Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

Anterior kaltevuus homologi 2 (AGR2) on toiminnallinen proteiini, joiden kriittiset roolit monia erilaisia ​​biologisia järjestelmiä, mukaan lukien selkärankaisten kudoksen kehittäminen, tulehduksellinen kudosvaurion vastauksia, ja syövän etenemisessä. Kliiniset tutkimukset ovat osoittaneet, että AGR2 proteiini yli-ilmentyy monissa erilaisissa ihmisen syövissä, mukaan lukien karsinoomien, ruokatorven, haima, rinta-, eturauhas-, ja keuhko-, jolloin proteiini mahdollisena syövän biomarkkereiden. Kuitenkin yleinen biokemialliset toiminnot AGR2 ihmissoluissa jäävät määrittämättä, ja viestinvälitystekniikoita joka ajaa AGR2 estävän p53 vielä ole selvästi esitetty. Siksi on hyvin kiinnostavaa kehittää molekyylinäytteitä nimenomaan tunnustaa AGR2 sen havaitseminen ja selvittäminen AGR2 liittyvien molekyylitason mekanismi.

Menetelmät /Principal Havainnot

Kautta helmi-pohjainen ja virtaussytometria seurataan SELEX tekniikka, olemme tunnistaneet joukko DNA aptameereillä jotka voivat sitoutua spesifisesti AGR2 kanssa

K

d

arvot nanomoolialueella jälkeen 14 kierrosta valintoja. Aptameeriin C14B valittiin lisätutkimuksia, koska sen suuri sitoutumisaffiniteetti ja spesifisyys. Optimoitu ja lyhentää C14B1 on erityinen G-rikas ominaisuuksia, ja G-rikas alue tämän sitova motiivi oli lisäksi tunnettu paljastaa molekyylin sisäinen rinnakkain G-Nelivaiheinen by CD-spektroskopialla ja UV-spektroskopialla. Meidän kokeissa vahvisti, että vakaus G-Nelivaiheinen rakenne oli voimakkaasti riippuvainen luonteesta yksiarvoisten ionien ja muodostumista G-Nelivaiheinen rakenne oli myös tärkeää, että sitova kapasiteetti C14B1 kohde. Lisäksi olemme suunnitelleet eräänlainen allosteerisen molekyylin beacon (AMB) koetinta valikoivaa ja herkkä havaitsemiseen AGR2.

Päätelmä /merkitys

Tässä työssä olemme kehittäneet uusia aptameeriin koettimia tietyille tunnustamista AGR2. Rakenteelliset tutkimus ovat tunnistaneet, että sitovaan motiiviin Aptameerin on molekyylin sisäinen yhdensuuntainen G-Nelivaiheinen rakenne ja sen rakenne ja sitoutumisaffiniteetin riippuvat voimakkaasti luonteesta yksiarvoinen ioni. Lisäksi meidän suunnittelu AGR2-AMB, AGR2 voisi olla herkästi ja valikoivasti havaittu. Tämä aptameeriin koetin on suuret mahdollisuudet olla hyödyllinen väline varhaisen diagnoosin ja ennusteen syövän ja perustutkimuksen valaista biokemialliset toiminnot AGR2.

Citation: Wu J, Wang C, Li X, Song Y Wang W, Li C, et ai. (2012) tunnistaminen, karakterisointi ja soveltaminen G-Nelivaiheinen Structured DNA aptameeriin syöpää vastaan ​​biomarkkereiden Protein Anterior Gradient Homologi 2. PLoS ONE 7 (9): e46393. doi: 10,1371 /journal.pone.0046393

Editor: Pierre Busson, Institute of syöpäoppi Gustave Roussy, Ranska

vastaanotettu: 02 kesäkuu 2012; Hyväksytty: 29 elokuu 2012; Julkaistu: 28 syyskuu 2012

Copyright: © Wu et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat National Basic Research Program of China (2010CB732402), National instrumentointi Program (2011YQ03012412), Natural Science Foundation of Fujian varten Distinguished Young Scholars (2010 J06004), ja kansalliset löytynyt edistäminen Talents of Basic Science (J1030415). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

anterior kaltevuus homologi 2 (AGR2) tunnistettiin aluksi erittävä tekijä ilmaistu Etualueella että selkä Ektodermi vuonna Xenopuslaevis alkioiden, jossa oletettiin välittävän erittely dorsoanterior ektodermaalinen kohtalo, erityisesti muodostumiseen sementin rauhanen [1]. Kliiniset tutkimukset ovat lisäksi osoittaneet, että AGR2 proteiini yli-ilmentyy monissa erilaisissa ihmisen syövissä, mukaan lukien karsinoomien, ruokatorven, haima, rinta-, eturauhas-, ja keuhkojen [2] – [6]. Enemmän biologisia tutkimuksia näissä syöpäsolulinjoissa ovat osoittaneet merkittävä rooli AGR2 in kasvaimeen liittyvien reittejä, kuten kasvaimen kasvua, solutransformaatioon, solujen vaeltamiseen, raajan uudistaminen, ja etäpesäkkeiden [5], [7] – [9]. Kuitenkin yleinen biokemialliset toiminnot AGR2 ihmissoluissa jäävät määrittämättä, ja viestinvälitystekniikoita joka ajaa AGR2 estävän p53 vielä ole selvästi ilmi [10]. Siksi kehittäminen molekyyli ligandien nimenomaan tunnustaa AGR2 on suuri merkitys varhaisen diagnoosin ja ennusteen syövän ja perustutkimusta varten selvittää sellaisten biokemiallisten toimintojen AGR2.

