Krooninen sairaus

tiivistelmä

Twist1 yliekspressio havaitaan usein eri syöpiä, kuten mahasyövän (GC). Vaikka DNA: n metylaatio on

Twist1

geeni on raportoitu syöpäsoluissa, mekanismeista transkription aktivointi jää epävarmaksi. Tässä tutkimuksessa, ensin tarkasteltiin epigeneettiset korjauksilla

Twist1

käyttämällä

Twist1

transkriptio-positiivisten ja -negatiivisilla solulinjat, jotka ovat peräisin meidän perustettu hajanainen-tyyppinen GC hiirimallissa. Hoito DNA demetylaatio agentti 5-atsa-dC uudelleenaktivoitu Twist1 ilmentyminen Twist1 ilmaisu-negatiivinen GC soluissa. Mukaan metylaatiospesifistä PCR ja bisulfiitti Sekvensointianalyysin metylaation CpG-rikas alue sisällä

Twist1

koodaus eksonin 1, eikä sen promoottorialue oli tiukasti sidoksissa transkription hiljentäminen

Twist1

ilmentyminen hiiren GC soluissa. Kromatiinin immunopresipitaatiomäärityksiä paljasti, että aktiivinen Histonimerkki H3K4me3 rikastui Twist1 ilmentymisen-positiivisten solujen, ja aktiivinen Histonimerkki H3K9me3 rikastui Twist1 ilmentymisen-negatiivisia soluja. Ilmaisu tasot

Suv39h1

ja

Suv39h2

, histoni metyylitransferaasit varten H3K9me3, olivat käänteisesti verrannollisia

Twist1

ilmaisun, ja knockdovvn

Suv39h1

tai

Suv39h2

aiheuttama

Twist1

ilme. Lisäksi Sp1 transkriptiotekijä sitoutuu eksonin 1 CpG-rikas alue Twist1 ilmaisu-positiivisia solulinjoja, ja

Twist1

ilmentyminen väheni mitramysiini, jotka joka häiritsee SP1 sitoutumisesta CpG-rikas säätelysekvenssejä. Meidän tutkimukset ehdotti, että

Twist1

transkription GC soluissa voidaan säännellä mahdollisia yhteistyössä DNA: n metylaatio, histonimodifikaation monimutkaisissa SP1 sitoutumisesta CpG-rikkaiden alueiden sisällä eksoni 1 -alueella.

Citation: Sakamoto A, Akiyama Y, Shimada S, Zhu WG, Yuasa Y, Tanaka S (2015) DNA metylointi on eksonissa 1 alueen ja monimutkainen sääntely Twist1 Expression mahasyövän Cells. PLoS ONE 10 (12): e0145630. doi: 10,1371 /journal.pone.0145630

Editor: Tae-Young Roh, Pohang University of Science and Technology (POSTECH), Korean tasavalta

vastaanotettu: 21 syyskuu 2015; Hyväksytty: 06 joulukuu 2015; Julkaistu: 22 joulukuu 2015

Copyright: © 2015 Sakamoto et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään

Data Saatavuus: kaikki asiaankuuluvat tiedot kuuluvat paperin ja sen tukeminen Information tiedostoja.

Rahoitus: Tätä työtä tukivat Apurahat-in-Aid tieteellisen tutkimuksen (C) (24590444) ja (A) (25253081), ja A3 ennakoinnin Program (AA005) päässä Japanin Society for Promotion of Science (JSP), ja käytännön tutkimus Innovative Cancer ohjaus (15Ack0106017h0002) Japanista Agency for Medical tutkimuksen ja kehityksen, AMED; https://kaken.nii.ac.jp/d/r/30253420.ja.html, https://kaken.nii.ac.jp/d/r/80262187.ja.html.

kilpailevat edut: kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

lyhenteet: BS, bisulfiitti sekvensointi; CGI, CpG-saarekkeen; Siru, kromatiinin immunosaostus; DCKO, kaksinkertainen ehdollinen hiiressä; DGC, diffuusi-tyyppinen mahasyöpä; GAPDH, glyseraldehydi-3-fosfaattidehydrogenaasi; GC, mahasyöpä; H3K4me3 histoni H3 lysiinin 4 tri-metylointi; H3K9me3 histoni H3 lysiinin 9 tri-metylointi; H3K27me3 histoni H3 lysiinin 27 tri-metylointi; MSP, metylaatiospesifinen polymeraasiketjureaktio; RT-PCR: käänteistranskriptio-polymeraasiketjureaktio; qRT-PCR, kvantitatiivinen RT-PCR; APT, tuumorisuppressorigeeneille; TSS, transkripti Aloitussivuston; 5-atsa-dC, 5-atsa-2′-deoksisytidiini

Johdanto

Twist1, joka toimii perus helix-loop-helix transkriptiotekijä, suoraan sitoutuu E-box elementtejä (NCANNTGN ) erityisistä kohdegeenien [1]. Twist1 on laajalti tunnettu olevan olennainen Mesodermi muodostumisen aikana alkion varhaiskehityksen Drosophila ja hiiren [2, 3]. Ihmisen syövissä, kohdunulkoinen Twist1 ilmentyminen on raportoitu liittyvän pahanlaatuiseen etenemiseen, invaasio, epiteelin-to-mechencymal siirtyminen, etäpesäke ja stemness, mikä viittaa potentiaaliseen onkogeenisiä toiminnot Twist1 [4-6]. Näin ollen on erittäin tärkeää selventää transkription sääntelymenetelmistä Twist1 syöpäsoluissa.

