Krooninen sairaus

tiivistelmä

tavoite

edellinen tutkimus ehdotti mahdollinen kliininen vaikutuksia BCAR1 vuonna ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC) (Mol Diagn Ther. 2011 15 (1): 31-40). Tässä pyrimme arvioimaan ennustavan voiman BCAR1 merkkiaineena huonon ennusteen NSCLC tapauksissa todentaa karsinogeeninen roolit BCAR1 että A549 keuhkojen adenokarsinoomasolulinjaan, ja todistavat BCAR1 /fosfo-p38 akselilla.

menetelmät

tammi 2006 kesäkuussa 2010 oli yhteensä 182 potilasta NSCLC (151 tapausta, joiden käytettävissä seurata tietojen ja 31 tapauksessa menetetty seurata johtuen virheellisen yhteystiedot). Me tarkastetaan BCAR1, fosfo-BCAR1 (Tyr410), fosfori-p38 (Thr180 /Tyr182) ja p38 ilmentymistä NSCLC kudoksissa ja sovitettu viereisten normaaleista kudoksista immunoblottauksella ja IHC. Sen jälkeen BCAR1 -RNA häiriöitä A549-soluja, me tarkasti proteiinin ilmentymisen (BCAR1, fosfo-BCAR1, fosfo-p38 ja p38) ja suoritettiin solubiologian kokeita (solujen kasvua, muuttoliike ja sykli).

Tulokset

BCAR1 yliekspressoitiin NSCLC kudoksissa (177/182) ja solulinjat (A549 ja Calu-3). Kuitenkin, se ei havaittu normaalissa viereisen kudoksen 161 182 tapausta. Korkeammat BCAR1 tasot olivat yhteydessä enemmän huonosti eriytetty NSCLC ja ennustaa huonompi ennuste. BCAR1 Knockdown aiheutti solujen kasvun pysähtymisen, solujen kulkeutumistestis- ja solusyklin pidätyksen A549-solut. Yliekspressio BCAR1 liittyi aktivointi p38 NSCLC tapauksissa, ja BCAR1 pudotus aiheutti vähentäminen fosfo-p38 tasot A549-solut.

Johtopäätös

yli-ilmentyminen BCAR1 on ennustaja huonon ennusteen NSCLC ja pelaa tärkeä karsinogeeninen rooleja karsinogeneesin luultavasti aktivoimalla p38 MAPK. Kuitenkin lisätutkimukset ovat tarpeen välittömästi.

Citation: Huang W, Deng B, Wang R-W, Tan Q-Y, hän Y, Jiang Y-G, et al. (2012) BCAR1 Proteiini on merkittäviä rooleja vuonna Karsinogeneesi ja ennustaa huonon ennusteen Non-Small-Cell Lung Cancer. PLoS ONE 7 (4): e36124. doi: 10,1371 /journal.pone.0036124

Editor: Keiran Smalley, The Moffitt Cancer Center Research Institute, Yhdysvallat

vastaanotettu: 16 joulukuu 2011; Hyväksytty: 26 maaliskuu 2012; Julkaistu: 27 huhtikuu 2012

Copyright: © 2012 Huang et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Työ tukivat National Natural Science Foundation of China (NSFC) (nro 81101782), NSFC hanke CQ CSTC (nro CSTC2011BB5020), ja NSFC kolmas Military Medical University (nro 2010XQN36). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Joka vuosi on 1,35 miljoonaa uutta keuhkosyöpää maailmassa [1]. Maailmanlaajuisesti Keuhkosyöpä on johtava syy syöpään liittyvien kuolemien [2]. Johtuen monimutkaisia ​​biologisia toimintoja, ennuste keuhkosyöpään on edelleen erittäin huono [1]. Siksi on tärkeää paljastaa biologisiin toimintoihin sairauden vuoksi parantaa terapeuttisen tehon [3].

Rintasyöpä antiestrogeeni vastus 1 (BCAR1), myös oikeus p130cas, oli yksi CAS proteiini (Crk liittyviä substraatti) perheenjäseniä. Se tunnistettiin alun perin solu- proteiini muuttavia 130 kDa, ja hyperfosforyloi- in v-Crk ja v-Src transformoitujen solujen [4], [5]. Aluksi intensiivinen tutkimukset keskittyivät korrelaatio rintasyövän ja BCAR1 [6], [1], [7], [8]. Esimerkiksi Brinkman et al. [7] ehdotti BCAR1 yliekspressio ZR-75-1 rintasyöpäsolulinja tekee antiestrogeeni resistenssin soluille. Lisäksi Dorssers et ai. [8] kertoi, että BCAR1 ilmentyminen kääntäen verrannollinen Relapsiin elinaika ja yleistä elinaika rintasyöpään.

