Krooninen sairaus

tiivistelmä

G-proteiiniin kytkeytynyt reseptori (GPCR), kysteiini (C) -X-C-reseptorin 4 (CXCR4), on tärkeä rooli eturauhassyövän etäpesäkkeiden. CXCR4 on yleisesti pidetään solukalvoreseptorin jossa se lähettää signaaleja, jotka tukevat muutosta, etenemistä ja lopulta etäpesäkkeitä. Koska keskeinen rooli CXCR4 kasvainten synnyssä, terapeuttisten lähestymistapojen kuten antagonisti ja monoklonaalisia vasta-aineita ovat keskittyneet reseptoreihin että olemassa solukalvon. Syntymässä konsepti G-proteiiniin kytkettyjen reseptorien on, että ne voivat paikallistaa ja liittävät tumaan, jossa ne säilyttävät toiminta ja välittävät ydin- signalointi. Tässä osoitamme, että CXCR4 liittyvät tuma pahanlaatuisen eturauhassyövän kudoksiin. Samoin ilmaus CXCR4 havaittiin ydin- jakeet useiden eturauhassyövän solulinjoissa, verrattuna normaaliin eturauhasen epiteelisolujen. Tutkimuksemme tunnistettu ydinvoiman altaan CXCR4 ja määrittelimme ydinvoiman kuljetus koulutusjakson CXCR4. Me paljastaa oletetun tumalokalisaatiosekvenssiai- (NLS), ”RPRK”, sisällä CXCR4 jotka vaikuttivat tumaanohjaussignaali. Lisäksi ydinvoiman CXCR4 vuorovaikutuksessa Transportinβ1 ja Transportinβ1-sitoutuminen CXCR4 edistänyt tumaansiirtymiseen. Tärkeää on, G

cci immunosaostuksella ja kalsiumin mobilisaatio tutkimukset osoittivat, että ydinaseiden CXCR4 oli toimiva ja osallistunut G-proteiinin signalointi, paljastaen että ydinvoiman altaan CXCR4 säilytetään funktion. Koska ehdotus, että toiminnallinen, ydin- CXCR4 voi olla mekanismi taustalla eturauhassyövän uusiutumisen, lisääntynyt metastaattinen kyky ja huonompi ennuste jälkeen kasvaimia on hoidettu terapian, joka kohdistuu solukalvon CXCR4, nämä tutkimukset käsitellään uudella mekanismilla ydin- signalointia CXCR4, uusi mekanismi kliinisiä kohdistaminen ja osoittavat aktiivisen ydin- allas, joka tarjoaa tärkeitä uusia tietoja valaista mitä on ollut lähinnä kliinisiä raportteja ydinaseiden CXCR4.

Citation: Don-Salu-Hewage AS, Chan SY, McAndrews KM, Chetram MA, Dawson MR, Bethea DA, et ai. (2013) Kysteiini (C) -X-C-reseptori 4 läpikäy Transportin 1-Dependent Nuclear lokalisointi ja säilyy toimivana klo Nucleus metastasoituneen eturauhassyövän solut. PLoS ONE 8 (2): e57194. doi: 10,1371 /journal.pone.0057194

Editor: Natasha Kyprianou, University of Kentucky College of Medicine, Yhdysvallat

vastaanotettu: 20 marraskuu 2012; Hyväksytty: 18 tammikuu 2013; Julkaistu: 28 helmikuu 2013

Copyright: © 2013 Don-Salu-Hewage et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tuettiin osittain National Institutes of Health myöntää 2R25GM060414, P201MD002285 (CVH), F31CA153908 (MAC), 2G12RR003062-22 (CVH) ja AAAS Naisten kansainvälinen Research Collaboration (WIRC) Vähemmistöasiain Tarjoilu toimielimille (MSI), National Science Foundation avustus (CVH). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Eturauhassyöpä (PCA) on toiseksi suurin syy lisääntynyt syövän esiintymisen ja syöpään liittyvien kuolemien miesten Yhdysvalloissa [1], [2]. Hoidosta huolimatta, korkea kuolleisuus PCA ovat johtuvan etäpesäkkeiden, joka on tärkein este PCA hoidossa [3]. Useita molekyylejä ja mekanismit edistää syöpäsolumetastaasi. Esimerkiksi kemoatrak- sytokiinien (kemokiinit) voimistaa metastaattista potentiaalia Eturauhassyövän sitomalla ja aktivoimalla perheen G-proteiiniin kytkettyjen reseptorien (GPCR: t) [4], [5], [6], [7], että aloittaa signaalien lisäämiseksi soluun tarttuvuus, invaasio ja liikettä, ja sen jälkeen, kasvain selviytyminen uudessa sivusto etäpesäke. GPCR: t muodostavat suurimman perheen transmembraani- plasmamembraanin (PM) reseptorit [8]. Tavanomaisissa GPCR signalointi, reseptorit paikantuvat PM ja vaikuttaa aktiivisuuteen PM-paikallinen entsyymien, ionikanavien ja /tai toisiolähettejä. Heidän aktivoinnin sopivalla ligandilla laukaisee signalointia G-proteiinin alfa (G

