Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

seriini /treoniini-kinaasi Aurora-A (Aur-A) on proto-onkoproteiinin yli-ilmennetään monenlaisia ​​ihmisen syövissä. Yliekspressio AUR-A on ajateltu johtuvan geenimonistuksen tai mRNA: n yli-ilmentymisen. On kuitenkin todisteita paljasti, että eroavuudet monistuminen

AUR-A

ja yliekspressio määriä AUR-A mRNA havaittiin rintasyöpä, mahasyöpä, maksasyövän, ja munasarjasyöpä. Huomasimme, että aggressiivinen pään ja kaulan alueen syövät näytteillä yli-ilmentymisen ja vakauttamiseen AUR-proteiini ilman geenimonistuksen tai mRNA yli-ilmentymisen. Tässä testasimme hypoteesin, että poikkeavuus proteiinin tuhoamisesta järjestelmä indusoi kertymistä ja siten yli-ilmentyminen AUR-A syövässä.

Keskeiset havainnot

AUR-A proteiini ubiquitinylated APC

Cdh1 ja näin hajoavat, kun solut poistui mitoosia, ja fosforylaatio AUR-A Ser51 havaittiin mitoosin aikana. Fosforylaatio Aur-A Ser51 esti sen APC

Cdh1 välittämää ubiquitylation ja siitä hajoamista. Mielenkiintoista, konstitutiivinen fosforylaatio Ser51 havaittiin pään ja kaulan alueen syöpä solujen proteiinin yli-ilmentymisen ja vakauttamiseen. Todellakin, fosforylaatio Ser51 havaittiin pään ja kaulan alueen syöpä kudoksiin AUR-proteiini yli-ilmentymisen. Lisäksi AUR-A Ser51 fosfo jäljittelevä mutantti näkyvissä vakauttaminen proteiinin aikana solusyklin etenemisen ja lisääntynyt kyky solutransformaatiota.

Johtopäätökset /merkitys

Yleisesti, tämä Tutkimuksessa nimetään uusi tila aur-A yli-ilmentymisen syöpä fosforylaatio riippuvaisen inhibition sen proteolyysin lisäksi geenimonistukseen ja mRNA yli-ilmentymisen. Ehdotamme, että esto Aur-A fosforylaation voi edustaa uutta tapa vähentää AUR-A tasot syövän hoidossa.

Citation: Kitajima S, Kudo Y, Ogawa I Tatsuka M, Kawai H, Pagano M , et ai. (2007) konstitutiivinen fosforylaatio Aurora-A Ser51 indusoi vakautus- ja seurauksena yli-ilmentyminen in Cancer. PLoS ONE 2 (9): e944. doi: 10,1371 /journal.pone.0000944

Academic Editor: Nils Cordes, Dresdenin teknillinen yliopisto, Saksa

vastaanotettu: 16 kesäkuu 2007; Hyväksytty: 05 syyskuu 2007; Julkaistu: 26 syyskuu 2007

Copyright © 2007 Kitajima et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tutkimus tukivat avustuksia-in-tukea opetus-, tiede- ja Japanin kulttuuri (YK ja TT); avustukset Uehara muistomerkki Foundation (YK) ja myöntää National Institutes of Health (R37-CA76584, R01-GM57587 ja R21-CA125173) (MP).

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä olemassa.

Johdanto

sarja määräajoin kinaasin reaktioita sykliiniriippuvaisten kinaasien (CDK) edistää etenemistä solusyklin [1]. Mitoosi tapahtumia rajuja ja nopeita morfologisia muutoksia myös tiukasti säännelty muiden kinaasien, mukaan lukien Aurora-A, -B ja -C [2]. Seriini /treoniini-kinaasi Aurora-A (Aur-A) on välttämätön mitoosi merkintä, sentrosomimäärän päällekkäisyyksiä, kara muodostumista, kromosomi erottelu ja sytokineesiin [3]. Ihmisen

AUR-A /STK15

sijaitsee kromosomissa 20q13.2, joka on yleisesti monistetaan erilaisten syöpien, kuten rinta-, paksusuoli-, virtsarakko-, munasarja-, haima- ja pään ja kaulan alueen syövät [4] – [9] ja tasot AUR-A mRNA: ta ja proteiinia kasvoi myös niiden kasvainten, [10] – [14]. Niinpä yli-ilmentyminen Aur-A-kinaasiaktiivisuuden on ajateltu edistämään karsinogeneesiin häiritsemällä järjestelmä, jolla varmistetaan ylläpito normaalin sentrosomimäärän tai kromosomiluku, ehkä johtuu arvonalentumisesta sentrosomimäärän tai sentromeeriantigeenin toiminto, sytokineesi tai kara Checkpoint asetuksen [2], [15], [16].

on hyvin tunnettua, että useimmat solusyklin säätimiä hajottaa ubikitiinipromoottori-proteasomin järjestelmä (UPS) [1], [17]. Aur-A myös hajoaa kautta ubikitiinipromoottori ligaasilla APC (anafaasia edistäviä kompleksi) ja sen koaktivaattoria Cdh1 on mukana [18], [19]. Ehdotettu vaatimukset AUR-A ubiquitylation ovat tunnustamista C-terminaalista Destruction box (D-box) by Cdh1 [20] ja lisäksi A-box /DAD motiivin