Äskettäin Tutkimuksemme ehdotti on kliininen seuraus BCAR1 ei-pienisoluinen keuhkosyöpä ( NSCLC) [9]. Olemme tutkineet seerumin BCAR1 tasot 80 NSCLC tapauksissa ja 80 terveen kontrollin, vastaavasti, käyttämällä erityistä entsyymi-immunologinen määritys (ELISA) [9]. Kiehtovan, huomasimme, että seerumin BCAR1 tasot olivat merkittävästi korkeammat NSCLC kuin kontrolliryhmässä, vähitellen lisätä etenemistä tuumorin luokitus, ja laski poiston jälkeen pahanlaatuisten vaurioiden [9]. Kuitenkin kasvaimia synnyttävän mekanismit BCAR1 NSCLC ovat edelleen arvoituksia.

Tässä toteutimme lisätutkimuksia arvioida ennustavan voiman BCAR1 biomarkkerina varten huonon ennusteen pienisoluista keuhkosyöpää. Ja me tarkistanut karsinogeeninen roolit BCAR1 kautta RNA-häirintää (RNAi) A549 keuhko adenokarsinoomasolulinjan. Kokeet in vivo ja in vitro osoittivat suljetun korrelaation BCAR1 ilmaisun ja aktivointi p38 joka on keskeinen haara MAPK (mitogeeniaktivoidut proteiinikinaasi) reitin [10], [11].

Materiaalit ja menetelmät

Potilaat

tutkimusprotokolla tarkasteli ja hyväksynyt tutkimuseettiseltä in Daping sairaalassa (Chongqing City, PRChina) [viite nro. TMMU-DPH /2006-012], ja tietoon perustuvan suostumuksen oli kirjoitettu ja saatu kaikki potilaat.

Tutkimuksessa välillä suoritetaan tammikuussa 2006 ja kesäkuussa 2010 oli yhteensä 182 potilasta NSCLC. Keuhkojen kasvain oli diagnosoitu radiologisesti ja vahvistettu patologia. Kukaan potilaista ei ollut saanut hoitoa ennen tutkimukseen tutkimuksessa. Väestörakenteen ja kliinis ominaisuudet potilaista on esitetty taulukossa 1. Kaikki potilaat saivat lobectomy ja imusolmukkeiden. Sata ja kolmekymmentäviisi potilasta sai postoperatiivinen adjuvanttihoitoa (paklitakseli plus nedaplatiini). Leikkauksen jälkeinen seuranta-aika oli käytettävissä 151 tapauksissa puhelimitse tai kirjeitse haastatteluun, ja 31 tapauksessa menetetty seurata johtuen virheellisen yhteystiedot.

Cell Culture

A549 ja Calu -3 keuhkoadenokarsinooma solulinjat saatiin American Type Culture Collection ja niitä viljeltiin RPMI1640 /10% FBS: ää, vastaavasti.

RNA häiriöt BCAR1

Ensinnäkin, seuraavat oligoribonukleotidi paria käytettiin: 5’CCGGGGTCGACAGTGGTGTGTATTTCAAGAGAATACACACCACTGTCGACCTTTTTTg-3 ’ja 5′-AATTCAAAAAAGGTCGACAGTGGTGTGTATTCTCTTGAAATACACACCACTGTCGACC-3’. Koko sekvenssit olivat peräisin sekvenssistä ihmisen BCAR1 mRNA. Oligonukleotidit saatiin Sunbio lääketieteellisen biotekniikan CO., Ltd (Shanghai City, P.R.China). Komplementaaristen kaksi juostetta (kukin 20 uM) 60 ui annealing-puskuria (Sunbio Medical Biotechnology CO., Ltd, Shanghai City, P.R.China) kuumennettiin 5 minuutin ajan 95 ° C: ssa ja sen jälkeen inkuboitiin 1 h huoneenlämpötilassa. Sen jälkeen GFP-leimatun lentivirusvektorilla pLVT351.LV varten BCAR1-RNAi rakennettiin insertoimalla hybridisoituvat nukleotidit osaksi Age I + EcoRI paikalle pMAGic 4,1 (Sunbio lääketieteellisen biotekniikan CO., Ltd, Shanghai City, PRChina).

Toiseksi, A549-solulinja maljattiin 2,3 x 10

5 solua per kuoppa 24-kuoppaisen soluviljelylevyn levylle ja tartunnan lentiviruksen on infektiokertoimella (MOI) 10. soluja infektoitiin pLVT351- LV ja CMV-GFP-LV (tyhjä lentivirusvektorilla, pMAGic 4,1) nimettiin A549-BCAR1-RNAi ja A549-negatiivinen kontrolli, vastaavasti.

Western-blottaus-analyysi BCAR1, fosfo-BCAR1, fosfo-p38 ja p38 in NSCLC kudosten ja solujen

NSCLC ja sovitettu viereisten normaaleissa kudoksissa (vähintään 5 cm: n päässä primäärikasvaimissa) oli saatavilla kaikkiaan kuusikymmentä (mukaan lukien 35 adenokarsinooman ja 25 okasolusyöpää) tapauksissa western blotting . Toimien aikana, näytteet kerättiin teknikot nopeasti noudattaen muutto. Lisäksi olemme myös valmiita solulinjoja, mukaan lukien Calu-3, A549, A549-negatiivinen kontrolli ja A549-BCAR1-RNAi.