α) ja /tai beeta-gamma (G

βγ) alayksiköstä [9], mikä kontekstisidonnaisia ​​tuloksia, jotka voivat positiivisesti ja /tai negatiivisesti säännellään toimintaa efektorimolekyylien merkinannossa solunsisäiseen [10], [11]. Lisäksi aktivoitu GPCR: t myös käynnistää sarjan molekyylivuorovaikutusten jotka mahdollistavat palautteen sääntelyä G-proteiinin kytkimen ja reseptorin endosytoosin vaimentaa reseptorin signaalia [12], [13], [14], [15], [16], [17 ], [18]. Müller

et al

. Aluksi kuvataan osallistuminen kemokiinin GPCR-reseptorien syövän etäpesäkkeiden [19] ja Akashi

et al.

raportoitu, että kemokiini GPCR, CXCR4, oli hyvin ilmaistu ihmisen pahanlaatuinen PCa verrattuna normaalin eturauhasen [20]. Lukuisat tutkimukset ovat dokumentoineet osallistumista CXCR4 keskeisillä vaiheet Eturauhassyövän etäpesäkkeiden: (i) signalointia; [21], [22]; (Ii) hyökkäyksen ja muuttoliike [23]; ja (iii) sellaisen verisuoniverkosto [24]. Näin ollen, useita terapeuttisia syöpäsolumetastaasi on suunniteltu antagonisoida CXCR4-välitteistä signalointia, [25], [26]. Tavanomaisissa CXCR4 signalointi, stroomasolujen johdettu 1 alfa (SDF1α) on yksinomainen ligandi CXCR4 [27], joka johtaa aktivoitumiseen polkuja tekee tämän reseptorin suotuisa tuumorigeneesiin: (i) G-proteiiniin kytkeytynyt reseptori (GPCR) signalointia ; (Ii) PI3K /AKT; (Iii) MAPK; (Iv) JAK /STAT; (V) Src ja (vi) HER2 [28], [29], [30].

Mielenkiintoista, GPCR: on havaittu subsellulaarisia soluelimiin eroaa klassisesta PM sijainti [31]. Nämä soluelimiin ovat Golgin laitteessa [32], endoplasmakalvostossa [33], solun tukirangan [34] ja ydin /tumakalvon [35]. Hanyaloglu ja von Zastrow olettaisi, että oletus kierrätys GPCR: ien mukaan endosomien voi edistää tehostetun toimittaa takaisin GPCR: ien PM, tai vaihtoehtoinen soluelimiin solussa, tuhoamatta niiden signalointikapasiteettia [36]. Kuitenkin nämä vuorotellen-lokalisoitu GPCR-reseptoreihin paljastaa uuden tason monimutkaisuutta, jotka voivat olla tärkeitä moduloimaan niiden toiminta. Yhä useammat GPCR: on havaittu tuman tai tumakalvoa, kuten lysofosfatidihappo reseptoreita, metabotrooppisia glutamaattireseptoreita, verihiutaleita aktivoiva tekijä reseptoreita, angiotensiini 2 tyypin I reseptorit, prostaglandiinireseptoreihin, endoteliinireseptorien, gonadotropiinia vapauttava hormoni tyyppi I-[ ,,,0],37] ja