Xenopus

AUR-A [21], [22]. Lisäksi on ehdotettu, että Ser53 (vastaa Ser51 ihmisen Aur-A) A-box fosforyloituu mitoosin aikana ja että fosforylaatio Ser53 (tai 51 ihmisen) on välttämätöntä mitoosi vakauttamiseen

Xenopus

[23] ja ihmisen AUR-A [24]. Vaikka mitoosi muutos, joka vaikuttaa AUR-A vakauttaminen havaittiin, fysiologista dynamiikkaa ja sen sääntely pysyy puutteellisesti.

Aiemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että taso Aur-proteiini kasvaimissa ei aina korreloi monistaminen

AUR-A

geeni [25], [26]. Olemme myös havainneet, että pään ja kaulan alueen syöpä solulinjoja ilman geenimonistuksen ilmaistu AUR-proteiini korkeammalla tasolla verrattuna niihin geenien monistuminen. Lisäksi tuoreessa tutkimuksessa käyttämällä siirtogeenisen mallin ja peräisin olevat solut on osoittanut, että siirtogeenisiä AUR-proteiini on suojattu UPS välittämän hajoamisen mitoosin aikana [27]. Nämä kumulatiiviset havainnot saivat meidät oletuksen, että poikkeamaa proteiinin tuhoamisesta järjestelmä indusoi kertymistä ja siten yli-ilmentyminen AUR-A syöpä. Tässä osoitamme, että kohonneet AUR-A havaittu pään ja kaulan alueen syöpä solulinjoja syntyvät konstitutiivista fosforylaatiota Ser51 joka estää APC

Cdh1 välittämää ubiquitylation ja peräkkäinen hajoaminen AUR-A.

tulokset

yli-ilmentyminen AUR-A pään ja kaulan alueen syöpä korreloi lasku sen hajoamista

yli-ilmentyminen AUR-A on esitetty monenlaisia ​​ihmisen syövissä. Immunohistokemiallisesti, pään ja kaulan alueen syöpä solut ilmensivät AUR-A korkeammilla tasoilla, verrattuna normaaliin suun epiteelisolujen (kuvio 1A). Tärkeää on, Aur-A yliekspressio korreloi huonon säilymisen pään ja kaulan alueen syöpäpotilasta (täydentävä taulukko, taulukko S1). Koska AUR-A on kartoitettu kromosomiin 20q13.2, joka on alue yleisesti monistettiin epiteelin pahanlaatuisia kasvaimia, yliekspressio AUR-A on ajateltu johtuvan geenin monistuminen ja /tai yli-ilmentymisen mRNA. Kuitenkin olemme huomanneet, että korkea ekspressio AUR-A-proteiini ei johdu pelkästään geenin monistuminen ja mRNA: n ekspression pään ja kaulan alueen syöpä solulinjoissa (kuvio 1 B). Erityisesti, AUR-A-proteiinin ilmentyminen HSC2 ja HSC3 solut oli suurempi kuin HSC4 soluissa, jotka sisältävät sekä geenin monistuminen ja kohonneet mRNA-tasoja. Hoito proteasomi-inhibiittoria, ZLLL, indusoi AUR-A-proteiinin kertymistä HSC4 ja Ca9-22 solut, mutta ei niitä, solulinjoja, jotka osoittavat korkeaa ekspressiota AUR-A (HSC2, HSC3 ja Ho-1-U-1) (kuvio 1C). Lisäksi puoliintumisaika AUR-proteiini oli pidempi HSC2 ja HSC3 soluissa kuin HSC4 soluissa korreloi ilmentynyt AUR-proteiini (kuvio 1 D). Nämä havainnot johtivat meidät hypoteesin, että lisäksi geenimonistukseen tai mRNA yli-ilmentymisen, Aur-A yliekspressio pään ja kaulan alueen syöpä soluja voi johtua vähentynyt proteiinien hajoamista.

V: n immunohistokemiallinen ilmaus Aur-A näytetään normaalissa suun limakalvojen ja pään ja kaulan alueen syöpä. B: Vertailu geenimonistuman, mRNA: n ekspressio ja proteiinien ilmentyminen 6 pään ja kaulan alueen syöpä solulinjoja. Geenin monistuminen ja mRNA: n ilmentymisen aiemmin tutkittu (9). Proteiinin ilmentyminen tutkittiin Western blot -analyysillä. Cul1 ilmentyminen käytettiin latauskontrollina. C: Kertyminen AUR-proteiini by proteasomin estäjä, ZLLL. Syövän soluja käsiteltiin kanssa tai ilman 25 uM ZLLL 6 tuntia. Expression of Aur-A tutkittiin Western blot-analyysi. Cul1 ilmentyminen käytettiin latauskontrollina. D: puoliintumisaika AUR-A syöpäsoluissa. Syöpäsolut käsiteltiin CHX varten ilmoitettuun aikaan. Expression of Aur-A tutkittiin Western blot-analyysi. Aika nollat ​​normalisoitiin yhtä pitkän AUR-A sijasta sama määrä proteiinia otteiden suoraan vertailla kahta puoliintumisajat. Cul1 ilmentyminen käytettiin latauskontrollina.