Epigeneettiset muutoksia, kuten DNA: n metylaation ja histonimodifikaation, ovat tiukasti sidoksissa geenien [7-9]. Vaikka epigeneettiset muutokset on CGI (CpG-saarekkeen) promoottorialueen tuumorisuppressorigeeneille (APT) ovat hyvin tiedetään liittyvän niiden geenin toiminnan lopettamisesta [10], mekanismeja epigeneettiset sääntelyn onkogeenien huonosti. Useat ryhmät ovat osoittaneet, että

Twist1

uudelleen aktivoitu käsittelemällä de-metylaation lääkettä, 5-atsa-2′-deoksisytidiini (5-atsa-dC), syöpäsoluja [11, 12]. Poikkeava DNA: n metylaatio klo CGI promoottori ihmisen

Twist1

on usein havaittu primaarisyöpien myös mahasyövän (GC) [11-14]. On kuitenkin olemassa paljon havaintoja, että DNA: n metylaatio on

Twist1

promoottorialue ei korreloi geenin ilmentymistä erilaisissa syövissä [12, 14]. Vaikka

Twist1

metylaatio saattaa olla hyödyllinen biomerkkiaine ennustaa kliinisiä tuloksia kuin uusiutumiseen ja eloonjäämisen potilailla, joilla on syöpiä [12, 13, 15], se on edelleen kiistanalainen vai ei

Twist1

metylaation promoottorialueen johtaa hiljentäminen geenin.

transkription säätelyyn geenien korreloi lysiini (K) metylaatiovyöhykkeiden histoni hännän, joka koostuu kolmesta eri lysiinin metylaatio todetaan (mono-, di- ja tri). Tri-metyloinnin H3K4 (H3K4me3) liittyy geeniaktivaatioon, ja että H3K9me3 ja H3K27me3 geeni tukahduttaminen [7-9]. Vaikka näitä kolmea histoni H3-methyaltion kuviot liittyvät CGI Metylointia hyvin, transkription sääntelymenetelmistä

Twist1

taustalla histonimodifikaation tunnetaan huonosti syöpäsoluissa.

GC on toiseksi yleisin kuolinsyy syöpään maailmassa [16]. GC luokitellaan kahteen pääluokkaan histologista tyyppiä; hajanainen ja suoliston, jotka ovat kaksi erillistä karsinogeenisia väyliä [17]. Diffuusi-tyypin mahalaukun syöpä (DGC) tunnetaan näyttää usein ja metastaasit, mikä johtaa huonoon ennusteeseen [18]. Menetys E-kadheriinin ja p53 on raportoitu diffuusi-tyyppinen mahasyövän [19-21]. Useat raportit osoittivat usein yli-ilmentyminen Twist1 ihmisen DGCs [22, 23].

aiemmin suunniteltu kaksinkertainen ehdollinen Knockout (DCKO) hiiri linjan E-kadheriinin ja p53, jotka on nimenomaan inaktivoituvat vatsassa [ ,,,0],19]. Kaikki DCKO hiirille kehittyi kohtalokas DGCs vuoden sisällä, fenotyyppien ollessa korkea invasiivisuus ja usein etäpesäkkeitä imusolmukkeisiin. On huomionarvoista, että geeni-ilmentymisen kuviot DGCs on DCKO hiirillä havaittu mikrosiruanalyysi olivat hyvin samanlaisia ​​kuin ihmisen ensisijainen DGCs muu kuin suoliston niistä. Siten meidän DCKO hiiri malli on tehokas työkalu tutkittaessa roolia geenin funktion DGC syövän synnyn ja kehittää terapeuttinen strategia. Tässä tutkimuksessa olemme perustettu Twist1 ilmaisu-positiivisia ja -negatiivinen DGC solulinjat, jotka ovat peräisin DCKO hiirillä. Seurauksena analyysin epigeneettiset muutokset, yhteinen sääntely mekanismia

Twist1

oli selvitetty, ja arvioidaan sekä hiiren ja ihmisen DGCs tässä tutkimuksessa.

Materiaalit ja menetelmät

etiikka lausunto

Kaikki

in vivo

menettelyjä hyväksynyt Animal Care komitean Tokion Lääketieteen ja hammaslääketieteen University (Permission nro 0160073A). Koska normaalin ihmisen mahalaukun limakalvoja näytteitä, kirjallinen suostumus saatiin kaikissa aineissa, ja hyväksyi tutkimuksen eettisen komitean Tokion Lääketieteen ja hammaslääketieteen University (No.1115).