Sen jälkeen lysaatit kudoksia ja solulinjoja valmistettiin RIPA-puskurissa, joka sisältää 50 mM Tris HCl: lla pH 7,5, 150 mM NaCl, 1% Triton X-100, 0,1% SDS, 0,5% deoksikoolihappo ja 0,02% natriumatsidia. Proteiinin pitoisuudet määritettiin BCA Protein Assay Kit (Pierce, Rockford, IL).

Proteiinit denaturoitiin 95 ° C: ssa 5 min, ja 50 ug proteiinia per kaista erotettiin natriumdodekyylisulfaatti-polyakryyliamidia geelielektroforeesi (SDS-PAGE) käyttäen 10% polyakryyliamidigeelillä. Proteiinit blotattiin polyvinylideenidifluoridi (PVDF) (Thermo), joka blokattiin sitten 5% rasvaton maito 1 h huoneen lämpötilassa. Proteiinit immunoblotattiin käyttämällä anti-BCAR1-vasta-ainetta (BD Transduction Laboratories, USA, 1:1000), anti-fosfo-BCAR1 (Tyr410) vasta-aine (Abcam, USA, 1:1000), anti-p38 (BD Transduction Laboratories materiaalia, USA , 1:1000) ja anti-fosfo-p38 (Thr180 /Tyr182) vasta-aineella (soluviestitykseen Transduction Laboratories, USA, 1:1000). Anti-β-aktiini (Sigma) tai GAPDH (Sigma) vasta-aine toimi kontrollina.

Gray asteikot immunoblottauksen NSCLC ja sovitettu viereisten normaaleissa kudoksissa analysoitiin kvantitatiivisesti käyttämällä kuvan hankinnan ja analyysin ohjelmistoa (Image Lab ohjelmisto, BIO-RAD, USA) mukaan valmistajan ohjeiden.

Tissue mikrosirujen rakentamiseen ja immunohistokemiallinen (IHC) määritys BCAR1, fosfo-BCAR1, p38 ja fosfo-p38 NSCLC kudoksissa

hematoksyliinillä ja eosiinilla (H +, Heikko asema ( 25%); ++, Kohtalainen kanta ( 50%); +++, Vahva asema (≥50%). ” 25%” on luokiteltu alhainen ilmaus, toisin kuin korkea ilme. Kolme tarkkailijaa suorittaa pisteet dioja ja keskiarvot saatiin lopulta.

TDT välittämää dUTP nick end merkintöjä määritys (TUNEL) ja NSCLC kudokset

Olemme suorittaneet TUNEL määrityksessä kudosleikkeiden kaikkien 182 tapausta. Apoptosis kasvaimen tarkastettiin in situ Cell Death Detection kit, POD (Roche, Saksa). kudosleikkeet parafiini ksyleenillä, ja sammutettua kautta lajitellut etanolia ja esikäsitellä mikroaaltouuni antigeenin hakuun (sitraattipuskuria, pH 7,5). Endogeeniset peroksidaasia blokattiin 0,3% H

2O

2 metanolissa 15 min. sen jälkeen kudosleikkeiden käsiteltiin 3% naudan seerumin albumiini 30 minuutin ajan ja inkuboitiin TUNEL reaktioseos (TDT: dUTP, 01:20) 45 min ajan 37 ° C: ssa. Kudosleikkeet yhdistettiin Converter-POD, jota seurasi pesu ja DAB (Zhong Shong, Kiina) värireaktio . aikana TUNEL menettelyä, leikkeitä pestiin fosfaattipuskurisuolaliuoksessa (PBS). Kudosleikkeet vastavärjättiin hematoksyliinillä, kuivatut kautta porrastettu etanolia, kirkastettiin ksyleenissä, ja asennettu. Negatiivisia kontrolleja, deionisoitua vettä sijasta käytettiin TDT. Positiiviset kontrollit koostuivat tulehtunut ihmisen nielurisojen. Soluja pidettiin positiivisina, kun voimakas ruskea reaktiivisuus havaittiin ytimet. Apoptotic indeksi laskettiin prosenttiosuus ydinvoiman positiivinen tahra 1000 soluissa viidessä eri paikoissa kunkin osan at 400 x suurennus.

