Krooninen sairaus

tiivistelmä

esitutkimuksessa miRNA paneelit havaittu, että miRNA-29c (miR-29c) ilmentyy differentiaalisesti pariksi matalan metastasoitunut keuhkosyövän solulinjaa 95C verrattuna korkean metastasoitunut keuhkosyövän solulinjaa 95D. Bioinformatiikan analyysi osoittaa, että integriinin β1 ja matriisimetalloproteinaasi 2 (MMP2) voisi olla tärkeä kohdegeenien miR-29c. Siksi me arveltu, että miR-29c estää keuhkosyöpä solun tarttumista soluväliaineen (ECM) ja etäpesäkkeiden kohdentamalla integriinin β1 ja MMP2. Voitto-of-function tutkimuksista, nosti miR-29c ilmentymistä 95D-soluissa käyttämällä sen jäljittelee osoitti vähennyksiä solujen lisääntymisen, tarttuvuus ECM, invaasio ja muuttoliike. Kontrasteja, keskeytys- toiminto tutkimuksista, vähensi miR-29c käyttämällä sen estäjää 95C soluissa edistänyt leviämisen, tarttuvuus ECM, invaasio ja muuttoliike. Lisäksi dual-lusiferaasireportteri- määrityksessä osoitti, että miR-29c esti lusiferaasi-geenin, joka sisältää 3′-UTR integriini β1 ja MMP2 mRNA. Western blotting osoitti, että miR-29c vaimentua ilmentymistä integriinin β1 ja MMP2 proteiinitasolla. Gelatiinitsymografialla analyysi vahvistivat lisäksi, että miR-29c laski MMP2 entsyymin aktiivisuutta. Nude hiiriä ksenograftimalleja keuhkosyöpään solujen vahvisti, että miR-29c esti keuhkosyövän etäpesäke in vivo, mukaan lukien luun ja maksan etäpesäke. Yhdessä tuloksemme osoittavat, että miR-29c toimii kasvaimen etäpesäke vaimennin, joka vaimentaa keuhkosyöpä soluadheesion ECM ja etäpesäkkeiden suoraan estämällä integriini β1 ja MMP2 ilmaisun sekä vähentämällä MMP2 entsyymin aktiivisuutta. Tulokset osoittavat, että miR-29c voi olla uusi terapeuttinen ehdokas tavoite hidastaa keuhkosyövän etäpesäkkeiden.

Citation: Wang H, Zhu Y, Zhao M, Wu C, Zhang P, Tang L, et ai. (2013) miRNA-29c vaimentaa Lung Cancer Cell Adhesion soluväliaineen ja metastaasin mukaan kohdistaminen integriini β1 ja Matrix Metalloproteinase2 (MMP2). PLoS ONE 8 (8): e70192. doi: 10,1371 /journal.pone.0070192

Editor: Edward F. Plow, Lerner Research Institute, Yhdysvallat

vastaanotettu: 08 huhtikuu 2013; Hyväksytty: 17 Kesäkuu 2013; Julkaistu: 06 elokuu 2013

Copyright: © 2013 Wang et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat osittain avustuksia National Natural Science Foundation of China (nro 30800631, nro 30872553 ja nro 81272433) sekä avustusta Shanghai Science and Technology komitea (nro 09411964800). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Tänään, keuhkosyöpä on yksi yleisimmistä syövistä. Enemmän kuin 90% keuhkosyöpä potilaat kuolevat etäpesäkkeiden pikemmin kuin niiden ensisijainen kasvaimia, viittaa siihen, että etäpesäke on keskeinen ennustetekijä [1], [2]. Kasvainprogression ja etäpesäkkeiden on monimutkainen prosessi, johon liittyy monia erilaisia ​​biologisia pelaajia. Yksi ratkaisevista säätimiä, jotka osallistuvat prosessiin on microRNA (miRNA) [3].

Kypsät miRNA ovat lyhyitä, yksijuosteisia, sisäsyntyinen ja ei-koodaavat RNA: t koostuu noin 22 nukleotidin, jotka säätelevät geenit at transkription jälkeisellä tasolla käännösprosessin aikana. Ne voivat kohdistaa 3′-UTR (transloimattomat alueet) mRNA: n, joka toiminnallisesti johtaa translaation inhibition tai vapauttaminen kohde-mRNA: n [4]. miRNA on suuri vaikutus erilaisiin biologisiin prosesseihin, kuten solujen erilaistuminen, proliferaatio, apoptoosin, stressinsietokyky, rasva-aineenvaihduntaa, ja kehitys. Siksi niillä on ratkaiseva merkitys eri sairauksia kuten syöpää [3]. Lisäksi tutkimukset osoittavat, että jotkut miRNA voivat toimia onkogeenien tai tuumorisuppressoreilla. MiRNA tärkeä rooli kasvainten synnyssä ja syövän etenemiseen, kuten solujen lisääntymisen ja etäpesäkkeiden [3], [5] – [8]. Esimerkiksi, miR-10b edistää rintasyövän tuumorimetastaasit, kun taas miR-335 ja miR-126 estää etäpesäkkeiden [9], [10]. Siksi seuraavan sukupolven terapeuttisia kohteita pahanlaatuiset kasvaimet voivat olla miRNA [11].

miR-29 perhe on konservoitunut perheen miRNA lukien miR-29a, miR-29b, miR-29c, ja miR -29d. Äskettäin ekspressiotasot monien miR-29 perheenjäsenten havaittiin vähentää eri syöpiä. Esimerkiksi Sengupta ja hänen kollegansa ovat osoittaneet, että miR-29c säätyy alas nenänielun karsinoomat [12], kun taas Fabbri kollegoineen havaitsi, että miR-29 perheen, mukaan lukien miR-29c, tavoitteet DNMT3A ja DNMT3B keuhkosyövän kudoksissa ja solujen [13].