Various ligandeja on kehitetty erityisiä molekyyli tunnustamista , kuten pienten molekyylien, vasta-aineita ja peptidejä, [11] – [13]. Viime aikoina toisen tyyppistä molekyyli ligandin, nimeltään aptameerin, on kiinnittänyt paljon huomiota. Aptameerit, yksijuosteiset muunnettuja tai muuntamattomia oligonukleotidit (RNA tai DNA), syntyy kautta

in vitro

valintaprosessissa tai SELEX (Systematic Evolution of Ligands by eksponentiaalinen rikastaminen) korkea sitoutumisaffiniteetti ja spesifisyys kohti määriteltyjä tavoitteita [14 ], [15]. Valittu Aptameerien voi tunnistaa erilaisia ​​tavoitteita, mukaan lukien pienet molekyylit, proteiinit, solujen ja kudosten luottaen niiden monipuolinen tertiaarirakenteisiinsa. Verrattuna vasta, aptameerit on pieni molekyylipaino, nopea kudos levinneisyys, korkea vakaus ja matala immunogenesis [16]. Ne voidaan syntetisoida kemiallisesti edullisia ja helposti muokata eri toimittajille [17]. Lisäksi ne voidaan ligatoida ja /tai vahvistetaan entsyymien

in vitro

[18]. Nämä edut tekevät Aptameerien lupaavia ligandeja lääketieteelliseen ja farmaseuttisen tutkimuksen, kuten lääkekehityksessä, taudin diagnosointiin ja täsmähoitoihin [19].

tarjoamat mahdollisuudet aptameerit ovat valtavat, ja jotkut aptameerejä ovat jo osoittaneet monia tärkeitä sovelluksia in bioanalysisand biolääketieteen [20] – [23]. Erityisesti, useita aptameerejä on tuotettu vastaan ​​syöpään liittyvien proteiinien, kuten PDGF, VEGF, HER3 NFKB, tenaskiini-C, tai PMSA [24] – [26]. Monet aptameric antureita, mittapäät ja määrityksiä on kehitetty, jotta herkkä ja valikoiva havaitseminen näiden syövän biomarkkereiden proteiinit [27]. Esimerkiksi Yang

et al

on raportoitu valoa kytkentä excimer aptameeriin antureista herkille havaitsemiseksi kvantitatiivisesti PDGF solussa media [28]. Kwon

et al

ovat kehittäneet funktionalisoitu polypyrroliin nanoputkien kanssa aptameerin rakentaa VEGF bioanturin [29]. Aptameerejä on myös haettu molekyylikuvantaminen ja

in vivo

kompleksin ominaispiirteitä patogeeninen toimintaa että mukana kasvaimen kasvua tautien varhaisen diagnoosin ja synnyssä mittaus [30] – [33]. Koska tavoitteet Aptameerien voisi olla solunsisäisiä, ekstrasellulaarinen tai solupinnan biomolekyylien erilaisia ​​hoitomenetelmiä on kehitetty käyttäen Aptameerien kuin kohdistaminen reagenssit [34] – [37], joka suuresti laajentaa kohdennetun hoidon. Lisäksi jotkut terapeuttisesti hyödyllisiä aptameerejä on havaittu estävän proteiini-proteiini-vuorovaikutuksia, kuten reseptori-ligandi-vuorovaikutusten ja siten toimivat antagonisteina [38].

Tässä tutkimuksessa käyttäen helmi-pohjainen ja virtaus cytometry seurataan SELEX tekniikkaa, pyrimme saamaan erityisiä aptameerejä on AGR2 ja tutkia heidän rakenne ja mahdolliset toiminta. Helmet-pohjainen SELEX sallittu käyttöön yksinkertainen, mutta tehokas, virtaussytometria-analyysi edistymisen valinnan, välttäen työläs, aikaa vievä ja radioaktiivisen EMSA [39] – [43]. Sen jälkeen kun 14 valintakierroksen olemme tunnistaneet joukko DNA aptameereillä joka sitoutuneena AGR2 kanssa suuret affiniteetit. Rakennetutkimukset yksi Aptameerin sekvenssit, C14B, paljasti molekyylin sisäisen rinnakkain G-Nelivaiheinen, ja sen rakenne ja sitoutumisaffiniteetti AGR2 riippuu K

+ ioni intensiivisesti. Lisäksi suunnittelimme allosteerisessa molekyyli majakka AGR2-AMB perustuu tunnistettu aptameeriin, joka mahdollistaa yksinkertaisen, herkkä ja valikoiva havaitseminen AGR2. Aptameeriä sekvenssit ja AGR2-AMB tässä tutkimuksessa ovat potentiaalisesti hyödyllisiä työkaluja varhaisen diagnoosin ja ennusteen syövän ja perustutkimuksen valaista biokemialliset toiminnot AGR2.

