Krooninen sairaus

tiivistelmä

Eturauhassyöpä on johtava syy on syöpään liittyvän kuoleman miehillä. Huolimatta intensiivistä investoinnit parantamaan varhaisdiagnoosia usein pakenee havaita ajoissa. Kuolleisuus on edelleen korkea pitkälle eturauhassyövän missä palliatiivinen hoito on ainoa vaihtoehto. Tehokas strategioita Sen vuoksi tarvitaan estämään ja taudin etenemistä. Kasviperäiset yhdisteet ovat olleet tärkeä lähde useiden kliinisesti käyttökelpoisia syöpälääkkeiden ja tarjoavat houkuttelevan lähestymistavan eturauhassyöpää vastaan. Osoitimme aikaisemmin, että metanoli uute Maytenus royleanus (MEM) lähtee ja sen jakeet olevan merkittävää antioksidantti kanssa terapeuttista potentiaalia vastaan ​​vapaiden radikaalien liittyvien vahingot. Tässä tutkimuksessa arvioitiin anti-proliferatiivista aktiivisuutta MEM eturauhasen syöpä malli järjestelmä. Analyysi MEM ja sen eri fraktioiden paljasti triterpenoids, flavonoideja ja tanniinit, konjugoituna yhteen tai useampaan polaarisia ryhmiä ja hiilihydraattiosien. Lisätutkimukset vastaan ​​tunnettuihin standardeihin toteen kofeiinihapon ja kversetiini 3-rhamnoside vaihtelevissa pitoisuus eri MEM jakeet. Aika tietenkin analyysi MEM käsiteltyjen syöpäsolujen osoitti merkittävää laskua solujen elinkelpoisuuden, arvioi MTT ja klonogeeniset selviytymisen määritykset. Tähän liittyi G2 vaiheen pysähtymisen solusyklin, downregulation sykliini /CDK-verkon ja kasvu CDK-inhibiittorit. MEM käsitellyt solut osoittivat pilkkominen kaspaasi-3 ja PARP, ja modulaatio apoptoottisten proteiinien perustamisesta apoptoosin ensisijaisena mekanismi solukuoleman. Erityisesti MEM tukahdutti AR /PSA signalointi sekä eturauhassyövän soluviljelmissä ja in vivo -mallissa. Intraperitoneaalinen injektio MEM (1,25 ja 2,5 mg /eläin) ja kateenkorvattomia nude-hiiriin istutettiin androgeenireseptorin herkkä CWR22Rν1 soluista osoitti merkitsevän eston kasvaimen kasvussa ja laski seerumin PSA-tasot edestakaisin in vitro löydöksiin. Yhdessä meidän tiedot viittaavat siihen, että MEM voidaan tutkia edelleen sen mahdollisia terapeuttisia vaikutuksia vastaan ​​eturauhasen syövän etenemisessä ihmisissä.

Citation: Shabbir M, Syed DN, Lall RK, Khan MR, Mukhtar H (2015) Voimakkaat antiproliferatiivisia, Pro-apoptoottinen aktiivisuus on Maytenus Royleanus Ote vastaan ​​syöpäsolujen: Evidence in

in-vitro

ja

in-vivo

mallit. PLoS ONE 10 (3): e0119859. doi: 10,1371 /journal.pone.0119859

Academic Editor: Ying-Jan Wang, National Cheng Kung yliopisto, Taiwan

vastaanotettu: 12 syyskuu 2014; Hyväksytty: 17 tammikuu 2015; Julkaistu: 23 maaliskuu 2015

Copyright: © 2015 Shabbir et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään

Data Saatavuus: kaikki asiaankuuluvat tiedot kuuluvat paperin ja sen tukeminen Information tiedostoja.

Rahoitus: tuettiin National Institute of terveys /National Cancer Institute RO1CA160867. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

huolimatta edistyksestä diagnosoinnissa ja hoidossa, eturauhassyöpä on edelleen yksi yleisimmistä terveysongelmia vaikuttaa miehiin elinaikanaan. Itse eturauhasen syöpä on toiseksi yleisin kuolinsyy miehillä Yhdysvalloissa ja monissa länsimaissa [1]. Viimeaikaiset tiedot hanke eturauhas-, keuhko-, ja paksusuolen syövän osuus on noin puolet kaikista vasta diagnosoitu syövistä miehillä vuonna 2014, eturauhassyöpä Yksistään noin 1: 4 tapauksissa [2].