Tässä tutkimuksessa, aikaisemmassa pilottitutkimus löysi lähes nelinkertainen erilaiseen ekspressioon miR-29c välillä korkea (95D) ja matala-metastasoitunut (95C) syöpäsolulinjoissa (yksityiskohdat Taulukko S1). Useat tutkimukset ovat hyödyntäneet tätä eroa hengen solulinjojen suhteen invaasiota ja etäpesäkkeiden [14], [15]. Kuitenkin rooli miR-29c keuhkosyövässä on vielä perusteellisesti tutkittu ja suurin osa sen yleistä biologisen toiminnan edelleen tuntematon. Täällä osoituksia siitä, että miR-29c toimii etäpesäke vaimennin, joka estää keuhkosyöpä soluadheesion ECM ja muuttoliike

in vitro

, ja tukahduttaa syöpäsolujen etäpesäkkeiden

in vivo

. Olemme edelleen vahvisti, että miR-29c voi suoraan downregulate integriini β1 ja MMP2 ilmaisun kohdistamalla 3′-untranslation järjestyksessä, estää proteiinin tasot integriinin β1 ja MMP2, ja vähentää MMP2 entsyymin aktiivisuutta. Tulokset osoittavat, että miR-29c voi olla uusia terapeuttisia ehdokas tavoite tai strategia pyrkii hallitsemaan keuhkosyöpään etäpesäkkeiden.

Materiaalit ja menetelmät

Ethics

Kaikki eläinkokeet olivat suoritettiin käyttäen naispuolinen nude-hiirissä (6-7 viikkoa vanhoja). Hiiret ostettiin SLAC Laboratory Animal Ltd, Co (Shanghai, Kiina) ja hoidetaan mukaisesti National Institutes of Health Guide for Care ja koe-eläinten käytön. Kaikki eläin tutkimussuunnitelma hyväksyttiin Institutional Animal Care ja käyttö komitea Tongji yliopiston (IACUC nro 1201).

Solulinjat ja soluviljelmä

pariksi matalan metastasoitunut 95C ja high-metastasoitunut 95D solulinjat subkloonattiin alhainen eriytetyn ihmisen suuri keuhkosyövän solulinjassa PLA-801. Solut hyvin todennettu ja julkaisi useita tutkimusryhmiä [14], [15]. Solut ystävällisesti professori Ying-Lin Lu, Department of patobiologian, Institute of Basic Medical Sciences, Academy of Military Medical Sciences, Peking, Kiina joulukuu 5,2009. Kuten kuvattu 95C ja 95D-soluja viljeltiin RPMI 1640: ssä (Invitrogen, USA) ja 100 yksikköä /ml penisilliiniä, 100 ug /ml streptomysiiniä ja 10% vasikan seerumia, ja kasvatettiin 37 ° C: ssa ilmakehässä, jossa 5% CO

2. Soluja käytettiin toiminnallisia tutkimuksissa 6 kuukauden kuluessa thawn nestemäisistä typpisäiliöstä.

MikroRNA array ja qRT-PCR-analyysi

Kun olet suorittanut yksinkertaisen migraatiokokeessa seuloa korkean ja matalan metastasoitunut soluissa teimme siirtokuoppaan määritys indeksinä matrigeelin invaasion

in vivo

käyttämällä ei-invasiivisia 95C solut ylemmässä kammiossa ei-päällystetyn transwell laita (24-kuoppaiset insertin; huokoskoko 8 pm; Corning, USA) ja 95D-solut pohjaan käyttäen Matrigel (50 ug /ml) päällystettiin transwell-insertin monistamiseen ero ilmentymisen miRNA. Sitten miRNA differentiaalikaavojen välillä 95C ja 95D mitattiin käyttämällä miR human_01_H10.1_080277 miRNA array (LC Sciences Houston, USA). Kaikki tiedot talletettiin Gene Expression Omnibus (GEO). Hakunumerolla on GSE47788. Mitattu miRNA tilastollinen ero (

p

0,01), katsottiin olevan merkittävästi ilmentyvät differentiaalisesti.