Tulokset ja keskustelu

Selection DNA aptameerit tunnistaa AGR2

tunnistaa aptameerejä vastaan ​​AGR2 rekombinantti AGR2 fuusioitiin glutationi-S-transferaasi (GST) helpottaa kiinnityksen proteiinin kiinteisiin tukiin (Sepharose GSH-helmiä). Saatu AGR2-GST-helmiä käytettiin positiivisena tavoite SELEX kun taas GST-helmiä negatiivisena kontrollina poistamaan ei-spesifinen pinta-sitovia sekvenssejä. Prosessi

in vitro

Sepharose-helmi-pohjainen SELEX on kaavamaisesti esitetty kuviossa 1.

Sepharose-helmiä-pohjainen SELEX-menetelmä proteiinin AGR2, GST-helmiä inkuboitiin ssDNA kirjasto counter-valinta poistaa epäspesifisen sekvenssit. Sitoutumattoman DNA: t inkuboitiin sitten AGR2-GST-helmiä, tavoitteita valinta. Jälkeen ankarasti Pesun AGR2-spesifinen DNA-sekvenssit monistetaan sen jälkeen PCR: llä seuraavalla valintakierroksella, tai kloonausta ja sekvensointia tunnistaa yksittäisiä aptameerit jälkeen virtaussytometria-analyysi.

87-nukleotidin ( 87-nt) yksijuosteisen DNA: n (ssDNA), kirjasto, jossa on 45 satunnaista emästä reunustaa kaksi alukesekvenssit (22-nt ja 20 nt) altistettiin SELEX-menettelyä. Kirjaston sallitaan ensin vuorovaikutuksessa yli negatiivisen kontrollin helmiä, ja vain DNA-sekvenssit, jotka eivät ole sitoutuneet GST-helmet otettiin talteen. Kerätty sekvenssit inkuboitiin sitten AGR2-GST-helmiä. Sen jälkeen tiukka pesu, ne sekvenssit, jotka joko eivät sitoudu tai vain heikosti sitoutuneen kohteena hylättiin. Vain sekvenssit, jotka sitovat voimakkaasti tarpeeksi jäivät helmille, ja helmi-ssDNA kompleksit kerättiin ja monistettiin PCR varten seuraavalla valintakierroksella. Sen jälkeen, kun useita kierroksia valinta, vähennyslaskun prosessin tehokkaasti vähentää DNA-sekvenssit, jotka sitoutunut GST helmiä, kun taas AGR2-spesifisiä aptameerin ehdokkaita vähitellen rikastettu. Eteneminen valintaprosessin seurattiin virtaussytometrialla. Vahvempi sitoutuminen DNA-kirjaston AGR2, sitä enemmän FAM leimatun sekvenssit helmiin sitoutunut, siten korkeampi fluoresenssi-intensiteetti helmien tulisi päästää. Kun yhä useammat valinta syklien, tasainen kasvu fluoresenssin intensiteetistä kohde helmien havaittiin (kuva 2a). Sitoutumisaffmiteettia rikastetun kirjaston sen jälkeen 14 valintakierroksen määritettiin olevan nanomoolialueella (K

d = 64,1 ± 5,4 nM), kun taas ei ollut havaittavissa sitovaa kirjaston ohjata helmiä (kuva 2b). Nämä tulokset viittaavat siihen, että DNA-aptameerit spesifisesti tunnistamaan AGR2 rikastettiin valintaprosessin aikana.

a) Virtaussytometria määrityksessä seurata sitova valitun uima-allas AGR2 (kohdeproteiinin) ja GST (kontrolliproteiini). Punainen käyrä edustaa tausta sitova Valikoitumattomien kirjasto. Sillä kohdeproteiinin AGR2, lisääntyi sitoutumisessa kapasiteetin pooliin valinnassa edistyi, kun taas ei ollut havaittavissa muutosta valvontaa GST. Lopullinen pitoisuus valitun altaan sitomispuskuriin oli 100 nM. b) määrittäminen dissosiaatiovakio rikastetun kirjaston ja valitsemattomat kirjasto AGR2. c) Fluoresenssimittaukset määrittää dissosiaatiovakio valitun aptameerin C14B. Kaksi negatiiviset kontrollit, GST-helmiä ja GSH-helmiä, tehtiin. Tiedot olivat keskimäärin kolmen rinnakkaisen kokeen tuloksia.

