Krooninen sairaus

tiivistelmä

virtsarakon syöpä (UBC) sijoittuu yhdeksänneksi maailmanlaajuisesti syöpä. Egyptissä rakenteessa virtsarakon syöpä on ainutlaatuinen, että siirtymä- ja okasolusyöpä tyypit voittaa. Vaikka paljon tutkimusta aiheesta, se on edelleen vaikea ennustaa syövän etenemiseen, optimaalinen hoito ja kliiniseen tulokseen. Folaatinkuljettajaproteiinin (RFC /SLC19A1) on merkittävä siirtojärjestelmä folaatit nisäkkäiden soluissa ja kudoksissa. RFC on myös ensisijainen keino soluunottoa varten antifolaatti kemoterapeuttisten syöpälääkkeiden kuitenkin kalvo kuljetusta antifolaattien RFC katsotaan rajoittaen antituumorivaikutus. Tämän tutkimuksen tarkoituksena oli verrata mRNA: n ilmentymisen tasoa RFC /SLC19A1 sisään urothelial ja ei-urothelial variantteja virtsarakkokarsinoomat. Kvantifiointi RFC mRNA limakalvon 41 käsittelemättömän virtsarakon syövän potilaille suoritettiin käyttäen RT-qPCR. RFC mRNA vakaan tilan pitoisuudet olivat ~9-kertainen (N = 39; P 0,0001) virtsarakon kasvain yksilöitä suhteessa normaaliin virtsarakon mRNA. RFC kiihdytyssäätely oli vahvasti korreloivat kasvaimen tyyppi (urothelial

vs.

Ei-urothelial; p 0,05), jossa mediaani RFC mRNA: n ekspressio oli merkittävästi (p 0,05) korkeampi urothelial (-14-kertaisesti) verrattuna ei-urothelial (~ 4-kertainen) variantti. Tämä voi selittää vaihtelua vastauksena antifolaatti sisältäviä hoitoja käytetään hoitoon joko tyyppiä. RFC mRNA ei liittynyt kasvaimen (I, II ja III) tai vaiheessa (lihas-invasiivisia

vs.

Kuin lihas invasiivisia) ymmärtää, että RFC ei voida käyttää ennustetekijöiden tarkoituksiin virtsarakkokarsinoomat voimistuva ilmaisu on varhainen tapahtuma ihmisen rakkokasvaimista synnyssä. Edelleen, RFC voidaan pitää mahdollisena markkeri ennustamiseksi vastauksena antifolaatin kemoterapian urothelial karsinoomissa.

Citation: Abdel-Haleem AM, El-Zeiry MI, Mahran LG, Abou-Aisha K, Rady MH, Rohde J, et al. (2011) Expression of RFC /SLC19A1 liittyy Kasvain Kirjoita virtsarakon syövän Potilaat. PLoS ONE 6 (7): e21820. doi: 10,1371 /journal.pone.0021820

Editor: Hassan Ashktorab, Howard University, Yhdysvallat

vastaanotettu: 19 tammikuu 2011; Hyväksytty: 12 Kesäkuu 2011; Julkaistu: 08 heinäkuu 2011

Copyright: © 2011 Abdel-Haleem et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ rahoittivat DAAD sekä GUC kuin MSC hankerahoitusta. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

20-60% syövän esiintyvyys maailmanlaajuisesti on liittynyt ravitsemukselliset tekijät [1]. Eräs laajimmin tutkittu ravinteita osallisina syövän etiologia on vitamiinia foolihappoa. Folaatit ovat elintärkeitä, ja folaatin puute edistää monia terveysongelmia, kuten sydän- ja verisuonitautien, sikiön epämuodostumia, neurologiset häiriöt ja syöpä [1], [2].

Syöpä rakko on yhdeksäs eniten yleisin syöpä maailmassa. Suurin osa (77%), virtsarakon kasvaimia esiintyy miehillä. Se on seitsemänneksi yleisin maligniteetti miehillä ja 17 naisilla [3]. Kirjo rakkokasvaimista on laaja ja sisältää siirtymäkauden cell carcinoma (TCC), levyepiteelisyöpä (SCC), adenokarsinooma ja pienisoluinen karsinooma. TCC on ylivoimaisesti yleisin ja parhaiten tutkittu. Yhdysvalloissa, 90% rakkokasvaimista ovat sitä urothelial variantti, joka kehittyy siirtymäkauden soluista. Kääntäen, Egyptissä, yleisin histopatologinen tyyppi virtsarakon syövän aiemmin SCC [4], jotka muodostavat 59%: sta 81% ilmoitetuista virtsarakon syöpien välillä 1960 ja 1980 [4], [5]. Toisin kuin johtava etiologiaa tupakoinnin ja ammatilliset altistukset länsimaissa, krooninen virtsarakon tulehdus kanssa