androgeenireseptorin (AR), joka kuuluu ytimen reseptorin superperheelle on tärkeä rooli kehityksessä, toiminta ja homeostaasin eturauhasen [3]. Ligandin läsnä ollessa, kuten dihydrotestosteronin (DHT) indusoi fosforylaation ja konformaatiomuutoksen AR, jolloin sen tumaansiirtymiseen, jossa se sitoutuu androgeenireseptorin vastauksen elementtejä kohdegeenien ja säätelee transkriptiota. Yli-ilmentyminen AR ja säätelyä sen transkriptionaalisen aktiivisuuden usein havaitaan pitkälle edenneen eturauhassyövän [4, 5]. Androgeenien puute hoito on edelleen standardi hoitoa edenneen taudin. Huolimatta ensimmäisen myönteisen vastauksen, melkein kaikilla potilailla poikkeuksetta edetä aggressiivisempi, castrate kestävä fenotyypin. Tutkimukset potilasnäytteiden osoittavat, että AR: ilmentyy lähes kaikissa syövissä eturauhasen, sekä ennen että jälkeen androgeeniablaatio hoidon [6]. Itse asiassa, prostataspesifinen antigeeni (PSA), joka koodaa androgen-reagoiva geenin, on havaittu, että suurin osa hormoni-tulenkestävien syöpiä, mikä osoittaa, että AR signalointireitin on edelleen toiminnallinen näiden syöpien [7].

seulonta PSA yhdessä eturauhasen, ja neulabiopsiaan, ovat parantaneet potilaiden selviytymistä helpottamalla varhaisten ja paikallinen tauti. Kuitenkin paranna kehittyneen ja etäpesäkkeitä on edelleen vaikeasti [8]. Nykyinen lääketieteellinen hoito lähestymistapoja ovat leikkaus, sädehoito ja kemoterapia, joko yksinään tai multimodaaliseen lähestymistapaan [8]. Rooli ruokavalio ihmisen syövässä on saavuttanut suurta huomiota viime vuosikymmeninä ja on johtanut paradigman muutos ymmärrystämme syövän ehkäisyyn ja hoitoon. On saatu näyttöä siitä, että ruokavalio, liikunta ja painon usein ilmaisua energiatase tekijät ovat tärkeitä tekijöitä muokkaamalla syövän etenemiseen, ja se voi liittyä suurentunut riski syövän uusiutumiseen [9]. Tällä hetkellä tutkimuksia käydään lisätä ymmärrystämme suhde ruokavalion ja eturauhassyöpää. Optimaalinen ravinto voi vähentää eturauhassyövän ja voi auttaa vähentämään riskiä sen etenemistä. Sisältää värikäs, kasvipohjaisia ​​elintarvikkeita ja säilyttää terveen paino on ehdotettu tärkeiksi ravinnon strategioita eturauhassyövän perhe [10]. Tuore tutkimus osoitti, että alhainen eturauhasen pitoisuus lykopeenin liittyy kehittämiseen eturauhassyövän potilailla, joilla on korkea-asteinen eturauhasen intraepiteelinen neoplasia [11]. Noudattaminen Välimeren ruokavalion koostuu runsaasti hedelmiä, vihanneksia, palkokasveja, pähkinöitä, puhdistamaton viljat, oliiviöljy ja kohtuullinen määrä kalan liittyy alhainen yleinen kuolleisuus diagnoosin jälkeen ei-metastasoituneen eturauhassyövän [12].

Maytenus royleanus kuuluu perheeseen Kelaskasvit, suuri perhe, joka koostuu noin 100 sukujen ja 1300 lajien levinneet laajalti ympäri maailman. Useita lajeja Maytenus on käytetty perinteisen lääketieteen, hoitoon ruoansulatuskanavan häiriöt, kuume, niveltulehdus jne. [13, 14]. Biologinen toiminta Maytenus lajien johtuvan läsnäolo eri luokkiin sekundäärimetaboliitteja kuten fenolisia glukosideja, flavonoidit ja triterpenes [15]. Aiemmissa tutkimuksissa osoitimme, että metanoli uute Maytenus royleanus (MEM) lähtee ja siitä valmistettujen jakeet hallussaan huomattava antioksidantti kanssa terapeuttista potentiaalia vastaan ​​vapaiden radikaalien liittyvien vahingoista [15]. Täällä tutkimme vaikutus MEM eturauhassyövän soluproliferaatioon ja osoittaa, että MEM estää niiden kasvun ja kannattavuuden sekä androgeenireseptorin herkkä ja androgeenista riippumaton eturauhassyöpä solujen ja kiinnostavuus voimakas estävä vaikutus AR /PSA signalointi sekä in vitro soluviljelmissä ja vivo tuumoriksenografteja.