Reaaliaikainen RT-PCR

tehon arvioimiseksi RNAi ja BCAR1, suoritimme kvantitatiivisen tosiaikaisen RT-PCR: A549-BCAR1-RNAi ja A549-negatiivisen kontrollin soluissa. Joko solut ympättiin pitoisuutena 1 x 10

5cells /kuoppa 6-kuoppaisilla levyillä. Kahden päivän kuluttua kylvön, kokonais-RNA uutettiin soluista käyttäen Trizol-reagenssia (Invitrogen). Ensimmäisen juosteen cDNA syntetisoitiin M-MLV transkriptaasia (Promega) ja oligo-dT. Reaaliaikainen PCR suoritettiin käyttäen SYBR Green PCR Master Mix (TAKARA) ja ABI Prism 7000 järjestyksessä tunnistusjärjestelmä (Applied Biosystems, Foster City, CA). PCR-alukkeita käytettiin seuraavista: 5′-CAATGCCTCACTGCTCTT-3 ’ja 5′-GTAGTCATAGTCCTCCATC-3’. Spesifisyys ilmaistujen signaalien varmistettiin dissosiaatiokäyrän koostuu yksittäinen piikki. Kaikki näytteet ajettiin kahtena kussakin kokeessa. Normalisoitiin ihmisen β-aktiini.

Cell Growth määritys

arvioimiseksi solujen kasvua, A549-negatiivinen kontrolli ja A549-BCAR1-RNAi-solut maljattiin 2,0 x 10

2 solua kuoppaa kohti kuuden kuoppalevyillä, vastaavasti. Ja joko solujen tarkastettiin ja valokuvattiin seuraava Giemsa värjäystä, yksitoista päivää sen jälkeen pinnoituksen.

Cell migraatiokokeessa

arvioimiseksi solun liikkuvuus, kammio muuttoliike määritykset suoritettiin käyttäen soluviljelyinsertissä ( 8-um huokoskoon, 24-kuoppainen formaatti; Cell invaasiomääritys Kit Cat. Chemicon, nro ECM550). A549-negatiivinen kontrolli ja A549-BCAR1-RNAi-soluja ympättiin kahtena kappaleena tiheydellä 3,0 x 10

5 solua /kammio. 48 tunnin kuluttua solut, jotka eivät olleet siirtynyt alempiin kuoppiin poistettiin yläpinnan läpi käyttäen vanupuikkoja, ja soluja, jotka oli siirretty alapinnan suodattimen värjättiin käyttämällä Cell Invasion Assay Kit Cat. (Chemicon, nro ECM550). Solumigraation kvantitoitiin visuaalisesti laskenta jälkeen valokuvataan. Kokeet suoritettiin kahtena kappaleena. Keskiarvoja kolmesta satunnaisesti alalla saatiin kuhunkin kuoppaan.

Cell Cycle määritykset

Virtaussytometristä määrittämiseksi solusyklin ajan, 2,0 x 10

6 A549-negatiivisen kontrollin soluissa ja A549 -BCAR1-RNAi solut kiinnitettiin 70% etanolilla ja värjättiin propidiumjodidilla, vastaavasti. Värjätyt solut analysoitiin FACScan-virtaussytometrillä suhteellista solusyklin ajan. Kokeet suoritettiin kahtena.

solukuoleman määritykset

arvioitiin solujen apoptoosin avulla FACScan-virtaussytometrillä. 2,0 × 10

6 A549-negatiivisen kontrollin soluissa (48 h kuluttua ohimenevän transfektion), A549-negatiivisen kontrollin soluissa (vakaa transfektio), A549-BCAR1-RNAi-solut (48 h kuluttua lyhytaikaista transfektiota) ja A549-BCAR1-RNAi solut (stabiili transfektio) kiinnitettiin 70% etanolilla ja värjättiin propidiumjodidilla, vastaavasti. Värjätyt solut analysoitiin FACScan-virtaussytometrillä suhteellista solujen apoptoosin. Kokeet suoritettiin kahtena.

Data Analysis

Tilastollinen analyysi suoritettiin käyttäen Studentin t-testiä, U-testi, Kruskal-Wallisin testi,

X

2 testiä ja Spearmanin rho, vastaavasti. Kuolema mistä tahansa syystä otettiin mukaan laskettaessa leikkauksenjälkeisen selviytymisen. Tauti erityinen eloonjääminen laskettiin Kaplan-Meier menetelmällä ja analysoidaan log-rank-testi. Ennustetekijöiden tutkittiin yhden ja usean analyysit käyttämällä Coxin suhteellisten riskien mallia. Kaikki edellä mainitut laskelmat suoritetaan käyttämällä SPSS versio 11.0 Windowsille (SPSS, Inc., Chicago, USA). Arvo p 0,05 (kaksipuolinen) pidettiin tilastollisesti merkitsevä.

Tulokset

BCAR1 yliekspressoituu NSCLC kudoksissa ja solulinjoissa

BCAR1 ilmentymistä havaittiin (joko tumassa, sytoplasmassa tai molemmat) 57 60 NSCLC tapauksissa käyttämällä Immunoblottausmääritys (kuva 1a), ja 177 182 NSCLC tapauksissa käyttämällä IHC määritystä (kuva 1c), tässä järjestyksessä. Kuitenkin, se ei havaittu normaalissa viereisen kudoksen 53 60 tapausta käyttämällä Immunoblotting (kuvio 1 a), ja 161 182 tapauksissa käyttämällä IHC määritystä (kuvio ei esitetty), vastaavasti. Analyysi harmaa asteikot immunoblottaus ehdotti myös BCAR1 tasot olivat merkittävästi korkeammat NSCLC kuin normaalissa vieruskudos (48,2 ± 24,7 vs. 11,0 ± 9,8, Studentin t-testi,

P

0,001, kuva 1b).