karakterisointi valitun aptameerin sekvenssien

jälkeen 14 valintakierroksen rikastetun DNA-poolin kloonattiin ja sekvensoitiin. Sekvensointi tiedot kloonit analysoitiin käyttämällä sekvenssianalyysi ohjelmistoa ClustalW 6.0 [44]. Sekvenssit ryhmiteltiin, joka perustuu homologia samankaltaisuutta DNA-sekvenssien yksittäisten klooni. Niistä sekvenssien 62 klooneista oli kaksi alaperheeseen, joista kukin sisältää useita sekvenssejä, joilla on yhteisiä piirteitä. Yksi subfamily on guanosiini-rikas sekvenssit (22 kloonia), ja toinen on tymiini-rikas sekvenssit (40 kloonia) (Kuva S1). Neljä sekvenssit valittiin ja syntetisoitiin edelleen karakterisointia (taulukko S1): kolme sekvenssejä G-rikas alaperheen, C14A (ilmestyi 2 kertaa), C14B (ilmestyi 3 kertaa) ja C14C (ilmestyi 5 kertaa), ja yksi sekvenssi, C14D (ilmestyi 2 kertaa) T-rikas subfamily. Vain yksi T-rikas sekvenssi valittiin, koska T-rikas sekvenssit ovat yleensä ei-jäykkiä tertiäärirakenteita ja mahdollisuus olla aptameerin ajateltiin olevan hyvin pieni. Kuten on esitetty kuviossa 2c, C14B voi sitoutua AGR2, jolla on korkein affiniteetti (

K

d

= 13,1 ± 7,2 nM). Titraamista C14B GST-helmet eivät paljastaneet havaittavaa sitovia, vahvistetaan, että sitova tavoite C14B oli todellakin AGR2. Muut kolme sekvenssiä ovat samanlaisia ​​sitovia vakioita AGR2 mutta hieman heikompi kuin C14B, jossa

K

d

ja C14A on 20,9 ± 5,2 nM, C14C on 44,6 ± 7,0 nM ja C14D on 48,4 ± 15,6 nM. (Kuva S2).

Sequence optimointi Aptameerin C14B

Koska C14B on paras aptameeriin me saadaan neljässä jaksossa testattu, se oli Choses tulevaa optimointia ja karakterisointia. Pituus C14B on 87mer, joka on epäedullista tulevaisuuden sovelluksiin, koska se on hankalaa ja kallista syntetisoida niin pitkä sarja. Tunnistaa sitova alue aptameerin, marginaalinen sekvenssit C14Bwas vähitellen katkaistu. Kaksi katkaistun sequencesC14B0 ja C14B1 päässä C14B on esitetty taulukossa 1. Sen jälkeen sitoutumisaffiniteetti kokeet osoittivat, että molemmat C14B0 (8,5 ± 3,6 nM) ja C14B1 (19,1 ± 5,1 nM) on samanlainen

K

d

on AGR2 kuin alkuperäisen C14B (13,1 ± 7,2 nM). Suurin osa poistetaan sekvenssit olivat alukesekvenssejä, mikä tarkoittaa, että sitova alue aptameerin oli keskellä satunnaisjono ja alukesekvenssit ei ole tai vaikutus on pieni sitoutumisaffiniteetti aptameerin. C14B1 on viisi annosta poly-G ja suunnittelimme viisi typistettyjä sekvenssejä poistamalla yksi poly-G osan kutakin (taulukko S2). Poistetaan kaikki poly-G osan tuhoaisi sen sitoutumisaffiniteetti jossain määrin (kuva S3), mikä viittaa koko G-motiivi tarvitaan aptameeriin sitovia. Ottaen Yhdessä nämä tulokset osoittavat, että C14B1, joka oli vain 33 mer, oli olennaisen sitovan alueen AGR2. Siten C14B1 haettiin lisäkarakterisointia ja sondirakenne.

valikoivuus Aptameerin C14B1

Osoittaakseen erityistä vuorovaikutusta AGR2 ja C14B1, kolme ohjaus proteiineja BSA, trombiinin ja trypsiini kytkettiin NHS-Sepharose-helmiä ja sitten inkuboitiin C14B1. Kuten kuviossa 3 on esitetty, C14B1 voisi sitoutua kohdistaa AGR2 voimakkaasti, kun taas ei ollut mitään tai vähän sitoutumisaffiniteetti kohti trombiinin, BSA: ta ja trypsiiniä, osoittaa korkeaa selektiivisyyttä aptameerin.

signaali-tausta-suhde (SBR) on määritelty fluoresenssisignaali suhde FAM-leimatun aptameerin FAM-leimatun satunnaisessa järjestyksessä, kun hoidetaan proteiinin modifioitu helmiä. Tiedot olivat keskiarvoa kolmena kokeilun tulokset.

aptameeriin C14B1 on Intramolecular Parallel G-Nelivaiheinen

Lisäksi tutkimus paljasti, että C14B1 on useita osuuksilla guaniinit (CGGGTGGGAGTTGTGGGGGGGGGTGGGAGGGT). On hyvin tiedossa, että guaniini-rikas sekvenssit voidaan taittaa neljään-stranded toissijaisia ​​rakenteita kutsutaan kvadrupleksien. Mukaan G-Nelivaiheinen ennustuksen kaava d (G