Schistosoma haematobium

, on ollut tärkein riskitekijä virtsarakon syövän Egyptissä [5]. Kuitenkin viimeaikaiset tutkimukset [5], [6] kertoi, että SCC Egyptissä näyttää laski 78% vuonna 1980 27% vuonna 2005.

biopsianäyttei- virtsarakon kasvain muutoksia voidaan saada helposti trans -urethral resektion (TUR) ennen käsittelyä. Vaikka paljon tutkimusta aiheesta, se on edelleen vaikea ennustaa syövän etenemiseen, optimaalinen hoito ja kliinistä tulosta [7]. Kasvaimen lavastus (TNM järjestelmä) pidetään paras ennustetekijöiden merkki; kuitenkin, ettei ennustaa taudin etenemisen tai uusiutumisen koetaan usein [8]. Lisäksi hoidon epäonnistuminen on suuri alue, jossa translationaalinen virtsarakon syövän tutkimus voisi hyödyttää potilaita. Esimerkiksi MVAC hoito (antifolaatista sisältävässä hoidossa) esiintyy vain rajoitetusti antituumorivaikutuksia kuin siirtymäkauden cell syöpä taas Hoitovaste jopa -70% raportoitu TCC samassa tutkimuksessa [9]. Jos geneettinen eroja kaksi vaihtoehtoa virtsarakkokarsinoomat vaikuttaa niiden etenemistä ja /tai vastauksena kemoterapiaa, niin kysymys on; joka geneettinen markkeri (t) on (ovat) kriittisimmät?

ekspressoituvat folaatinkuljettajaproteiinin (RFC) pidetään merkittävä liikenteen reitti folaatit fysiologisessa kofaktori pitoisuuksina, vaikka useita oton järjestelmät ovat läsnä [ ,,,0],1], [10], [11]. Menetys RFC ilmentymistä tai toimintaa ennakoi mahdollisesti syvällinen fysiologiaan ja kehitykseen seurauksia [1], [12]. RFC on myös merkittävä kuljettaja antifolaattilääkkeiden huumeita käytetään syövän kemoterapiassa kuten metotreksaatti (MTX), pemetreksedi, ja raltitreksedi. Tehokkuus kemoterapian näillä aineilla liittyy läheisesti tasoa ja toimintaa RFC sekä kasvaimissa ja normaaleissa kudoksissa [13], [14]. MTX, esimerkiksi, on edelleen tärkeä osa kemoterapeuttisen armamentarium erilaisia ​​maligniteetteja, mukaan lukien virtsarakon syöpä [15], [16]. Pemetreksedin on myös äskettäin harkittu käytettäväksi hoitoon virtsarakon syöpään [16]. Kalvo kuljetus näistä antifolaattien on kriittinen antituumorivaikutus koska tämä riittävä (sitoutumaton) solunsisäinen huumeiden ylläpitämään maksimaalisen eston kohde-entsyymi (esim DHFR; Dihydrofolaattireduktaasi) ja synteesiin polyglutamaatin johdannaisten tarvitaan sitoutuu voimakkaasti solunsisäisiä entsyymejä [13 ]. Folaatinkuljettajaproteiinin geeniekspressiota voidaan luotettavasti tutkia mRNA-tasolla, ja joka perustuu useisiin tutkimuksiin [13], [14], [17], [18], [19], [20], [21] ilmaisu on todennäköisesti osoitus aktiivisuudesta RFC sekä kasvaimissa ja normaaleissa kudoksissa. Siten tarkastaa poikkeavuudet RFC ilmaisun kesken eri tyyppisiä virtsarakon syöpiä voidaan tasoittaa tietä mahdollinen parantaminen rationaalisesti perustuu antifolaatti sisältävä solunsalpaajahoito.

Tämä tutkimus oli siten sitoutunut tutkimaan mRNA ilmaisun ja mahdollinen kliininen merkityksellinen (eli yhdistysten kasvaimen vaiheesta, laatu ja /tai histologinen tyyppi) suurten folaatin kuljettaja, RFC, ryhmässä ihmisen virtsarakon kasvaimet eri histologisia tyyppejä.

Materiaalit ja menetelmät

Eettinen lausunto

Ensimmäinen numero 61 virtsarakon syöpä potilasta mukana tässä tutkimuksessa. Kaikkien potilaiden tietoja analysoitiin anonyymisti ja potilaiden suostumus oli saatu sisältämään irrotettiin kudosta nykyisen tutkimuksen kautta patologian osasto National Cancer Institute (NCI), Kairossa, Egyptissä. Kaikki tutkimussuunnitelmissa hyväksyi laitoksen tarkastus- lautoja NCI ja tutkimuksen eettisen komitean saksalaisen yliopiston Kairossa.