β

adrenergisiin reseptoreihin [38], [39], [40], [41], [42], [43], [44]. Nuclear GPCR: on ehdotettu säännellä lukuisia fysiologisia prosesseja, muun muassa solujen proliferaatiota, eloonjäämistä, tulehdusreaktioita, tumorgenesis, DNA-synteesin ja transkription [43], [45], [46], [47], [48], [49 ], [50]. Nuclear GPCR: t voivat olla konstitutiivisesti aktiivisia tai aktivoitu sisäinen, juuri syntetisoidun ligandit, joita sitoo erityksen [51]. Sen jälkeen, klassinen toisiolähetin signalointireittejä, kuten adenylyylisyklaasin aiheuttama proteiinikinaasi A (PKA) aktivaation [38], fosfolipaasi-indusoitua intranukleaarinen kalsium, diacyglycerol aiheuttama proteiinikinaasi C (PKC) [39], [52], ERK1 /2, p38 MAP-kinaasien ja proteiinikinaasi B (PKB) [49], [50] on osoitettu aktivoitava ydin- GPCR: t.

Nuclear lokalisointi proteiinien sanelee ydin- tuonnin ja viennin kautta ydin- huokosten kompleksit [53]. Pieniä proteiineja ( 30-50 kDa) voi kulkea tumahuokonen vapaan diffuusion; mutta useimmat Lastiproteiinimalleja edellyttävät aktiivista kuljetusta menevän tuman [54]. Suurempien proteiinien käyttää aktiivisen kuljetuksen mekanismeja, jotka tarvitsevat apua liikenteen proteiinit [55], [56], [57]. Monet proteiinit kohdennettu tumaan sisältää klassisen tumalokalisaatiosignaalin (NLS), joka on tunnustettu heterodimeerisen tuonti reseptori koostuu Importiini alfa- ja Importiini beta. Monet näistä reseptorien suoraan tunnistaa lastin proteiineja ja kohdistaa ne suoraan tumahuokonen [58]. Kun kyseessä on tämä suuri perhe, kohdistaminen signaaleja lastin proteiinit ovat usein hyvin määritelty [59]. Jokainen proteiini, joka paikantuu tumaan on oltava toimiva NLS tai vaaditaan sitoutuvan lastin proteiineja, jotka omistavat NLS (s). Importiini alfa tunnistaa Maanmittauslaitos tavaratilassa proteiinin samalla Importiini beta kohdistettu tuonti kompleksin tumahuokonen [58], [60]. Importiini beta on osa laajempaa perheen liikenteen reseptorien usein ilmaisua importins /exportins [59].

Vaikka otaksuttu MML on tunnistettu CXCR4 [61], tehtävä tämän ydinvoiman kohdistaminen signaalin yhteydessä CXCR4 ei ole tutkittu. Selvä Importiini riippuva liikenteen reitin on ollut mukana kuljettamiseen C-C kemokiinireseptori tyypin 2 (CCR2) [62]. Favre

et al

. havaitsivat, että muokatun, HA-koodattu CCR2 liittyy jäsenen Importiini perheen ydinvoiman liikenteen reseptorien, Transportinβ1 (TRN1), joka CCR2-null solulinjassa [62]. Vuorovaikutuksesta CCR2 kanssa TRN1 vaadittiin havaita CCR2 ydin- jakeet, mikä viittaa siihen, että CCR2 kuljetetaan tumaan kautta TRN1 [62]. TRN1 on liitetty GPCR sisäistämistä ja siedätyshoito [63]. Lisäksi TRN1 toimii reseptorina NLS-null proteiinien NLS-sisältävät lastia alustoille [64], joten se on olennainen proteiini tuonnin kautta tumahuokonen monimutkainen [65]. Yhdessä nämä tutkimukset viittaavat siihen, että sekä klassisen ydinvoiman tuonnin koneet ja TRN1 ovat ehdokkaita, jotka on rooli CXCR4 tumaansiirtymiseen [66].