Soluviljelmät ja kudosnäytteiden

aiemmin vahvistettu E-kadheriinin /p53 DCKO (

Atp4b-Cre

+

;

Cdh1

loxP /loxP

;

Trp53

loxP /loxP

) hiirimallissa [19]. Sen cancerous kudosten, loimme viisi hiirtä DGC solulinjojen ja nimesi ne MDGCs (Shimada S, julkaisematon havainto). MDGC-1 ja MDGC-3-soluja viljeltiin Dulbeccon modifioidussa Eaglen väliaineessa (DMEM), joka sisälsi runsaasti glukoosia, johon on lisätty 10% naudan sikiön seerumia, ja MDGC-7, MDGC-8 ja MDGC-9 viljeltiin Hamin F12, johon oli lisätty 5% hevosen seerumia. DNA-analyysi suoritettiin, jotta voidaan havaita katkaistu

Cdh1

ja

Trp53

alleelien (S1 Kuva). Kahdeksan ihmisen GC solulinjoissa (KATO-III, GCIY, AGS, MKN7, MKN45, MKN74, NUGC4 ja HSC60) käytettiin myös tässä tutkimuksessa. MKN7, MKN45, MKN74, GCIY ja KATO III ostettiin RIKEN solu pankki (Tsukuba, Japani). NUGC4 ja AGS-solut hankittiin Human Science Research Resources Bank (Osaka, Japani) ja ATCC (American Type Cell Collection). HSC60 solut saatiin Dr. Kazuyoshi Yanagihara (National Cancer Research Center, Tokio, Japani) [24]. KATO III, MKN7, MKN45, MKN74, NUGC4, AGS ja HSC60 soluja viljeltiin RPMI 1640: ssä, ja GCIY viljeltiin Dulbeccon modifioidussa Eaglen väliaineessa, jotka molemmat oli täydennetty 10% naudan sikiön seerumia. For de-metylaatio tutkimuksia, hiiren ja ihmisen GC-soluja käsiteltiin päivittäin 500 nM 5-atsa-deoksisytidiini (5-atsa-dC, Sigma, # A3656) 72 tunnin ajan. Käsittelimme näitä GC soluja 100 nM trikostatiini A (TSA, Wako, # 200-11993) 24 tuntia tai 100 nM mitramysiiniä A (Wako, # 132-17101) 24 tuntia.

Kahdeksantoista ensisijainen GC kudosten ja vastaavien ei-syöpä mahalaukun limakalvon saatiin 15 DCKO hiirillä. Mitä tulee ihmisten mahan kudoksissa, käytimme kolme ei-syöpä mahalaukun limakalvon GC potilaista. Olemme myös saaneet viisi normaalia mahalaukun limakalvon välillä

Atp4b-Cre

–

;

Cdh1

loxP /loxP

;

Trp53

loxP /loxP

hiiriä, joita käytettiin negatiivisina kontrolleina edellisessä tutkimuksessa [19]. Tässä tutkimuksessa olemme nimeltään ”normaali mahan limakalvon” jos yksilöt saatiin verrokkihiirten, ja ”ei-syöpä mahalaukun limakalvon” jos yksilöt saatiin DCKO hiirillä ja ihmisen GC tutkimuspotilaat.

Käänteinen transkriptio (RT) -PCR ja kvantitatiivinen RT-PCR: llä (qRT-PCR) B

Kokonais-RNA eristettiin RNeasy Mini kit (Qiagen, # 74134), ja cDNA valmistettiin RNA: sta käyttäen SuperScript III (Invitrogen; # 18.080.044) mukaan valmistajan protokollia. Päätepiste RT-PCR suoritettiin useita syklien määrä 28-35 syklit. Koska sisäinen valvonta, glyseraldehydi-3-fosfaattidehydrogenaasin (

GAPDH

) monistettiin 21 sykliä varmistaa cDNA laadun ja määrän kutakin RT-PCR. Monistetut tuotteet on lastattu 2% agaroosigeeleillä tai määrällisesti kvantitatiivisen RT-PCR: llä käyttäen LightCycler DNA Master SYBR Green I (Roche Diagnostics; # 04707516001). Monistaminen ohjelmat PCR toistettiin 40 sykliä GAPDH ja 45cycles muiden geenien paitsi GAPDH. PCR-tuotteet kloonattiin pMD20 T-vektoriin käyttämällä Mighty TA-kloonaus (Takara BIO INC; # 6028), ja sitten sekvensoitiin suoraan. Alukesekvenssejä ja PCR-tuotteen koot esitetään S1 taulukossa.