Potilaat

Kuusikymmentä yksi kasvainbiopsioissa saatiin TUR at NCI aikana maaliskuusta 2009 tammikuussa 2010. 17 yksilöt myöhemmin pois tutkimuksesta aikana RNA laadun tarkastus vaiheessa (katso alla). Jäljellä 44 yksilöitä, kasvaimen vaiheen ja luokka jaettiin mukaan TNM [4], jonka patologian yksikön NCI .. Potilaat mukana tässä tutkimuksessa (n = 44; 31 urosta, 11 naarasta ja 2 tuntematon; ikäryhmä: 31-79) jaettiin kahteen pääryhmään riippuen kasvaimen histologinen tyyppi: urothelial kasvaimet ”ryhmä; TCC ja TCC kanssa levyepiteelikarsinooma metaplasiaa; ja ei-urothelial kasvainten ryhmä; SCC ja adenokarsinooma. Tuolloin sisällyttämistä yksikään potilaista oli saanut hoitoa missään muodossa. Kliiniset ominaisuudet virtsarakon syövän potilaiden mukana tässä tutkimuksessa on esitetty taulukossa S1.

Yhteensä RNA ja käänteinen transkriptio

Leikatut kasvainbiopsioissa käytetään mRNA analyysiä pantiin välittömästi RNA

myöhemmin

® RNA Stabilization Reagent (Qiagen, Saksa), pidettiin -4 ° C: ssa yli yön, sitten niitä säilytettiin -20 ° C: ssa. Kokonais-RNA eristettiin jäädytetyistä koepaloja (-30 mg) käyttäen Ehdottomasti RNA mini-prep (Stratagene, Saksa) mukaan valmistajan ohjeiden. Eristetty RNA eheys elektroforeettisesti varmistettiin etidiumbromidivärjäyksellä ja A

260 /A

280 absorption suhde (alue 1,8-2,0) (A260 nm = 1 vastaa 40 ug /ml RNA). 02:01 intensiteetti suhde 28S ja 18S rRNA pidettiin vertailukohtana ehjän RNA (kuva S1). 17 kasvain näytteet jätettiin pois tutkimuksesta, joka perustuu niiden RNA eheys profiili (kuva S1). 5 ug kokonais-RNA käänteistranskriptio Sprint ™ RT Täydellinen Tuotteet Kit (Clontech, Saksa) kanssa 20 ui mukaan valmistajan ohjeiden.

RT-qPCR kvantifiointiin RFC mRNA

RT-qPCR protokolla seurasi tässä tutkimuksessa rakentui ympärille Minimi Tietoa julkaiseminen Quantitative Real-Time PCR Kokeet (MIQE) ohjeet, julkaisija Bustin

et al.

[22]. RFC mRNA kvantifioitiin RT-qPCR on Mx3005P ™ väline (Stratagene, USA). Selostukset β-aktiini kvantifioitiin kuin endogeeninen RNA ohjaus [7], [23] poistamaan määrän vaihtelut ja /tai laatua kokonais-RNA lisättiin kuhunkin reaktioseokseen, ja kukin näyte normalisoitiin pohjalta sen β-aktiini mRNA sisältöä. Kaikki määrällisiä tässä tutkimuksessa on esitetty suhde kohde- geenin ja β-aktiini. Alukesekvenssit, pariutumisen lämpötila ja PCR-tuotteiden koko kohdegeenin RFC ja viitegeenin β-aktiini on esitetty taulukossa 1. spesifisyys kunkin alukeparia vahvistettiin sulamiskäyräanalyysillä (kuvio S2), joka johti yhden tuotteen erityisiä sulaminen lämpötiloissa.