Nuclear CXCR4-proteiinin ilmentyminen on havaittu pahanlaatuinen hepatosellulaarinen, peräsuolen, munuaissolukarsinooma ja nenänielun karsinoomat [67], [68], [69], [70]. Nämä tutkimukset kuitenkin ilmoitettiin kliiniset havainnot, ja ei tutkinut mekanismeja CXCR4 lokalisointi tai biologinen toiminta liittyy ytimen reseptori. Nämä tiedot ovat yhdenmukaisia ​​raportteja, jotka ovat osoittaneet toiminnallinen GPCR: t liittyvät tuma, ja edelleen edistää jatkuvaa syövän hoitotoimenpiteiden vastaan ​​CXCR4. Tärkeää on, toiminnallinen ydin- CXCR4 voivat edistää PCa uusiutumisen huolimatta nykyinen antagonisteja ja monoklonaalisia vasta-aineita PM sidottuja CXCR4 ja tietoihin ei saa ylittää PM, joka vaadittaisiin antagonisoida aktiivinen CXCR4 ytimessä. Lisäksi tunnistaminen liikenteen väyliä tarvitaan ydinvoiman lokalisoinnin CXCR4 voi paljastaa lisää terapeuttisen kehittämisen kohteita estää eturauhassyövän etäpesäkkeiden ja parantaa potilaan selviytymistä.

Materiaalit ja menetelmät

Soluviljely, Antibodies ja Reagent olosuhteissa

PC3, DU145, 22RV1 ihmisen eturauhassyövän solulinjoissa (PCa), RWPE1 ihmisen eturauhasen solulinja ja 293T ihmisalkion munuais- solulinja saatiin American Type Culture Collection (ATCC). PC3, DU145, 22RV1 ja 293T-soluja ylläpidettiin täydelliseen RPMI-elatusaineeseen: RPMI 1640, joka sisälsi 10% naudan sikiön seerumia (FBS), 1% ei-välttämättömiä aminohappoja ja 1% antibiootti-antimykoottia 37 ° C: ssa 5% CO

2. RWPE1 soluja pidettiin keratinosyyttien seerumia (KSFM), joka sisälsi 50 mg /ml gentamysiiniä, 0,05 mg /ml naudan aivolisäkeuutetta (BPE) ja 5 ng /ml epidermaalista kasvutekijää (Invitrogen) 37 ° C: ssa, 5% CO

2. Kaikki soluja pidettiin 60%: sta 80%: n konfluenssiin. PC3-solut eristettiin alun perin eturauhasen selkärangan etäpesäkkeitä, kun taas DU145-solut saatiin eturauhasen aivometastaasi. 22RV1 solut olivat peräisin ihmisen eturauhasen karsinooma epiteelisolulinja peräisin ksenografti, joka on sarjaan kasvatettiin hiirissä, ja RWPE1 solut eristettiin normaalista ihmisen eturauhasen epiteelissä. Soluviljely tarvikkeita ja kanamysiinisulfaattia (61-176-RG) olivat MEDIATECH; SDF1α (300-28A) oli peräisin PeproTech. Seuraavat reagenssit ja ihmisen vasta-aineet olivat peräisin Cell Signaling: 10 x soluhajotuspuskurin (9803), hiiren anti-kani-IgG: llä (5127), anti-CD44 (156-3C11), anti-GFP (2956S) ja anti-G

a i (5290). Anti-CXCR4 (MAB172) oli R TBST: ssä) 30 min. CXCR4 havaittiin hiiren anti-ihmis-CXCR4 monoklonaalinen vasta-aine (R 1:1000), blokkausliuoksessa 30 minuutin ajan RT: ssä. Näytteet pestiin huolellisesti inkubaatioiden välillä, kehitetään diaminobentsidiinillä (Vector Laboratories) ja 3 min ajan huoneenlämpötilassa, ja vastavärjättiin Meyerin hematoksyliinillä käyttäen standarditekniikoita. Negatiivinen kontrolli kudoksen näyte valmistettiin inkuboimalla biotinyloidun affiniteettipuhdistettu vuohen anti-hiiri-IgG (H + L) -vasta-ainetta, vain, kuten edellä on kuvattu. Näytteet analysoitiin ja valokuvattiin Dr. Dezhi Wang [71] Center for Metabolinen luustometastasointia Core Laboratory, UAB School of Medicine, Birmingham, Alabama. Jakauma positiivisten solujen CXCR4 kirjattiin kuvata hajanainen tai paikallinen luonne positiivisten solujen satunnaista (positiivisia soluja 5%); polttoväli (positiivisia soluja 11%, mutta vähemmän kuin 50%); tai hajanainen (positiivisia soluja 50%) mukaan keskimääräinen tiheys positiivisten solujen CXCR4 (DAB värjätty), nähdä selvä ero voimakkuudessa CXCR4 ilmaisun.