V: Immunoblottausmääritys merkitty joko BCAR1 tai fosfo-p38 (Thr180 /Tyr182) tasot kolmessa NSCLC kudoksissa (C) olivat huomattavasti korkeammat kuin viereisen normaaleissa kudoksissa (N). Mutta fosfo-BCAR1 (Tyr410) ja p38 tasot NSCLC ja viereisen normaalit kudokset olivat samanlaiset. BCAR1, fosfo-BCAR1, p38 ja fosfo-p38 ilmaisuja havaittiin myös A549- ja Calu-3 NSCLC solulinjaa käyttämällä immunoblottaustestiä. BCAR1 Knockdown aiheuttaa huomattavaa alenemista fosfo-BCAR1 ja fosfo-p38 tasoja A549-soluja. B: harmaa asteikot analyysi immunoblottaus ehdotti myös BCAR1 ja fosfo-p38 (Thr180 /Tyr182) tasot olivat merkittävästi korkeammat NSCLC kuin normaalissa vieruskudos (48,18 ± 24,7 vs. 10,97 ± 9,8,

P

0,001 ; 16,03 ± 5,8 vs. 28,82 ± 8,0,

P

0,001). Kuitenkin fosfo-BCAR1 (Tyr410) ja p38 ei ollut suuntaus (20,72 ± 6,4 vs. 24,37 ± 7,5,

P

= 0,22; 25,3 ± 11,2 vs. 27,8 ± 15,2,

P

= 0,476 ). C: IHC ehdotti ilmauksia BCAR1 (joko tumassa, sytoplasmassa), fosforia BCAR1 (alttiita paikantaa solulimassa), fosfori-p38 (alttiita paikantaa tumassa), p38 (alttiita paikantaa sytoplasmassa ) ja apoptoottisia kappaleita. Huomautus: N (viereiseen normaaliin kudokseen); C (NSCLC kudos); ** (

P

0,001); # (

P

0,05).

Kuitenkin, fosfo-BCAR1 (Tyr410) havaittiin sytoplasmaan 29 60 NSCLC käyttämällä Immunoblottausmääritys (kuva 1a), ja 32 tapausta 182 NSCLC tapauksissa käyttämällä IHC määritystä (kuva 1c), tässä järjestyksessä. Kuitenkin havaittiin myös normaalin viereisen kudoksen 30 60 tapausta käyttämällä Immunoblotting (kuvio 1 a), ja 34 182 tapauksissa käyttämällä IHC määritystä (kuvio ei esitetty), vastaavasti. Analyysi harmaa asteikot immunoblottaus ehdotti ei ollut tuntuva ero BCAR1 tasojen välillä NSCLC ja normaalin viereisen kudoksen (25,3 ± 11,2 vs. 27,8 ± 15,2,

P

= 0,476, Studentin t-testi, kuva 1b) .

BCAR1 ja fosfo-BCAR1 (Tyr410) havaittiin A549- ja Calu-3 NSCLC-solujen avulla immunoblottaustestiä (kuva 1a).

Korkeammat BCAR1 tasot korreloivat voimakkaasti enemmän huonosti eriytetty kasvaimia ja ennustaa huonompi ennuste

käyttämällä IHC määritystä 182 NSCLC tapauksissa olemme huomanneet, että korkeammat BCAR1 tasot korreloivat voimakkaasti huonommin erilaistumista. (Kruskal-Wallisin testi,

P

= 0,01; taulukko 1). Kuitenkaan ollut mitään merkittävää korrelaatiota BCAR1 ja muut kliiniset-patologinen ominaisuudet kuten ikä, sukupuoli, histologia, TNM, kasvaimen koon ja lymphonode etäpesäkkeiden (taulukko 1). Huolimatta BCAR1 ekspressiota havaittiin joko solulimassa, tumassa tai molemmat NSCLC, ei ollut merkittävää korrelaatiota proteiinin sijainti ja kliinisen patologisen parametrit (tietoja ei esitetty). Sitä paitsi, ei ollut merkittävää korrelaatiota fosfo-BCAR1 ja kliinisen-patologinen ominaisuudet (tuloksia ei esitetä).

eloonjäämisluku BCAR1 korkean ilmentymisen ryhmässä oli merkittävästi alhaisempi kuin alhaisen ilmentymisen ryhmässä (

P

= 0,001, kuvio 2a). Monimuuttuja-analyysi paljasti, että BCAR1 tasot (riskisuhde 1,777,

P

= 0,028), lymphonode etäpesäke (riskisuhde 1,277,

P

= 0,040) ja TNM-luokitus (riskisuhde 1,298,

P

= 0,007) olivat merkittäviä ja riippumaton prognostisia indikaattoreita NSCLC tapauksissa (taulukko 2).