Jokainen alukeparia arvioitiin sekundaarirakenteita ja SNP että

in silico

arviointiin työkalun RTPrimerDB (https://medgen.ugent.be/rtprimerdb). Erittäin hyvin puhdistettua suolaa primeri RFC ja β-aktiini (taulukko 1) muodostettiin kaupallisesti (Metabion GmbH, Saksa) ja optimoitu kaksivaiheinen (yhdistetty pariutumis /pidennys-lämpötilassa) PCR. Pooli 3 virtsarakon syövän cDNA näytteitä käytettiin testin optimoinnin suhteen, ja vahvistus tehokkuuden arviointi (taulukko 1) käyttäen ”standardikäyrän” menetelmä. Standardikäyrä kullekin geeni sitten automaattisesti luoma Mx3005P ™ ohjelmiston, jolloin log kohteena pitoisuus piirrettiin vastaaviin kvantifiointiin sykli (Cq) arvo [22]. Ehdot kaikille PCR optimoitiin suhteen eteen- ja taaksepäin alukkeiden pitoisuuksia ja eri hehkutuslämpötiloja (55-66 ° C). Reaaliaikainen PCR Mastermix seuraavista reaktion komponenteista on laadittu osoitettu loppukonsentraatio: 12,5 ui Virta SYBR® Green PCR Master Mix (Applied Biosystems, UK), 0,2 ui aluketta RFC (100 nM), 0,2 ui reverse-aluketta RFC (100 nM) ja 11,1 ui nukleaasitonta vettä kohdegeenin; ja 12,5 ui Virta SYBR® Green PCR Master Mix, 0,75 ui aluketta β-aktiini (300 nM), 0,75 ui reverse-aluketta β-aktiini (300 nM) ja 10 ui nukleaasitonta vettä viite geeniä. 24 ui valmis Mastermixin pipetoitiin kuoppaa kohti 96-kuoppaiselle levylle. 1 ui cDNA-templaattia lisättiin sitten kunkin reaktion hyvin. Hakemukset koko cDNA panos tehtiin kaksoiskappaleet. 96-kuoppaisen levyn suljettiin PCR optisen liimakalvo (Eppendorf AG, Saksa). Seuraavat optimoitu terminen profiili on käytetty: denaturointi ohjelmaa (95 ° C: ssa 10 min), monistus ja kvantifiointi ohjelma toistetaan 40 kertaa (95 ° C: ssa 15 s, 60 ° C 1 min, jossa on yksi fluoresenssin mittaus), sulamiskäyräanalyysillä ohjelma (55-95 ° C ja lämmityksen nopeudella 0,1 ° C sekunnissa ja jatkuva fluoresenssin mittaus). Fluoresenssin kerättiin ja mRNA kvantitoitiin Mx3005P ™ ohjelmaversio 4.1. Cq-arvot lasketaan automaattisesti mukaan ”fit pisteen menetelmä”; jossa Cq on määritelty murto-syklien lukumäärä, jossa PCR kineettinen käyrä saavuttaa ohjelman määrittämä kynnys fluoresenssin määrää.

kertainen muutos ilmentymisen β-aktiini arvioitiin menetelmän mukaisesti ja Schmittgen ja Livak [24]. Kuten on esitetty taulukossa 2, vaihtelu β-aktiinin ekspressio oli vähäistä joukossa urothelial ja ei-urothelial ryhmiä.

Tilastollinen analyysi

tietoja testattiin normaalisuus käyttämällä Shapiro -Wilk normaalius testi. Parametriset testit päätettiin vastaavasti. P-arvot alle 0,05 pidettiin merkittävänä. Mann-Whitneyn U-testi ja Kruskal-Wallisin testiä käytettiin korreloivan ilmentymisen RFC kasvaimen vaiheessa, laatu ja tyyppi. Ohjelmisto

Graph Pad Prism

(versio 5) käytettiin tilastolliseen analyysiin.

Tulokset

mRNA ilmaus RFC

mRNA ilmentymistä folaatin transporter RFC oli määrällisesti 41 virtsarakkosyöpänäytteiden, kolme yksilöä ei ollut näyttöä maligniteetin saadun virtsarakon limakalvon vieressä syöpäkudokseen, ja kaupallisesti saatavilla viittaus virtsarakon RNA yhdistettiin 26 mies /nainen valkoihoiset; ikäinen 22-70 (Clontech, Saksa). Jälkimmäinen kutsutaan kalibraattorin seuraavissa osissa.

RFC mRNA: n ekspressio havaittiin kaikissa virtsarakon yksilöihin, joita käytetään tässä tutkimuksessa. Vakaan tilan ekspressiotasot RFC mRNA oli merkittävästi (

P

0,0001) korkeampi virtsarakkosyöpänäytteiden by ~9-kertaiseksi (8,661, alue 0,98-50, N = 39) kuin kalibraattorin .

Kliininen

vs.

hisotpathological parametrit

monimuuttujamenetelmin tehtiin määrittämiseksi merkittävimmistä tekijöistä, joiden kanssa RFC mRNA ilmentyminen oli yhteydessä. Korrelaatio RFC mRNA-tasoja ja testattu kliinis parametrit virtsarakon syöpä on esitetty yhteenvetona taulukossa 3. RFC suhteellinen ekspressio taso oli merkitsevästi (

P

0,05) korkeammat urothelial

vs.