Quantitative real-time PCR (qRT-PCR) suoritettiin mittaamaan ekspressiotasot of 95C ja 95D-soluissa. Kokonais-RNA villityypin 95C ja 95D eristettiin käyttäen Trizol reagenssia (Invitrogen, USA) mukaan valmistajan ohjeiden. Kokonais-RNA (50 ng) käänteistranskriptoituneet kanssa miR-29c kantasilmukan RT-alukkeita tai U6 RT alukkeita (Shanghai Laajennettu Nature Biotech Co., Ltd) käyttäen RevertAid ™ First Strand cDNA Synthesis Kit (Fermentas, USA) valmistajan protokollan muodostamiseksi cDNA. Reaaliaikainen PCR suoritettiin käyttäen SYBR® Esiseos Ex Taq ™ Kit (TaKaRa, Japani), jossa miR-29c tai U6 PCR-alukkeita (Shanghai Laajennettu Nature Biotech Co., Ltd). Reaktiot suoritettiin käyttäen ABI7500 Real-Time PCR System (Applied Biosystems). Kaikki tiedot kunkin näytteen kerättiin kolmena kappaleena ja arvioidaan 2

-ΔΔCt suhteellista kvantitatiivista analyysiä.

Gain-of-function ja menettämisestä toiminto miR-29c

Herkkyys-of-function määrityksessä miR-29c jäljittelee sekä menettämisestä funktion määrityksessä miR-29c estäjä

in vitro

suoritettiin solutransfektiolle käyttämällä jäljempänä mainitun menetelmän. Oligonukleotidisekvenssit Mir-29c jäljittelee, estäjä ja niiden negatiivinen kontrolli ovat:

miR-29c matkii (29c):

Sense: 5′-UAGCACCAUUUGAAAUCGGUUA-3 ’,

Anti-sense: 5′-UAACCGAUUUCAAAUGGUGCUA-3 ’;

miR-29c matkii negatiivinen kontrolli (MiNC):

Sense: 5′-UCACAACCUCCUAGAAAGAGUAGA-3′,

Anti-sense: 5′-UCUACUCUUUCUAGGAGGUUGUGA-3 ’;

miR-29c estäjä (29ci): 5′-UAACCGAUUUCAAAUGGUGCUA-3′

miR-29c estäjä negatiivinen kontrolli (IhNC): 5’UCUACUCUUUCUAGGAGGUUGUGA-3 ’.

Kaikki nämä oligonukleotidit chemosynthesized pidennetyistä Nature Biotech, Shanghai.

Solun transfektio

95C tai 95D-soluja viljeltiin noin 80 % konfluenssiin 6-kuoppalevyille ja transfektoitiin Lipofectamine 2000 (Invitrogen, USA) valmistajan ohjeiden mukaisesti. Solut kussakin kuopassa 6-kuoppalevyllä transfektoitiin 100 nM jäljittelee tai 200 nM inhibiittoria. 24-48 tuntia transfektion jälkeen solut kerättiin lisäkokeita, kuten solujen lisääntymisen, tarttuvuus, muuttoliike, ja hyökkäystä.

soluproliferaatiomäärityksissä

Leviämisen transfektoituja soluja arvioitiin MTT määritys. Noin 2 x 103 solua ympättiin 96-kuoppalevylle 100 ui kunkin kaivon alusta. 24 tunnin kuluttua, 48 h 72 h ja 96 h, 20 ui MTT: tä (5 mg /ml) lisättiin 96-kuoppaiselle levylle ja niitä inkuboitiin 4 tunnin ajan ennen lukemista 530 nm: ssä levynlukijalla. Kaikki riippumattomat kokeet suoritettiin kolminkertaisina.

Soluadheesio soluväliaineen (ECM) määritykset

transfektoitujen solujen adheesiota Matrigel arvioitiin MTT-määrityksellä ja laskenta. MTT-määrityksessä, 96-kuoppaisilla levyillä esi-päällystettiin 40 ui 50 ug /ml matrigeeliin (BD Biosciences, USA) ja sitten 1 x 104 solua maljattiin jokaiseen kuoppa 96-kuoppaiselle levylle 100 ul keskipitkän ja soluja inkuboitiin 37 ° C: ssa 2 tuntia. Seuraavaksi suoritettiin MTT-määritystä aikaisemmin kuvatulla tavalla sen jälkeen, kun kolme kertaa pesun pois tarttumattomat solut PBS: llä. Kun laskenta määrityksessä 95D ja 95C-solut transfektoitiin lentivirus NC-CMV-GFP-LV (Shanghai Genechem) vakaasti ilmentämään GFP-geenin. 95D-GFP: n ja 95C-GFP-soluja transfektoitiin 100 nM jäljittelee tai 200 nM inhibiittoria, vastaavasti, trypsinoitiin, pestiin kaksi kertaa 1 x PBS: ssä, ja sitten 1 x 104 solua with100 ui väliaineessa maljattiin jokaiseen kuoppa 96-kuoppaisille levy pinnoitettu edeltäkäsin 40 ui 50 ug /ml matrigeeliin, ja soluja inkuboitiin 37 ° C: ssa 30 min.The tarttumattomat solut pestiin pois 3 kertaa PBS: llä, ja solujen lukumäärä, jotka noudattavat Matrigel on laskettiin alle käännettyä mikroskooppia (Olympus Corp. Tokio, Japani) 100 x suurennus 3 satunnaisesti valitun vihreiden kussakin kuopassa. Riippumaton Kokeet ajettiin kolme kertaa.

