Krooninen sairaus

tiivistelmä

Glioblastoomat (GBM) voi sisältää vaihtelevan määrän aktiivisia syövän kantasoluja (CSCS) kykenee itseuudistumisen, on aggregoitumassa CD133

+ neuropallojen sekä kehittää kallonsisäinen kasvain, joka phenocopy alkuperäisiin. Oletimme, että nucleostemin voivat edistää syövän kantasolujen biologian nämä solut on samoja ominaisuuksia normaaleja kantasoluja. Me raportoimme tässä, että nucleostemin ilmaistaan ​​GBM-CSCS eristetty potilasnäytteistä, ja että sen ilmentyminen, päinvastoin, mitä on kuvattu, tavallisille kantasoluja, ei häviä, kun solut on eriytetty. Merkitys nucleostemin ilmaisun CSCS käsiteltiin kohdistamalla vastaavan mRNA käyttäen lentivirally transdusoidut lyhyt hiusneula-RNA (shRNA). Näin löysimme off-tavoite nucleostemin RNAi (shRNA22), joka poistetaan proliferaatiota ja indusoi apoptoosia GBM-CSCS. Lisäksi läsnä ollessa shRNA22, GBM-CSCS epäonnistunut muodostamaan neuropalloja

in vitro

tai kasvaa pehmeällä agarilla. Kun nämä solut ksenotransplantaatio aivoihin nude rottien, kasvaimen kehitys on merkittävästi viivästynyt. Pyrittiin tunnistamaan ensisijaisen tavoitteen /s shRNA22, mikä viittaa transkriptiotekijä osallistuu yksi MAP-kinaasien signalointi-polkuja tai useita tavoitteita. Käyttämällä tätä shRNA voi osaltaan kehittää uusia hoitomenetelmiä tämän parantumaton aivokasvain.

Citation: Gil-Ranedo J, Mendiburu-Eliçabe M, García-Villanueva M, Medina D, del Álamo M, Izquierdo M (2011) murretun Target Nucleostemin RNAi inhiboi in Human glioblastoma-Derived Cancer Kantasolut. PLoS ONE 6 (12): e28753. doi: 10,1371 /journal.pone.0028753

Editor: Keith L. Musta, Cedars-Sinai Medical Center, Yhdysvallat

vastaanotettu: 28 kesäkuu 2011; Hyväksytty: 14 marraskuu 2011; Julkaistu: 12 joulukuu 2011

Copyright: © 2011 Gil-Ranedo et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat varoja: Ministerio de Ciencia e Innovación (SAF 2009-07259) Espanjassa, ja Fundación Eugenio Rodriguez Pascual (Madrid). Centro de Biología Molecular S.O. on myös vastaanottaja institutionaalisen avustusta Ramón Areces Foundation. JG-R oli vastaanottajaa predoctoral apurahan päässä Gobierno Vasco, Espanja. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

glioblastooma on yksi pahanlaatuinen ja yhteisiä kaikkien astrocytic kasvaimista [1]. Kasvu kuvio GBM on erittäin infiltroiva, tekee kirurginen hoito hyvin vaikeaa ja johtaa erittäin huono selviytyminen tuloksia, jotka ovat parantuneet vain hieman viime vuosikymmenien ajan [2]. Syöpä kantasolu hypoteesi ehdottaa, että kasvaimia on järjestetty hierarkiaan, jossa on alapopulaatio CSCS vastuussa syövän etenemiseen, huolto-, ja toistumisen [3]. Solut, joissa varsi kaltaisia ​​ominaisuuksia tunnistettiin aluksi akuutti myelooinen leukemia [4], ja tällä hetkellä niiden olemassaolo on vahvistettu rintasyövässä [5], medulloblastoma ja glioblastooma [6], eturauhassyöpä [7], melanooma [8], munasarjasyöpä [9], pään ja niskan levy- karsinoomista [10], paksusuolen syöpä [11], haimasyöpä [12] ja keuhkosyövän [13], muiden muassa. Glioblastoma, pahenemisvaiheita yleensä seuraa hoitoa, luultavasti siksi CSCS ovat erittäin infiltroiva, selektiivisesti resistentti sädehoidot, solunsalpaajahoitojen [14], [15], [16], immunoterapioiden [17], ja edistää angiogeeninen aktiivisuus. Lisäksi kemo- ja radio- hoitoja voi prime aivokasvain CSCS tehostamaan kantasolujen kaltaisia ​​ominaisuuksia [18]. Tämä väestö CSCS on erittäin tuumorigeenisemmiksi ja phenocopy alkuperäisen kasvaimen jyrsijöiden ksenograftimalleissa [19], [20]. Approaches pakottaa CSCS erilaistua soluihin rajoitettu, tai ei solunjakautumisen määritteitä, altistamalla heidät luun morfogeneettisen proteiinien esimerkiksi käytettiin tekevät niistä alttiimpia perinteisiin hoitoihin, ja osoitti huomattavaa tehoa hiirimalleissa [21]. Ymmärtäminen perusbiologian syövän kantasoluja on keskeinen piirre ennen muuttoa otaksuttu hoitoja niiden poistamiseksi.