fosforylaatio AUR-A Ser51 estää APC

Cdh1-välitteinen hajoaminen

AUR-A-proteiinin ilmentyminen huiput mitoosin aikana nisäkäs- solut (täydentävä kuviossa Fig. S1 A ja B). ZLLL indusoi AUR-A kertymistä solut G1 vaiheessa, mutta ei soluissa mitoosin (täydentävä kuva, kuva. S1C). Itse asiassa, proteiini taso AUR-A pienenee myöhään mitoosia seurauksena ubiquitylation välittämän APC: n ja sen koaktivaattoria Cdh1 [20]. Käyttäen kotransfektiokokeissa, olemme huomanneet, että AUR-A-proteiini hajotettiin kautta Cdh1, mutta ei Cdc20 (kuvio 2A), kuten aikaisemmin on raportoitu [18], [19], [23], [24], [28]. Sen sijaan, AUR-B, joka on AUR-A paralogi, ei hajoa joko transfektiolla Cdh1 tai Cdc20 (kuvio 2A). Seuraavaksi tutkimme yksityiskohtaisesti mekanismin APC

Cdh1 välittämää AUR-huonontuminen. Aur-A: lla on neljä otaksuttu D-Box ja yksi KEN ruutuun motiiveja, jotka voitaisiin tunnistaa APC

Cdh1 ubikitiinipromoottori ligaasilla monimutkainen. Vuonna

Xenopus

, N-terminaalissa A-box ja C-pään D-box of AUR-A ovat välttämättömiä sen hajoamiseen [23]. Kaavamainen domeenirakenne ihmisen AUR-A villityypin ja kaksi deleetiomutanttien (An ja ACk) on esitetty kuviossa 2B. Asema kaksi hajoamisen motiivien, A-box ja D-box, on myös merkitty. Villityypin Aur-A hajottavat kotransfektoimalla Cdh1, kun sekä Dn ja ACk AUR-A-mutantit eivät hajota (kuvio 2C). C-päässä D-box mutantti ja A-box mutantti ei myöskään hajoa, mikä osoittaa, että, kuten

Xenopus,

A-box ja D-box motiivit ovat välttämättömiä hajoamista ihmisen Aur-A proteiinia (kuvio 2D).

V: FLAG-merkitty AUR-A ja Xpress-tagged AUR-B kotransfektoitiin tai ilman HA-koodattu Cdc20 tai Cdh1 293T solussa. B: Kaavamainen domeenirakenne AUR-A villityypin (wt) ja kaksi deleetiomutanttien (Dn ja ACk) esitetään. Asema kaksi hajoamisen motiivien, A-box ja D-box, on merkitty. C: AUR-A-An tai -ΔC mutantti kotransfektoitiin Cdh1 293T solussa. D: A-box mutatoitunut (

46RVL

48 – AVA) tai D-box-mutantin (

371RPML

374 – APMA) AUR-A kotransfektoitiin tai ilman Cdh1 . E: Ser51 korvattiin alaniinilla (S51A) tai asparagiinihappoa (S51D). Kukin paino, S51A ja S51D mutantti AUR-A kotransfektoitiin tai ilman Cdh1 tai Cdc20. F: herkkyys ubiquitylation AUR-A wt ja S51 mutantit analysoitiin

in vitro

. APC immunosaostettiin anti-Cdc27 vasta-aineen HeLa solulysaateista suoritettiin

in vitro

ubiquitylation määritys, kuten on kuvattu Materiaalit ja menetelmät. Reaktio lopetettiin 60 min. IVT-AUR-A (nuoli) käytettiin substraattina. ”Aur-A

Ub” ilmaisee ubiquitylated AUR-A.

On raportoitu, että Ser53, Thr295 ja Ser349 AUR-A fosforyloidaan

Xenopus

mitoottisiin otteita [21]. Mielenkiintoista, fosforyloitu Ser53 vuonna

Xenopus

AUR-A estää hajoamista UPS [23]. Olemme tuottaneet fosforylaatio viallisen AUR-mutantti (Ser51 korvattu Ala; S51A) ja fosfo-matkii mutantti (Ser51 korvattu Asp, S51D). Kukin mutantti transfektoitiin soluissa tai ilman Cdh1 tai Cdc20. Villityypin ja S51A mutantti olivat lähes täysin hajonnut, kun kotransfektoitiin Cdh1, kun taas S51D mutantti oli hajonnut vähemmässä määrin (kuvio 2E). Villityypin, S51A ja S51D mutantit eivät hajoa kautta APC

Cdc20 (kuvio 2E). Sen mukaan, mitä löytyy

in vivo

The S51D mutantti vähemmän ubiquitylated

in vitro

APC

Cdh1 (kuvio 2F). Kaiken kaikkiaan nämä tulokset osoittavat, että fosforylaatio Ser51 estää D-box-riippuvainen hajoamista AUR-A esiintyvä G1 soluihin APC

Cdh1.