Solun maahanmuutto- ja invaasion määritykset

Mahdollisuuksia muuttoliike ja invaasion transfektoitujen solujen arvioitiin Transwell määrityksessä. Vuonna migraatiokokeessa, 2,5 x 104 solua viljeltiin 200 ul: ssa väliainetta, jossa 1% vasikan seerumia ylemmässä kammiossa ei-päällystetty transwell-insertin. Alemmassa kammiossa, 600 ui elatusainetta 10% vasikan seerumia käytettiin kemiallis-houkutin kannustaa solujen vaeltamiseen. Vuonna invaasiomääritys, ylemmän kammion Transwell-irto-päällystettiin 50 ui 2,0 mg /ml matrigeeliä ja 5 x 104 solua maljattiin ylemmässä kammiossa Matrigel-päällystetty transwell-insertin. Solut Molempien määritykset inkuboitiin 24 tuntia ja solut, jotka eivät muuttaneet tai hyökätä poistettiin käyttäen pumpulipuikolla. Kaikki solut värjättiin käyttäen kristalliviolettia värjäystä ja laskettiin käännettyä mikroskooppia. Valitsimme neljä random näkymät laskea solujen ja riippumattomat kokeet toistettiin kolmesti.

määritys miR-29c kohdennussekvenssiä laskennallisilla ennustuksen

Computational ennustaminen on jo osoittautunut tehokkaaksi ja tehokas menetelmä ennustamiseen miRNA tavoitteet. Käytimme TargetScan, PicTar ja Miranda ennustaa miR-29c kohdennussekvenssiä. Tavoitteisiin, jotka ennustettiin kolmen tietokantoja ja liittyivät invaasion ja -metastaasin merkityksellisinä Tutkimuksemme.

Dual-lusiferaasianalyysissä määrittämiseksi vaikutusten kohdesekvenssien 3′-UTR alue integriini β1 ja MMP2

3′-UTR-fragmentti integriini β1 ja MMP2 geenejä, mukaan lukien miR-29c sitoutumiskohdan, monistettiin PCR: llä 95D solun genomisesta DNA: sta käyttäen seuraavia alukkeita. PCR-alukkeet integriini β1 olivat:

Intβ1-

Sal

I-UTR1, 5′-TGGAGCTCTAACTGCCCGTGCAAATCCCACAAC-3 ’(eteenpäin),

Intβ1-

Mlu

I-UTR2, 5′-TGACGCGTAACTTCAGTAAATAGCACTGTA-3 ’(taaksepäin).

PCR-alukkeet MMP2 olivat:

MMP2-

Mlu

I-UTR1, 5′ -TGACGCGTAACTGCCTTCGATACACCGGGCCTG-3 ’(eteenpäin), MMP2-

Hind

III-UTR2, 5′-TGAAGCTTGCACATAGAAAGCACTCTATTAATTC-3′ (reverse).

integriini β1 ja MMP2 geeni mutantti 3′-UTR fragmentti, joka sisälsi miR-29c sitomiskohta monistettiin 3′-UTR-fragmentti käyttäen seuraavia alukkeita integriini β1 mukaan Intβ1-

Sal

I-UTR1 + Intβ1-

Mlul

I

mut

-UTR3 (5′-TGACGCGTGAAGAGGTGACAGAAACTAAGT GACATTAAAC-3 ’) ja MMP2 mukaan MMP2-

Mlu

I-UTR1 + MMP2-

Hind

III

-mut –

UTR (5′-TGAAGCTTGAAGAGCCTGAAGTGTGGCAGCGTCTGGGC-3 ’) (Alleviivatut emäkset osoittavat mutaation).

monistettu fragmentti kloonattiin pMIR-REPORT sivektorissa (Ambion, USA)

Sal

I +

Miu

I

ja Mlul

I +

Hind

III sivusto integriinin β1 ja MMP2, vastaavasti.

95C tai 95D solut ko-transfektoitiin 24-kuoppaisille levyille, jotka sisälsivät 200 ng tulikärpäsen lusiferaasi vektori, 40 ng

Renilla

lusiferaasia PRL-TK-vektoria (Promega, USA) ja 100 nM jäljittelee tai 200 nM inhibiittoria. Tulikärpäsen lusiferaasi toimi reportterigeenin ja

Renilla

lusiferaasia normalisoitu kontrolli. Transfektoituja soluja inkuboitiin 48 tuntia. Lusiferaasiaktiivisuus mitattiin käyttämällä Dual-Luciferase Reporter Assay System (Promega, USA).

