuvon hallinnan, mutta vain päivittäinen hoito johti solukuoleman (kuva 3). Koska ohjaus solut olivat saavuttaneet konfluenssin päivällä 6, nämä solut jätettiin pois jäljellä kokeen. Hoidon jatkuessa joko järjestelmää määrästä solukuoleman kasvoi edelleen, että 12 päivää, saavuttaa 61,4% varten toinen päivä hoidon ja 68,6% päivittäiseen hoitoon. Mielenkiintoista on, että solut, jotka saivat vain hoitoa 6 päivää näytetään yhtäläinen solukuoleman niille, jotka saivat hoitoa 12 päivää (kuvio 3).

(A) ja (C) LNCaP-eturauhassyöpäsoluissa (2,5 x 10

4 solua per kuoppa 24-kuoppaisilla levyillä) käsiteltiin 10 uM 5-atsa-CDR- tai ajoneuvon hallinnan, täydennetään joka toinen päivä. (B) ja (D) LNCaP-eturauhassyöpäsoluissa (1 x 10

4 solua per kuoppa 12-kuoppalevyille) käsiteltiin 2,5 uM 5-atsa-CDR- tai ajoneuvon hallinnan, täydennetään päivittäin. Seuraavat 6 päivää hoidon valvonnan solut lakkasi, ja jäljellä olevia soluja joko edelleen vastaanottamaan 5-atsa-CDR (10 uM-12d tai 2,5 uM-12d, vastaavasti) tai vastaanotettu tuoretta väliainetta, joka sisälsi ajoneuvon (10 uM-6d tai 2,5 uM -6d). (A) ja (C) solut laskettiin päivänä 6, 8 ja 12 käyttäen hemosytometriä, ja elävien solujen lukumäärä arvioitiin trypaanisinisen väriaineen syrjäytymistä. (B) ja (D) kuolleiden solujen ilmaistaan ​​prosentteina kokonaismäärästä solujen laskettiin.

GSTP1

promoottori DNA metylaatiostatuksen ja proteiini uudelleen ilmentymisen merkkiaineina 5-atsa-CdR teho

selvittämään, miten antiproliferatiivisia vaikutuksia 5-atsa-CdR liittyvät sen demetyloivan aktiivisuutta, MSP arvioimiseksi suoritettiin DNA metylaatiostatuksen

GSTP1

promoottorin (kuvio 4A). Hypermetyloitunut

GSTP1

promoottori-DNA oli läsnä LNCaP vehikkeliä ohjaus. Sen sijaan, metyloimattomia

GSTP1

promoottori-DNA havaittiin LNCaP käsiteltiin päivittäin 0,05 uM tai enemmän 5-atsa-CdR, mutta täysin demetyloidaan

GSTP1

promoottori-DNA: ta ei havaittu edes korkeimmalla pitoisuus on 5-atsa-CDR: ssä. Demetylaation

GSTP1

promoottorin 5-atsa-CdR annoksilla suuri kuin tai yhtä suuri kuin 0,05 uM samaan aikaan kyky 5-atsa-CDR oleellisesti estävät solujen proliferaatiota näissä pitoisuuksissa (kuvio 2A-B) .

DNA: ta ja proteiineja uutettiin LNCaP-soluja käsiteltiin kasvavia annoksia 5-atsa-CDR (0,005-2,5 uM). Soluja käsiteltiin päivittäin ja DNA: n ja proteiinin sadon 6 päivää hoidon jälkeen. (A) MSP suoritettiin bisulfiitti-muunnetun DNA alukkeilla kohdistamista bisulfiitti-modifioitu metyloituja

GSTP1

promoottori tai metyloimattomia

GSTP1

promoottori. (B-C) suhteellinen metylaatio tilan GSTP1 promoottori seuraavat 5-atsa-CdR hoidon lisäksi arvioitiin COBRA käyttämällä kahta restriktioentsyymejä, BstUI ja Hhal. MDA-MB-231-rintasyöpäsolujen käytettiin kontrollina metyloimattoman

GSTP1

promoottori. (D) Immunoblot tehtiin analysoida GSTP1 proteiinin ilmentymisen. Havaitseminen Hsp90 käytettiin latauskontrollina.

tutkia edelleen suhteellisen DNA metylaatiostatuksen

GSTP1

promoottorin 5-atsa-CdR käsiteltyjen LNCaP, COBRA oli suoritettiin käyttäen BstUI ja Hhal-restriktioentsyymeillä (kuvio 4B-C). Metyloitumattomalla

GSTP1

promoottorin läsnä MDA-MB-231-rintasyöpäsolujen ei digestoitiin BstUI tai HhaI (kuvio 4B). Yhdenmukainen MSP tuloksia, metyloitu