Materiaalit ja menetelmät

Materiaalit

Vasta-aineita cdk2, cdk4, CDK6, sykliini B1, sykliini D1, sykliini D2, sykliini E, P27, p21, PSA, Poly (ADP riboosi) polymeraasi (PARP), Bcl-2, Bax, Bak, Bcl-XL: n ja AR saatiin Cell Signaling Technology (Beverly, MA). Anti-hiiri-anti-kaniini-vasta-ainetta piparjuuri per-oksidaasi-konjugaatti saatiin Amersham Pharmacia Life Sciences. Bio-Rad DC Protein Assay Kit ostettiin Bio-Rad, CA, Yhdysvallat Novex betonielementit Tris- glysiinigeelejä saatiin Invitrogen. Anneksiini-V-FLUOS Värjäys Kit ostettiin Roche.

valmistelu kasviuutetta

Kuivatut lehdet MEM ensin jauhemaista seurasi kaksi uuttoa 95% metanolia. Suodatettu MEM on spray-kuivattiin ja suspendoitiin 50 ml tislattua vettä ja fraktiot valmistettiin 200 ml: aan liuottimien polaarisuus oli kasvava so, n-heksaani, etyyliasetaatti ja n-butanolia. Jokainen kerros erotettiin ravistaen voimakkaasti ja liukoisen jääneen käytettiin jäljellä vesifraktiosta.

Phytochemical seulonta

[A] Nestekromatografia massaspektrometrianalyysissä.

MEM analysoitiin LC-MS tuottaa sormenjälki phytochemicals läsnä kasvissa. Kuivattu näyte MEM ja sen eri fraktiot liuotettiin 15 mg /ml: ssa metanolia. Liukenemattomia hiukkasia poistettiin ja 10 ui näytettä alistettiin HILIC kromatografia negatiivisissa ionisaation ja käänteisfaasi- (RP) sekä positiivisia että negatiivisia ionisaatio tilat kohdistaa flavonoideja ja fenolisia happoja. Sillä HILIC erottaminen, näytteet kromatografisesti ratkaista Phenomenex Luna HILIC, 3 um, 2x150mm sarakkeeseen Agilent 1200 HPLC (Agilent, CA), jossa on automaattinen näytteenotin pidettiin 5 ° C: ssa, käyttäen lineaarista gradienttia 10 mM ammoniumformiaattia (pH = 4,5) in vesi ja 1 mM ammoniumformiaattia (pH = 4,5) 99% asetonitriiliä 45 minuutin aikana. Myönteisiä RP erottaminen, näytteet kromatografisesti ratkaista Agilent ZORBAX® 300SB-C18, 1.8μm, 2.1x50mm sarake Agilent 1200 HPLC (Agilent, Palo Alto, CA), jossa on automaattinen näytteenotin pidettiin 5 ° C: ssa, käyttäen lineaarista gradienttia 0,1% muurahaishappoa vedessä ja 0,1% muurahaishappoa asetonitriilissä 60 minuutin aikana. Negatiivinen RP erottaminen, samanlainen väline setup, positiivinen toiminto on käytetty, kuten edellä, kun taas muuttamalla liikkuvan faasin lineaarista gradienttia 10 mM ammoniumformiaattia (pH 6,5) veteen ja 1 mM ammoniumformiaattia (pH 6,5), 99% asetonitriiliä 45 minuutin aikana. Virtausnopeus sekä erottamiseen tilat oli 250 pl /min.

[B] Suuren erotuskyvyn nestekromatografiaa (HPLC) kasviuutetta.

250 mg kasvin jauhetta uutettiin 10 ml: lla 25% HCl: ää ja 25 ml: lla kloroformia. Uute suodatettiin ja laimennettiin 100 ml. 10 ui suodatettua näytettä injektoitiin Agilent 1200 HPLC-järjestelmä. Erottaminen toteutettiin C18 -pylvästä varustettuna UV-VIS Spectra-Focus detektori, injektorin ja auto näytteenottaja). Trifluorietikkahappoa ja asetonitriiliä käytettiin liikkuvana faasina virtausnopeudella 1 ml /min. Kofeiinihappoa ja kversetiini 3-rhamnoside käytettiin sisäisinä standardit vertailevaa havaitsemista sisällä MEM jakeet. Kalibrointikäyrät syntyy sekä vakio yhdisteiden välillä näytteen määrä (0,02-0,5 ug). Kaikki ajot tehtiin kolmena kappaleena.

Solujen käsittely

C

4-2 ja CWR22Rν1 ihmisen eturauhasen syöpä soluja hankittiin ATCC (American Type Culture Collection). Molemmat solulinjat kasvatettiin RPMI 1640 (Life Technologies, NY), jota oli täydennetty 10% FBS: ää ja 1% penisilliini /streptomysiiniä, 5% CO

2, 37 ° C: ssa. MEM liuotettiin DMSO: hon, käytettiin solujen käsittely. Solujen konfluenssiin ~ 70% hoidettiin MEM 10-100μg /ml 24 h solujen täydellisen väliaineessa, jossa DMSO: n loppupitoisuus käytettiin kussakin käsittelyssä oli alle 0,1% (v /v).