3 + N

1-7G

3 + N

1-7G

3 + N

1-7G

3 +) [45], C14B1 oli suuri todennäköisyys muodostaa G-Nelivaiheinen rakenne. G-Nelivaiheinen, tasomaista neliön järjestely neljä guaniinit (tetrad) stabiloidaan Hoogsteenin vetysidoksen. Suunnasta riippuen säikeiden tai osia juosteen, jotka muodostavat tetrads, rakenteita voidaan kuvata rinnakkain tai antiparallel. Lisäksi nämä kvadrupleksien voivat muodostaa kautta molekyylien yhdistyksen neljä tai kahden DNA-molekyylin, tai molekyylinsisäinen laskostuminen yhden lohkon, joka sisältää neljä lohkoa guaniinit [46] CD kokeet suoritettiin tutkimaan sekundaarirakenteen aptamerC14B1. CD spektri C14B1 negatiivisesti huippu lähellä 240 nm ja positiivinen huippu lähellä 260 nm, joka on tyypillinen spektri rinnakkaisen G-Nelivaiheinen [47]. Sen tutkimiseksi, onko C14B1 muodostaa molekyylien välisiä 4 kerrattu tai molekyylin sisäisiä yksijuosteinen G-Nelivaiheinen rakenne, riippuvuus sulamislämpötilan pitoisuudesta C14B1 tutkittiin [48]. Sulamislämpötila C14B1 havaittiin olevan 59 ° C, joka on itsenäinen suhteessa oligonukleotidin konsentraatio (kuvio S4), joka osoittaa, että aptameerin muodostaa molekyylin sisäisen G-Nelivaiheinen.

sitoutumisaffiniteetti ja rakenne Vakaus C14B1 on K

+ Dependent

Monet DNA-aptameerejä on havaittu muodostavan G-Nelivaiheinen rakenteita [49] – [51]. Se on vakiintunut, että olemassaolo monovalentin kationin (erityisesti kalium) keskellä näiden tetrads voi merkittävästi vakauttaa G-kvadrupleksien [52] – [54]. Siten tutkimme miten kationin vaikuttaisi rakenteelliseen vakauteen C14B1 ja sen sitoutumisen aktiivisuutta ja AGR2. Kuten kuviossa 4a on esitetty, vakautta C14B1 G-Nelivaiheinen rakenne on voimakkaasti riippuvainen läsnä ollessa yksiarvoinen ioni. 60 mM KCI, vahva CD piikkejä havaittiin, mikä viittaa muodostumista vakaa G-Nelivaiheinen rakenne. Korvaaminen KCI samalla LiCl-pitoisuus, NaCl, ja MgCl

2 johti dramaattiseen intensiteetin laskua CD.

a) CD spektrit Aptameerin C14B1 läsnäollessa eri kationien. Tämä aptameeriin positiivisesti bändi lähellä 260 nm, joka voidaan liittää rinnakkain Nelivaiheinen rakenteita. b) rakenteellinen vakaus Aptameerin nojaa vahvasti [K

+]. c) Fluoresoiva signaali kulkeutumista C14B1 sitoutumisen AGR2-helmiä eri pitoisuutena K

+ tutkittiin. d) sitova vakioita C14B1 puskuriin w /ja w /o K

+. Tiedot olivat keskiarvoa kolmena kokeilun tulokset.

lisäksi tutkittiin vaikutusta K

+ keskittyminen vakauteen G-Nelivaiheinen. Kuviossa 4b, lisäämällä 0,1 mM K

+ fosfaattipuskurissa kasvanut dramaattisesti CD intensiteetti 240 ja 260 nm. CD imeytyminen voimakkuus parannettu kasvu K

+ keskittyminen ja saavutti tasanteen kun K

+ pitoisuus oli suurempi kuin 20 mM. Affiniteetti C14B1 eri pitoisuuksilla K

+ tutkittiin myös. Kuten virtaussytometrillä tulokset on esitetty kuviossa 4c, hyvin heikko sitoutuminen C14B1 kohti AGR2-helmiä havaittiin, kun ei ollut K

+ puskuriin, ja sitoutumisaffiniteetti piti lisätä lisäämällä K

+. Sitova vakioita C14B1 mitattiin ja verrattiin läsnä ollessa tai poissa ollessa K

+ (kuvio 4d).