Aurora-B (Aur-B), joka on paralogi on Aur-A, eroaa lokalisointi ja aktivoinnin ajoitus aikana solukierron välillä Aur-A, vaikka -60% sekvenssi-identiteetti niiden välillä. Vertailu kaavamaisen rakenteen välillä AUR-A ja -B on esitetty kuviossa 3A. Sen Samoin Aur-A, Aur-B on yksi otaksuttu KEN ruutuun neljä D-box ja yksi A-box motiiveja. Kuten on esitetty kuviossa 2A, kuitenkin, AUR-B ei hajoa ilmentäminen rinnakkain joko Cdh1 tai Cdc20. Kohdistus vastaa A-box-motiiviin AUR-A ja -B on esitetty kuviossa 3B. Ser51 in Aur-A vastaa Glu32 in AUR-B. Ajattelimme, että AUR-B ei ehkä hajoa kautta APC

Cdh1 takia Glu32 jäljitteleviä fosforylaation. Tukeakseen Tämän hypoteesin aminohappoa Aur-B A-box mutatoitiin (KEP – PSN, ASN, PSA, KSP, KAP ja PEN) ja transfektoitiin sitten soluissa tai ilman Cdh1 (kuvio 3C). Kaavamaisen sivustoja mutatoidun ja tulokset kotransfektiokokeissa on esitetty kuviossa 3D. Mielenkiintoista, PSN, ASN, PSA, KSP ja KAP mutantit hajosivat, kun taas PEN mutantti ei ollut huonontunut kautta APC

Cdh1. Näin ollen AUR-B näyttää suojattava APC

Cdh1-välitteinen hajoaminen, koska Glu32, joka jäljittelee vaikutus fosforylaation. Yhdessä nämä tulokset viittaavat siihen, että fosforylaatio AUR-A Ser51 tärkeä rooli sääntelyä varten sen vakauden.

V: vertailu kaavamaisen rakenteen välillä AUR-A ja -B näkyy. Aur-B on useita hajoaminen kuviot samoin AUR-A. B: Vastaava aminohapposekvenssi A-box välillä AUR-A ja -B on esitetty. C: Aur-B mutatoitunut aminohappoa A-box (

31KEP

33 – PSN, ASN, PSA, KSP, KAP ja PEN) kotransfektoitiin tai ilman Cdh1. D: Yhteenveto mutatoitunut sivustot ja niiden tulokset esitetään.

Seuraavaksi tutkitaan, onko fosforylaatio Ser51 oli mukana säätelyyn AUR-A ilmaisun aikana solusyklin etenemisen. Keräsimme fosfospesifisiä vasta-ainetta synteettistä peptidiä, joka ulottuu fosforyloitua Ser51 jäännös AUR-A. Tämä vasta-aine tunnistaa spesifisesti villityypin ja S51D mutantin, mutta ei S51A-mutantti (kuvio 4A), mikä osoittaa, että S51D korvaaminen tehokkaasti jäljitellä negatiivinen varaus fosfaatin asennossa 51. fosforylaatio on Ser51 endogeenisen AUR-A havaittiin HeLa-soluissa käsiteltiin nokodatsoli (joka lisää solujen prosenttiosuus mitoosissa), mutta ei niitä, ilman nokodatsoli (kuvio 4B). Yhdeksänkymmentä minuuttia vapautumisen jälkeen mitoosia, Aur-A fosforyloitu Ser51 katosi laskiessa proteiinin taso AUR-A ja fosforyloitiin AUR-A T288 (kuvio 4C). Mielenkiintoista on, että fosforylaatio Ser51 ei havaittu soluissa, jotka on transfektoitu kinaasin inaktiivinen mutantti (K /R, K162R) (kuvio 4D). Kuviossa. 4E, lisääntynyt Ser51 fosforyloituu AUR-A wt jälkeen havaittiin noc /OA hoito, kun taas FLAG-AUR-A K /R-mutantti ei havaittu tai ilman noc /OA hoito. Käytimme okadahapon kuin fosfataasinestäjällä. Käytimme myös nokodatsoli synkronointiin solujen mitoosia kun Ser51 fosforyloituu. Nämä tulokset osoittivat, että kinaasiaktiivisuus AUR-A on välttämätöntä fosforylaatiota Ser51. Havainto, että Ser51 fosforyloituu AUR-A korotettiin PM /OA hoito tukee voimakkaasti viimeisten tietojen mukaan fosforylaatio Ser51 oli dephosphorytated jonka PP2A. Kuitenkin yksityiskohtainen mekanismi fosforylaatio Ser51 on vielä kokeissa.