metylointianalyysi

uutettu genomi-DNA hiiren ja ihmisen GC solulinjoissa jonka fenoli-kloroformilla menetelmällä, ja sitten toteutetaan bisulfiitti muutos ja MSP menettely. Bisulfiittikäsittelyn DNA: ta suoritettiin EZ DNA Metylointi-Gold (ZYMO RESEARCH, # D5006) ja sen jälkeen metylaatiospesifinen PCR (MSP) suoritettiin. Lyhyesti, PCR-reaktio suoritettiin 35 syklillä 25 ui seosta, joka sisältää bisulfiitti-muunnettu DNA, 2.5μl 10x PCR-puskuria, 1,25 pl 25 mM dNTP: itä, 25 pmol /l kutakin aluketta ja 1 U JumpStart RedTaq polymeraasia (Sigma ; # D0563). Edellytykset PCR olivat seuraavat: 95 ° C 5 minuuttia; 35 sykliä 95 ° C: ssa 1minutes, 53 ° C: ssa 2minutes, ja 72 ° C: ssa 1.5minutes; ja lopullinen pidennys 72 ° C: ssa 5 minuutin ajan. Kuten hiiren GC kudosten, DNA uutettiin formaliinilla kiinnitetyt, parafiiniin upotettuja (FFPE) kudoksiin. Bisulfiitti DNA monistettiin reunustavien PCR-alukkeita ja sen jälkeen sisäkkäin MSP suoritettiin [25, 26]. Alukkeen sekvenssit ja PCR-tuotteen koot on esitetty S2 taulukossa.

Kromatiini immunosaostuksella (ChIP) määritys

ChIP Määritys suoritettiin käyttämällä ChIP-IT Express kit (Active motiivi, # 53008) mukaan valmistajan protokollaa. Immunosaostettiin DNA rikastus normalisoitui kun tuloon. Vasta-aineita käytettiin tässä tutkimuksessa olivat anti-histoni H3K4me3 (Active motiivi, # 39915), anti-H3K9me3 (Active motiivi, # 39765), anti-H3K27me3 (Active motiivi, # 39155), anti-H3K36me2 (Abcam; # ab9049) , anti-SP1 (Abcam; # ab13370), ja anti-histoni H3 (Active motiivi, # 39163) vasta-aineita. Normaali kanin IgG (Cell Signaling Technology, # 2729s) käytettiin negatiivisena kontrollina siru. Alukesekvenssejä ja PCR-tuotteen koot on esitetty S2 taulukossa.

Knockdown analyysi käyttämällä pieniä häiritseviä RNA: ita

siRNA-pohjainen knockdovvn

Suv39h1

ja

Suv39h2

suoritettiin käyttäen elektroporaatiota (Neon transfektion järjestelmää, Invitrogen) mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. MDGC solut transfektoitiin 50 nM siRNA on Suv39h1 (SASI_Hs02_00335192, Sigma), Suv39h2 (SASI_Hs01_00101226), tai negatiivinen kontrolli siRNA (Mission siRNA Universal negatiivinen kontrolli, Sigma). 48 tunnin kuluttua viljelyn, solut kerättiin RT-PCR, Western blot-analyysit, muuttoliike, invaasio, ja proliferaatioanalyysi.

Western Blot analyysi

GC solut lyysattiin Pierce RIPA-puskuria (Thermo tieteellinen; # 89900). Proteiinit erotettiin SDS-polyakryyliamidigeeleillä ja siirrettiin sitten polyvinylideenifluoridia (PVDF), jonka jälkeen inkuboitiin vasta-aineiden kanssa liuotetaan Tris-puskuroidussa suolaliuoksessa (TBS), joka sisälsi 2% kuorittua maitoa ja 10% Tween 20 primaaristen vasta-aineiden, joita käytetään tässä tutkimuksessa oli hiiren monoklonaalinen anti-Twist1 (1: 100, Santa Cruz Bio-teknologia, # sc-81417), kanin polyklonaalinen anti-SP1 (1: 200, Active Motif, # 39058), ja hiiren monoklonaalinen anti-α-tubuliinin ( 1: 200, Santa Cruz, # sc-8035) vasta-aineet. Toissijainen vasta-aineet olivat alkalinen fosfataasi-konjugoitua anti-kani-IgG: tä (1: 3000, Bio-Rad Laboratories, # 1706518) ja anti-hiiri-IgG: tä (1: 3000, Bio-Rad Laboratories, # 1706520). Blotit kehitettiin ImmunoStar AP Substrate (Bio-Rad Laboratories, # 1705018).

immunohistokemia

FFPE osat (4 uM) poistettiin parafiini ksyleenillä, kostutetaan etanoliliuok- ja sitten antigeeni haku suoritettiin 10 mM sitruunahappopuskurilla mikrossa. Immunohistokemia suoritettiin käyttäen anti-Twist1 vasta-aineita (Santa Cruz, 01:20), kuten aiemmin on kuvattu [19]. Expression of Twist1 määriteltiin positiiviseksi tumavärjäystä yli 10% soluista, ja intensiteetti pisteytettiin ar- (negatiivinen), + (heikko) ja ++ (kohtalainen vahva) kolme tutkijat itsenäisesti.

tulokset

Twist1 ilmentymistä hiiren ja ihmisen GC solulinjoissa

Vuodesta DGC kudoksissa DCKO hiirten,

Twist1

transkriptio-positiivisia solulinjoja (MDGC-7, MDGC- 8 ja MDGC-9) ja negatiivisia solulinjoja (MDGC-1 ja MDGC-3) määritettiin (kuvio 1A ja S2A kuviossa), ja ekspressio Twist1 proteiinin varmistettiin kussakin solulinjassa (kuvio 1 B). Twist1 ekspressio oli lisääntynyt mRNA ja proteiini tasoilla Twist1 ilmentymisen-negatiivinen MDGC soluista hoidon jälkeen DNA demetylaatio agentti 5-atsa-dC (kuvio 1 C ja 1 D), kun taas sen ilmentyminen ei muuttunut hoidon jälkeen histonideasetylaasi estäjän TSA (S2B Kuva). Kahdeksassa ihmisen GC solulinjoissa tutkittiin,