K

d

arvo läsnäollessa K

+ määritettiin 6,2 ± 1,9 nM. Tulokset osoittivat, että muodostuu G-Nelivaiheinen on tärkeää sitovaa kykyä aptameerin C14B1 sen tavoite, joka on erittäin K

+ riippuvainen.

allosteric molekyylimajakat havaitsemiseksi AGR2

kliiniset tutkimukset ovat jo osoittaneet, että AGR2 proteiini yli-ilmentyy monissa erilaisissa ihmisen syövissä. Herkkä ja selektiivinen havaitseminen AGR2 on siis erittäin tärkeää varhaisen syövän diagnostiikassa. Tässä soveltamalla valitun ja optimoitu aptameeriin C14B1, me suunniteltu ja kehitetty allosteerisessa molekyylimajakka- vastaan ​​AGR2, nimeltään AGR2-AMB, joka muuntaa molekyyli tunnustamista omaisuutta aptameerin fluoresenssin virtaussytometrialla signaali AGR2 tunteva [55]. Kuvio 5 havainnollistaa toimintaperiaate AGR2-AMB. AGR2-AMB on ssDNA, joka koostuu streptavidiini (SA) aptameerin sekvenssin [56], joka on C14B1 sekvenssi, lyhyt sekvenssi sisältyy pieni osa SA aptameerin sekvenssin, ja fluorofori. Vakaa hiusneularakenne muodostetaan molekyylinsisäinen hybridisaation SA aptameeri sekvenssin ja komplementaarisen sekvenssin, tilapäisesti käytöstä anturin kykyä sitoutua SA helmiä. Näin ollen, kun inkuboidaan SA helmiä, ei koetin voi sitoutua SA helmiä, ja helmiä näyttää hyvin pieni fluoresenssi. Läsnä ollessa AGR2 kuitenkin C14B1 sekvenssi silmukan AMB sitoutuu kohdesekvenssiin, mikä puolestaan ​​häiritsee hiusneularakenteen vapauttaa SA sitovan sekvenssin, siten aktivoimaan anturin sitoutumisaffiniteetti SA helmiä. Siten AGR2 sidottu koetin sitoutuu SA helmiä, joka fluoresoi voimakkaasti, koska anturi on FAM leimattu. Target molekyylejä voidaan havaita ja kvantifioidaan lukemalla fluoresenssin voimakkuutta SA helmiä kautta virtaussytometrin.

Suunnittelimme AGR2-AMB, jossa on seuraava sekvenssi: CGACGCACCGATCGCAGGTTCGGGATTTTCGGGTGGGAGTTGTGGGGGGGGGTGGGAGGGTT-FAM, jossa AGR2 sitova alue on alleviivattu ja SA aptameeriin sekvenssi on lihavoitu. Stabiili hiusneularakenne muodostetaan molekyylin sisäisen hybridisaatiolla (kuvio S5). Meidän kokeessa, kun vain AGR2-AMB inkuboitiin SA helmiä, ei koetin voi sitoutua SA helmiä, ja helmiä fluoresoi hyvin heikosti. Läsnä ollessa AGR2 kuitenkin fluoresenssin voimakkuus SA helmiä kasvaa merkittävästi, mikä viittaa siihen sitoutumisen AGR2 sitoutuneen koetin SA helmiä. Lisäyksen kanssa AGR2 pitoisuuden, tasainen kasvu fluoresenssin intensiteetistä kohde helmien havaittiin. AGR2 100 nM konsentraatio voidaan helposti havaita (kuvio 6a). Sarja proteiineja, kuten BSA: ta, trypsiiniä, trombiinia, ja IgG käytettiin kontrolleina (500 nM), ja ilman selkeää fluoresoivat signaalit havaittiin (kuvio 6b), mikä osoittaa erinomaisen spesifisyyden AGR2-AMB kohti kohdemolekyylin. Tulokset osoittivat herkkyys ja spesifisyys allosteerisen koetinta, mikä sen sovellusmahdollisuudet todellisessa analyysissä kuten proteiinien toiminnan tutkimus ja taudin diagnosointiin.

a) vaste AGR2-AMB eri pitoisuuksia AGR2 Tris-HCl-puskuria. b) vaste AGR2-AMB erilaisiin tavoitteisiin kuten AGR2 (100 nM), BSA, IgG, Trypsiini ja trombiini (500 nM kutakin valvontaa proteiinit). Tiedot olivat keskiarvoa kolmena kokeilun tulokset.

Yhteenvetona olemme kehittäneet uusia aptameeriin koettimia tietyille tunnustamista AGR2. SELEX-menetelmä, AGR2-GST fuusioproteiini käytettiin kohdeproteiinin ja jotka liittyvät Sepharose-helmiä kautta lievä, mutta erityisiä, ei-kovalenttisesti GST-Glutathione vuorovaikutusta. Helmet-pohjainen SELEX sallittua käyttöön yksinkertainen, mutta tehokas, virtaussytometria analyysi edistymisen valinnan, välttäen työläs, aikaa vievää ja radioaktiivisen EMSA prosessi. Läpi useita kierroksia valinta GST kontrollina, olemme tunnistaneet Aptameerien selektiivisesti tunnistavat AGR2 nanomolaarisella

K

d

arvoja. CD-mittaukset ja sulamis- lämpötilan määrityksiä osoittivat, että optimaalinen aptameeri C14B1 muodostaa molekyylin sisäisen rinnakkain G-Nelivaiheinen rakenne ja sen rakenne ja sitoutumisaffiniteetin riippuvat voimakkaasti luonteesta yksiarvoinen ioni. Lisäksi meidän suunnittelu AGR2-AMB, AGR2 voisi olla herkästi ja valikoivasti havainnut aptameeriin sekvenssit ja anturien ilmoitetaan tässä on suuret mahdollisuudet olla hyödyllinen väline varhaisen diagnoosin ja ennusteen syövän ja perustutkimuksen valaista biokemialliset toiminnot AGR2.