Non -urothelial virtsarakkokarsinoomat jossa RFC mRNA lisääntyi ~ 14-kertaisesti (13,27; n = 27) in urothelial kasvaimissa verrattuna 4-kertainen (4,083; n = 10) kasvaa vain ei-urothelial variantteja (kuvio 1A). Mediaani ekspressiotaso RFC että TCC yksilöiden oli 17,48; n = 23 verrattuna 5.538; n = 6 yksilöiden luokiteltu TCC kanssa levyepiteelikarsinooma metaplasiaa tai seka siirtymäajan ja okasolusyöpää. Kuitenkaan mitään tilastollisesti merkitsevää eroa välillä havaittiin RFC mRNA: n ekspression virtsarakkosyöpänäytteiden luokiteltu puhtaana TCC

vs.

Ne, joilla TCC kanssa levyepiteelikarsinooma risolumuuntumisessa (kuvio 1 D). Tämä osoittaa, että RFC mRNA: n ekspression ei-urothelial kasvaimia on paljon pienempi kuin niiden urothelial kollegansa ja suomuinen komponentti on pääasiassa liittyy vähentynyt RFC mRNA ilmaisun. Ilmaisu taso RFC vuonna virtsarakkosyöpänäytteiden sisältävä bilharzial munasoluja verrattiin niihin, joissa ei ilmene bilharzial infektion missä RFC mRNA oli merkittävästi (

P

0,05) vähentynyt bilharzial liittyvää (BA) virtsarakkosyöpänäytteiden (3,13; n = 7) verrattuna ei-bilharzial liittyvä ryhmä (9,76; n = 32) (kuvio 1 E).

Kiinteä vaakaviivat osoittavat mediaanin kunkin yksittäisen ryhmän. Kaikki tulokset on esitetty suhteena kohdegeenin ja beeta-aktiini. *

P

-arvo, ei-parametrinen, Mann-Whitney tai Kruskal-Wallis testejä. BA, Bilharizal liittyvä.

tutki korrelaatio ekspressiotasoja RFC mRNA ja merkkiaineiden kasvaimen aggressiivisuuden (nimittäin, laatu ja vaihe). Ilmaisu RFC mRNA ei korreloinut kasvaimen (kuvio 1 B), jossa ei ollut tilastollisesti merkitsevää eroa (

P

= 0,3008) välillä havaittiin laadut I, II tai III. Edelleen, RFC ilmentyminen ei tilastollisesti muuttunut (

P

= 0,2666) välillä lihas-invasiivisia ja ei-lihas- invasiivisia yksilöt (kuvio 1 C). Erityisesti kaikki SCC näytteet (n = 8) luokiteltiin lihas-invasiivisia kasvaimia, mikä viittaa enemmän aggressiivinen luonne SCC ja ei-urothelial karsinoomia. Lisäksi ei havaittu tilastollisesti merkittävää eroa (

P

= 0,2162) havaittiin vuotiaita potilaita, joilla urothelial karsinoomat (keskiarvo = 60,42)

vs.

Kuin ei-urothelial ryhmä (keskiarvo = 52,88).

keskustelu

Koska nisäkässoluissa voi koota folaatit

de novo

, tiukasti säänneltyjä soluotto prosessit ovat kehittyneet ylläpitämään riittävää solunsisäisen folaatit [25], [26]. Kontekstissa maligniteetti, suuret folaatin kuljetusjärjestelmän, RFC, lisääntynyt ilmentyminen on sopusoinnussa tarpeen lisätä solujen säilyttäminen folaatit tukemaan vaatimuksia nopeasti jakautuvia syöpäsoluja DNA-synteesiin ja replikaatiota. Esillä olevassa tutkimuksessa, meidän havainnot ihmisen virtsarakon syövän koepaloja olivat mukaisesti tätä käsitystä missä RFC mRNA ilmentyminen lisääntyi merkitsevästi ~ 14-kertaisesti urothelial virtsarakkokarsinoomat (TCC ja TCC kanssa levyepiteelikarsinooma metaplasiaa) ja ~ 4-kertaiseksi ei-urothelial variantteja (SCC Adenokarsinooma). Altered ilmaus RFC on myös raportoitu leukemiat erityisesti B-esiaste ALL [11], [26], [27], osteosarkooma [17], peräsuolen syöpä ja primaarinen keskushermoston lymfoomat [1] sekä transkriptio ja proteiini tasoilla.

poikkeama RFC mRNA ilmaisun välillä urothelial ja ei-urothelial rakkokasvaimista, raportoitu nykyisessä tutkimuksessa, voisi johtua yläjuoksun geneettisiä tapahtumia, jotka tapahtuvat kunkin, jotka voivat vaikuttaa transkription säätelyn kuljettajaan. Sekä kaikkialla ja kudosspesifisiä TF: ille, joka transaktivoimaan tai tukahduttamiseksi transkriptio vastauksena vaatimukset folaatin kofaktoreita ohjata netto tasojen RFC transkriptien kudoksissa [1], [18]. Kirjallisuus ja polku louhinta käyttämällä