Twist1

ilmentymistä vaimentua neljässä solulinjoissa (kuvio 1 E, vasemmalla), kolme (KATO-III, GCIY ja AGS), joista osoitettiin uudelleen aktivointi

Twist1

ilmaisu käsittelyn jälkeen 5-atsa-dC RT-PCR: llä (esimerkiksi, kuvio 1E, oikealla). Mitä

Twist1

ilmaisu-positiivisten GC solulinjoissa, kun 5-atsa-dC hoitoa, 2.1- ja 3.2-kertainen säätely ylöspäin

Twist1

havaittiin MKN45 ja MKN7 vastaavasti by qRT-PCR, kun taas Twist1 ilmentyminen ei muuttunut MDGC-9-soluissa (kuvio 1 F).

(A) RT-PCR-analyysi

Twist1

mRNA ilmaisun viidessä hiiren GC solulinjoja MDGC-1, MDGC-3, MDGC-7, MDGC-8 ja MDGC-9) peräisin DCKO hiirillä. Hiiri

GAPDH

käytettiin sisäisenä kontrollina. (B) ilmentäminen Twist1 proteiinin MDGC soluissa Western blot. α-tubuliinin käytettiin sisäisenä kontrollina. (C ja D) vaikutukset DNA-demetylaatio aineen MDGC soluissa. Käsittelyn jälkeen 5-atsa-dC,

Twist1

ilmentyminen säädeltiin mRNA (C) ja proteiinin tasot (D) Twist1 ilmentyminen-negatiivinen MDGC-1 ja MDGC-3-soluissa, mutta ei Twist1 ilmaisu-positiivisia MDGC-9-soluja. M, mock; A, 5-atsa-dC. (E) RT-PCR-analyysi

Twist1

mRNA: n ekspression ihmisen GC solulinjoissa (KATO-III, GCIY, AGS, MKN74, MKN7, MKN45, NUGC4 ja HSC60) (vasemmalla).

Twist1

ilmentyminen säädelty mRNA-tasolla Kato-III ja GCIY solujen jälkeen 5-atsa-dC hoito (oikealla). Ihmisen

GAPDH

käytettiin sisäisenä kontrollina. (F) qRT-PCR-analyysi

Twist1

mRNA: n ekspression MDGC-9, MKN7 ja MKN45 solujen kanssa ja ilman 5-atsa-dC käsittely (** P 0,01).

CGI metylaatio ja ilmentyminen

Twist1

GC solulinjoissa

Twist1

on tiheä CGI alue promoottorin koko eksonin 1, tämä alue on erittäin konservoitunut keskuudessa selkärankaisilla mukaan lukien hiiren ja ihmisen (S3 kuvassa). Selventää CGI hiiren ja ihmisen

Twist1

, suoritimme laskennallisen analyysin avulla UCSC Genome Browser (https://genome.ucsc.edu/index.html) ja MethPrimer (http: //www.urogene. org /methprimer /), jota käytetään laajasti, koska tunnistaminen CGI ja MSP-alukkeita [27]. Analysoimme noin 1,4 kb alueesta sisältäen promoottorin ja koko eksonin 1. UCSC Genome selaimessa hiiren ja ihmisen analyysi osoitti yhden CGI tutkittavalla alueella (tuloksia ei ole esitetty). Kuitenkin otaksuttu kaksi CGI sivustoja havaittiin alueella sekä hiiren että ihmisen kun käytimme kriteerit CGI GC-pitoisuus 50% ja havaittu /odotettu CpG suhde 0,8 by MethPrimer (kuvio 2A ja 2C). Näiden kahden mahdollisen CGI alueet sijaitsivat promoottorin ja eksonin 1. Koska metylaation promoottorialueen on raportoitu erilaisissa ihmisen syövissä [12, 14], me aluksi tarkasteltiin metylaatiostatuksen on alueen hiiren ja ihmisen GC solulinjoja MSP. Kuitenkin metylaatiostatuksen on promoottorialueen

Twist1

ei vastaa sen ilmentymistä millään GC solulinjoissa tutkittiin (alue P1, kuvio 2A). Määrittää kriittisesti metyloitu alueisiin, jotka liittyvät Twist1 ekspression MDGC soluissa, me suoritetaan lisäksi MSP on CGI alueen eksoni 1 (E1-1, E1-2 ja E1-3), ja ennustettu CpG shore päällä sijaitsee noin 1,6 kb TSS (transkriptio aloituskohdasta, S1) (kuvio 2A). Tämän seurauksena, CGI metylaation alueen (E1-1 ja E1-2) ympärille TSS on