Histomophometry mittaus Värjäys intensiteetti varten CXCR4 Eturauhassyöpä kudokset

keskimääräinen tiheys positiivisten solujen (DAB värjätty) mitattiin käyttämällä Bioquant® Image Analysis Software (RtmBometrics) ja Olympus BX51 mikroskooppi, jossa on Q-Imaging kamera. Ohjelmisto analysoi keskimäärin ryhmä pikseleitä ja palautettu data-arvo värin perusteella arvosta pikselien värjätään näytteissä. Kolme satunnainen aloilla eturauhaskudoksiin valittiin suurennoksella (400 x) ja kunkin osan koon perusteella kudoksen. Kussakin satunnainen alueella, nämä solut (ryhmä pikseliä), jotka värjättiin positiivisesti (ruskea) kanssa CXCR4-vasta valittiin kynnystyspiirin työkalu ohjelmiston. Näyte valonlähde tiedetään vaikuttavan tiheyden mittaus; Näin ollen, kaikki osat mitattiin käyttäen samoja tausta toimittaman korjauksen Bioquant.

Solunosafraktiointi

PCa ja normaalissa eturauhasessa epiteelisolut (1 x 10

6) pidettiin seerumin puutteessa 3 t (22RV1 ja RWPE1) tai 24 tuntia (PC3 ja DU145), ennen käsittelemällä SDF1α (100 ng /ul), 30 minuutin ajan. Subsellulaarisista Fraktioinnit suoritettiin kohti valmistajan ohjeiden (Thermo Scientific). Lyhyesti, solut hajotettiin useita puskureita ja sentrifugointivaiheet, jolloin saatiin ei-ydin- osa ja ehjä ydin- pelletti, jonka jälkeen edelleen hajottamalla eristämiseksi tumaproteiineja. Neljäkymmentä sata mikrogrammaa ydin- ja ei-ydin- jakeet erotettiin SDS-PAGE-elektroforeesilla ja siirrettiin PVDF-kalvoille. Expression of CXCR4 tai GFP-CXCR4-fuusioproteiini havaittiin hiiren monoklonaalisella GFP-vasta-ainetta (Santa Cruz, 1:500) tai anti-ihmis-CXCR4-vasta-aine (R pEGFPN1-CXCR4 toimi malli [72]. Eteenpäin ja reverse-alukkeita ja R146A, R148A ja poistetaan NLS oli (Integrated DNA Technologies): (i) R146A: FWD5′-CACGCCACCAACAGTCAGGCACCAAGGAAGCTGTTGGCTG-3 ’, REV 5′-CAGCCAACAGCTTCCTTGGTGCCTGACTGTTGGTGGCGTG-3′; (Ii) R148A: FWD5`-CCAACAGTCAGAGGCCAGCGAAGCTGTTGGCTGAAA-3`, REV 5`-TTTCAGCCAACAGCTTCGCTGGCCTCTGACTGTTGG-3`; ja (iii) NLS poistetaan: FWD5’-CGCCACCAACAGTCAGCTGTTGGCTGAAAAGG-3 ’ja REV5′-CCTTTTCAGCCAACAGCTGACTGTTGGTGGCG-3’. Saatu plasmidit olivat pEGFPN1-CXCR4R146A, pEGFPN1-CXCR4R148A ja pEGFPN1-CXCR4ΔNLS. Positiiviset CXCR4 mutantti kloonit valittiin kanamysiiniä ja puhdistettiin edelleen maxi-prep (Omega Bio-tek). Tarkkuus mutaatiot varmistettiin DNA-sekvensoinnilla ABI 3130 xl Gene Analyzer Sequencer Morehouse School of Medicine, Atlanta, GA.

Transient transfektoinneilla

Transient transfektiot suoritettiin 2 ug väkevää DNA ja jetPRIME® Polypus transfektion kohti valmistajan ohjeiden. Lyhyesti, PC3-soluja inkuboitiin jetPRIME®-DNA-kompleksit 15% FBS /RPMI 4 tuntia, ja elatusaine korvattiin 15% FBS: ää RPMI: ssa vielä 18 tuntia, ennen seerumin nälkään (24 tuntia). Sitten solut otettiin talteen vastaaville kokeita.