Western blotting

eristämiseksi proteiinien kokonaismäärän, koe- ja kontrolliryhmässä solut pestiin 1 x PBS: llä, hajotettiin RIPA-puskurilla (50 mmol /l Tris-emästä, 150 m mol /l NaCl: a, 0,1% SDS, 1% Triton X-100, 0,5% natriumdeoksikolaatti, 1 m mol /l natriumortovanadaattia, 10 m mol /l natrium- fluoria, 1% proteaasiestäjäseostabletit) 15-20 minuutin ajan jäillä. Kun oli sentrifugoitu 12000 rpm: ssä 15 minuutin ajan, supernatantit otettiin talteen. ja proteiinipitoisuus kvantitoitiin BCA-proteiinimäärityksellä. 20-30 ug kokonais-proteiinien liuotettiin SDS-PAGE-latauspuskurilla, kuumennettiin 100 ° C: ssa 5 min, erotettiin 10% polyakryyliamidigeelillä, siirrettiin nitroselluloosakalvoille (Amersham Biosciences). Membraanit blokattiin 5% rasvatonta maitoa TBST-puskuriin (Tris-puskuri suolaliuos, joka sisältää 0,1% Tween-20) 1 tunnin ajan huoneenlämpötilassa, ja sen jälkeen inkuboitiin yön yli 4 ° C: ssa sopivasti laimennettua ensisijainen vasta-aineita kanin monoklonaalista anti -ihmisen integriini β1 ja MMP2 (laimennettu 1:1000; Cell Signaling Technology). Sen jälkeen kun oli pesty TBST: llä puskuria, blotteja inkuboitiin sitten HRP-konjugoidun sekundaarisen vasta-aineen kanssa 1 tunnin ajan huoneenlämpötilassa. Sen jälkeen kun oli pesty TBST-puskurilla, kohdeproteiinit havaittiin tehostetulla kemiluminesenssin reagenssit ECL.

gelatiinitsymografialla of MMP2 entsyymiaktiivisuuden

Tämä koe pyrki spesifisten MMP2 ja MMP-9 entsyymin aktiivisuutta. Media ilman seerumia kerättiin transfektoiduista 95C ja 95D-soluissa 24 tunnin kuluttua analysoitiin käyttäen gelatiinitsymografialla Assay Kit (Applygen, Kiina). MMP-aktiivisuus mitattiin SDS-PAGE: lla ei-pelkistävissä olosuhteissa. Geeli sisälsi 1% gelatiinia ja 30%: sta akryyliamidia. Elektroforeesi suoritettiin 4 ° C: ssa. Sen jälkeen kun oli pesty puskurilla A (joka sisälsi 2% Triton X-100) sarjasta, geeli inkuboitiin 37 ° C: ssa puskurissa B (joka sisältää tarvittavat metalli-ioni: 5 mmol /CaCI

2, 1 umol /L ZnCl

2). MMP-aktiivisuus visualisoitiin värjäämällä Coommasie Blue R-250.

In vivo etäpesäkkeiden määrityksissä nude-hiirissä ksenograftimallissa

95D ja 95C-solut transfektoitiin lentivirus ja U6-RNAi- (Ubi ) -luc-LV (Shanghai Genechem) vakaasti ilmentämään tulikärpäsen lusiferaasi keuhkojen syöpäsoluja. 95D-luc ja 95C-luc-solut transfektoitiin 100 nM jäljittelee tai 200 nM inhibiittoria, vastaavasti, trypsinoitiin, pestiin kaksi kertaa 1 x PBS: llä ja suspensoitiin uudelleen konsentraationa 1-5 x 10

6 solua /ml kylmä 1 x PBS: ää. Nainen karvattomia hiiriä (6-7 viikkoa vanhoja) nukutettiin injektoimalla vatsaonteloon ketamiinia (90-110 mg /kg) ja ksylatsiinilla (10 mg /kg) ennen intrakardiaalisella injektiot ja asetettiin selälleen. Jossa on 25-gaugen neulalla, 2-3 x 10

5 solua injektoitiin vasempaan kammioon (tilavuus 0,1 ml), sen jälkeen, kun visualisointi valtimoveren virtauksen ruiskuun. Injektion jälkeen hiiret laitettiin kuumennettaessa häkkeihin toipua nukutuksesta. Solu-pistetään eläimiä oli pidetty steriileissä olosuhteissa Experimental Animal Facility Tongji yliopiston (Shanghai, PR China).

in vivo

etäpesäkkeitä määritys, keuhkosyöpä etäpesäke valvottiin elävien eläinten bioluminesoiviin kuvantaminen (BLI) käyttäen LB 983 in vivo kuvantamisjärjestelmä (Berthold) alkaa 3-4 viikkoa istutuksen jälkeen. Viisitoista minuuttia ennen

in vivo

BLI, eläimet nukutettiin 1-3% isofluraania ja injektiona vatsaonteloon D-lusiferiini (150 mg /kg 1 x PBS). Kokeet suoritettiin käyttäen 5 tai 6 hiirtä ryhmää kohti ja toistettiin kolmesti. Kehittäminen luun etäpesäkkeiden seurattiin X-ray radiografia varten 6-8 viikkoa injektion jälkeen. Hiiret nukutettiin, sijoitettu läpinäkyvä aluksella vatsallaan ja sivusuunnassa kantoja, altistuvat röntgensäteilyä 30 kV ja 0,5 mA 10 s on Fixitron MX-20 radiografiajärjestelmään instituutin traumatologian Ortopedia, Shanghai Academy of Traditional Chinese Medicine.