Materiaalit ja menetelmät

Initial kirjaston suunnittelu

HPLC-puhdistettu kirjasto sisältää keskeinen satunnaistettu sekvenssi 45 nukleotidin reunustaa kaksi 20-nt ja 22-nt pohjamaali hybridisaatio sivustoja. Alkuperäinen kirjasto oli: 5′- TCT CGG ACG CGT GTG GTC GG-N45-C TCG CTG CCT GGC CCT AGA GTG-3 ’, eteenpäin aluke: 5′-FAM-TCT CGG ACG CGT GTG GTC GG-3′, käänteinen aluke : 5’-Biotin-CAC TCT AGG GCC AGG CAG CGA G-3 ’.

valmistaminen AGR2-GST fuusioproteiini

plasmidi pGEX-GST-AGR2 transformoitiin engineering-kannan BL-21 ja GST-merkityn AGR2 ekspressoitiin. Puhdistuksen jälkeen glutationi-Sepharose-helmiä (GE Healthcare) affiniteettikromatografialla, GST-AGR2 fuusioproteiini on sidottu sepharoosipartikkeleihin positiivisen valinnan. Sen jälkeen, kun pestään useita kertoja W1-puskurilla (25 mM Tris-HCI, pH 7,5, 150 mM NaCl, 0,07% β-merkaptoetanolia, 1% Triton X-100), lopullinen puhdistettu AGR2-GST-helmiä säilytettiin steriloitiin PBS-puskurissa. Virtaussytometrianalyysi kanssa TAMRA-leimatun anti-AGR2 monoklonaalinen vasta-aine (Santa Cruz) ja SDS-PAGE osoitti, että GST-AGR2 fuusioitu proteiini onnistuneesti liitetty sefaroosihelmet.

Valinta AGR2 sitovien aptameerien

menettelyjen valinta olivat seuraavat. SsDNA-pooli (200 pmol) liuotetaan sitomispuskuriin (200 ui, 1 x PBS-puskuria, joka sisälsi 137 mM NaCl, 2,7 mM KCI, 10 mM Na

2HPO

4 ja 2,0 mM KH

2PO

4, pH 7,4), denaturoitiin kuumentamalla 95 ° C: ssa 5 minuutin ajan, sitten jäähdytettiin nopeasti jäiden päällä 10 min, ja sen jälkeen inkuboitiin vielä 10 min huoneenlämmössä, ennen kuin sitova. SsDNA-pooli inkuboitiin sitten negatiivinen GST helmiä (1,0 x 10

5 helmiä) varten vastavalinta poistamiseksi sekvenssit epäspesifisesti sitoutuvan GST helmiä. Suodatuksen jälkeen kotitekoinen suodatin sarake, suodos inkuboitiin positiivinen AGR2-GST-helmiä (1,0 x 10

5 helmiä) 37 ° C: ssa 45 min. Sitoutumattoman tai epäspesifisesti sitoutuneen oligoes poistettiin suodattamalla. Sekvenssit sitoutunut kohde-päällystettyjä helmiä monistettiin sitten PCR: llä FAM ja biotiini-leimattuja alukkeita (5-15 sykliä 0,5 min 94 ° C: ssa, 0,5 min 53 ° C: ssa, ja 0,5 min 72 ° C: ssa, minkä jälkeen 5 min 72 ° C: ssa, vaan Easytaq plus-polymeraasilla ja dNTP: t saatiin transgeeniset Beijing). Denaturoinnin jälkeen NaOH (0,1 M), valitun sense ssDNA erotettiin biotinyloitu antisense ssDNA strand streptavidiinipäällystetyille sefaroosihelmet (GE Healthcare) ja käytettiin seuraavan kierroksen valintaa. Ensimmäisen kierroksen valinta, määrä alkuperäisen ssDNA allas oli 5 nmol, liuotetaan 500 ui sidospuskurissa ja vastakkaisella valinnalla askel oli eliminoitu. Hankkia aptameerit suurella affiniteetilla ja spesifisyys, valinta vahvuus parannettiin asteittain lisäämällä määrää pesujen (kolmesta kymmeneen kertaa 200 ui 1 x PBS-puskurilla kukin) ja vähentämällä määrä ssDNA kirjaston per kierros (200 150 pmol).

kloonaus ja DNA-sekvensointi

tuloksena altaalle 14

th kierros PCR-monistettiin, kloonattu ja sekvensoitu (Shanghai Sangon sekvensointi laitos). Tuloksena 62 sekvenssit alistettiin useita sekvenssin rinnastus analyysi käyttämällä ClustalW 6.0 -ohjelmisto löytää erittäin konservoituneiden motiivien ryhmissä valittujen DNA-sekvenssit. Löydetyn konsensus-sekvenssit suurella toistoja keskuudessa valittu altaat sitten kemiallisesti syntetisoitiin lisätestejä.