Nucleostemin on GTP-sitovaa proteiinia, ns koska sen nucleolar lokalisoinnin ja etuoikeutetut ilmaisun kantasolujen [22 ]. Vaikka proteiini on pääasiassa läsnä alkion ja aikuisen kantasoluja, se on myös ilmaistu useissa transformoiduissa solulinjoissa ja kasvaimia [23], [24]. Nucleostemin, toisaalta, on äkillisesti alassäädetty erilaistumisen aikana ennen terminaaliin solunjakautumisen. Tämä proteiini tunnistettiin ensin aikuisen rotan hermo kantasoluja, ja on ollut mukana solusyklin etenemisen [22]. Useat nucleostemin sitovia proteiineja on tunnistettu, mukaan lukien p53, MDM2 ja telomeerisesti toista sitovaa tekijää 1 (TRF1) [22], [25], [26]. Muutokset nucleostemin ekspressiotasot alentavan leviämisen määrä soluja, sekä p53 riippuvaisia ​​ja riippumattomia tapoja, [22], [26] – [28]. Proteiini on välttämätön alussa alkionkehityksen [29], mutta on tärkeää myös aikuisten hermo kantasoluja [30]. Jotkut tutkimukset ovat osoittaneet, että ehtyminen nucleostemin liittyy rajallinen tuumorigeenisia kapasiteettia sekä HeLa ja PC-3-solujen [31], [24]. Vieressä sen implisiittisesti säätelyssä soluproliferaation, useita muita rooleja on osoitettu nucleostemin kuten telomeeripituuden sääntelyn edistämällä hajoaminen TRF1 [25], käsittely ennalta rRNA [32] ja ylläpito nucleolar arkkitehtuuri [33].

Tarkoituksena oli tutkia roolia nucleostemin ihmisen GBM-CSCS käyttäen lentivirally transdusoidut lyhyt hiusneula-RNA: iden (shRNAs) supistaa huomattavasti sen läsnäolo soluissa. CSCS tyhjentynyt nucleostemin ilmaisun (shRNA18) ei aiheuttanut syvällinen vähentäminen soluproliferaation ja lisääntynyttä apoptoosia että olimme odottaneet. Sen sijaan, off-tavoite lentivirukselle (shRNA22) lakkautetaan lisääntymistä, itseuudistumisen ja selviytymistä CSCS. Myös esiintyminen shRNA merkittävästi viivästynyt CSCS tuumorigeenisia kapasiteetti kun ksenosiirrettyjä nude rotan aivoissa.

Tulokset

ilmentäminen nucleostemin kahden ihmisen-glioblastooma johdettu syövän kantasolulinjojen

kaksi rikastettu syövän kantasoluja, jotka ovat peräisin ihmisen aivokasvain näytteet (näytteet CSCS-5 ja CSCS-7). Molemmat solulinjat kasvoivat räjähdysmäisesti ja muodostivat neuropallojen vaikka ympättiin alhainen tiheys, mikä osoittaa vahvan kyky uusiutua. Neuropallojen olivat positiivisia ja CD133: a (Fig. 1A, vihreä), nestiinifenotyypin (Fig. 1A, punainen), Sox2 (Fig. 1B; vihreä) vimentiinista (Fig. 1 B, punainen), ja nucleostemin (Fig. 1 B, pinkki) hermo kantasolujen merkkiaineita. Nucleostemin oli läsnä tumassa 88% of CSCS-5 ja CSCS-7-soluissa, määritettynä immunofluoresenssi- määritykset (Fig. 1 C). Suuri osa soluista (76%) olivat myös positiivisia CD133, ja jopa korkeampia prosentteja saatiin nestiinin, vimentiinistä ja Sox2 (yli 95%), joista jälkimmäinen osallistuu itseuudistumisen ja leviämisen kantasolujen. CD15 oli markkeri 54% CSCS-5 ja 69% varten CSCS-7. Multipotenttisuus Näiden kahden kulttuurin osoitettiin sillä neuropallojen kasvanut erilaistumista indusoivan keskipitkän näkyy tyypillisiä morfologisia erilaistumista kohti kaikkien kolmen hermo suvusta – astrocytic, hermosolujen ja oligodendrocytic, joka arvioidaan positiivisuutta β-III-tubuliinin [34] ja MAP2 ( hermosolujen) (Fig. 1D punainen, ja S1 punainen), GFAP (astrocytic) (Fig. 1D vihreä), ja NG2 (oligodendrocytic esiaste) (Fig. S1 vihreä) antigeenien vastaavasti. Kuitenkin erilaistuneet solut eivät löysä ilmentymisen nucleostemin (Fig. 1 E), vaikka se ei ekspressoi mitään muita stemness liittyviä geenejä (tuloksia ei ole esitetty). Karyotyyppitutkiraus analyysit osoittivat useita muutoksia heijastava muuttamassa aktiivisuutta, ja kyky muodostaa klooneja määrityksissä pehmeässä agarissa osoitti kehitystä monien pesäkkeiden.