V: karakterisointi phosopho-spesifistä vasta-ainetta vastaan ​​Ser51 AUR-A. Expression of Ser51 fosforyloitu AUR-A-proteiini tutkitaan immunosaostuksella (IP), jossa on phosopho-spesifistä vasta-ainetta vastaan, Ser51 AUR-A, jota seuraa immunoblottoing (IB) analyysin monoklonaalisen vasta-aineen ja AUR-A wt ja S51 mutantit Aur- transfektoitu 293T-solut. B: n fosforylaatio Ser51 HeLa-soluissa tai ilman Noc hoitoa. C: n fosforylaatio on Ser51 HeLa-soluissa. HeLa-solut vapautettiin Noc aiheuttama prometaphase pidätys ja kerätty ilmoitettu aikoina. Näytteet analysoitiin SDS-PAGE ja sen jälkeen Western blotting, jossa fosfo-S51 AUR-A, AUR-A, fosfo-T288 AUR-A, fosfo-histoni H3 (Ser10) ja Cul1 vasta-aineita (ylempi paneeli). Kuvaaja osoittaa ilmentymistaso Aur-A, fosfo-S51 Aur-A, fosfo-T288 AUR-A ja fosfo-histoni H3 (Ser10) (alempi paneeli). D: n ilmentyminen Ser51 fosforyloitu AUR-proteiini tutkitaan Western blot analyysissä S51D ja K /R (kinaasi inaktiivinen) mutanttien 293T-soluissa. Fosforylaatio Thr288 tutkittiin osoittamaan, että K /R vaikutti kuin hallitseva negatiivinen. E: n ilmentyminen Ser51 fosforyloitu AUR-proteiini tutkitaan Western blot analyysissä paino ja K /R mutantti 293T-solujen nokodatsoli (NOC) ja okadahapon (OA).

Aur-A yliekspressio pään ja kaulan syöpäsolut aiheuttavat konstitutiiviset fosforylaatio Ser51

Kun otetaan huomioon edellä havainnoista, me arveltu, että AUR-A yliekspressio pään ja kaulan alueen syöpä soluja voi johtua stabilointi AUR-proteiini kautta konstitutiivinen fosforylaatio Ser51. Siksi tutkimme asemaa fosforylaatio Ser51 pään ja kaulan alueen syöpä solulinjoja. Fosforylaatio Ser51 havaittu HSC2, HSC3 ja Ho-1-U-1-soluja (kuvio 5A). Kiinnostavaa kyllä, nämä solut ekspressoivat AUR-A-proteiinin korkeammilla tasoilla. Kuitenkin HSC2 ja HSC3 solut eivät osoittaneet geenimonistuksen tai mRNA yli-ilmentymisen. HSC4 soluja, mikä näyttää sekä geenin monistuminen ja korkea mRNA, mutta proteiinin tasot alhaisempi kuin läsnä HSC2 ja HSC3 ei todettu fosforylaatio Ser51. Siksi tila Ser51 tila näyttää vaikuttavan proteiinin ekspressiotasoja. Mielenkiintoista on, että fosforylaatio Ser51 havaittiin myös HSC2, HSC3 ja Ho-1-U-1-soluissa, kun solut synkronoidaan G1 vaiheeseen, mikä viittaa siihen, että Ser51 oli konstitutiivisesti fosforyloitu syöpäsoluissa (kuvio 5B). Lisäksi tutkimme asemaa fosforylaatio Ser51 pään ja kaulan syöpätapausta. Itse asiassa, fosforylaatio Ser51 havaittu 4 9 pään ja kaulan alueen syöpä tapauksissa (kuvio 5C). Kaikki tapaukset, joissa fosforylaatio Ser51 osoitti erittäin ilmentymistä AUR-proteiini.

V: n fosforylaatio on Ser 51 pään ja kaulan syöpäsoluja. Expression of Ser51 fosforyloitu AUR-A-proteiini tutkitaan immunosaostuksella (IP), jossa on phosopho-spesifistä vasta-ainetta vastaan, Ser51 AUR-A, jota seuraa immunoblottoing (IB) analyysin monoklonaalisen vasta-aineen ja AUR-A pään ja kaulan alueen syöpäsoluja. Geenin monistuminen ja mRNA: n ilmentymisen aiemmin tutkittu [9]. B: konstitutiivisen fosforylaatio Ser 51 pään ja kaulan syöpäsoluja. Osoitti syöpäsolun linjat vapautettiin noc aiheuttama prometaphase pidätys ja kerättiin 4 tuntia. Solut olivat miltei täysin irtautunut mitoosin. Expression of Ser51 fosforyloitu AUR-A-proteiini tutkitaan immunosaostuksella (IP), jossa on phosopho-spesifistä vasta-ainetta vastaan, Ser51 AUR-A, jota seuraa immunoblottoing (IB) analyysin monoklonaalisen vasta-aineen ja AUR-A. Cul1 käytettiin lastaus ohjaus ja fosfo-histoni H3 (Ser10) käytettiin markkerina mitoosia. C: n ilmentäminen Ser51 fosforyloitu AUR-A-proteiini tutkitaan immunosaostuksella (IP), jossa on phosopho-spesifistä vasta-ainetta vastaan, Ser51 AUR-A, jota seuraa immunoblottoing (IB) analyysin monoklonaalisen vasta-aineen ja AUR-A soluissa normaalissa suun limakalvon kudosten ja 9 pään ja kaulan alueen syöpä kudoksiin. ß-Actin ilmentymismäärä käytettiin latauskontrollina.