LitInspector

ohjelmisto [28] osoitti, että RFC (SLC19A1) on mahdollinen vuorovaikutus CREB1 (CAMP reagoiva elementti sitova proteiini-1). CRE /AP-1-kuin konsensussekvenssi on yksi kaksi suurta sivustoja sääntelyn RFC pohjapinta promoottorit [18]. CREB, joka sitoutuu CRE /AP-1, on yksi TF: ien aktivoida ERK (MAPK), jotka ovat komponentteja RTK-RAS-signalointireitin. Kertyvät todisteet osoittavat, että tärkeimpien osien signalointireitin usein aktivoituvat ihmisen urothelial karsinoomia [29], mutta ei ei-urothelial tyypit [30], [31]. Ihmisen fibrosarkoomasoluissa, CREB-1 ja c-Jun olivat soluspesifinen transkriptiotekijöiden mukana CRE sitovia RFC promoottori. Samanlaisia ​​tuloksia saatiin varten CREB-1 ja ATF-1 ihmisen maksasyövän solut ja ihmisen leukemiasolujen [18], [32]. Lisäksi kaksi kolmasosaa antifolaatti vastustuskykyisten solulinjojen näkyy vähentyneen merkittävästi transkriptiotekijän sitova yhteen CRE sivuston läsnä minimaalinen promoottori A RFC-geenin [33]. Näin ollen on yhä enemmän näyttöä siitä, että sitoutuminen CREB-1 CRE RFC promoottori on tärkeä tekijä induktion RFC geeniekspression syöpäsolulinjoissa ja pahanlaatuisia kasvaimia [18], [32], [33]. Siksi oletamme, että konstitutiivinen aktivointi RTK-RAS-reitti on todennäköisesti yksi tekijä, joka selittää lisääntynyt RFC mRNA: n ekspression urothelial karsinoomia. Ei-urothelial karsinoomien kuitenkin RAS mutaatiot ovat harvinaisia ​​ja muiden mutaatioiden kuvaan (p16 p15 poistetaan [31], [32], Bax, Bak EGFR yli-ilmentymisen ja p53 inaktivaation [32]). Siksi odotamme erilaisia ​​geneettisiä tapahtumia ovat johtaneet vähäinen nousu RFC mRNA tasolla kuin urothelial karsinoomia, ja mahdollisesti eri TF: iä mukana RFC transkription aktivaation. Tämä tukee edelleen se, että lisääntynyt RFC ilmentyminen on erittäin todennäköisesti liittyy inaktivoimiseksi tuumorisuppressorigeeneille, jossa 5-metyyli tetrahydrofolaatti (5-CH3-THF) on kofaktori de novo synteesiä S-adenosyylimetioniinin, joka osallistuu in metylaatio CpG-saarekkeiden. RFC on tärkein saapumistie THF ja lisätä RFC ilmaisua johtavat näin kertymistä metyloitua folaatinkuljettajaproteiinin [11], [15], jotka voivat lopulta johtaa inaktivoimiseksi eri tuumorisuppressorigeeneille kuten; p16, p15 ja /tai p53 [34], [35].

Lisäksi perustuvat tämänhetkisiin havaintojen RFC yliekspressio tarkoittaa, että urothelial virtsarakkokarsinoomat olisi luontaisesti herkempi antifolaatteja kun taas ei-urothelial karsinoomia osoittaisi epäedullisempaan vastaus antifolaatti kemoterapiaa. Tämä keinottelu voi selittää, miksi MVAC hoito näyttelyitä vain rajoitetusti antituumorivaikutuksia kuin siirtymäkauden cell syöpä taas Hoitovaste jopa -70% raportoitu TCC samassa tutkimuksessa [9].

havainnot osoittavat, että RFC mRNA lisääntynyt ilmentyminen ei liity kasvaimen tai vaihe sotkea että lisääntynyt ilmentyminen RFC mRNA näyttää tapahtuvan aikaisin prosessissa monivaiheinen syövän etenemiseen. Tätä olettamusta tukee lisäksi johdonmukaisesti RFC mRNA ilmaisu kasvu keskuudessa eri ikäryhmien tutkimuksessamme. Kuitenkin on raportoitu, että vain -15% alhaisen pinnalliset kasvaimet etenee soluttautua lihaksiston ja että korkea-asteen lihas-invasiivisia kasvaimia, joko peräisin tasainen karsinooma in situ (CIS) /-kar- tai syntyvät

de novo

[29]. Näin ollen vaihtoehtoinen hypoteesi voisi olla, että lisääntynyt RFC mRNA: n ilmentymisen seurauksena esiintyy riippumattomia tapahtumia kesken eri virtsarakkokarsinoomat. Mielenkiintoista, kaikki ei-urothelial kasvainbiopsioissa hyödynnetään tässä tutkimuksessa olivat lihas-invasiivisia osoittavaa epäsuotuisa diagnostiset ominaisuudet kuin urothelial kasvainten kuten jo ehdotti Erdemir

et al.