. CSCS-5 ja CSCS-7 neuropallojen ilmentävät CD133 (vihreä) ja nestiinin (punainen). Mittatikku: 50 um. B. CSCS-5 ja CSCS-7-soluissa, joissa esitetään ja sijainti solun Sox2 (vihreä), vimentiinistä (punainen) ja nucleostemin (lila). Mittatikku: 10 um, ja määrällisiä tontti (C) kantasolujen merkkiaineita CD133, nestiinifenotyypin, vimentiinistä, Sox2, nucleostemin ja CD15 in CSCS-5 (harmaa) ja CSCS-7 (vihreä). D. Neuron (β-III-tubuliinin, pinkki-punainen) ja astrocytic (GFAP, vihreä) eriyttäminen kapasiteetti CSCS-5 ja CSCS-7. Mittatikku: 50 um. E. Nucleolar nucleostemin ilmaisun varsi tai differentiatiated CSCS-5 (harmaa) ja CSCS-7 (vihreä) soluja. F. Magnetic resonance imaging of

in vivo

kasvaimia kehittyi CSCS-5 ja CSCS-7 (keltainen nuolenpäät osoittavat kasvain), ja Kaplan-Meier eloonjäämisen analyysi (G) immunodeficent rotilla, kun CSCS-5 (punainen) tai CSC-7 (vihreä) potilaalle tehdä ksenografteissa.

sitten tutkitaan mahdollisuudet sekä CSCS-5 ja CSCS-7 muodostaa kasvaimia jälkeen potilaalle tehdä xenogratf in immunodeficent rotan aivoissa. Pistämisen jälkeen 5 x 10

5-solujen sisäistä cranially, sekä solulinjoja on muodostettu suuria kasvaimia 100%: ssa tapauksista (n = 12 CSCS-5 ja 11 CSCS-7), jonka jälkeen magneettikuvaus (MRI) (Fig. 1 F). Tuumorit olivat erittäin infiltratiivinen (Fig. S2). Eksplanttien näistä gliooma sarjoittain istutetaan aivoihin muista nude rottien ja tuotettu tappavan kasvaimia, jotka olivat yhtä rikastuneet CSCS, mikä osoittaa suuren kapasiteetin itseuudistumisen. Keskimääräinen elossaoloaika isännät olivat 60 ± 4 päivää CSCS-5 ja 81 ± 11 vuorokautta CSCS-7-soluissa (kuvio. 1G). Histopatologisia analyysejä ksenograftien osoitti yleisen ominaispiirteitä GBM, kuten pseudopalisade ja polttoväli kuolio korkea soluihin, korkea ilmentyminen EGFR ja korkea proliferatiivinen indeksi (MIB-1). Potilaat ja ksenografteissa näytteet osoittavat samanlaista ekspressiotasoja kaikista markkereita, mukaan lukien keskipitkän (potilas /ksenografti 5) ja matalan (potilas /ksenografti 7) ilmentymistä p53, ja hyvin alhainen, jos sellainen on, ja p16 (Fig. S3). Tulokset osoittavat, että siirrettyjen kasvainten rotilla olivat phenocopies alkuperäisen potilaan kasvaimia.

