Krooninen sairaus

tiivistelmä

G-proteiiniin kytkettyjen reseptorien (GPCR) ovat suurimmat perheen solun pinnan molekyylien on tärkeä rooli /s useissa biologisten ja patologisten prosessien kuten syöpiä. Aikaisemmat tutkimukset ovat korostaneet, miten tärkeää on Wnt7a signaloinnin kautta sen vastaavan reseptorin Frizzled9, GPCR, estymiseen solujen lisääntymisen, ankkurointi riippumattoman kasvun, ja kääntyminen transformoidun fenotyypin ulkopuolisissa pienisoluinen keuhkosyöpä ensisijaisesti aktivointi tuumorisuppressorin, PPARy. Kuitenkin G-proteiini effektorit että pari tähän tärkeään tuumorisuppressoriproteiinia koulutusjakson ei ole tunnistettu, ja ovat mahdollisia terapeuttisia kohteita. Tässä tutkimuksessa, käyttämällä kahta itsenäistä Wnt7a /Frizzled9-specific read-out, tunnistamme G

α16 uutena alavirtavaikuttajainhibiittorit Wnt7a /Frizzled9 signalointia. Mielenkiintoista, G

α16 ilme on vakavasti alassäädetty, sekä lähetti-RNA-tasoihin ja proteiinien tasolla, monet ei pienisoluinen keuhkosyöpä solulinjat. Lisäksi kautta geenispesifiseen knock-alamäkiä ja ilmentyminen GTPaasia puutteelliset lomakkeet (Q212L) G

α16, me myös perustaa G

α16 uutena säädin ei pienisoluisen keuhkosyövän solujen lisääntymistä ja kiinnittymisestä riippumatonta solujen kasvua. Yhdessä meidän tiedot ei ainoastaan ​​vahvistaa, kuinka tärkeää on G

α16 kriittinen alavirtavaikuttajainhibiittorit ei-kanoninen Wnt-signalointireitin, vaan myös mahdollisena terapeuttisena kohteena hoitoon ei-pienisoluinen keuhkosyöpä.

Citation: Avasarala S, Bikkavilli RK, Van Scoyk M, Zhang W, Lapite A, Hostetter L, et al. (2013) heterotrimeeristen G-proteiini, G

α16, on kriittinen alavirtavaikuttajainhibiittorit Non-Canonical Wnt Merkinanto ja voimakas estäjä transformoidun solun kasvu Non pienisoluinen keuhkosyöpä. PLoS ONE 8 (10): e76895. doi: 10,1371 /journal.pone.0076895

Editor: Sumitra Deb, Virginia Commonwealth University, Yhdysvallat

vastaanotettu: toukokuu 29, 2013; Hyväksytty: 28 elokuu 2013; Julkaistu: 18 lokakuu 2013

Tämä on avoin-yhteys artikkeli, vapaa kaikki tekijänoikeudet, ja saa vapaasti jäljentää, levittää, välittää, modifioitu, rakennettu, tai muuten käyttää kuka tahansa laillista tarkoitusta. Teos on saatavilla Creative Commons CC0 public domain omistautumista.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukivat Merit palkinnon US Department of Veterans Affairs, National Institutes of Health (NIH) myöntää R01CA1385282522717 ja 5R21CA153268- 02 RAW. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Co-kirjailija, tohtori Robert Winn on PLoS One Editorial hallituksen jäsen. Tämä ei muuta tekijöiden noudattaminen kaikki PLoS ONE politiikan tietojen jakamista ja materiaaleja. Kirjoittajat ilmoittavat, että ei kilpailevia etuja olemassa.

Johdanto

Wnts erittyy glykoproteiineja, jotka transduce avain signaalitransduktiotapahtumien että kriittisiä rooleja ei ainoastaan ​​nisäkkäiden kehityksen mutta myös monien ihmisten sairauksia [1 ]. Wnts sitoutuvat Frizzled-reseptorien (Fzds), ja aktivoi joko kanonisen tai β-kateniinin riippuvaisen reitin tai ei-kanoninen tai β-kateniinin riippumattomia reittejä kautta c-Jun N-terminaalisen kinaasin (JNK), p38 mitogeeni aktivoitu proteiinikinaasi (MAPK ) kautta tai peroksisomiproliferaattoreilla aktivoituvan reseptorin γ väyliä (PPARy) [2] – [7]. Poikkeava aktivaatio Wnt signalointia on liitetty moniin sairauksiin, mukaan lukien syöpä [1], [8]. Olemme aikaisemmin havainneet, että Wnt7a katoaa ei-pienisoluisen keuhkosyövässä (NSCLC) [5], [6], ja palauttaminen Wnt7a signaloinnin NSCLC solulinjoissa johtaa käänteinen transformoidun fenotyypin [6], paljastus Wnt7a signalointi kuin novel tuumoria tukahduttavan väylän keuhkosyöpä. Kuitenkin mekanismi Wnt7a signaalinvälityksessä solukalvon sytoplasmaan ja tumaan jää suurelta osin tuntemattomia.