Tilastollinen

Quantitative arvot esitetään keskiarvona ± SEM. Opiskelijan

t

ja χ

2 kokeita vertaamaan vastaavat tiedot. Erot

P

0,05 katsottiin olevan tilastollisesti merkitsevä.

Tulokset

miR-29c säätyy alas korkean metastasoitunut keuhkosyöpään solujen

tässä tutkimuksessa 95C ja 95D-solujen linjat valittiin, koska ne ovat peräisin samasta yksilöstä ja on dramaattinen ero metastasoituneeseen käyttäytymistä. Tunnistaa ero ilmaus miRNA välillä 95C ja 95D-soluissa. Ensinnäkin ensisijainen seulonta suoritettiin käyttämällä yksinkertaista Matrigel hyökkäyksen siirtokuoppaan määritys ennen miRNA array. Löysimme merkittävä ero ilmaus miRNA välillä 95C ja 95D-soluissa käyttämällä miRNA array (Yksityiskohdat taulukossa S1). Tutkia mahdollista roolia miRNA jotka estävät keuhkojen syöpäsolumetastaasi ja mahdollisia ehdokkaita kohdegeeneihin, keskityimme miR-29c, koska se säätyy alas korkean metastasoitunut 95D-solujen ja säädellään ylöspäin alhaisen metastasoitunut 95C soluissa. Havainto saattaa merkitä miR-29c toimivat tuumorimetastaasimallissa vaimennin. Tiedot qRT-PCR vahvisti lisäksi eri ekspressiotasoja miR-29c välillä 95C ja 95D-soluissa. Tämä tulos on yhdenmukainen miRNA array tuloksia. (MiR-29c osoitti 3,8 kertainen kertaa suurempi 95C kuin 95D kuviosta 1A).

(A) qRT-PCR miR-29c in 95D ja 95C solulinjoissa. Muuta laskettiin 2

-ΔΔCt suhteellinen kvantitatiivinen analyysi; **

p

0,01 (Opiskelijan

t

-testi). Kokeet toistettiin vähintään kolme kertaa (n = 3). (B) miR-29c estää solujen lisääntymisen in 95D-soluissa MTT: llä. **

p

0,01 (Opiskelijan

t

-testi, n = 3). (C) miR-29c estäjä lisäsi solujen proliferaatiota 95C soluissa MTT: llä. **

p

0,01 (Opiskelijan

t

-testi, n = 3).

miR-29c tukahduttaa soluproliferaatiota 95D soluissa

Voit selvittää miR-29c tukahduttaa keuhkosyövän solujen lisääntymistä, miR-29c matkii (miR-29c) ja jäljittelee negatiivinen kontrolli (MiNC) transfektoitiin 95D soluihin, kun taas miR-29c estäjä (29ci) ja inhibiittoripastojen negatiivinen kontrolli ( IhNC) transfektoitiin 95C soluihin. MTT-testit suoritettiin solujen proliferaation mittaamiseen. Tulokset (kuvio 1 B) viittaavat siihen, että miR-29c on estävä vaikutus proliferaatioon 95D-solujen. Ei ollut eroa 24 h leviämisen 95D-solujen välillä miR-29c ja MiNC ryhmät (

p

0,05). Oli kuitenkin merkittävä ero näiden kahden ryhmän välillä 48 tunnin kuluttua, 72 tunnin ja 96 tunnin inkuboinnin (

p

0,01). Inhiboiva hyötysuhde oli 37,5%, 54,4% ja 40,3% (kuvio. 1 B), tässä järjestyksessä. Näin ollen, miR-29c: n inhibitio 95D solun proliferaatio on ajasta riippuva prosessi.

95C-soluja, jotka on transfektoitu miR-29c estäjä (miR-29ci), proliferaatio lisääntyi ajasta riippuvalla tavalla. Lisääntyminen hinnat välinen miR-29ci ja IhNC ryhmät eivät vaihdelleet (

p

0,05) klo 24 h pisteen inkubaation. Oli kuitenkin tilastollisesti merkitsevä kahden ryhmän välillä 48 tunnin kuluttua, 72 tunnin ja 96 tunnin inkubaation leviämisen hinnat 15,2%, 13,7% ja 10,4% (kuvio 1 C,

p

0,01), vastaavasti. Siksi miR-29c edistänyt 95C soluproliferaation ajasta riippuva tavalla.

miR-29c inhiboi soluadheesion ECM in vitro

Tartunta ECM on tärkeä askel, kun syöpäsolut istuttaa itse kaukaisissa paikoissa aikana etäpesäke. Matrigel sisältävä tyvikalvon komponenteista voi simuloida soluadheesiota

in vitro.