GSTP1

promoottorin havaittiin vehikkelillä käsiteltyihin (kontrolli) ja 5-atsa-CdR käsitelty LNCaP-solujen annoksilla +0,005-+0,5 uM. Huomattavaa

GSTP1

promoottori-DNA: demetylaatio havaittiin ainoastaan ​​vastauksena 0,5 uM 5-atsa-CDR, joka on alin 5-atsa-CdR annokseksi, joka riittää aiheuttamaan täydellisen inhibition LNCaP-solujen lisääntymisen ja solukuoleman osoitettu solujen elinkelpoisuuden määritykset (kuvio 2A-B). Nämä havainnot viittaavat siihen, että teho 0,5 uM 5-atsa-CdR johtuu sen kyky aiheuttaa suuremman DNA-demetylaation

GSTP1

kuin pienemmillä annoksilla.

suurempi demetyloivan vaikutus 0,5 uM verrattuna 0,05 uM 5-atsa-CdR vastaa GSTP1 proteiini re-ilmentyminen havaittiin 0,5pM 5-atsa-CdR tai suurempi (kuvio 4D). Tämän mukaisesti, 5-atsa-CdR annoksilla, jotka johtavat uudelleen ilmentymisen GSTP1 proteiinin aiheuttaa myös merkittäviä solukuoleman LNCaP (kuvio 2B ja 2F).

Zebularine estää leviämisen eturauhasen syöpäsolujen mutta on rajalliset vaikutukset solukuoleman

LNCaP-soluja käsiteltiin Zebularine (0-1000 uM; käytetty suurin annos aiemmissa tutkimuksissa [30]), kun taas PC3-soluja käsiteltiin Zebularine annokset olivat enintään 400 uM. Zebularine annettiin päivänä 0 ja täydennetään jälleen puolivälissä hoitojakson aikana. Zebularine aiheutti annoksesta riippuvan inhibition lisääntymistä sekä LNCaP ja PC3 eturauhasen syöpäsolujen (kuvio 5A ja 5C, p 0,0001), mikä viittaa siihen, että Zebularine on samanlainen AR riippumatonta kasvua estävä vaikutusmekanismi eturauhasen syöpäsolujen 5-atsa -CdR. Merkittävä väheneminen elinkykyisten solujen lukumäärän havaittiin 100-200 uM Zebularine, ja täydellinen inhibitio soluproliferaatiota havaittiin 400 uM tai enemmän sekä LNCaP ja PC3-soluja (kuvio 5A ja 5C, p 0,0001). Kun taas Zebularine ei onnistunut indusoimaan solukuolemaa millä tahansa annoksella LNCaP-soluissa (kuvio 5B), merkittävä solukuolema indusoitiin 400 uM Zebularine PC3-soluissa (kuvio 5D, p = 0,0004).

(AB) LNCaP ja (C-D) PC3 syöpäsolujen (1 x 10

4 solua per kuoppa 12-kuoppalevyille) käsiteltiin kasvavia annoksia Zebularine (0-400 uM, jopa 1000 uM LNCaP-solut) täydennetään kerran päivä 4 ajan 6 päivää PC3-solut, ja 8 päivää LNCaP. (A) ja (C) solut laskettiin säännöllisin väliajoin käyttäen hemosytometriä ja solujen elinkelpoisuus arvioitiin trypaanisinisen väriaineen syrjäytymistä. (B) ja (D) kuolleiden solujen määrä ilmaistaan ​​prosentteina kokonaismäärästä solujen laskettiin. Tietoja kerta-piste edustaa keskiarvoa +/- SE rinnakkaisesta kuopasta. * Yksisuuntainen ANOVA; p 0,0001 (A) ja (C); p = 0,0004 varten (D) verrattuna ajoneuvon ohjaus (ajon).

Zebularine on heikompi demetyloivan toimia

GSTP1

promoottori verrattuna 5-atsa-CdR

tutkimiseksi demetyloiva aktiivisuus Zebularine, MSP suoritettiin tutkia DNA metylaatiostatuksen

GSTP1

promoottorin LNCaP-soluissa (kuvio 6A). Kun 8 päivän hoidon, metyloitua

GSTP1

oli läsnä ajoneuvonhallintajärjestelmän ja kaikki Zebularine käsiteltyjen näytteiden (0-400 uM), kun taas demetyloituminen

GSTP1

promoottori puuttui annosvasteen (kuva 6A). Kun suhteellinen DNA metylaatiostatuksen

GSTP1

promoottorialue näissä Zebularine-käsiteltyjen LNCaP-soluja verrattiin COBRA käyttämällä BstUI ja Hhal restriktioentsyymipilkkomisen metyloimattomia

GSTP1

havaittu (kuvio 6B ). Heikko ja epäjohdonmukainen demetyloivan toimia Zebularine LNCaP-soluissa näkyi myös puute GSTP1 proteiinin uudelleen ilmentymisen kuluttua 8 hoitopäivän (kuvio 6C).