V: n eloonjäämisluku BCAR1 korkean ilmaisi ryhmässä oli merkitsevästi alempi kuin matalan ilmaistuna ryhmä (

P

= 0,001). B: Fosfo-p38-positiivisten solujen merkittävästi ja korreloi positiivisesti prosenttiosuudet BCAR1 positiivisten solujen, että 182 NSCLC kudokset (Spearmanin rho, korrelaatiokerroin = 0,811, p 0,001). Ja prosenttiosuudet fosfo-p38 positiivisten solujen BCAR1 korkean ilmaisi kudokset olivat merkittävästi korkeammat kuin alhaisen ilmaisi kudoksissa (U-testi z = -3,689

P

0,001). C: Peräkkäiset leikkeet värjättiin BCAR1, fosfo-BCAR1, fosfo-p38 ja p38, joka osoitti, että solut yli-ilmentävät BCAR1 on myös korkeampi fosfo-p38 (x 200). Joko fosfo-BCAR1 tai p38 oli lievästi positiivinen.

BCAR1 Knockdown aiheuttaa solujen kasvun pysähtymisen, solujen kulkeutumistestis- ja solukierron pysähtymisen A549-solujen

Me perustettiin ihmisen NSCLC syövän A549-soluja, jotka ekspressoida pysyvästi pLVT351-LV (A549-BCAR1-RNAi-solut) ja CMV-GFP-L.V. (A549-negatiivinen kontrolli solut) käytön kautta lentiviruksesta järjestelmän. Vähintään 80%: n vähennys mRNA tasoilla BCAR1 A549-BCAR1-RNAi-solujen vahvistettiin reaaliaikainen RT-PCR: llä (kuvio 3a) ja Western-blottaus-analyysi (kuvio 1), vastaavasti. Samalla, voimme nähdä inhibition fosfo-BCAR1 yhdessä BCAR1 pudotus (kuvio 1 a).

: vähintään 80%: n vähennys mRNA BCAR1 A549-BCAR1-RNAi-solujen vahvistettiin real- aika RT-PCR. B: pesäkkeitä muodostavat yksiköt A549-BCAR1-RNAi olivat havaittavasti alle A549-negatiivisen kontrollin soluissa, yksitoista päivää sen jälkeen pinnoitus. C: Cell migraatiokokeessa ehdotti BCAR1 Knockout esti solujen migraation A549-BCAR1-RNAi-soluissa. D: Virtaussytometria osoitti BCAR1 Knockout aiheuttivat solusyklin pysähtymisen A549-BCAR1-RNAi-soluissa. E: Virtaussytometria osoitti BCAR1 tyrmäys ei lisännyt apoptoosia korko seuraavat joko ohimeneviä (39,1% vs. 42,1%) tai vakaa transfektion (0,33% vs. 0,4%) A549-soluissa.

Kuva 3b ehdotti, pesäkkeitä muodostavien yksiköiden A549-BCAR1-RNAi-solut olivat detektoitavissa alle A549-negatiivisen kontrollin soluissa, yksitoista päivää sen jälkeen pinnoituksen (kuvio 3b). Cell migraatiokokeessa ehdotti BCAR1 Knockdown esti solujen migraation A549-BCAR1-RNAi-solut (kuvio 3c). Ja Virtaussytometria osoitti BCAR1 Knockdown aiheuttivat solusyklin pysähtymisen A549-BCAR1-RNAi-solut (kuvio 3d).

BCAR1 haitallisesti korreloi apoptoottista indeksiä NSCLC kudoksissa. Kuitenkin BCAR1 knockdown voi lisätä apoptoosia A549- soluissa

Apoptoottiset havaittiin kaikissa 182 NSCLC kudoksiin (kuva 1c). Niistä kudokset, oli merkittävä ja käänteinen korrelaatio BCAR1 ja apoptoottista indeksiä (Spearmanin rho, korrelaatiokerroin = -0,183;

P

= 0,013). Apoptotic indeksi BCAR1 korkean ilmaisi kudoksissa oli huomattavasti pienempi kuin BCAR1 matalan ilmaisi kudoksissa (Studentin t-testi t = 2,312

P

= 0.022).