Expression of Transportinβ1 (TRN1) B

Serum-ruokittu soluja (5 x 10

6) hoidettiin SDF1α 30 minuuttia ennen sadonkorjuuta 60 ug kokosolulysaateista western blot -analyysillä. Expression of TRN1 havaittiin hiiren monoklonaalisella vasta-aineella (Santa Cruz, 1:1000); α-Tubulin tai β-Actin käytettiin latauskontrollina.

immunosaostus

Yksi milligramma PC3 kokosolulysaateille immunosaostettiin ja CXCR4 (Santa Cruz, 1 ug per 250 ug proteiinia) yön yli 4 ° C: ssa, mitä seurasi inkubointi proteiini A /G Plus-agaroosi-helmiä (Santa Cruz) 2 tunnin ajan 4 ° C: ssa. CXCR4-sitoutuneen agaroosihelmet erotettiin lysaatin joukko 3 pesua PBS: llä ja sentrifugoimalla maksiminopeudella 1 min ajan 4 ° C: ssa. Helmet käsitellä western blot analyysi TRN1 (Santa Cruz, 1:1000) ja myöhemmin uudelleenseulottiin varten CXCR4 kanin anti-CXCR4 (Santa Cruz, 1:500) vasta seurasi inkubointi hiiren anti-kaniinin IgG (Cell Signaling) toissijainen vasta-aine. Kolmekymmentä mikrogrammaa saatu supernatantti inkuboinnin jälkeen agaroosihelmiä myös erotettiin 10% SDS-PAGE, ja käsiteltiin Western blot-analyysi CXCR4 kuvattu luonnehdinta CXCR4-vasta-aine.

Short häiritsevä RNA transfektio

Ohimenevä transfektio TRN1 erityisiä siRNA (Santa Cruz) suoritettiin PC3-soluille, jotka maljattiin lasipeitinlevyille käyttäen JetPRIME®. Lyhyesti, solut (2 x 10

5) maljattiin 35 mm, 6 kuopan astioihin ja transfektoitu 50 nM TRN1-siRNA (Santa Cruz) 15% FBS /RPMI-väliainetta 37 ° C: ssa 5% CO

2: ssa 24 tuntia. Sen jälkeen, transfektoituja soluja pidettiin seerumin puutteessa 24 tunnin ajan, ennen immunosytokemia analyysiä.

immunosaostus G

cci

seerumia soluja (5 x 10

6) olivat käsitelty SDF1α 30 minuuttia ennen sadonkorjuuta varten immunosaostuksella. Lyhyesti, solut pestiin 1 x PBS: ssä ja raaputettiin hellävaraisesti NP-40 lyysipuskuria (1 x PBS, pH 7,4, 0,1% Triton x 100, 0,1% NP40: tä ja 1 x cocktail-estäjä). 30 min jäissä inkuboinnin, lysaattia sentrifugoitiin 600 RCF /5 min /4 ° C). Supernatantti varovasti dekantoitiin, ja ydin- pelletti suspendoitiin uudelleen lyysipuskuriin, 10-kertainen verrattuna ytimet pellettien, ja sonikoitiin jäissä 3 sekuntia. Lysaattia sentrifugoitiin 600 RCF /5 min /4 ° C: ssa, ja 1 mg: n supernatanttia immunosaostettiin ja CXCR4 (hiiren monoklonaalinen, Santa Cruz), yön yli 4 ° C: ssa, mitä seurasi inkubointi proteiini A /G Plus-agaroosi-helmiä ( Santa Cruz) 2 tunnin ajan 4 ° C: ssa. CXCR4-sidottu agaroosihelmet erotettiin lysaatin joukko 3 pesua NP40 lyysipuskuria ja sentrifugoimalla (5000 pm /2 min /RT). Lopullinen pesu oli 1 x PBS. Helmet käsitellä western blot analyysiä ja kalvot koetettiin G

a i (Cell Signaling, 1:1000). Tämän jälkeen blotit uudelleenseulottiin ja CXCR4 kanin anti-CXCR4 (Santa Cruz, 1:500) vasta-aine, jonka jälkeen inkuboitiin hiiren anti-kani-IgG: tä (Cell Signaling) sekundaarisella vasta-aineella. Topoisomerase1 (Santa Cruz) ja anti-CD44 (Cell Signaling) arviointiin käytettiin puhtauden ytimien lysaatit.