karakterisointi shRNAs suunniteltu kohdistamaan ihmisen nucleostemin

nucleostemin-geeni on 15 eksonia, ja se käy läpi vaihtoehtoisen silmukoinnin tuottaa kolme erilaista mRNA dokumenttinsa. Paitsi eksoni 1, nämä variantit ovat samankaltaisia ​​sekvenssejä. Siksi suunniteltaessa alukkeita knock-alas kaikki kolme vaihtoehtoa, olemme valinneet alukkeita yhteistä sivustoja eksonien 4, 10, 13 ja 15 (Fig. 2A). Olemme suunnattu nucleostemin infektion lentiviruksen antaisi shRNA vastaan ​​nucleolar proteiinia. Viisi eri shRNAs täydellinen komplementaariset sekvenssit ihmisen nucleostemin mRNA otettiin käyttöön CSCS-5 ja CSCS-7-soluissa. Kolme viidestä shRNAs valittiin lisäkarakterisointia: shRNA18, shRNA20 ja shRNA22. RT-PCR: llä ja western blot-analyysi osoitti, että vaikka shRNA18 aiheutti huomattavaan vähenemiseen nucleostemin mRNA: ta (78%) ja proteiinia tasot (51%), sekä shRNA20 ja shRNA22 ei näytä vaikuttavan tasot mRNA: ta ja proteiinia, kun normalisoitu vastaavaksi vastaavia GAPDH (mRNA) ja aktiini (proteiini) kontrollien (Fig. 2B). Tulokset viittaavat siihen, off-tavoite sitova sekä shRNA20 ja shRNA22. Vaihtoehtoisesti suhteellisen vähäisiä vähennyksiä nucleostemin messenger tasojen kautta kohde vaikutus voisi olla hallitseva vaikutuksia määrityksen, jos tulos on erittäin annoksesta herkkä tasoa tämän tietyn proteiinin. Suunnittelimme määritystä, joka perustuu pesäkkeiden muodostumisen pehmeässä agarissa, erottamaan kaksi mahdollisuutta. Ilmentymistä shRNA18 in CSCS-5 tai CSCS-7 ei estä pesäkkeiden muodostumisen pehmeässä agarissa, samalla kun ekspressio shRNA22, ja vähäisemmässä määrin shRNA20, rajusti pesäkkeiden lukumäärä kasvanut tämäntyyppisen väliaineen (Fig. 2C ja 2D). Jos shRNA22 aiheutti pieni väheneminen nucleostemin viestin, ja tämä aiheutti suuren kasvun estyminen, koska polku mukana oli hyvin herkkä pieniä tasolle vähennyksiä, messenger tai proteiini, meidän pitäisi odottaa samanlainen vaikutus, kun solut joko tartutettiin shRNA18 yksin, tai kun solut ovat samanaikaisesti infektoidaan sekä shRNA18 ja shRNA22. Tämä tarkoittaa, että suuri määrä pesäkkeiden kasvaa. Toisaalta, jos todellinen off-tavoite vaikutus oli toiminnassa täällä, tuloksena yhdistelmä olisi päinvastainen, koska todellinen tavoite eroaisi nucleostemin, ja me tarkkailla muutaman pesäkkeiden kasvaa pehmeässä agarissa kuin ne havaittiin, kun shRNA22 käytettiin yksinään. Infektio solujen lentiviruksesta ei kuljettaa shRNA käytettiin kontrollina. Mittaus määrä CSCS-5 muodostuneiden pesäkkeiden pehmeässä agarissa jälkeen eri yhdistää hoitoihin antoi seuraavat tulokset (Fig. 2E): suuren määrän pesäkkeitä valvontaa shRNA (shRNACo) ja yhdistelmä shRNACo + shRNA18, odotetusti , ja pieni määrä pesäkkeiden sekä shRNACo + shRNA22, ja shRNA18 + shRNA22. Performing tätä kokeilua, pystyimme syrjiä mahdollisuuksia kaikkien shRNAs kohdistaminen nucleostemin eriasteisesti Tai shRNA22 jolla on eri kohde. Jos vaikutus johtui alhaisesta inhibition, co-ilmentymisen shRNA18 ja shRNA22 tulisi peittää vaikutus jälkimmäisen, koska shRNA18 estäisi voimakkaampi ilmentyminen nucleostemin geenin. Toisaalta, jos vaikutus oli off-tavoite, toivommekin seurauksia shRNA22 riippumatta ilmaisun shRNA18. Tulokset osoittavat selvästi, että shRNA22 indusoi hänen vaikutus riippumatta ilmentymisen shRNA18, mikä osoittaa, että on, koska off-tavoite vaikutus. Siksi sulkea pois oletusta hyvin vähäinen vähennys nucleostemin jonka shRNA22 jossa on hallitseva negatiivinen vaikutus solujen kasvuun. Uskomme, että kasvun estäminen vaikutuksen shRNA22 pehmeässä agarissa johtuu

bona fide

armottoman vaikutus.

. Kaaviokuva 3 nucleostemin transkriptivariantissa ja eksonit. Arrowheads osoittavat kukin suunniteltu shRNA. B. Nucleostemin mRNA (punainen) ja proteiini (sininen) kvantifiointiin CSCS-5 käsitelty shRNACo, shRNA18, shRNA20 ja shRNA22. C. shRNAs vaikutus CSCS-5 ja CSCS-7 pehmeä agar pesäkkeitä muodostavat kyky, ja sen kvantitatiivisen analyysin (D). E. Pehmeä agar pesäkeluvut double-infektioiden määrittämiseksi nucleostemin-spesifisyys shRNA22. ** P≤0.05; *** P≤0.001.

ehtyminen nucleostemin mukaan shRNA18, ei merkittävästi vähentää S-vaiheeseen solupopulaation kuten osoitetaan taso BrdU oton jälkeen 15 min-pulssi (Fig. 3A) tai koko solupopulaation pyöräily vangiksi 20 h BrdU hoitoon (Fig. 3B). Kaksi muuta shRNAs: shRNA20 ja shRNA22, jolla on hyvin alhainen, jos sellainen on, esto ilmaisun, näytetään johdonmukaisesti alhaisempi S-vaiheeseen ja pyöräily soluja. Kuten käy ilmi kasvukäyrä määrityksissä, kokonaismäärä infektoitujen solujen valvonnan lentivirusta puuttuu shRNA ilmentävän insertin (shRNACo) kasvoi moninkertaiseksi kuuden päivän aikana. ShRNA20 tai shRNA22 tartunnan solut eivät lisääntyvät, tai jopa laskea huomattavasti (Fig. 3C ja 3D), kun taas CSCS tartunnan shRNA18 käyttäytyi paljon lähempänä valvoa soluja kuin shRNA20 ja shRNA22. Tulokset viittaavat seuraus ensisijainen kohde shRNA22, ja hieman vähemmässä määrin kuin shRNA20 osuma, kasvun ja eloonjäämisen ihmisen GBM-CSCS. Emme ole varmoja shRNA20 ja shRNA22 jakaa ensisijainen tavoite, vaikka fyysinen läheisyys alkuperäisen shRNA20 ja shRNA22 sekvenssien nucleostemin geenissä. Vaikka vain 66 nukleotidin erottaa näitä kahta sekvenssit, ihmisen sekvenssikohdistuksen haku ottaen huomioon 66 nukleotidin välissä ei paljastunut ottelun lisäksi nucleostemin.