Kuitenkin, verrattuna negatiivisen kontrollin solut, BCAR1 tyrmäys ei lisännyt apoptoosia korko seuraavat joko ohimeneviä (39,1% vs. 42,1%) tai vakaa transfektion (0,33% vs. 0,4%) vuonna A549-soluja (kuvio 3e).

yli-ilmentyminen BCAR1 korreloi aktivaation p38 NSCLC tapauksissa ja BCAR1 knockdown aiheuttaa vähentäminen fosfo-p38 A549-soluissa

Phospho-p38 ilmentymistä havaittiin 31 60 NSCLC tapauksissa käyttämällä immunoblottauksella (kuva 1a), ja 91 182 NSCLC tapaukset (altis sijoittumaan tumaan) käyttämällä IHC määritystä (kuva 1c). Samanlainen suuntaus BCAR1 tasoilla, harmaasävyt analyysi paljasti fosfo-p38-tasot olivat merkittävästi korkeammat NSCLC kuin normaalissa viereisten kudosten (16,03 ± 5,8 vs. 28,82 ± 8,0,

P

0,001; Kuva 1b) . Kuitenkin p38 ei ollut suuntaus (20,72 ± 6,4 vs. 24,37 ± 7,5,

P

= 0,22) (kuva 1b). Sitä paitsi, IHC ehdotti positiivisten määrä joko BCAR1 tai fosfo-p38 oli huomattavasti suurempi NSCLC kuin normaalissa kudoksessa (

P

0,001 ja P 0,001, vastaavasti) (taulukko 1). Kuitenkin p38 ei ollut tällaista suuntausta (

P

= 0,62).

Löysimme prosenttiosuudet fosfo-p38-positiivisten solujen merkittävästi ja korreloi positiivisesti kuin BCAR1 positiivisten solujen, kaikissa 182 NSCLC kudokset (Spearmanin rho, korrelaatiokerroin = 0,811, p 0,001; Kuva 2b). Ja prosenttiosuudet fosfo-p38 positiivisten solujen BCAR1 korkean ilmaisi kudokset olivat merkittävästi korkeammat kuin BCAR1 matalan ilmaisi kudoksissa (U-testi z = -3,689

P

0,001; Kuva 2b). Kuitenkin, ei ollut mitään korrelaatiota fosfo-BCAR1 ja fosfo-p38 tasojen (P = 0,892).

Yrittäessään kuvaamaan voimakas korrelaatio BCAR1 positiivisen ja fosfo-p38-positiivisia soluja, esitimme peräkkäinen osat värjättiin yhdessä tapauksessa BCAR1, fosfo-BCAR1, fosfo-p38 ja p38, joka osoitti, että solut yli-ilmentävät BCAR1 on myös korkeampi fosfo-p38 (kuvio 2c).

BCAR1 tasot Calu-3-solut olivat havaittavasti korkeampi kuin A549-soluja (kuvio 1a). Kiehtovan, Kuva 1a ehdotti fosfo-p38 tasoilla oli myös sama suuntaus. Lisäksi BCAR1 Knockdown aiheuttaa myös huomattavan alenemisen fosfo-p38 runsautta A549-soluja (kuva 1a).

Keskustelu

BCAR1 adaptoriproteiinina proteiini paikantuu kromosomiin 16q22-q23

7 ja koostuu pääasiassa neljästä funktionaalisia osia, kuten aminoterminaalinen Src homologia 3 (SH3) verkkotunnuksen, Src-sitovan domeenin (SBD), suurelle substraatille verkkotunnuksen (SD) ja heliksi-silmukka-heliksi domain (HLH) [12 ], [13]. BCAR1 etsii kaikkialle in vitro ja in vivo [14], [15], [16], ja on mukana erilaisissa solujen prosesseissa kuten muuttoliike, kemotaksista, apoptoosin, solukierron, erilaistumiseen ja niin edelleen [17], [18].

toistaiseksi hyvin harvat tutkimukset keskittyneet karsinogeneesin on BCAR1 keuhkosyövässä. Wei et ai. [19] ehdotti, että kiinnittymisestä riippumaton fosforylaation BCAR1 suojattu keuhkoadenokarsinooma solujen anoikis. Äskettäin meidän tutkimuksessa todettiin, että seerumin BCAR1 tasot olivat merkittävästi korkeammat NSCLC kuin kontrolliryhmässä, vähitellen lisätä etenemistä tuumorin luokitus, ja laski poiston jälkeen pahanlaatuisten vaurioiden [9]. Tämän seurauksena olemme oletettava uusi kasvaimia synnyttävän roolia BCAR1 in NSCLC. Tässä pyrittiin tarkistamaan kliinisiä vaikutuksia BCAR1 yli-ilmentymisen ja NSCLC, sekä valaista karsinogeenisia mekanismeja BCAR1 in NSCLC. Kuten odotettua, löydettiin BCAR1 proteiini on erityisen runsaasti NSCLC soluja ja kudoksia. Ja tutkimuksemme in vivo ja in vitro osoitti läheinen korrelaatio BCAR1 ilmaisun ja aktivoitumista p38 MAPK. Vaikka ennen tutkimukset ovat osoittaneet, että tyrosiinifosforylaatiota BCAR1 voi olla kriittinen alavirran signalointia [20], Tutkimuksemme osoitti, että fosfo-BCAR1 (Tyr410) havaittiin vain 34 182 tapausta, eikä korreloi kliinisen patologinen ominaisuudet. Tähän mennessä useita sivustoja ihmisen BCAR1 fosforylaation löytyy kuten: tyrosiinitähteissä aa 12, 128, 165, 192, 222, 224, 234, 249, 267, 287, 306, 327, 362, 372, 387, 410, 653, 664, 666; seriinitähteissä aa 134, 139, 292, 437, 639; ja treoniiniryhmä aa 269, 326, 385. Oletamme, että tiettyjä sivustoja fosforylaation ovat kriittisiä signaalin päällekkäisiä BCAR1 in NSCLC. Kiinnostavaa vieressä normaaleissa kudoksissa osoittavat paljon korkeampia fosfo-BCAR1 kuin BCAR1 proteiineja (kuvio 1 a). Olemme myös vahvisti inhibitio fosfo-BCAR1 yhdessä BCAR1 pudotus yrittää, jotta voidaan varmistaa tämän vasta-aineen. Oletamme, että erityinen entsyymi keuhkokudoksissa nimenomaan hajoaa Non-fosfo-BCAR1 kuitenkin fosfo- BCAR1 selviävät. Ja kaikki edellä mainitut hypoteesit ansaitsevat edelleen enemmän tutkimuksia.