Solujen elinkelpoisuus määritys

3- (4,5-dimetyylitiatsol-2-yyli) -2,5-difenyyli tetrazoliumbromide (MTT) käytettiin tutkimaan vaikutusta MEM elinkelpoisuudesta C

4-2, PC3, DU145 ja CWR22Rν1cell linjat. Solut maljattiin (1 x 10

4 solua per kuoppa) 1 ml täydellistä kasvatusalustaa, joka sisälsi 10-200μg /ml pitoisuuksia MEM 24-kuoppaisilla mikrotiitterilevyillä. Inkuboinnin jälkeen kostutetussa inkubaattorissa 24 tuntia 37 ° C: ssa, 200 ui MTT: tä (5 mg /ml: 1 x PBS) lisättiin kuhunkin kuoppaan ja inkuboitiin kaksi tuntia, minkä jälkeen 200 ui DMSO: ta lisättiin. Sitten levyjä sentrifugoitiin (1800 x g 5 min 4 ° C: ssa). Absorbanssi 540 nm: ssä kirjattiin mikrolevylukijalla. Vaikutus MEM on kasvun inhibitio laskettiin% solujen elinkykyä, jossa DMSO-käsitellyt solut otettiin 100% valvontaa.

klonogeeninen määritys

käsittelyn vaikutus klonogeenisten selviytymisen eturauhassyöpäsolujen määritettiin käyttäen pesäkemuodostusta. Sekä CWR22Rν1 ja C

4-2-soluja käsiteltiin kasvavilla pitoisuuksilla (20, 40 60 ug /ml), MEM RPMI-1640 täydellistä alustaa. Käsittelyn jälkeen solut uudelleen maljattiin kolmena kappaleena on 6-kuoppaiselle kudosviljelylevylle 5000 solua /kuoppa ja viljeltiin 5% CO 2 37 ° C: ssa 8 päivää, joissa kasvualustaa on korvattu kanssa /ilman MEM välein 2 päivää. Sitten solut värjättiin 0,5% kristallivioletilla (metanoli: H

2O, 1: 1) ja kuvat on otettu käyttämällä digitaalikameraa. Kuvat on tehostettu käyttämällä Adobe Photoshop kirkkautta, kontrastia ja teroitettu yhtenäisyysvaatimukset ulkonäkö.

Solusyklianalyysiä /apoptoosin virtaussytometrialla

CWR22Rν1 ja C

4-2 soluja käsiteltiin MEM (20-60μM: 24h) täydellisessä väliaineessa trypsinoitiin ja kiinnitettiin 1% paraformaldehydiä: 1 x PBS: ssa tunnin ajan ja pestiin kahdesti kylmällä PBS: llä ja sentrifugoitiin. Pelletti suspendoitiin jäähdytettyyn 70%: sta etanolia ja säilytettiin yön yli. Seuraavaksi solut sentrifugoitiin 5 min nopeudella 1000 rpm, ja saatu pelletti pestiin kahdesti kylmällä PBS: llä etanolin poistamiseksi. Solut leimattiin FITC: llä ja propidiumjodidilla käyttäen Apo-Direct Kit (BD Pharmagen, CA), kuten valmistajan protokollan mukaisesti. Analyysi suoritettiin FACScan (Becton Dickinson, NJ). Noin 10000 solua näytettä kerättiin ja DNA histogrammit analysoitiin ModFitLT ohjelmisto (Totisesti Software House, ME).

Proteiinin uutto ja Western blot-analyysi

hoidon jälkeen MEM jääkylmää hajoamiseen puskuria lisättiin soluihin (50nmol /l Tris-HCI: a, 150 mmol /l NaCI, 1 mmol /l EGTA: a, 1 mmol /l EDTA: a, 20 mmol /l NaF, 100 mmol /litra Na3VO4, 0,5% Nonidet P-40, 1% Triton X-100, 1 mmol /l PMSF, pH 7,4) proteaasi-inhibiittoreiden kanssa (Calbiochem, Saksa) inkuboitiin jäällä 20 minuuttia. Länsi-blottaus 8-12% poly akryyliamidigeelejä käytettiin ratkaisemaan 40 ug proteiinia, siirrettiin nitroselluloosamembraanille, tutkittiin sopivia monoklonaalisia primaarisilla vasta-aineilla, ja kemiluminesenssilla autoradiografialla inkuboinnin jälkeen erityisiä sekundaarisia vasta-aineita.

geeniekspressioanalyysiä

Kokonais-RNA eristettiin soluista käyttämällä kaupallista RNeasy-kittiä (Qiagen, CA), RNA-pitoisuus mitattiin spektrofotometrisesti 260 nm: ssä ja cDNA tehtiin noudattaen valmistajan protokollaa. Reaktioseos, joka sisälsi 10 ui FastStart Universal SYBR green Master (Roche, Saksa), 6 uM reverse-alukkeita, ja 10 ug cDNA, jossa on RNaasi vapaata vettä lisättiin kokonaistilavuudessa 20 ui. Vahvistuksen ja reaaliaikainen analyysi tehtiin 40 sykliä seuraavien tekijöiden; 95 ° C (10 min) aktivoimiseksi Fast Start Taq DNA-polymeraasia; 60 ° C (1 min) monistamiseen ja reaaliaikaisen analyysin. Geeni-ilmentymisen tasot määritettiin käyttäen 2

-ΔΔCT. Alukesekvenssin käytettiin; AR Sense 5′-CTGGACACGACAACAACCAG-3 ’; AR Antisense 5’CAGATCAGGGGCGAAGTAGA-3 ’; GAPDH Sense 5′- AAGGTCGGAGTCAACGGATTTGGT-3; GAPDH Antisense 5’-ACAAAGTGGTCGTTGAGGGCAATG-3 ’.