. Lukumäärä vaihe-S tai kokonaan, pyöräily (B) CSCS-5 (harmaa) ja CSCS-7 (vihreä) käsiteltyjä soluja eri shRNAs. C. elävien solujen lukumäärä on DIV 0, 3 ja 6 CSCS-5 ja CSCS-7 (D), joita hoidettiin eri shRNAs. ** P≤0.05; *** P≤0.001.

Off-tavoite shRNA20 ja shRNA22, apoptoosin tapahtuu ensisijaisesti CD133 + CSCS ja heikentää neuropallo muodostumista

Jos tällaisia ​​shRNAs vaikuttavat paitsi solujen lisääntymistä mutta myös solujen eloonjäämistä. Kvantitoimme prosenttiosuus apoptoottisten solujen sekä CSCS-5 ja 7 populaatiot seuraava shRNACo, shRNA18, shRNA20 ja shRNA22 lentivirus infektio. 7-AAD /anneksiini V-värjäys paljasti etuoikeutettu apoptoosin CD133

+ solujen sekä CSC-5 ja 7 kantaa (Fig. 4A ja 4B); suhteelliset arvot suhteessa ohjaimet CSCS-5 ja CSCS-7 on esitetty taulukossa 1. Lisäksi prosenttiosuus CD133

+ solujen vähenee sekä CSCS-5 ja CSCS-7 populaatioiden seuraavat shRNA20 ja shRNA22 lentivirus infektion (Fig. S4). Nämä tulokset viittaavat siihen, että ensisijainen kohde shRNA22 ja shRNA20 on eloonjäämistekijänä GBM-CSCS ilmentyy edullisesti CD133

+ solut.

. Aiheuttamaa apoptoosia shRNAs in CSCS-5 ja CSCS-7 (B) CD133

+ (punainen) tai CD133

– (sininen) populaatioissa. C. neuropallo muodostavan kyky CSCS-5 ja CSCS-7 (D) solut, käsiteltiin eri shRNAs. ** P≤0.05; *** P≤0.001.

Jakaminen tiettyjä keskeisiä ominaisuuksia normaalien kantasoluja, CSCS pystyvät itseuudistumisen, joka mahdollistaa jatkuva ylläpito tämän alaryhmän ja laajentaminen vastaavan kasvain. Neuropallo muodostuminen kapasiteetti käsittelyn jälkeen eri shRNAs mitattiin (Fig. 4C ja 4D). Käytännössä ole palloja muodostettiin solut käsiteltiin shRNA22 ja hyvin harvat mukaan ShRNA20 käsitellyissä soluissa sekä CSCS-5 ja 7 kantaa. Neuropallojen kehitetty 100%: n kontrolliryhmiin. Nämä tulokset yhdessä havaintojemme että CSCS epäonnistui lisääntyä ja kävivät apoptoosin, viittaavat siihen, että ensisijainen kohde shRNA22 ja shRNA20 tarvitaan itseuudistumisen glioblastooma syövän kantasoluja.

Off-tavoite shRNA22 vähentää huomattavasti kasvaimia potentiaalia CSCS-5

tutkittiin, mikä vaikutus tartuttamisesta CSCS-5-solujen ohjaus lentiviruksien tai lentiviruksien ilmentävät shRNA22. Sen jälkeen puromysiiniselektion, 5 x 10

5 solua ruiskutetaan aivoihin nude rotilla. Kaikki eläimet, joissa ohjaus soluja, jotka on infektoidut solut tyhjä lentivirus (n = 3) kehittyi suuria kasvaimia, ja sen jälkeen magneettikuvaus, ja kuoli 63 ± 1 päivä, ei ole kovin erilainen infektoimattomilta CSCS-5 (61 ± 4 päivää, n = 12). Sitä vastoin eläimet injektoitiin soluja, jotka ilmentävät shRNA22 (n = 6), joka on kehitetty huomattavasti pienempiä kasvaimia, että mediaani tilavuus 148 mm

3, kun taas keskiarvo ilmentävien kasvainten shRNACo olivat 358 mm

3 (kuvio . 5A ja 5B). Kaplan-Meier selviytymisen käyrä osoittaa merkittävää eroa shRNACo ja shRNA22 käsiteltiin kasvainsolujen, joiden keskimääräinen eloonjääminen jälkimmäinen 71 ± 2 päivää (Fig. 5C). Siten läsnäolo ja ilmentyminen shRNA22 vuonna CSCS näyttää olevan tärkeä vaimentamiseksi syövän etenemiseen.