Otimme hyväkseen tätä ominaisuutta ja suorittamansa adheesiomäärityksellä. Vuonna 95D transfektoiduissa soluissa miR-29c matkii (miR-29c) ja jäljittelee negatiivinen kontrolli (MiNC), solujen lukumäärä, jotka noudattavat matrigeelin väheni merkittävästi (

p

0,01, kuva 2 A-C ) jälkeen miR-29c transfektion verrattuna transfektoitu MiNC. Kuitenkin 95C transfektoiduissa soluissa miR-29c estäjä (29ci) ja inhibiittoripastojen negatiivinen kontrolli (IhNC), miR-29c estäjä on kasvanut merkittävästi 95C kiinnittyminen matrigeeliä kun solut oli transfektoitu miR-29c estäjä verrattuna transfektoitu IhNC (

p

0,01, kuva 2 D-F). Nämä tulokset osoittavat, että mir-29c voi vähentää määrää tarttumisen solujen korkean etäpesäke 95D-soluissa, kun taas esto mir-29c voi kasvoi soluadheesiota matalan metastaattinen 95C soluissa (kuva 2).

( A) 95D-solut, jotka on transfektoitu miR-29c matkii tarttumista Matrigel mitattiin laskemalla, kuten on kuvattu Materiaalit ja menetelmät. Edustavia aloilla 95D 29c ja 95D MiNC (suurennus x 100). (B) Keskimääräinen tarttuvuus solujen määrä per satunnaiskentän. **

P

0,01 (Opiskelijan

t

-testi, n = 3). (C) miR-29c estää 95D soluadheesiota (MTT-määritys). **

p

0,01 (Opiskelijan

t

-testi, n = 3). (D) edustaja kentät 95D 29ci ja 95C IhNC keuhkosyövän soluja (suurennus x 100). (E) Keskimääräinen tarttuvuus solujen määrä per satunnaiskentän. **

P

0,01 (Opiskelijan

t

-testi, n = 3). (F) tukahduttaminen miR-29c parannettu soluadheesion 95C soluissa (MTT-määritys). **

p

0,01 (Opiskelijan

t

-testi, n = 3).

miR-29c estää solujen invaasiota ja muuttoliike in vitro

TranswellTM määritystä käytetään laajasti mittaamaan solujen käyttäytymistä siirron aikana ja invaasion, keskeiset vaiheet tuumorimetastaasissa. Asetamme Matrigel kalvo tai siirtokuoppaan itselleen kemiallis-houkutin simuloida soluinvaasiota ja muuttoliike käyttäytyminen

in vitro

. Vuonna 95D-soluissa jälkeen miR-29c ja MiNC transfektio, näkyvä todettu merkitsevää eroa vähemmillä miR-29c transfektoidut solut laskettiin kuin MiNC transfektoidut solut (solujen määrä alennetaan 104,2% vuonna migraatiokokeessa ja 136% vuonna invaasiomääritys,

p

0,01). Tämä havainto voi osoittaa, että ylössäätely miR-29c estää solujen invaasiota ja muuttoliike (kuvio 3A ja B). Sen sijaan, transfektointi 95C solujen miR-29c estäjän ja IhNC osoittivat päinvastaiseen tulokseen; enemmän miR-29c estäjä transfektoiduissa soluissa läpi matrigeelin ja Transvvell- kalvo (solujen määrä kasvoi noin 79,7% vuonna migraatiokokeessa ja 97,4% vuonna invaasiomääritys,

p

0,01) verrattuna 95C soluihin transefected kanssa IhNC (kuvio 3 C ja D). Nämä tiedot osoittavat, että miR-29c vaikutteita soluinvaasiota ja muuttoliike käyttäytyminen

in vitro

.

(A) Matrigel invaasiomääritys, miR-29c matkii transfektoitujen 95D-solujen vs MiNC transfektoituja soluja 200 × valo laajuus jälkeen kristalliviolettia värjäystä. (B) matrigeelin invaasio ja siirtokuoppaan maahanmuutto: 95D solut laskettiin valon laajuus neljässä satunnainen näkemyksiä. **

p

0,01 (Opiskelijan

t

-testi, n = 4). (C) Matrigel invaasiomääritys, miR-29c estäjä transfektoitujen 95C solujen vs IhNC transfektoituja soluja 200 × kevyt laajuus jälkeen kristalliviolettia värjäystä. (D) matrigeelin invaasio ja siirtokuoppaan maahanmuutto: 95C solut laskettiin valon laajuus neljässä satunnainen näkemyksiä. **

p

0,01 (Opiskelijan

t

-testi, n = 4).

miR-29c suoraan suunnattu 3′-UTR integriinin β1 ja MMP2 geeni

tutkimaan edelleen mekanismeja, joilla miR-29c tukahduttaa keuhkosyöpäsolua invaasiota ja etäpesäkkeiden, analysoimme todennäköinen alavirtaan tuumorietäpesäke liittyviä geenejä. Laskennallisen ennustus käytettiin selvittää todennäköisin kohdegeenin. Otimme etuna TargetScan, PicTar ja Miranda tietokantoja ennustettujen mikroRNA tavoitteiden analysoida taregets Mir-29c. 3′-UTR integriini β1 (Intβ1) ja MMP2 oltava miR-29c-sitoutumiskohtia. 3′-UTR integriinin β1 ja MMP 2 miR-29c sitovaa kohtaa on erittäin konservatiivinen sekvenssit nisäkkäillä (kuvio 4A ja D). Tutkimuksissa otetaan oletetun toimintoja miR-29c in soluadheesion ja invaasio kannusti meitä lisätutkimusta integriini β1 ja MMP2.