[19]. Kliininen merkitys squamous eriyttäminen näyttää olevan epäsuotuisa ennustetekijöiden ominaisuus johtuu sen yhdessä korkean asteen invasiivisen kasvaimet.

Vaikka merkittävä ero havaittiin välillä RFC ekspressiotasot bilharzial- ja ei-bilharzial liittyvä virtsarakon syöpien tämä havainto voi olla ratkaiseva, sillä vain 7 tapausta (18% kokonaismäärästä) ja bilharzial liittyvien virtsarakon syöpä oli mukana tässä tutkimuksessa (vrt 32 ei-bilharzial liittyvä tapaus). Lisäksi korkeampi RFC mRNA: n ekspression BA-TCC (2 yksilöt)

verrattuna of the SCC tai sekatyyppiset (5 yksilöt) voi myös merkitä sitä, että RFC lisääntynyt mRNA ilmaisu on oikeastaan ​​riippumaton bilharzial infektio.

mainitsemisen arvoista (koska tämä tukee kannalta merkityksellinen teksti) on, että ominaisuudet virtsarakkosyöpänäytteiden tässä tutkimuksessa käytettiin edustivat virtsarakon syövän potilaiden väestön suhteen sukupuolen, iän ja histologisia tyyppejä. Suhde female:male potilailla oli ~1:3. Keski-ikä kaikki virtsarakon syövän potilaiden tutkimuksessa mukana oli 60, jossa keski-ikä ei-urothelial ryhmissä oli pienempi kuin urothelial rakkosyöpä- potilasta (53

vs.

60), joka osoittaa aggressiivista luonne ei-urothelial variantteja virtsarakon syöpä. Lisäksi 64%: lla potilaista oli urothelial karsinoomat, kun taas vain 24% esittelyyn ei-urothelial variantteja. Nämä demografiset tiedot olivat mukaisesti muutoksista siinä virtsarakon syövän Egyptissä aiemmin raportoitu Felix

et al.

Vuonna 2008 [5], mikä korostaen syntyminen ja levinneisyys siirtymäkauden solutyypin ja takaisinveto ei-urothelial tyyppejä.

Lopullisesti, RFC ilmaisua voidaan pitää kaksiteräinen ase (kuva 2). Lisääntynyt RFC ilme edistäisivät kemosensitiivisyys antifolaattien samalla, laajeneva solunsisäinen folaattivarastoa koko; joka voi johtaa hankittu resistenssi. Tätä ajatusta tukee lisäksi havainto, että menetys folaatin viejien johti resistenssiä antifolaatteja kautta laajennus folaattivarastoa koko [21]. Erityisesti, virtsarakon karsinoomat, Rady

et ai.

, (Julkaisemattomat tulokset) raportoivat, että BCRP (vienti mono-, di-, ja triglutamates on folaatit) ilmentyminen väheni, kun taas MRP3, jotka ovat rajoitettu kyky viedä vain monoglutamate folaatit, havaittiin olevan yli-ilmentynyt [julkaisematon työ Rady et al. 2009]. Lisäksi MRP3 oli merkitsevästi korkeampi urothelial suhteessa ei-urothelial rakkosyöpä- variantti [julkaisematon teos Rady et al. 2009]. Nämä vaihtelut ekspressiotasot antifolaattien ulosvirtausta ja tulva pumput merkitse sitä, että käyttö paneelin geneettisen biomarkkereita kullekin kasvaintyyppi voi olla tarkoituksenmukaista määriteltäessä vastaus kemoterapiaa eikä samalla itsenäistä geneettisen merkin.

joka kuvaa ehdotetun kaksiteräinen roolia RFC syövän kemoterapiassa. Lisääntynyt ilmentyminen ennustaa antifolaattien (MTX) kuljetus. Samaan aikaan, lisääntynyt ilmentyminen RFC johtaa folaattivarastoa koko laajeneminen pakottaa negatiivista palautetta esto on ottoa antifolaattien.