perustamisasiakirjan fosforylaatio Ser51 tehostetun solutransformaatiota

Jotta voitaisiin edelleen arvioida kasvaimen kehittymisen aiheuttama yli-ilmentymisen AUR-proteiini takia fosforylaatio Ser51 teimme vakautta S51D mutantin ja solutransformaatiota verrattuna villin tyypin. Vaikka ekspressio villityypin proteiinin ja S51D mutantti on lähes sama mitoosi solujen S51D mutantti ei ollut huonontunut, kun solut poistuivat mitoosin (kuvio 6A). Lisäksi, puoliintumisajat ja S51D mutantti oli pidempi kuin villityypin, S51A ja K /R-mutantit (kuvio 6B). Siten S51D mutantti ilmennettiin stabiilisti aikana solusyklin etenemisen. Sitten tutkimme vaikutus solutransformaatiota käyttäen BALB /

c

3T3 A31-1-1 soluja (kuvio 6C). Me kotransfektoidaan

AUR-A

ja G12V-

HRAS

(T24-

ras

), ja totesi, että

AUR-A

voimisti taajuus of G12V-

HRAS

n aiheuttamaa muutosta. Mielenkiintoista, paljon suurempi määrä pesäkkeiden havaittiin käyttäen S51D mutantti, mikä viittaa siihen, että konstitutiivinen fosforylaatio Ser51 on parannettu onkogeenista potentiaaleja.

V: muuttaminen paino- ja S51D AUR-A ilmaisun jälkeen nokodatsoli vapautumisen HeLa-soluissa. HeLa-soluja transfektoitiin ohimenevästi paino- ja S51D AUR-A. 48 h jälkeen transfektion solut synkronoitu noc pidätyksestä ja mitoosi shake-off, vapautuu tuoreeseen alustaan, korjattu ilmoitettuina aikoina. Näytteet analysoitiin SDS-PAGE ja sen jälkeen Western blotting FLAG, sykliini-A, P27, fosfo-histoni H3 (Ser10) ja Cul1 vasta-aineita. B: puoliintumisaika wt ja mutanttien (S51A, S51D ja KR) AUR-A 293T-soluissa (vasen paneeli). Soluja käsiteltiin CHX varten ilmoitettuun aikaan. Oikea paneeli esittää AUR-A /Cul1 suhde mitattuna densitometria. C: Effect of S51D mutantti AUR-A ilme solutransformaatiota BALB /

c

3T3 A31-1-1 soluja. FLAG-merkitty wt, S51A ja S51D mutantit AUR-A transfektoitiin tai ilman H-Ras (G12V). Expression of paino-, S51A ja S51D mutantit Aurora-A: n ja H-Ras vahvistaa Western blot -analyysillä (vasen paneeli). 2 viikon kuluttua kulttuurin, astiat kiinnitettiin etanolilla ja värjättiin Giemsa-liuoksella (keskimmäinen paneeli). Kvantifiointi määrä transformoitujen pesäkkeitä määritettynä tavallisilla kriteerit (oikea paneeli). Virhe palkit edustavat sd

Keskustelu

AUR-A-kinaasi liittyy sentrosomimäärän alkaen, kun sentrosomimäärän päällekkäisyyksien kautta mitoottisiin exit ja liittyy myös alueiden mikrotubulushaarojen proksimaalisen että sentrosomien mitoosissa [2]. Somaattisissa soluissa, sekä proteiinin tasot ja kinaasiaktiivisuutta AUR-A huippu mitoosin aikana, ja sitten laskee (täydentävä kuva, kuva S1) [4], [29]. On käynyt ilmi, että AUR-A ubiquitylated APC

Cdh1 ulostulon mitoosin [18], [19], [23], [24], [28]. APC

Cdh1 ubikitiinipromoottori ligaasilla kompleksi tunnistaa proteiinit, jotka sisältävät joko D-Box tai KEN-box motiiveja [30] – [32]. Itse asiassa Aur-A: lla on neljä D-Box ja yksi KEN-box motiiveja. Täällä me vahvisti, että C-terminaali D-box ja N-terminaalin A-box (

47RxLxPSN

52) olivat välttämättömiä hajoamista ihmisen Aur-A, samankaltaisissa Aiempien raporttien [20] – [ ,,,0],22]. Lisäksi

Xenopus

Ser53 sisällä A-box fosforyloituu mitoosin aikana ja että fosforyloitu Ser53 (tai 51 ihmisen) on välttämätön mitoosi erityisiä vakauttaminen [23], [24]. Olemme myös havainneet, että Ser51 fosforylaatio esti APC

Cdh1 välittämän hajoamisen. Kuten kuviossa 3A, Aur-B on myös neljä D-Box, yksi KEN-box motiiveja ja vastaavat A-box-sekvenssit AUR-A. Vaikka se on viime aikoina raportoitu, että proteiinin taso AUR-B ohjataan myös APC