. Kvantifiointi määriä kasvaimia indusoitiin CSCS-5-soluja käsiteltiin shRNACo (musta) ja shRNA22 (punainen). B. Magneettikuvaus edustavien esimerkkien kasvainten jälkeen potilaalle tehdä nude rotta-aivot CSCS-5-solut kuljettavat shRNACo tai shRNA22, ja Kaplan-Meier selviytymisen juoni (C) immunodeficent rottien ympätty CSCS-5 (mock, harmaa ), jotka kantavat shRNACo (musta) ja shRNA22 (punainen). *** P≤0.001.

Vaikutus shRNA22 ei näytä olevan yksin CSCS

Yritimme määrittää vaikutus shRNA22 in glioomasoluihin ilman CD133

+ varsi ominaisuudet, kuten U87MG ja U373MG ihmisen glioomasolulinjoja. Olemme arvioineet klonogeeniset potentiaalinsa pehmytagar- määrityksessä seuraavat shRNACo ja shRNA22 lentivirus infektio. Merkittävä väheneminen keskimäärin pesäkkeiden havaittiin, kun shRNA22 ilmaistiin U373MG (alaspäin 1%), ja vähemmässä määrin, kun siinä U87MG glioomasolulinjaa (alas 41%) (Fig. 6A). Olemme myös mitataan solujen selviytymisen arvioimalla prosenttiosuus apoptoottisten solujen sekä U373MG ja U87MG solulinjoissa seuraavat shRNACo, ja shRNA22 lentivirusten infektio. 7-AAD /anneksiini V-värjäys paljasti etuoikeutetut apoptoosin U373-soluissa samalla käyttäytymisen CSCS. Toisaalta, U87MG solut näyttivät melko resistenttejä apoptoosin (Fig. 6B). Tulokset viittaavat siihen, että vaikka shRNA22 voivat heikentää kasvainten kasvua glioomasoluilla yleisesti sen vaikutus voi riippua solutyypistä. Se havainto, että shRNA22 vaikutus ei rajoitu CSCS on tärkeää, kun suunnitellaan strategioita poistaa kaikki syövän solutyypit, jotka rakentaa erittäin heterogeeninen kasvain kuten glioblastooma.

. shRNAs vaikutus U373MG (musta) ja U87MG (harmaa) pehmeä agar pesäkkeitä muodostavat kyky. B. shRNAs aiheuttama apoptoosin U373MG (musta) ja U87MG (harmaa). ** P≤0.05; *** P≤0.001.

Yritykset tunnistaa ensisijainen kohde shRNA22

Suoritimme genomista etsiä sekvenssit, muut kuin nucleostemin, eriasteisia homologiaa shRNA22 nukleotidit. Tästä käytimme perus paikallinen linjaus hakuvälineenä (BLAST) ja valitsemme neljä ehdokasta: PCLO, mukana neurotransmisor julkaisu; HSPA13, jäsen chaperon perheen HSP70; SEC22C, mukana vesicular liikenteessä; ja CNOT1 liittyvät transkription ja mRNA: n hajoamisen. 21 nukleotidista, 14 oli täydellisesti kaikissa tapauksissa paitsi CNOT, jossa on 13 nukleotidin ottelussa. Ei kuitenkaan yksi neljästä ehdokkaiden ensisijainen tavoite shRNA22 mitattuna qRT-PCR: llä (tuloksia ei ole esitetty), kuten ei havaittu eroja pitoisuus niiden mRNA: n läsnä ollessa tai poissa ollessa shRNA22 liittyvien shRNACo.

määrittämiseksi genominlaajuisten differentiaalisesti ilmentyvien geenien in CSCS-5 jälkeen shRNA22 infektion, käytimme Affymetrix GeneChip Gene 1,0 ST Array System, jossa on noin 28,869 ihmisen geenejä, mukaan lukien 3′-alue (UTR) mRNA: iden, jotka voivat olla kohdistaa sidontareunuksen mikro (mi) RNA-tavoin. Tämän seurauksena tunnistimme 182 geenejä säädellä vähentävästi CSCS-5 hoidettiin shRNA22 suhteessa shRNACo (taulukko S1). Kuten odotettua, nucleostemin ei kuulunut alas geenien. Yritykset ryhmä geenien kanssa shRNA22 osuu toiminnoittain (perustuen Gene ontologia ja signalointireitin data) teki läsnäolon paljastamiseksi 26 osallistuvien geenien säätelyyn transkription keskuudessa vaiennetaan geenit, ja 56 DNA sitovia proteiineja (Fig. 7A). Signaalinvälitysreitin enemmän geenejä alassäädetty oli MAPK-kinaasien reitin (Fig. 7B). Vaikka tulokset ovat tähän mennessä eivät ole ratkaisevia, osoitus siitä, että shRNA22 voi olla osallisena vaientamisessa transkriptiotekijä osallisena yksi MAP-kinaasien signalointi-reitit voidaan ehdotti. Vaihtoehtoisesti useita kohde vaikutukset ovat myös vahva mahdollisuus shRNA22, samalla tavalla mikro-RNA: t.