Twist1

eksoni 1 havaittiin vastaavan geenin ilmentymistä in MDGC soluissa, vaikka ei ollut korrelaatiota ne ennustettu shore alue (S1) ja lopussa eksonin 1 alueella (E1-3) (kuvio 2B, vasemmalla) on MDGC soluissa. Ei metylaatio havaittiin tahansa CpG alueita kolmessa normaalissa mahalaukun limakalvon ilman Twist1 lausekkeen

Atp4b-Cre

–

;

Cdh1

loxP /loxP

;

Trp53

loxP /loxP

hiiriä (kuvio 2B). Ihmisen mahalaukun limakalvojen, ei

Twist1

metylaatio havaittiin myös kolme ei-syöpä mahalaukun limakalvon GC potilaista (kuvio 2D), joista yksi oli hyvin heikko

Twist1

ilmaisu (tietoja ei ole esitetty ). Tutkimme myös neljällä ei-syöpä mahalaukun limakalvon GC potilaista, kun taas mitään metylaatio havaittiin E1-2 alueen missä tahansa tapauksessa (tietoja ei esitetty). Bisulfiitti sekvensointi (BS) osoittivat, että CGI alue eksoni 1 osoitti tiheää metylaation Twist1 ilmentymisen-negatiivinen MDGC-3-soluissa, mutta ei Twist1-positiivisia MDGC-9-soluja (BS-c, kuvio 2A ja 2B, oikea), kun taas ei ollut eroa metylaation niiden välillä on CpG rantaan ja promoottori alueet (BS-a ja BS-b, S4A kuvassa). Niistä ihmisen GC solulinjat, KATO III ja GCIY ilman

Twist1

ilmaisu osoitti tiheän CGI metylaation alueella eksonin 1 (E1-2), joka on yhdenmukainen niistä hiiren

Twist1

(kuvio 2C ja 2D, vasen). Sekä metylointi ja unmethylation että E1-2 alueella havaittiin MKN7 ja MKN45 solujen MSP ja bisulfiitti-sekvensoinnilla (kuvio 2D), jotka basaalisesti ilmaistaan ​​Twist1 mutta niiden ekspressiotasot nostettiin sen jälkeen, kun 5-atsa-dC jälkeen (kuvio 1 F). Näin ollen tietomme osoittavat, että metylaatio eksonin 1 alueella

Twist1

havaittu tässä tutkimuksessa korreloi sen ekspression.

(A) Kaavamainen esitys genomista rakennetta ja ennustettu CGI MethPrimer (https://www.urogene.org/methprimer/) hiiren

Twist1

geenin. Kaksi CGI (ohut sininen alueilla, vasemmalle, -358–149, oikealle, -96-759) havaittiin alueella promoottorista koko eksonin 1 (Obs /Exp = 0,8,% GC 50%). Taivutettu Nuoli osoittaa transkription aloituskohdasta (TSS). Yksittäiset CpG alueet ilmoitetaan oranssina pystysuoraa viivaa. Laatikot tarkoittavat eksoni. Musta kaksipäinen nuolet osoittavat alueet (S1, P1, E1-1, E1-2 ja E1-3) tutkittiin metylaatiospesifisen PCR (MSP). Sininen kaksipäinen nuolet osoittavat alueet tutkinut Chip määrityksessä. Punaiset palkit osoittavat alueet tutkittiin bisulfiitti sekvensointi (BS). (B) MSP-analyysi MDGC solulinjojen ja kolme normaali mahan limakalvon välillä

Atp4b-Cre

–

;

Cdh1

loxP /loxP

;

Trp53

loxP /loxP

hiiret viidellä alueella (vasen). U: metyloitumattomat alleelit; M: metyloitu alleeleja. BS alueen 322-670 (BS-c) MDGC-3 ja MDGC-9 (oikealla). BS-a ja BS-b on esitetty S3 kuviossa. MSP alue E1-2 ja BS-c vastaavat

Twist1

ilme. Mustat ympyrät edustavat metyloitu CpG sivusto; valkoiset ympyrät edustavat metyloitumattomalla CpG sivustoja. (C) Kaaviokuva genomista rakennetta ja ennustettu CGI MethPrimer ihmisen

Twist1

geenin. Kaksi CGI (vasen, -369–138, oikealle, 91-742) havaittiin (Obs /Exp = 0,8,% GC 50%). (D) MSP ja BS analyysit ihmisen GC solulinjojen ja kolme ei-syöpä mahalaukun limakalvon GC potilaista. Arvioimme neljä aluetta (vasen, P1, E1-1, E1-2 ja E1-3) ja eksonin 1 (oikea, 315-651, BS-c) ihmisen

Twist 1

geeni, jotka sijaitsevat samalla tavoin kuin hiiren MSP ja BS alueilla. Tiheä metylaatio havaittiin KATO-III soluista puuttui

Twist1

ilmaisu, kun taas MKN45 solut, jotka ilmentävät

Twist1

näytteillä sekä metyloidut ja metyloitumattomien alleelien.

Twist1

metylaatio ja ilmaisun DCKO hiiren GC kudosnäytteitä

tutki metylaatiostatuksen

Twist1

käyttäen 18 ensisijaista GC kudoksia 15 DCKO hiirillä. Koska GC alueet olivat hyvin pieniä ja niiden DNA FFPE näytteet osoittivat pieniä pitoisuuksia, suoritimme sisäkkäisiä MSP [25, 26].