virtaussytometrianalyysin

Voit seurata rikastamiseen Aptameerien valinnan jälkeen, FAM-leimatun ssDNA-pooli inkuboitiin 5 x 10

4 AGR2-GST-helmiä tai GST-helmiä sitomispuskuriin (200 ui) 37 ° C: ssa 45 min. Helmet pestiin kolme kertaa 200 ui sitomispuskuria suodattamalla, ja suspendoitiin sitoutumispuskuriin (250 ui). Fluoresenssin voimakkuus tuloksena helmien seurattiin FACSAria sytometrillä (Becton Dickinson Immuno cytometry järjestelmät) laskemalla 10000 tapahtumia. Sitoutumisaffiniteettien aptameerit määritettiin inkuboimalla AGR2-GST-helmiä (5 x 10

4) eri pitoisuuksilla FAM-leimatun aptameerit (pre-lämpökäsitelty) sitomispuskuriin (200 ui) 37 ° C: ssa 45 min pimeässä. Helmet pestiin sitten kolme kertaa sitomispuskurilla, sitten suspendoitiin uudelleen sitomispuskuriin (250 ui) ja alistettiin virtaussytometria-analyysi. FAM-leimatun valitsematta ssDNA kirjastoa käytettiin negatiivisena kontrollina epäspesifisen sitoutumisen arviointi. Kaikki sitova kokeet toistettiin kahdesta neljään kertaa. Keskimääräinen fluoresenssi-intensiteetti kohdeproteiinin leimattu aptameerien käytettiin arvioimaan sitoutumisaffiniteetti vähentämällä keskimääräinen fluoresenssi-intensiteetti epäspesifisen sitoutumisen tuottaman valitsemattomat ssDNA kirjasto. Dissosiaatiovakiot (

K

d

) fluoresoivien ligandien saatiin sovittamalla riippuvuus fluoresenssin voimakkuus spesifisen sitoutumisen pitoisuudesta ligandien yhtälön (1): Y = B

maxX /(

K

d

+ X) käyttäen SigmaPlot ohjelmistoa.

Sirkulaaridikroismispektrejä spektroskopia

CD mittaukset suoritettiin Jasco J-810 spektropolarimetrissa varustettu ohjelmoitava lämpötila-ohjausyksikkö (Julabo HP-4). DNA: n pitoisuus näytteissä oli 2 mM. Ennen CD spektrin mittaus, DNA-näytteet hybridisoitiin kuumentamalla 95 ° C: ssa 5 min, minkä jälkeen se jäähdytettiin nopeasti jäissä 10 min, ja inkuboitiin vielä 10 min huoneenlämmössä. Spektrit 400-200 nm saatiin käyttämällä 1 nm raon leveyttä ja 0,1 nm skannaustarkkuutta. Kukin CD-spektri oli keskimäärin 8 skannaa puskurilla taustalla vähennetty.

UV lämpö-denaturaatio kokeilu

UV-absorbanssilla ja sulamisen tutkimuksia tehtiin Agilent 8453 spektrofotometriä varustettu ohjelmoitava lämpötila -Säätimet yksikkö (Agilent 89090A). Sulattamalla lämpötiloissa (T

m) otettiin lämpötilan puoli-dissosiaatio Nelivaiheinen ja saatiin enintään ensimmäinen derivaatta dA /dT koealojen 295 nm: ssä. Lämpökäsitellyn DNA-liuokset useilla pitoisuuksilla vietiin kvartsikyvettiin ja peitettiin ohuella kerroksella silikonia haihtumisen estämiseksi. Optisen reitin pituuden oli 1 cm. Absorbanssi ja lämpötila tallennettiin joka 2 ° C: ssa.

arviointi AGR2-AMB

AGR2-Amb (40 nM) oli hehkutettu kuumentamalla 95 ° C: ssa 5 minuutin ajan 200 ul Tris- HCl-puskuria (25 mM Tris-HCI, 120 mM NaCI, 0,5 mM KCI, 2 mM MgCI

2 pH: ssa 7,4), ja sitten nopeasti jäähdytettiin jäillä 10 min ajan, ja sen jälkeen odottaa vielä 10 min huoneenlämmössä, ennen kuin käyttää. Liuokseen AGR2-AMB, eri pitoisuuksia AGR2 lisättiin ja tuloksena liuosten annettiin inkuboitua 37 ° C: ssa 30 minuutin ajan. Seokseen, 1 ui streptavidiinihelmillä (noin 5 x 10

4 helmiä) lisättiin ja seoksen annettiin kovettua 45 minuutin ajan pimeässä. Pesun jälkeen kahdesti Tris-HCI-puskuria, SA helmet suodatettiin poistamaan sitoutumaton AGR2-AMB ja suspensoitiin Tris-HCl-puskuriliuoksella 250 ui ennen virtaussytometria-analyysi.