Imunofluorescence mikroskoopilla

C

4-2 ja CWR22Rν1 soluja ympättiin kaksikamarinen solukkoviljelyn lasilevyille ja käsiteltiin 40 ug /ml MEM 70% konfluenssiin 24 tuntia. Pesun jälkeen PBS: llä solut kiinnitettiin 2% paraformaldehydillä, jota seuraa läpäiseväksi metanolilla ja estää 2% seerumia. Inkuboinnin primaarisilla vasta-aineilla yli yön seurasi inkubointi sopivilla fluoroforin merkitty sekundäärisiä vasta-aineita. Mikroskooppipreparaatin haalistumista estävää DAPI (Invitrogen, NY) käytettiin asennus ja counterstaining välineellä. Analyysiä varten Bio-Rad Radiance 2100 MP Rainbow järjestelmä biologinen kuvantaminen on käytetty. Havaitsemiseksi apoptoottisten ja nekroottisten solujen anneksiini-V-Fluos Värjäys Kit (Roche, Sveitsi) käytettiin mukaisesti valmistajan protokollaa. Zeiss LSM 410 konfokaalimikroskopia käytettiin mitattiin fluoresenssi. Solut värjättiin anneksiini-V ja unstained solujen valitun kentän laskettiin selvittämään laajuuden apoptoosin ja nekroosin.

PSA ELISA

kvantitatiivinen määritys PSA tasot C

4-2 ja CWR22Rν1 solut ihmisen PSA ELISA kit (Anogen, Ontario, Canada) käytettiin mukaisesti valmistajan protokollan.

Eettinen linjaus varten eläinkokeissa

Kateenkorvattomia nude-hiirten tutkimukset tehtiin mukaan institutionaalisten suuntaviivat hoitoon ja käyttöön ja hyväksyttiin Animal Care ja käyttö komitea, School of Medicine and Public Health, University of Wisconsin-Madison.

In vivo ksenograftimallissa

Kateenkorvattomiin (nu /nu) nude saatuja hiiriä NxGen Biosciences (San Diego, CA) pidettiin alle patogeenivapaissa olosuhteissa (12 h valo /12 h pimeäjaksoilla) ja ruokittiin autoklaavikäsiteltyä ruokavalion adlibitum. Valitsimme CWR22Rν1 solujen määrittämiseksi in vivo vaikutuksia MEM, koska nämä solut muodostavat nopean ja toistettavan kasvaimia nude-hiirissä. Kiinnittymisestä CWR22Rν1 solujen on myös vastuussa eritystä merkittäviä määriä PSA veressä isäntä. Kasvaimen hiirissä määritettiin ihonalaisella CWR22Rν1 soluja (1 x 10

6) sekoitettuna Matrigel (Collaborative Biomedical Products, MA) suhteessa 1: 1. Kahdeksantoista eläimet valittiin sattumanvaraisesti kolmeen ryhmään, joka koostuu kuudesta eläimiä kutakin. Ensimmäinen ryhmä eläinten toimiessa kontrolliryhmä sai DMSO vatsakalvonsisäisesti (i.p.). Eläimiä Ryhmien 2 ja 3 saivat i.p. injektio MEM, 1,25 ja 2,5 mg per eläin, vastaavasti, kahdesti viikossa ja koko tutkimuksen kehon paino, ruokavalio ja veden kulutus kirjattiin. Kasvaimen tilavuus laskettiin kaavalla 0,5238 x L1 x L2 x H (L1 = pitkä halkaisija, L2 = lyhyt halkaisija ja H = korkeus kasvain) ja kasvainten koot mitattiin kaksi kertaa viikossa. Eläimet tapettiin käyttämällä CO2 hengitettynä menetelmällä seuraavat ARAC ohjeita, kun kasvainten saavuttanut ~ 1200

3. Verinäytteet kerättiin alaleuan bleed ja seerumin erotetaan kokoverestä säilytettiin -20 ° C: ssa. Seerumin PSA-tasot analysoitiin PSA ELISA kit on kuvattu edellä. H 0,05 pidettiin merkittävinä.