Twist1

merkittävästi metyloitu (9/18, 50%) ala-GC verrattuna vastaaviin ei-syöpä kudoksiin (1/10, 10%), tilastollisesti merkitsevä ero (P 0,05, taulukko 1). Edustavia tietoja MSP on esitetty kuvassa 3A. Niistä, 4 10 (40%) tapauksessa oli intramucosal ja 5 8 (62,5%) oli invasiivisia GC (taulukko 1). Tässä tutkimuksessa

Twist1

metylointi-positiivisia tapauksia osoitti metyloimaton MSP bändejä sekä, mikä johtuu läsnäolo normaalin strooman /fibroblastien ja tulehdussolujen syövän kudosleikkeiden, vaikka emme voi kieltää mahdollisuutta osittaiseen metylaation kuten MKN45 ja MKN7 ja kasvaimen epäyhtenäisyys.

(A) edustaja tulokset sisäkkäisiä MSP-analyysi

Twist1

sisään DGCs päässä DCKO hiiristä ja vastaavan ei-syöpä mahan limakalvon (kaista N). Alueet (E1-2) analysoidaan on esitetty kuviossa 2A. U: metyloimaton alleeli; M: metyloitu alleeli. (B) edustaja immunohistokemiallisella värjäyksellä Twist1 proteiinin DGC kudoksissa DCKO hiirillä. (I) Vahva tumavärjäystä of Twist1 proteiinin GC ilman metylaatio. (Ii) Negatiivinen Twist1 proteiinin ilmentymistä GC metylaatiospesifisiin. Alkuperäinen suurennos, X400. (C) Tiivistelmä

Twist1

metylaatio ja ilmaisun ensisijainen DGCs.

Twist1

metyloitiin 9 18 GC, kuten M. intensiteetti Twist1 värjäys pisteytettiin ar- (negatiivinen), + (heikko) ja ++ (kohtalainen vahva). Hiiren GC jaettiin kahteen ryhmään, intramucosal ja invasiivisia GC kriteerien mukaan ihmisen GC perustettu Japani mahasyövän Association [53].

Twist1 proteiinin ilmentymistä havaittiin 7 18 (38,9%) GC verrattuna vastaaviin ei-syöpä mahalaukun limakalvon immunohistokemiallisesti. Edustavia kuvia esitetään kuviossa 3B. Olemme edelleen analysoineet suhde

Twist1

ilmaisun ja metylaatiotasoilla näissä tapauksissa. Niistä 18 ensisijaista GC tutkitaan, yhdeksässä tapauksessa osoitti korrelaation

Twist1

metylaatio ja ilmaisun (kuvio 3C). Kolme neljästä tapauksissa Twist1 heikko ilme näytteillä sen metylaatio, mahdollisesti että alhainen ilmentyminen Twist1 saattaa johtua sen metylointi. Kuitenkin loput viisi tapausta ei esiintynyt metylaatio ja ilmaisun (taulukko 1).

histoni metylaatio liittyy sääntelyyn

Twist1

ilmaisu

tutkimme seuraavaksi, onko lysiini metylaatio taso histoni H3 myötävaikuttaa

Twist1

ilme. Kromatiinin immunosaostus (ChIP) määritykset suoritettiin ennustettu CpG rannalla (CP1.3k), promoottori (CP1), ja eksonit 1 (CE1-1 ja CE1-2) ja 2 (CE2) alueet (kuvio 2A). Tällä CP1 ja CE1-2 alueet, aktiivisen Histonimerkki H3K4me3 on rikastettu Twist1 ilmentymisen-positiivisia soluja (MDGC-7 ja MDGC-9), mutta ei-aktiivinen Histonimerkki H3K9me3 on rikastettu Twist1 ilmentymisen-negatiiviset solut (MDGC-1 ja MDGC -3) (kuvio 4A ja 4B). ChIP määritykset osoittivat sekä H3K4me3 ja H3K9me3 signaaleja MDGC-1 ja MDGC-3-solujen kanssa 5-atsa-dC käsittelylle, mikä ilmaisee kohonnut H3K4me3 tasot näissä soluissa (kuvio 4C). Sitä vastoin H3K27me3 ja H3K36me2 tasot eivät korreloi Twist1 ilmaisumuotoja MDGC soluissa tutkittiin tässä tutkimuksessa. Koska ihmisen GC-solulinjat, samanlainen alue sijaitsee promoottorista eksoni 1 osoitti H3K4me3 rikastumisen

Twist1

ilmaisu-positiivisia MKN45 soluja, ja H3K9me3 on

Twist1

ilmaisu-negatiivinen KATO III solut (kuviot 2C ja 4D).