Johtopäätökset ja kehittyminen jatkossa

Tämä tutkimus oli sitoutuneet tutkimaan muutoksia RFC ilmaisun kesken eri variantteja virtsarakkokarsinoomat. RFC mRNA: n ilmentymisen on osoitettu olevan tyypin riippuvainen, mutta vaiheessa- ja luokka riippumaton. Vaikka eriyttäminen urothelial ja ei-urothelial virtsarakkokarsinoomat voidaan tehdä mikroskooppinen tutkimus, perimmäisenä tavoitteena olisi sisällyttää molekyylidiagnostiikassa kliiniseen käytäntöön. Mahdollinen arviointi paneelin folaatin kuljettajat (kuten, RFC, BCRP ja MRP3), voi ennustaa vastaus antifolaatti hoito, ehdottaa uusia hoitostrategioita ja siten parantaa hoitotuloksia yksittäisten virtsarakon syöpäpotilailla. Erot kuvattu väliset urothelial ja ei-urothelial karsinoomien virtsarakon voisi heijastaa eri etiologies ja /tai riskitekijöitä. Suurempi tutkimuksen tarkoituksena on tarjota korrelaatioita laajuudesta RFC metylaatio kliinis ominaisuudet, kuten ikä, sukupuoli, histologinen luokka, vaihe, ja eteneminen voisi tuottaa hyödyllistä tietoa etiologian RFC muuttunut ekspressiotasoja eri tyyppisiä virtsarakon syöpiä. Muita tunnettuja DNA: n metylaatio tavoitteet virtsarakon saattaa olla myös nähdä vaikutus korkeamman ilmentymisen RFC ja korkeamman folaatin liikenteen DNA: n metylaatio.

tukeminen Information

Kuva S1.

RNA laadun arviointi. Agaroosigeelielektroforeesi kokonais-RNA: miniprep-. Näytteet ”kaistat on merkitty niiden tunnusnumero niille keräämisen jälkeen. Havaintoja terävä bändejä 28S rRNA (4,8 kb) ja 18S rRNA (1,8 kb) oli osoitus ehjän RNA (T82, T65, S22 ja T38). S22 ja S38 sisältää jäämiä genomisesta DNA: sta, mutta RFC ja β-aktiini-alukkeet suunniteltiin ulottumaan eksoni /introni-risteyksestä minimoimiseksi genomi-DNA: n monistumisen. T118 osoitti osittaista hajoamista, mutta 28S ja 18S bändit olivat erittäin heikko; kokonais-RNA: saanto T118 oli vain 2 ug. T107 osoitti hajonnutta RNA: ta ja jätettiin lisäanalyysejä. RNA (nuolet) ja DNA-markkerit (1031-80 bp) otettiin mukaan vertailun vuoksi. Tämä kuva valokuvattiin käyttäen UVIsoft kuva mittausjärjestelmällä (Tokio, Japani).

Doi: 10,1371 /journal.pone.0021820.s001

(TIF) B Kuva S2.

sulamiskäyrää Analyysit. Sulamiskäyräanalyysi osoittamiseksi Pohjustusaineilla erityispiirteet. Paneeli A: Dye fluoresenssi laskee nopeasti, kun DNA sulaa. Sulamispiste määritetään käännepisteen sulamiskäyrä, mikä on helpoin määritetään maksimi negatiivinen 1. derivaatta sulamiskäyrä. Dissosiaatio käyrät sekä kohde (RFC) ja viite (ACTB) geenit näkyvät. Jokainen tuote näyttää yhden terävän piikin osoittaa spesifisyyttä alukeparia ja alukkeen poissaollessa-dimeerejä tai epäspesifisten monistustuotteiden. NTC joko ei merkinnyt Ct arvo tai tallennettu Ct arvoja välillä (35-38), jotka eroavat enemmän kuin 5cycles korkeimmasta Ct arvo tallentamien näytteiden (ei esitetty). Flat käyrät ROX passiivinen väriaine osoita lisäystasot (ei kuvassa). Paneeli B: agaroosigeelielektroforeesi tavanomaisten PCR-tuotteen käyttämällä käänteistranskriptio cDNA yhden kasvaimen näyte (T42) ja käänteiskopioitua cDNA kalibraattorin (kaupallisesti saatavilla, normaalissa virtsarakossa RNA, Clontech). Single bändejä oikeat koot RFC ja viittaus geeni osoittaa spesifisyyden tuotteiden.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0021820.s002

(TIF) B Taulukko S1.

Kliiniset ominaispiirteet virtsarakon syöpäpotilailla.

doi: 10,1371 /journal.pone.0021820.s003

(XLS) B

Kiitokset

Arvostamme tukea professori Ashraf Zaghloul ja tohtori Ahmed Moustafa on National Cancer Institute, toimittajina virtsarakkosyöpäpotilaan yksilöitä. Kiitämme Prof Raid Amin, johtaja UWF Statistical Consulting Services, avusta kanssa tilastollisen analyysin tuloksia. Prof. Stephen Bustin ja Prof. Sanaa Eissa vaikuttanut monien hedelmällisiä keskusteluja, ja kehitteli monia näkökohtia RT-qPCR. Olemme myös kiitollisia Shady Saad ja Deena Amr heidän apua perustamisesta menetelmien ja kokeellisen tutkimuksen suunnittelu.