intranukleaarinen Kalsium (Ca

2 +) Liikkeelle

seerumia PC3 -soluja (2,5 x 10

5), otettiin talteen, jolloin saatiin ehjänä tumien NP-40 hajotuspuskuria edellä kuvatulla tavalla, ennen kuin määritys suoritetaan kohden valmistajan ohjeiden (Enzo Life Sciences). Lyhyesti, käsittelemätön eristetty tumat suspendoitiin uudelleen 100 ul: aan FluoForte väriaine-loading liuosta (Enzo Life Sciences) 45 min 37 ° C: ssa ja 15 minuuttia huoneenlämmössä, sitten sentrifugoitiin 600 RCF /5 min /RT. Liuokset AMD3100 (100 ng /ul) ja pertussis-toksiini (PTX) (200 ng /ml) valmistettiin kalsiumia, fenolia vapaa RPMI. Tumat näytteet suspensoitiin uudelleen 100 ul: aan AMD3100 ja PTX, jaettiin musta-muurin, kirkas pohja 96-kuoppaiset levyt, ja inkuboitiin 1 h. Seuraavaksi SDF1α lisättiin näytteitä levyt, (lopullinen laimennus 100 ng /ul), ja inkuboitiin 30 minuuttia huoneenlämpötilassa. Intranukleaarinen kalsiumin mobilisaatio määritettiin intensiteetin (lisäys) loisteputki (FluoForte) -bound Ca

2+ mediassa. Tulokset mitattiin mikrolevylukijalla virityksellä 490 nm: ssä ja emissio 525 nm: ssä. Kukin näyte valmistettiin kolmena kappaleena koetta kohti, ja suoritetaan ainakin kolme kertaa.

Tilastollinen analyysi

Tarvittaessa tiedot analysoitiin pariksi opiskelijan t-testiä tai ANOVA käyttämällä GraphPad Prism (GraphPad ) ohjelmisto. P-arvot alle 0,05 pidettiin merkittävinä.

Tulokset

CXCR4 ilmaistaan ​​Nucleus eturauhaskudoksen

Edellinen alueanalyysi CXCR4 ehdotti, että CXCR4 sisältää ydin- kohdistaminen signaali aminohappojen välillä 90-170 [73]. Bioinformatiikan analyysi käyttäen PSORT II NLS ennustaminen ohjelmisto (https://psort.ims.u-tokyo.ac.jp/) paljasti oletetun tumalokalisaatiosekvenssiai-, ”RPRK” [72], [74], [75], [76]: n aminohappojen 146-149 sisällä CXCR4 (taulukko 1). Lisäksi suoritetaan HomoloGene /NCBI-tietokannan etsiminen Maanmittauslaitoksen sisällä CXCR4 paljasti, että ”RPRK” on säilytetty joukossa lajeja, kuten kana, hiiri, simpanssi ja muut (taulukko 2). Lisäksi CXCR4 on havaittu tumaan useita syövän kudoksissa [68], [70]. Näiden tietojen perusteella testasimme CXCR4-proteiinia ei voitu todeta tumassa eturauhasen kudoksiin. Käyttämällä eturauhasen kudosta microarray vaihtelevat normaalista korkealaatuisesta etäpesäkeleesioita, havaitsimme positiivinen immunoreaktiivisuus CXCR4 eturauhasessa. Positiivinen immunoreaktiivisuus havaittiin kuin satunnaista (CXCR4 positiivisia soluja 5%), polttoväli (CXCR4 positiivisia soluja 11%, mutta vähemmän kuin 50%), tai moniin (CXCR4 positiivisia soluja 50%), verrattuna keskimääräiseen koko tiheys positiivisten solujen CXCR4 (DAB värjätty). Näytteitä, joiden immunohistokemiallinen tulokset negatiivinen, heikko tai kohtalainen värjäystä, jossa satunnaista niille keskuksille jakaumia, katsottiin olevan ”matala” ilmaisu, kun taas hajanainen jakaumat värjäytymisen katsottiin olevan ”korkea” lauseke CXCR4. Värjäytymisvoimakkuus oli satunnaista keskeiselle tumassa huono laatu eturauhaskudoksiin (Fig. 1A), kun taas korkea laatu pahanlaatuinen kudosten (Fig. 1A), ovat aiempaa värjäytymisen intensiteettiä ja hajanainen ilmaus CXCR4 koko kudoksen verrattuna huono laatu. Sekä matala ja korkea laatu kasvaimet, murto CXCR4 selvästi yhteistyössä paikallistaa tumaan. Värjäys intensiteetti CXCR4 oli heikko, tai jopa null, normaaleissa kudoksissa (Fig. 1A).