Cdh1 [33], [34], tutkimuksessamme, Aur-B-ilmentymisen määrä ei muuttunut, kun kotransfektion Cdh1 (kuva 2A). Mielenkiintoista, Aur-B E32A ja E32S mutantit (Glu32 vastaavat Ser51 AUR-A) on hajoa APC

Cdh1 (kuvio 3C ja D), mikä viittaa vahvasti siihen, että AUR-B ei saa hajota, koska fosforylaation jäljitteleviä at Glu32 . Kaiken kaikkiaan mukaan fosforylaatio Ser51 tärkeä rooli stabilointiin AUR-proteiini. Mielenkiintoista, fosforylaatio Ser51 ei havaittu kinaasi aktiivinen mutantti, mikä viittaa siihen, että Ser51 fosforylaatio voidaan säädellä ainakin Thr288 fosforylaation (kuvio 4D ja E). Ser51 fosforylaatio havaittiin mitoosin ja katosi ennen vähentämällä proteiinin taso AUR-A (kuvio 4C). Siksi ehdotamme, että Ser51 fosforylaatio voi ohjata vakautta Aur-proteiini tason ja de-fosforylaation Ser51 voi olla laukaista AUR-huonontuminen. Kiinnostavaa kyllä, se viime aikoina on raportoitu, että proteiini fosfataasi PP2A ja AUR-A co-paikallistaa solussa pylväät mitoosin aikana [35]. Huomasimme, että Ser51 fosforylaatio AUR-A indusoitiin jälkeen 2h PP2A estäjähoidon HeLa-soluissa (S. Kitajima ja Y. Kudo julkaisematon data). Nämä havainnot viittaavat vahvasti siihen, että PP2A voi ohjata AUR-A hajoamista de-fosforyloivaa Ser51. Lisäksi on tunnettua, että viat PP2A fosfataasin havaittiin joidenkin syöpien ja useita PP2A: n estäjät voivat aiheuttaa pahanlaatuisia muutos [36]. Nämä havainnot saivat meidät oletuksen, että häiriö on PP2A voi aiheuttaa konstitutiivisen fosforylaatio Ser51 AUR-A syöpäsoluissa. Siksi tutkimme asemaa PP2A ja korreloi AUR-A Ser51 fosforylaation tilaansa pään ja kaulan alueen syöpä solulinjoja. Kuitenkin PP2A ekspressiota ei korreloi Ser51 fosforylaatiotilaa syöpäsolulinjoissa (täydentävä kuviossa Fig. S2). Lisäksi olemme tutkineet mutaation analyysi

PPP2R1B

-geeni, joka koodaa beeta-isoformin A-alayksikön PP2A.

PPP2R1B

tunnistettiin otaksutun ihmisen tuumorisuppressorigeenin ja mutaatio

PPP2R1B

havaittiin keuhkojen ja paksusuolen syövissä [37]. Emme voineet havaita mitään mutaatiota

PPP2R1B

geenin pään ja kaulan alueen syöpä solulinjoissa (tuloksia ei esitetty). Valitettavasti emme löytäneet mahdollisia korrelaatio PP2A ja AUR-A Ser51 fosforylaatiotilaa syövässä. Osoittaakseen korrelaatio PP2A ja AUR-A Ser51 fosforylaation tila on vielä kokeissa.

Samoin kuin AUR-Asetus fosforylaation, Cdc6 on suojattu APC-deirected hajoamista nojalla se fosforylaation [38]. Fosforyloitua sivustoja Cdc6 by sykliini E-CDK2 sijaitsevat suoraan vieressä D-box, ja siksi estää tunnustamista Cdc6 APC

Cdh1. Kun kyseessä on Aur-A, Ser51 sijaitsee kaukana D-box, mutta Ser51 sijaitsee A-box, mikä on myös tärkeää ubiquitylation. Kuitenkin S51D Aur-mutantti sekä paino- ja S51D mutantti voi sitoutua Cdh1 (täydentävä kuva, kuva. S3A). Yllättäen AUR-A sitoutuu Cdh1 ja APC komponentti, Cdc27 M vaiheessa (täydentävä kuviossa Fig. S3B ja C). Kuten

in vitro

ubiquitylation estyi S51D mutantti (kuvio 2G), ehdotamme, että Ser51 fosforylaatio voivat häiritä ubiquitylation prosessia APC

Cdh1. Vaikka rooli APC alayksiköiden substraattitunnistus on enemmän salaperäinen, paitsi vuorovaikutukset substraattien ja yhteistyötä aktivaattorit vaan myös niitä välillä substraattien ja APC näyttävät olevan D-box riippuvainen [39], [40]. Mutaatioanalyysit osoittavat, että Doc1 on olennainen kyky APC ubiquitylate substraatteja prosessoivaan tavalla [41]. Siksi fosforylaatio Ser51 voivat häiritä tunnustaa APC alayksiköiden kuten Doc1, mutta on olemassa useita muita mahdollisuuksia. Selventää mekanismia suojan AUR-huonontuminen fosforylaatio on Ser51 lisätutkimuksia tarvitaan. Lisäksi on mielenkiintoista tutkia, onko vai ei sääntely APC välittämän proteolyysin fosforylaation, kuten todettu AUR-A: n ja Cdc6, on yleinen tapahtuma joukossa muilla pinnoilla.