tulokset

Phytochemical analyysi MEM

MEM yhdessä n-heksaani, butanoli, etyyliasetaatti ja jäljelle jäänyt vesipohjainen fraktiot erotettiin LC-MS-analyysillä. Tätä tekniikkaa käytetään pääasiassa tuottamaan sormenjälki phytochemical koostumuksen MEM. Uute näyttää olevan monimutkainen seos tuntematon phytochemicals katsottuna peruspiikki kromatogrammia HILIC (ve) kromatogrammi (Fig. 1). HILIC ajon MEM osoitti läsnäolon 164 yhdisteiden perustuu pohja huiput syntyvät moolimassa ja retentioaika yhdisteiden (Fig. 1A; tiedot liitteenä S1_Dataset). Joka ulottuu sama data-analyysi muiden fraktioiden HILIC (-ve) -tilassa, n-butanoli fraktio sisälsi 79 yhdisteitä, kun taas etyyliasetaattia ja n-heksaania fraktiot osoittivat 69 ja 40 yhdisteet vastaavasti. C18 RP (ve) kromatogrammi jäänyt vesipitoinen osa osoitti, että läsnä oli 84 yhdisteiden kun HILIC (ve) osoitti 83 yhdisteitä. Joka perustuu alustavia todisteita on saatu LC-MS-tiedot, edellä mainittu (Fig. 1A), joka lisäksi analyysi suoritettiin luokitella ainesosana yhdisteiden MEM, käyttäen UV-diodirivi-ilmaisinta. Kofeiinihappoa ja kversetiini-3-rhamnoside tunnistettiin vertaamalla niiden UV ja MS-spektrit vastaavaan sisäisiä standardeja. UV-spektrit n-heksaani, etyyliasetaatti ja n-butanolia fraktiot paljasti kofeiinihapon ja kversetiini-3-rhamnoside vaihtelevina pitoisuuksina osoittaa, että MEM on korkea pitoisuus flavonoideja, joilla tiedetään olevan syövän vastaista aktiivisuutta (kuvio. 1B; S1 Kuvio ).

a. Taulukko osoittaa kokonaismäärä yhdisteitä löytyy MEM ja sen eri fraktioiden HILIC ja C18 RP-kromatografia, joka perustuu retentioaika ja moolimassan; Kaikkien ionien kromatogrammit eri fraktioiden: etyyliasetaatti osa (-ve HILIC); n-butanolia osa (-ve HILIC); n-heksaani osa (-ve HILIC); Vesipitoinen osa (-ve HILIC); Vesipitoinen osa (-ve C18 RP). b. UV-kromatogrammit etyyliasetaattia n-heksaani ja n-butanolia jakeet MEM, 280, 320 370 nm, kofeiinihapon ja kversetiini 3-rhamnoside sisäisiä standardeja.

MEM estää kasvun ja elinkelpoisuuden eturauhassyöpäsolujen

Koska molemmat näistä yhdisteistä tiedetään olevan syövän toimintaa , kysyimme uute itse olisi tehokkaampi kasvun estämisessä ja elinkelpoisuus eturauhasen syöpäsoluja. Tutkia anti-proliferatiivista potentiaalia MEM, teimme 3- (4, 5-dimethythiazol-2-yyli) -2, 5-difenyylitetratsoliumbromidi (MTT) vastaan ​​androgen-herkkien (C

4-2 ja CWR22Rν1) ja androgeenista riippumaton (PC3 ja DU-145) syöpäsolujen. Havaitsimme, että MEM hoitoon (10-180μg /ml 24 h ja 48 h) ja eturauhasen syöpäsolujen aiheutti solujen kasvun esto annoksesta riippuvalla tavalla. Aika tietenkin analyysi paljasti, että oli olemassa vain vähäinen ero vähentää solujen elinkelpoisuuden solujen 24 ja 48 h, mikä viittaa siihen, että eturauhassyövän solut reagoivat MEM hoitoa 24. Kuten esitetään (Fig. 2A), IC

50-arvot MEM saaneista CWR22Rν1 olivat 47,4 42 ug /ml; C

4-2, 52,8 44,4 ug /ml; for PC3, 61,8 36 ug /ml; ja DU145, 90,6 88,2 ug /ml 24 ja 48 h vastaavasti. Tiedot ehdotti, että androgen-herkkien C

4-2 ja CWR22Rν1 solut osoittivat hieman parempi herkkyys MEM kohtelun kuin DU145 ja PC3cells (Fig. 2A). Klonogeeniset määritys edelleen validoitu Näiden havaintojen jossa CWR22Rν1 ja C

4-2 soluja käsiteltiin seitsemän päivää MEM 20, 40 60 ug /ml osoitti merkittävää annoksesta riippuvaa inhibitio pesäkkeiden muodostumisen suhteessa käsittelemättömiin kontrolleihin (Fig. 2B). Eri fraktiot MEM erotettiin perusteella polariteetin eri liuottimissa, kuten n-heksaani, etyyliasetaatti, n-butanolia ja vettä tutkittiin myös niiden kasvua estävä vaikutus CWR22Rν1 soluihin. N-heksaani ja vesifaasin osoittautunut tehokkaampia proliferaation estossa CWR22Rν1 soluja (20 36μg /ml) verrattuna butanolin ja etyyliasetaatin jakeet (39,6 66.8μg /ml) (Fig. 2C).