DNA ja proteiinit uutetaan LNCaP 8 päivän kuluttua hoidon kasvavia annoksia Zebularine (0-400 uM). (A) DNA bisulfiitti-modifioitu ja MSP suoritettiin alukkeilla kohdistaminen bisulfiitti-modifioitu metyloitu

GSTP1

tai metyloitumattoman

GSTP1

. (B) suhteellisen DNA: n metylaatio tilan

GSTP1

promoottorin seuraavat Zebularine hoidon arvioitiin COBRA käyttämällä kahta restriktioentsyymejä, BstUI tai HhaI. (C) Immunoblot tehtiin analysoida GSTP1 proteiinin ilmentyminen LNCaP-soluissa sen jälkeen, kun 8 päivää ja Zebularine hoidon. Proteiinit uutettiin LNCaP-soluja käsiteltiin kasvavia annoksia Zebularine (0-400 uM). PC3-solut ilmentävät endogeenistä GSTP1 proteiinia ja käytettiin positiivisena kontrollina.

Keskustelu

Vaikka DNMTi 5-atsa-CdR on tehokas hoidettaessa hematologisia olosuhteissa, kliinisiä tutkimuksia kiinteät kasvaimia ja eturauhasen syöpä on todettu vähäinen tai olematon. Epäonnistuminen aiempien kliinisten tutkimusten kiinteitä kasvaimia syyksi on sopimatonta annostuksesta, mikä myrkyllisyys liittyviä haittavaikutuksia. Osittain tämä johtuu huonosta ymmärtämistä mekanistinen toimia 5-atsa-CDR kiinteitä kasvaimia. Tässä tutkimuksessa osoitamme, että 5-atsa-CdR, annoksena 0,5 uM annetaan päivittäin, inhiboivat täydellisesti solujen proliferaation ja indusoi solukuoleman eturauhassyövän soluissa, ja siihen liittyi demetylaation

GSTP1

promoottorin ja uudelleen-ilmentymisen GSTP1 proteiinia. Nämä havainnot viittaavat siihen, että päivittäinen pienen annoksen 5-atsa-CdR hoito-ohjelma voi olla tehokkaampi kuin harvemmin tai yhden suuren annoksen ohjelma valvontaa varten eturauhasen syöpäsolujen kasvua. Olemme myös osoittaneet, että päivittäinen pienen annoksen 5-atsa-CdR hoito on tehokkaampi kuin yksi käyttäen vakaampi DNMTi, Zebularine. Tärkeintä on, voimme osoittaa, että lisääntynyt teho on 5-atsa-CdR verrattuna Zebularine eturauhassyöpäsoluissa liittyy läheisesti sen demetyloivan toimintaa ja tunnistaa

GSTP1

mahdollisesti hyödyllisenä biomarkkereiden arvioimiseksi DNMTi teho eturauhasen syöpä.

Useat tutkimukset ovat osoittaneet, että 5-atsa-CdR vähentää solujen proliferaatiota ja indusoi uudelleen tiettyjen geenien ekspressiota erilaisissa syövissä (taulukko S1). Eri syöpätyyppien reagoida 5-atsa-CdR eri tavalla, mutta monenlaisia ​​5-atsa-CdR annokset ja hoito-ohjelmat on käytetty aiemmissa tutkimuksissa, ja päätepisteissä ja analyysi olivat erilaisia ​​eri tutkimuksissa. Yhdeksän julkaistuissa tutkimuksissa on tutkittu vaikutuksia 5-atsa-CdR elinkelpoisuudesta eturauhassyövän solulinjoissa (taulukko S1A) [10], [11], [31], [32], [33], [34], [ ,,,0],35], [36], [37]. Vertailut näistä tutkimuksista on vaikea johtuu edellä luetelluista syistä. Esimerkiksi, Walton et ai [11] on raportoitu noin 30% soluproliferaation inhibointi verrattuna ajoneuvon valvonnan LNCaP-eturauhassyöpäsoluissa käsittelyn jälkeen 8,8 uM 5-atsa-CdR, kun taas Pulukuri et ai [10] on raportoitu 70%: n inhibition solujen lisääntymisen verrattuna vehikkelikontrolliin samassa solulinjassa, jolla on suuri annos 10 uM 5-atsa-CdR hoitoon.