kokeissa in vitro osoittivat, että BCAR1 Knockdown A549-soluissa aiheutti solujen kasvun pysähtymisen, solusyklin pysähtymiseen ja solun kulkeutumistestis-. Vaikka BCAR1 Knockdown A549-solut eivät aiheuta apoptoosia, on olemassa huomattava ja käänteinen korrelaatio BCAR1 ja apoptoottisten indeksiä NSCLC kudoksissa. Emme tiedä syitä välinen ero NSCLC solujen ja kudosten. Lisäksi tutkimuksemme in vivo osoitti, että BCAR1 tasot olivat merkitsevästi ja käänteisesti verrannollisia kasvain eriyttäminen, joko laskemalla positiiviset prosentteja soluja (Kruskal-Wallisin testi,

P

= 0.010) tai arvioi värjätään intensiteetti (achromasy = 0 , stramineous = 1, buffy = 2, ruskea = 3, Kruskal-Wallisin testiä,

P

= 0,014). Kaplan-Meier käyrä osoitti myös, että korkeampi BCAR1 ennusti huonompi ennusteen 151 tapauksissa voimassa seurata tietoja. Kaikki edellä mainitut kokeet ehdotti BCAR1 ollut ratkaiseva rooli syövän synnyssä. Lisäksi BCAR1 tunnetaan Src substraattina, ja Src-estäjällä AZD0530 voi myös johtaa merkittävään estoon solumigraation ja matrigeeliä hyökkäyksen keuhkosyövän soluihin [21], joka mahdollisesti kannattaa karsinogeneesi Src /BCAR1 akselilla.

käyttäen immunoblottauksella, Greenberg et ai. [22] osoitti, että vain aktivoituu p38 MAPK johdonmukaisesti lisääntyi NSCLC verrattuna normaaliin kudokseen, mikä viittaa ylimääräinen rooli tämän väylän solujen pahanlaatuista kasvua tai muutosta. Todellakin, lukuisat tutkimukset olivat julkisti karsinogeenisia toimintaa p38, kuten proliferaation ja muuttoliike [1], [23], [24]. Matsuda K et ai. [23] totesi, että EGF edistää leviämisen kautta p38 MAPK signa- in ASPC-1, PANC-1 ja T3M4 haimasyövän solulinjoissa, ja p38 MAPK estäjän SB203580 voi estää EGF-stimuloidun mitogeneesin. Lisäksi p38 MAPK-reitin on ollut mukana olevan tärkeä rooli endoteelisolujen migraatiota koska estävä p38MAPK aktiivisuutta alas-säätelee VEGF-stimuloimaa muuttoliike [24]. Äskettäin, Wendt et ai.: N tutkimuksessa [25] osoittivat, että ekspression lisäämiseksi joko täysipituisen tai vain karboksiterminaalipäästä BCAR1 nisän epiteelisolujen lisääntynyt p38-aktivaation. Kiehtovan, 182 NSCLC kudoksissa, löysimme oli läheinen korrelaatio ilmaus BCAR1 ja fosfo-p38. Arvioimalla värjätään intensiteetti fosfo-p38 ja BCAR1 (achromasy = 0, stramineous = 1, buffy = 2, ruskea = 3, ” 2 tulokset” luokiteltiin heikkoa ilmentymistä, toisin kuin korkea ilmaus), löysimme runsaasti fosfo-p38 oli myös merkitsevästi ja positiivisesti korreloida BCAR1 (Spearmanin rho, p 0,001). lisäksi BCAR1 knockdown aiheutti myös huomattavaa alenemista fosfo-p38 tasoja A549-solut. kuitenkin taustalla olevien mekanismien ansaitsevat lisätutkimuksia. lisäksi