(A) Konservoituneisiin kohdentamista 3′-UTR ihmisen int β1 by asennuspalveli- 29c (alleviivattu). Villityypin ja mutantti-sekvenssit int β1 3′-UTR on lueteltu vertailua varten. (B) Dual-lusiferaasireportteri määritys kohdegeenin int β1 in 95D transfektoiduissa soluissa miR-29c matkii. **

p

0,01 (Opiskelijan

t

-testi, n = 3). (C) Dual-lusiferaasireportteri määritys kohdegeenin int β1 95C soluissa tai ilman transfektoimalla mir-29c estäjiä. **

p

0,01 (Opiskelijan

t

-testi, n = 3). (D) miR-29c sitoutumiskohdat MMP2 3’UTR alue (alleviivattu); sitoutumiskohta on erittäin konservoitunut selkärankaisten eläinten, ihmiset mukaan lukien. Villityypin ja mutantti-sekvenssit MMP2 3’UTR on lueteltu vertailun. (E) Dual-lusiferaasireportteri määritys MMP2 mRNA 95D transfektoiduissa soluissa miR-29c matkii. **

p

0,01 (Opiskelijan

t

-testi, n = 3). (F) Dual-lusiferaasireportteri määritys MMP2 mRNA 95C soluissa tai ilman transfektoimalla mir-29c estäjiä. **

p

0,01 (Opiskelijan

t

-testi, n = 3).

Voit selvittää integriinin β1 ja MMP2 vaimennetaan asennuspalveli- 29c sitoutumalla niiden mRNA 3′-UTR: n, suoritimme kahden lusiferaasianalyysissä tarkistaa suhde kahden kohdegeeni ja miR-29c. Villityypin ja mutantti-integriini β1 ja MMP 2: n mRNA 3′-UTR insertoitiin alavirtaan alueelle lusiferaasireportterigeeniin päässä pMIR-REPORT vektori, ja nimittäin villin tyypin integriini β1 3′-UTR: n vektori, MMP 2 3 ”-UTR vektori, mutantti integriini β1 3′-UTR vektori ja mutantti MMP2 3′-UTR vektori, vastaavasti. Käytimme pMIR-REPORT sivektorissa kontrollina, sillä se ei saa vaikuttaa millään miR-29c jäljittelee tai estäjä, ja se voi myös toimia tavallisena kontrollina transfektiotehokkuuden. Siksi

Renilla

sivektorissa (PRL-TK vektori) ja tulikärpäsen lusiferaasi vektori kotransfektoitiin kanssa jäljittelee tai estäjä. Vuonna 95D solujen miR-29c jäljittelee, lusiferaasiaktiivisuus villityyppisen integriini β1 ja MMP2 vektori suhteellinen suhde estyi noin 2,00 kertaa verrattuna kontrolliryhmään (kuva 4 B ja C,

p

0,01) . Vaikka mutantti integriini β1 ja MMP2 vektorin 95D-solut osoittivat alempaa lusiferaasiaktiivisuus kuin kontrolli, ei ollut merkittävää eroa (

p

0,05). Vuonna 95C soluissa esto miR-29c on kasvu integriini β1 ja MMP2 lusiferaasiaktiivisuutta (kuvio 4 E ja F

p

0,01) verrattuna soluihin, joita ei stimuloitu miR-29c estäjä takia integriini β1 ja MMP2 vektori lusiferaasiaktiivisuus, joka estyi endogeeniset miR-29c. Samoin mutantti integriini β1 ja MMP2 95C solut osoittivat merkittävää reaktiota kontrolliin (

p

0,05). Ilmeisesti miR-29c tavoitteet integriini β1 ja MMP2 suoraan koska voitto-of-toiminto miR-29c in 95D-soluissa merkittävästi vähentynyt integriini β1 ja MMP2 vektori lusiferaasiaktiivisuus, ja keskeytys- toiminto miR-29c estäjää 95C soluista osoitti että integriini β1 ja MMP2 säilyttää ilmentymistaso vain silloin, kun solut eivät altistu miR-29c inhibiittori (kuvio 4).

miR-29c inhiboi endogeenisen proteiinin integriinin ekspressiota β1 ja MMP2

edelleen tutkittiin vaikutusten miR-29c integriini β1 ja MMP2 proteiinin ilmentymistä Western-blottauksella. Vuonna 95D-soluissa, jotka on transfektoitu miR-29c jäljittelee, ilmaus integriinin β1 ja MMP2 proteiini- tasot olivat merkittävästi pienempi kuin negatiivisen kontrollin transfektoitujen solujen MiNC (kuvio 5,

p

0,01) . Vuonna 95C soluissa, verrattuna transfektoidun IhNC, Western blotting tulokset osoittivat integriini β1 ja MMP2 preotein ilmentyminen ylössäädellään jälkeen transfektoitu miR-29c estäjää 95C (kuvio 5,

p

0,01). Nämä tulokset osoittavat integriini β1 ja MMP2 ovat kohdistu suoraa miR-29.

(A) Effects of miR-29c endogeenisten integriini β1 proteiinia.