a. Eturauhassyövän soluja käsiteltiin MEM 24/48 h, ja solujen elinkyky määritettiin MTT-määrityksellä. Taulukossa on esitetty IC

50

CWR

22Rν1, C

4-2, PC-3 ja DU145 24 ja 48 h. Keskiarvo ± SD kokeita suoritettiin kolmena rinnakkaisena on esitetty. b. Annoksesta riippuvaa vaikutusta MEM on clonogenecity on

CWR

22Rν1 ja C

4-2 soluja havaitaan pesäkemuodostusta. Tiedot on kuvattu materiaali menetelmillä. c. Vaikutus eri fraktioiden (n-heksaani, etyyliasetaatti, n-butanoli ja vesi) on elinkelpoisuus

CWR

22R ν1 soluja, määritettiin MTT-määrityksellä. * P 0,05 ** p 0,01 pidettiin tilastollisesti merkitsevä.

MEM indusoi G2 vaiheen pysähtymisen eturauhassyöpäsolujen

arvioimiseksi solusyklin profiilia MEM käsitellyn eturauhasen syöpäsolut suoritimme virtaussytometrianalyysin ja havaittu vaikutus MEM solusyklin jakeluun. Merkittävä annoksesta riippuva lisäys solupopulaation G2 vaiheen solusyklin havaittiin seurauksena MEM hoidon CWR22Rν1 ja C

4-2-soluissa. G2 vaihe solusyklin jakelu C

4-2 oli 25,7%, 44,61%, 59,52% ja CWR22Rν1was 38,6%, 47,72%, ja 57,72% 20, 40 ja 60 uM pitoisuuksina MEM vastaavasti (Fig. 3A; S2 Kuva). Kasvu G2-vaiheessa solupopulaatio mukana samanaikainen lasku G0 /G1 ja S vaihe solupopulaation. Me seuraavaksi tutkittiin, mikä vaikutus MEM solusyklin säätelymolekyyleja toimintansa G2 vaiheen solusyklin. Immunoblot-analyysi osoitti, että MEM hoito C

4-2 ja CWR22Rν1 alensivat proteiinia ilmauksia CDK 2, 4 6 ja sykliinejä B1, D1, D2 E verrattuna käsittelemättömiin kontrolleihin (Fig. 3A ja 3B, S3 kuvassa). Tähän liittyi havaittavissa induktioon p21 ja p27 MEM käsitellyissä soluissa (kuvio. 3D, S3 kuvassa).

a.

CWR

22Rν1 ja C

4-2-soluja käsiteltiin MEM 24 värjättiin propidiumjodidilla ja analysoitiin virtaussytometrialla. Prosenttiosuus solupopulaation G2-vaiheen solusyklin näkyy laatikossa kunkin histogrammin. Keskiarvo ± SD kokeita suoritettiin kolmena rinnakkaisena on esitetty. b-d. Vaikutus MEM hoidon solusyklin säätelyproteiineja: kokosolulysaateista

CWR

22Rν1 ja C

4-2 soluja /ilman MEM (20-60 ug /ml: 24), alistettiin SDS- polyakryyliamidigeelielektroforeesilla. Equal lastaus vahvistettiin reprobing kanssa GAPDH. Immunoblottauksia esitetty edustavat kolmen erillisen kokeen samanlaisin tuloksin.

MEM indusoi apoptoosin aktivoitumisen kautta ulkoisen ja sisäisen reaktiotien

tutkia havaittuun vähentää solujen elinkelpoisuus liittyy apoptoosin induktio teimme anneksiini värjäys MEM käsiteltyjen syöpäsolujen. Käytimme anneksiini V merkitty FITC, jolla on vahva ja spesifinen affiniteetti fosfatidyyliseriinin, seurata sen translokaation solukalvon. MEM käsitellyt solut osoittivat merkittävää vihreän fluoresenssin lisäys verrattuna käsittelemättömiin kontrolleihin osoittaa, että hoito MEM aiheuttaman apoptoosin eturauhassyöpäsoluissa (S4 kuvassa). Virtaussytometria-analyysi suoritettiin sitten mitata solujen lukumäärä apoptoosin seurauksena MEM hoitoon. Merkittävä annosriippuvainen nousu väestön apoptoottisten solujen havaittiin molemmissa solulinjoissa, tuloksena MEM hoidon (Fig. 4A, S4 kuviossa). Immunoblot-analyysillä käytettiin vieressä tutkia liittyvien proteiinien ilmentymisen solujen apoptoosin. Kaspaasi 3, jäsen kaspaasi perheen aspartaatti-erityisiä kysteiiniproteaaseista on keskeinen rooli suorittaessaan apoptoottisen ohjelman. PARP-1 on yksi useista tunnetuista solun substraattien Kaspaasit ja lohkaisu PARP-1 Kaspaasit pidetään tuntomerkki apoptoosin [16]. MEM käsitellyt solut osoittivat lisääntyneen ekspression aktivoitu kaspaasi-3; liittyvä PARP pilkkominen (Fig. 4B, S5 kuvassa) lisäksi validointi, että apoptoosi on ensisijainen mekanismi MEM-solukuolema. Sen tutkimiseksi, MEM aiheuttaman apoptoosin välittyy aktivoitumisen luontaisia ​​tai ulkoisia reittejä me seuraavaksi tutkittiin ilmaus Kaspaasit -8 ja -9 MEM käsitellyissä soluissa. Olemme löytäneet induktio pilkottiin kaspaasi-8: lla käsiteltyjen solujen 20, 40 ja 60 ug /ml MEM (Fig. 4C, S5 kuvassa). Samanaikainen lasku pro-muoto kaspaasi-9 ja Bid vuonna CWR22Rν1 ja C