AUR-A on raportoitu yliekspressoituvan monenlaisia ​​ihmisen syövissä, ja sen yliekspressio indusoi aneuploidian, sentrosomimäärän vahvistusta ja tuumorigeenisia transformaatio viljellyissä ihmisen ja jyrsijän soluja [3] – [5]. Koska AUR-A on kartoitettu kromosomiin 20q13.2, alue yleisesti monistettiin ihmisen syövissä [4] – [6], yliekspressio AUR-A on ajateltu johtuvan geenimonistuksen tai transkriptionaalisen aktivaation. Tässä tutkimuksessa havaittiin, että korkea ekspressio AUR-A-proteiini ei johdu pelkästään geenin monistaminen ja mRNA: n yli-ilmentymisen on pään ja kaulan alueen syöpä solulinjoja. Tätä päätelmää tukee aiempaan toteamukseen monistuminen

AUR-A

havaittiin vain 3%: ssa tapauksista, mutta yli 60%: ssa tapauksista yli-ilmentynyt AUR-A mRNA ja proteiini hepatosellulaarikarsinoomien [42]. Samanlaisia ​​eroavaisuuksia vahvistusta ja yli-ilmentyminen hinnat raportoitiin myös rintasyövän [5], mahasyöpä [26] ja munasarjasyöpä [12]. Tämä ero voi selittyä havaintomme että Ser51 konstitutiivinen fosforylaatio havaittiin pään ja kaulan syöpäsolut yli-ilmentymisen AUR-proteiini. Todellakin, Ser51 fosforylaatio havaittiin myös pään ja kaulan alueen syöpä kudoksiin AUR-proteiini yli-ilmentymisen. Kuten Ser51 fosforylaatio inhiboituu APC

Cdh1-välitteinen hajoaminen, me vahvasti siihen, että konstitutiivinen fosforylaatio Ser51 voi aiheuttaa proteiinin stabiloimiseksi ja sen seurauksena kerääntymisen syöpäsoluja, jotka osoittavat yli-ilmentyminen AUR-A-proteiinia (kuvio 7). Se Äskettäin on paljastunut, että hiiren alkion fibroblastit eivät osoittaneet transformoidun fenotyypin kun AUR-A yliekspressoitui [43], ja että siirtogeenisiä hiiriä, jotka yli-ilmentävät AUR-A ei kehittynyt pahanlaatuinen kasvain [44]. Lisäksi vastaavan proteiinin ei havaittu uutteet, vaikka kohonneen transkriptien AUR-A useissa elimissä siirtogeenisiä hiiriä, ja käsittely siirtogeenisten johdettujen alkion fibroblastien proteasomiestäjät lisääntyi merkittävästi proteiinin taso siirtogeenisten AUR-A [27]. Siksi tukahduttaminen proteiinien hajoaminen voi olla tärkeää AUR-A yli-ilmentymisen ja sen onkogeenista rooli. Cell transformaation AUR-A yliekspressio voi vaatia tukahduttaminen proteiinien hajoamista, eikä muita tekijöitä. Tärkeää on, AUR-A S51D mutantti osoitti huomattavan suuri alttius muunnos (kuvio 6C). Yhteenvetona, suosittelemme, että suojelu sen proteiinin hajoamista konstitutiivisia fosforylaatio Ser51 voivat aiheuttaa AUR-A yliekspressio syövässä, ja että ei-hajottavien AUR-A voi olla vahva onkogeenisia rooleja. Siksi sääntely Aur-A fosforylaation voi olla uusi kohde syövän hoidossa.

aikana mitoosia, Aur-A on fosforyloitu Ser51 normaaleissa soluissa. Tällä mitoosi exit Aur-A on de-fosforyloituu PP2A ja ubiquitylated APC

Cdh1. Toisaalta, AUR-A on konstitutiivisesti fosforyloitu Ser51 syöpäsoluissa. Siksi Aur-A ei voi ubiquitylated ja siten kertynyt syöpäsoluissa.

Materiaalit ja menetelmät

reagenssit ja vasta

Proteasome estäjä ZLLL (Z-Leu -Leu-Leu-CHO) saatiin Peptide institute inc. (Osaka, Japani). Sykloheksimidillä (CHX), nokodatsoli (NOC) ja okadahapon (OA) saatiin Sigma. AUR-A fosfo-Ser51-spesifinen vasta-aine on tuotettu immunisoimalla kaneja synteettisellä peptidillä P * SNSSQRIPC, vastaa aminohappoja 50-59 ihmisen AUR-A: n sekvenssin, jossa on fosfo-Serine asemassa 51 (* S). Vasta-aine puhdistettiin seerumista kaksi kierrosta affiniteettikromatografialla fosfo-Ser51 peptidi sarakkeen seuraa ei-fosfopeptidi sarakkeessa.