. Merkitysarvo alaspäin (vihreä), ylä- (punainen) ja kaikki säädelty (sininen) geenit ryhmitelty toiminta biologisten prosessien tai kuuluvien signalointipolkujen (B) aiheuttama shRNA22 in CSCS-5-soluissa.

keskustelu

yhtäläisyyksiä ja eroja lyhytsanomapalvelukeskusta ja CSCS ollut lähde paljon väitteen [35], [36], [37]. Brain CSCS muistuttavat hermo lyhytsanomapalvelukeskukset kannalta fenotyypin, signalointi ja käyttäytyminen in vitro [38], mutta tällä hetkellä epäselvää CSCS ovat itse asiassa

bona fide

kantasoluja. Kokeellinen luonnehdinta syövän kantasolukkoa voi auttaa näissä asioissa. Rotilla, nucleostemin on erittäin ilmaistaan ​​nucleoli keskushermoston lyhytsanomapalvelukeskukset, mutta ei niiden eriytetty jälkeläisiin geeni näyttää olevan äkillisesti pois päältä erilaistumisen aikana ennen loppuvaiheissa [22]. Meidän havainnot nucleostemin ilmaistaan ​​jälkeenkin CSCS joutuivat erilaistua kulttuuriin, merkitsee uuden allekirjoituksen CSCS ja merkittävä ero SCS, ei aiemmin raportoitu.

Käytimme RNAi lähestymistapa nimenomaan edistämään hajoamista nucleostemin mRNA: ta. Aiemmat tiedot ovat osoittaneet, että nakutuksen alaspäin nucleostemin ilmaisu aiheutti vakavia lasku solujen lisääntymisen virtsarakon syövän soluissa [39] ja vähensi palloja muodostavan kyky ihmisen rintasyövän kantasolujen [40]. Merkittävä väheneminen solusyklin etenemisen erityyppisissä ihmisen aivokasvainten ja ihmisen glioblastooma solulinjat on myös raportoitu [41]. Havaitsimme kuitenkin, että vain shRNAi, joka tehokkaasti vähentää proteiinin, ei tukahduttaa solusyklin etenemistä, ei vähennä kasvua CSCS kulttuureissa, ja ei vähennä muodostuneiden pesäkkeiden määrästä pehmeässä agarissa, verrattuna kontrolleihin tartunnan tyhjä lentiviruksen. Erot voivat johtua eroista nakutuksen alas tasot nucleostemin saavutettu aiemmissa raporteissa (yli 75% ja joskus yli 90%) ja meitä (51%).

RNAi tekniikkaa on käytetty laajasti nisäkässoluissa tukahduttaa ekspressiotason yksittäisten geenien, mikä auttaa määrittelemään toiminnallisten roolien geenien, erityisesti sairauksia. Paljon työtä on keskittynyt shRNA muotoilu algoritmeja, jossa keskitytään geenien kohdespesifisyys ja tehokkuutta [42], [43]. Kuitenkin off-tavoite vaikutukset ovat yleisiä, ja yksittäiset shRNAs on osoitettu alas-säädellä yhden tai useamman muun ”ei-toivotut” geenit [44], [45], joskus sitovaa mikro (mi) RNA-samoin edellytyksin 3 ”UTR mRNA [46]. Löysimme kuin shRNA22 sitoo muille /s kuin aiottuun kohdegeenin. Off-tavoite todettujen vaikutusten aiempien RNAi tutkimuksia välittyy osittain täydentävät toisiaan shRNAs ja 3 ’UTR off-kohdegeenien, johon liittyy heptameerin tai heksameeris- alkuvaiheen ottelussa shRNA juosteen 5’loppuun asemissa 2-8 tai 2-7, vastaavasti [46], [47]. Mekanismi on samanlainen kuin miRNA. Vaikka BLAST kirjastoa käytetään sisältyi 3’UTRs sanansaattajilta 7 nukleotidin ottelu parametri ei sisälly siiviläanalyysi-, koska se edustaa merkittävää lieventämistä olosuhteissa ja suuri lisäys otaksuttu ottelut. Yhteinen ensisijainen tavoite shRNA20 ja shRNA22 oletetaan, koska sekvenssit ovat vain 66 nukleotidin päässä toisistaan ​​nucleostemin eksonissa 10. On mahdollista, että nucleostemin sekvenssi, mukaan lukien shRNA22, alueen kahden shRNAs ja shRNA20 (ehkä osittain), myös olla läsnä toisessa genomin alueella, joka koodaa eri proteiinia, jonka mRNA: n sekundaarisen rakenteen olisi helpommin shRNA22 ja shRNA20 kuin yksi on nucleostemin mRNA. Silti ei uusia tulitikut vieressä nucleostemin löydettiin ihmisen genomin laajuinen haku täydentäviä alueita kahden shRNA sekvenssit ja nukleotidit niiden välillä, suoritetaan käyttämällä perus paikallinen linjaus hakuvälineenä (BLAST).