(A) histoni metylaatiostatuksen in Twist1 ilmentymisen-positiivisia soluja (MDGC-7 ja MDGC-9) ja -negatiivinen soluja (MDGC-1 ja MDGC-3). ChIP määritys suoritettiin käyttäen H3K4me3, H3K9me3, H3K27me3 ja H3K36me2 vasta-aineita. Viisi ChIP alueet (CP1.3k, CP1, CE1-1, CE1-2 ja CE2) analysoitiin on esitetty kuviossa 2A. Input DNA-näytteet käytettiin sisäisen valvonnan. (B) Semikvantitatiivisilla ChIP analyysit histoni H3K4me3 ja H3K9me3 rikastamiseen. ChIP intensiteetit analysoitiin Image J 1.47v ohjelmisto, ja sitten ChlP /Input laskettiin. Aktiivinen Histonimerkki H3K4me3 rikastui Twist1 ilmentymisen-positiivisten solujen, mutta aktiivinen Histonimerkki H3K9me3 rikastui Twist1 ilmentymisen-negatiivisia soluja. (C) välinen suhde histoni ja CGI metylaatio MDGC soluissa. MDGC-1 ja MDGC-3-soluja käsiteltiin 5-atsa-dC, ja histoni metylaatiostatuksen niiden H3K4me3 ja H3K9me3 tutkittiin ChIP määrityksessä. H3K4me3 kohoamiseen näissä 5-atsa-dC-käsitellyissä soluissa verrataan käsittelemättömiin verrokkeihin (kuva 4A), kuten on esitetty kolmioina. (D) Semikvantitatiivisilla ChIP analyysi H3K4me ja H3K9me3 ihmisen GC soluissa. Alueet (CP1, CE1-2) analysoitiin esitetään kuviossa 2C. Samanlainen tietojen hiiri

Twist1

(kuvio 4B), The H3K4me3 ja H3K9me3 tasot rikastuneet MKN45 ja KATO-III-soluissa, vastaavasti. Keskimääräinen (sarake) ± SD (bar) kolme riippumatonta agaroosigeelillä elektroforeesi eri kokeissa on osoitettu (** P 0,01).

Suv39h1

ja

Suv39h2

, histoni metyylitransferaasin, säätelee H3K9me3

on olemassa paljon histoni metyylitransferaasit liittyy H3K4, H3K9 ja H3K27 [28]. Näin ollen, mitkä histonimodifikaation entsyymit ovat vastuussa H3K4me3 tai H3K9me3 rikastumiseen

Twist1

eksonin 1 alueella GC-soluissa, tutkimme kymmenen H3K4me3 (

Mll1

,

Mll2

,

Mll3

,

Mll4

,

Setd1a

,

Setd1b

,

Ash1

,

Ash1l

Smyd3

ja

Meisetz

), seitsemän H3K9me3 (

Suv39h1

,

Suv39h2

,

G9a

,

Setdb1

,

Clld8

,

Glp

ja

RIZ1

), ja yksi H3K27me3 (

Ezh2

) liittyviä geenejä. Edustavat tiedot on esitetty kuvassa 5A. Niistä ekspressiotasot

Suv39h1

ja

Suv39h2

oli korreloi käänteisesti

Twist1

ilmaisua. Kuitenkin ekspressiotasot loput 16 histoni methylatasferase geenejä tutkittiin ei liittynyt

Twist1

ilmentymistä MDGC soluissa. Suoritimme siRNA-pohjainen knockdovvn

Suv39h1

tai

Suv39h2

vastaavissa ilmaisu-positiivisia MDGC-1 ja MDGC-3-soluihin elektroporaatiolla (kuvio 5B). Knockdovvn

Suv39h1

tai

Suv39h2

näissä solulinjoissa johtivat kasvua

Twist1

ilme havaittavissa RT-PCR (kuvio 5B) ja qRT-PCR (MDGC- 1, kuvio 5C).

(A) ilmentyminen histoni metyylitransferaasit varten H3K4 (

Mll1

,

Mll2

,

Mll3

,

Mll4

,

Setd1a ja Ash1l

), H3K9 (

Suv39h1

,

Suv39h2

,

G9a ja Setdb1

), ja H3K27 (

Ezh2

) määritettiin RT-PCR: llä. Ilmentymistasojen

Suv39H1

ja

Suv39H2

oli korreloi käänteisesti

Twist1

ilmaisua.

GAPDH

käytettiin sisäisenä kontrollina. (B ja C) vaikutus

Suv39h1

tai

Suv39h2

Knockdown on

Twist1

ilmentymistä MDGC soluissa. RT-PCR suoritettiin MDGC-1 ja MDGC-3-solujen

Twist1

ilmentymisen transfektion jälkeen si

Suv39h1

(sih1), si

Suv39h2

(sih2) tai negatiivinen kontrolli (sinc) siRNA. (C)

Twist1

,

Suv39h1

ja

Suv39h2

mRNA tasot MDGC-1-solut lisävahvistusta qRT-PCR. Pylväät ja palkit osoittavat keskiarvot ja S. D., vastaavasti. ** P 0,01.

ry SP1 kanssa transkription säätelyyn

Twist1

Konsensus 5 ’- (G /T) GGGCGG (G /A) (G /A) (C /T) -3-sekvenssi tunnetaan sitovaan motiiviin SP1 transkriptiotekijän, ja suhde CGI metylaation ja Sp1 sitoutuminen promoottori on raportoitu [29, 30].