, Ihmisen eturauhasen kudosta array, jotka vaihtelevat normaalista korkealaatuisesta eturauhassyöpä, arvioitiin IHC varten CXCR4 ilmaisun käyttäen standardimenetelmiä. Näytteet arvioitiin suurennos 40X, käyttäen Q-kuvantamiskameraa Olympus BX51 mikroskooppi Bioquant® Image Analysis Software (RtmBometrics). Normaalin eturauhasen kudosten osoitti hieman heikko tai havaitsemattomia ruskea värjäytymistä CXCR4 (positiivisia soluja 5%), ja ei CXCR4 ilmentyminen tumassa. Edustavia huono laatu eturauhasessa (luokka 2, vaihe II, T

2 N

0 M

0, adenokarsinooma) osoitti satunnainen /polttoväli positiivista värjäytymistä varten CXCR4 tumassa (positiivisia soluja 11%, mutta vähemmän kuin 50%), mikä osoittaa alhainen ilmentyminen CXCR4. Edustavia korkealaatuista metastaattinen eturauhasessa (luokka 4, vaihe IV, T

4N

1M

1, adenokarsinooma) osoittivat hajanainen /voimakas värjäytyminen (positiivisia soluja 50%), mikä osoittaa korkea lauseke CXCR4 vuonna ydin. Scale palkki edustaa 50 um.

B

, CXCR4 IgG2B hiiren monoklonaalinen vasta-aine arvioitiin spesifisyys CXCR4-proteiinia Western blot analyysi PC3 (CXCR4 positiivinen) tai 293T (CXCR4 null) solulinjat.

C

, CXCR4-vasta arvioitiin spesifisyys CXCR4 proteiinin immunosaostuksella varten CXCR4 ja western blot analyysiä varten CXCR4.

D

, CXCR4 IgG2B vasta-aine arvioitiin spesifisyys CXCR4 proteiinin immunosaostuksella fibronektiinin IgG2B hiiren monoklonaalinen vasta-aine (jotka eivät liity isotyyppikontrolli) ja western blot analyysi CXCR4; ilmentyminen fibronektiinin proteiinin varmistettiin Western blot -analyysillä. Beta-aktiini käytettiin latauskontrollina.

Olemme raportoineet, että PC3-solut olivat positiivisia ja 293T-soluja null osalta, että CXCR4-proteiinia [21]. Varmistaakseen spesifisyyden CXCR4 monoklonaalinen vasta-aine (MAB172IgG2b) käytetään havaitsemaan sen vastaavan proteiinin tumassa eturauhasen kudosten, me analysoitiin uudelleen PC3 ja 293T varten CXCR4 kanssa CXCR4-aineella (MAB172IgG2b) Western blot analyysi (Fig. 1 B). Samanlainen kuin meidän aiempien tutkimusten, CXCR4 havaittiin PC3 muttei 293T kokosolulysaateista (Fig. 1 B). Myöhemmät analyysi solulysaateista immunosaostuksella MAB172 IgG2b ja sen jälkeen Western blot-analyysi, jossa MAB172 IgG2b havaittu CXCR4 vain PC3 lysaateissa (Fig. 1 C). Edelleen spesifisyyden varmistamiseksi MAB172IgG2b CXCR4, PC3 solulysaatit altistettiin immunosaostukselle fibronektiinin IgG2b, isotyyppikontrolli, jonka jälkeen Western blot-analyysi, jossa MAB172 IgG2b (Fig. 1 D). Fibronektiini ei havaittu IP CXCR4, mutta havaittiin Western blot kanssa fibronektiinin vasta-aineella (Fig. 1 D).

CXCR4 on läsnä Nuclear fraktioita eturauhassyöpäsolujen

Käytimme biokemiallisia fraktiointi vahvistaa ydinvoiman lokalisoinnin CXCR4 havaittu omassa kudosvärjäyksellä. kolmesta itsenäisestä kokeesta. Sun

et al

. Wang

et al

. Olemme myös kiitollisia Drs.