geeni-ilmentymisen profilointi CSCS-5: n läsnä tai poissa ollessa shRNA22 ei yksiselitteisesti osoittavat sen ensisijainen kohde. Pikemminkin useita kohde vaikutukset ovat kohtuullisen mahdollisuuden tähän shRNA. Suurin määrä geenejä vaiennettu liittyi transkription säätelyyn kun osumia ryhmiteltiin toiminto, ja yliedustus geenien MAPK signalointireitillä olivat alas-säädellä shRNA22 ilme. Yli-ilmentyminen yhden tai useamman geenin ja MAPK signalointireitin on yleinen glioblastoomat, ja useita pieniä molekyylejä, jotka inhiboivat PI3-kinaasi-Akt signalointireitin ovat kliinisessä kehitysvaiheessa. Vaikka monet näistä molekyyleistä ovat olleet tehokkaita kokeellisissa malleissa, on epäselvää, onko tämä strategia yksistään riittää keskeyttää molekyylitason tapahtumia aloittaa ja antaa signalointi pitkin reittejä, koska aktivointi muiden polkuja, jotka kompensoivat estyminen kohdennettujen kinaasi. Yrityksiä on tehty vastikään geenien tunnistamiseksi tai väyliä, joiden inaktivoitumista, yhdessä PI3K-estäjien PX-866 ja NVPBEZ-235, saattaa johtaa tappavan fenotyypin glioblastoma multiforme soluissa [48]. Tunnistetut shRNA22, kun ilmaistaan ​​CSCS alkaen glioblastooma potilaista, estää soluproliferaatiota ja itseuudistumisen, indusoi apoptoosia ja vähentää merkittävästi niiden Tuumorigeenisuustutkimuksissa kun ksenotransplantaatio aivoihin nude rotilla. Se seikka, että ensisijainen kohde shRNA22 ei rajoitu CSCS on tärkeää, koska silloin, kun yritetään poistaa kasvaimen täytyy kohdistua myös kasvaimen strooman solut ja mikroglia, koska nämä solut edistävät kasvaimen ylläpitoon ja etenemiseen. Käyttämällä tätä shRNA yksinään tai yhdessä muiden lääkkeiden kanssa voi edustaa mahdollista kliinistä terapeuttinen strategia.

Materiaalit ja menetelmät

Statement Eläinten hoito

Tutkimus toteutettiin tiukasti lainsäädännön mukaisesti ja suuntaviivoja eläinten hoitoon ja käsittely Espanjassa (Espanjan kuninkaallinen asetus 1201/2005, BOE julkaistiin 21 lokakuu 2005), ja ne, Euroopan unionin (2003/65 /EY Euroopan parlamentin ja neuvoston heinäkuuta 2003) . Protokolla hyväksyi valiokunnan Ethics eläinkokeiden autonomisen yliopiston Madridin (luvan liittyvän projektin SAF 2009-07259 liikkeeseen Madrid 11

maaliskuuta 2009) ja jonka CBMSO institutionaalisten Biosafety komitea. Kaikki Leikkaus suoritettiin isofluoraanikaasuanestesiassa, ja yritettiin minimoida kärsimyksen.

Statement potilaan suostumus

Saimme kaksi uutta syövän kantasolulinjoja (CSCS-5 ja CSCS-7 ) alkutuotannosta glioblastooma kirurgisista näytteistä potilailta, joille suoritetaan resektio äskettäin diagnosoitu gliooma mukaisesti protokollien hyväksymien institutionaalisten Ethic komitean Ramón y Cajal sairaalassa. Kirjallinen suostumus käyttää ylimääräistä kudosta tutkimukseen saatiin kunkin potilaan, ja de-tunnistettu kudoksista, yksityisyyden suojelemiseksi, käytettiin (lupa liittyvän projektin SAF 2009-07259, antoi Madridissa 26

helmikuuta 2009 Espanja ).

lausuma microarray data

Kaikki tiedot esitetään tässä MIAME yhteensopiva ja raakadataa on talletettu GEO yhteensopiva tietokanta (Access numero: GSE30448).

solujen eristäminen ja kulttuuri

uusi kulttuureissa CSCS-5 ja CSCS-7, luotiin tuoreista kirurgisista näytteistä kerätä suoraan leikkaussalissa PBS plus 0,6% glukoosia ja välittömästi kuljetettu jäällä soluun kulttuuri huone ja valmistettu seuraavasti: kasvaimen kappaletta pestiin ja jauhettu hienoksi, jossa pienillä saksilla, sitten niitä inkuboitiin 0,1% trypsiiniä ja 0,04% DNaasi (tyyppi II, Sigma) PBS: ssä 1 tunnin ajan 37 ° C: ssa . Digestoitu kudos pestiin kaksi kertaa ja mekaanisesti hajotetaan kulkee tulen Paseur- pippetes.