4-2 soluja, post MEM hoito ehdotti aktivointi sekä ulkoisten ja sisäisten reittien apoptoosin. Olemme arvioineet vaikutusta uutteen Bcl-2-perheen proteiinien, mukana apoptoosin. MEM käsitellyt solut osoittivat ekspression lisääntymisen pro-apoptoottisten Bax ja Bak ja lasku ilmentymisen anti-apoptoottisten Bcl-2 ja Bcl-X

L-proteiineja (Fig. 4D, S5 kuvassa).

a.

CWR

22Rν1 ja C

4-2-soluja käsiteltiin MEM (20-60 ug /ml: 24) leimattiin FITC: llä ja analysoitiin virtaussytometrialla. Prosenttiosuus apoptoottisten solujen vastaavaan annoksen MEM näkyy jokaisessa histogrammissa. Keskiarvo ± SD kokeita suoritettiin kolmena rinnakkaisena on esitetty. b-d. Kokosolulysaateista

CWR

22Rν1 ja C

4-2 soluja /ilman MEM (20-60 ug /ml: 24) käsittely tehtiin SDS-polyakryyliamidigeelielektroforeesi. Vaikutus MEM hoidon osallistuvien proteiinien apoptoosin reittejä. Equal lastaus vahvistettiin reprobing kanssa GAPDH. Immunoblottauksia esitetty edustavat kolmen erillisen kokeen samanlaisin tuloksin.

MEM vähenee AR ja PSA ilmentymistä eturauhasen syöpäsolujen

Androgeenit tärkeä rooli kehityksessä ja etenemisessä eturauhassyövän ja PSA, tunnettu androgen reagoiva geeni on tällä hetkellä hyväksytty merkkiaine arviointia eturauhassyövän etenemisen ihmisellä [17]. Vaikutus MEM hoidon AR ja PSA ilmentymistä tutkittiin CWR22Rν1and C

4-2 solulinjoja käyttämällä immunoblottauksen ja RT-PCR. Merkittävä väheneminen AR proteiinin ilmentymistä havaittiin MEM hoitoon (Fig. 5A ja 5B, S6 Kuva). Immunofluoresenssi CWR22Rν1 C

4-2-solut osoittivat laskua tumaanohjaussignaali AR MEM käsitellyissä soluissa verrattuna kontrolliin (kuvio. 5B) kantavassa CWR22Rν1 ja C

4-2 syöpäsolujen osoittavat suurta proteiinia Solunsisäiset PSA, kuten osoituksena 34 kDa PSA band (Kuva. 5A). Annoksesta riippuvat vaikutukset MEM on CWR22Rν1 ja C

4-2 soluihin johti merkittävä lasku PSA-proteiinin tasot 20, 40 ja 60 ug /ml pitoisuuksina (Fig. 5A, S6 Kuva). Väheneminen -proteiiniekspressio mukana alennettu transkriptipitoisuuksissa AR MEM käsitellyissä soluissa (kuvio. 5C; S6 Kuva). Olemme edelleen määritelty eritetyn PSA tasot CWR22Rν1 ja C

4-2 solulinjat, joissa käytetään määrällisiä sandwich-ELISA-tekniikka. Merkittävä väheneminen PSA-tasot havaittiin molemmissa solulinjoissa MEM (40 ug /ml) käsittely (Kuva. 5D).

a. Kokosolulysaateista

CWR

22Rν1 ja C

4-2 soluja /ilman MEM (20-60 ug /ml: 24), alistettiin SDS-polyakryyliamidigeelielektroforeesilla. Equal lastaus vahvistettiin reprobing kanssa GAPDH. Immunoblottauksia esitetty edustavat kolmen erillisen kokeen samanlaisin tuloksin. b. c. d. e. b. c. d. b. b.