superperheen G-proteiiniin kytkettyjen reseptorien (GPCR: t) on suurin tunnettu perheen proteiinien nisäkkään genomissa [9], ja niiden toimintahäiriö liittyy useita yleisiä ihmisen sairauksia. Itse asiassa, kehittyvien kokeelliset ja kliiniset tiedot osoittavat, että GPCR: on ratkaiseva rooli paitsi syövän etenemisen ja etäpesäkkeiden, mutta myös monissa muissa ihmisen sairauksia, mikä GPCR: t suurimmat tavoitteet nykyinen terapeuttisten aineiden [10]. Aikaisemmin on osoitettu, että GPCR: t liittyvät autokriinisen kasvun Small Cell Lung Cancer (SCLC, [11], [12]). Frizzleds oikeutetusti kuuluvat G-proteiiniin kytketty reseptori (GPCR) superperheen kuin ne näytetään seitsemän transmembraanisen domeenin rakennetta, herkkyys pertussistoksiini ja modulaatio solunsisäisen kalsiumin. Kiinnostavaa on kymmenen erilaista Fzds kloonattu tähän mennessä. Vaikka kaikki FZD reseptorit osoittavat samankaltaisia ​​heptahelical rakenne, se on edelleen heikko, miten nämä reseptorit signaali eri loppupään efektoreja. Toinen kardinaali ominaisuus GPCR: on, että ne signaloida heterotrimeeristen G-proteiinien [13] – [19], mikä tarkoittaa, että heterotrimeeristen G-proteiinien voisi moduloida vaikutukset Fzds.

Olemme aiemmin osoittaneet, että palauttaminen Wnt7a /Fzd9 signalointia estämällä sekä solujen lisääntymistä ja ankkurista riippumaton kasvu, edistää solujen erilaistumista ja käänteinen transformoidun fenotyypin NSCLC soluissa aktivaation kautta PPARy ja stimulaation E-kadheriinin proteiinit [5], [20]. Kuitenkin G-proteiini /s välittämisessä antituumorigeenisiä rooli Wnt7a /Fzd9 signalointi on edelleen tuntematon. Tässä tutkimuksessa käytimme Wnt7a stimuloiman PPARy ja E-kadheriinin aktivoinnista readouts ja tunnistaa heterotrimeeristen G-proteiini, G

α16, tärkeänä alavirtavaikuttajainhibiittorit Wnt7a /Fzd9 signalointi. Kiinnostavaa kyllä, myös tarkkailla alentunut ilmentyminen G

α16; sekä ote tasolla ja proteiinin tasolla, monissa NSCLC solulinjoissa. Lisäksi käyttäen geeniä erityisiä knock alamäkiä ja ilmentymistä konstitutiivisesti aktiivisia mutantteja G-proteiinien, myös osoittaa, että G

α16 on kriittinen Wnt7a /Fzd9 estoa transformoitujen kasvun NSCLC. Lisäksi olemme myös luoda G

α16 uutena välittäjänä Wnt7a /Fzd9 aktivaatio ERK5 ja tumareseptorin kasvaimia estävä PPARy. Yhdessä G

α16 Tässä näkyy olevan uusi säätelijä NSCLC solujen lisääntymisen ja ankkurista riippumaton solujen kasvua.

Tulokset

tunnistaminen heterotrimeeristen G-proteiinien Regulating Wnt7a /Fzd9 signalointi

arvioimiseksi mahdollista osallistumista G-proteiini /s Wnt7a /Fzd9 signalointi, olemme käyttäneet konstitutiivisesti aktiivisen G

α alayksiköistä G-proteiineja, jotka ovat puutteellisia GTPaasi toimintaa, ja tutkittiin niiden vaikutukset kaksi vakiintuneita Wnt7a /Fzd9 riippuvia read-out

nim.

PPAR-riippuvaista geenin transkriptio ja E-kadheriinin-riippuvaista geenin transkription NSCLC solulinjoissa [5], [20]. NSCLC solulinjoja (H157 ja H2122) transfektoitiin väliaikaisesti joko tyhjällä vektorilla tai paneelin konstitutiivisesti aktiivisen G

α alayksiköistä G-proteiinien (G

αi2Q205L, G

αoQ205L, G

αqQ209L , G

αzQ205L, G

α12Q229L, tai G

α16Q212L) yhdessä PPAR-Response Element (RE) lusiferaasireportterilla vektori. Vaikutukset ilmentymisen konstitutiivisesti aktiivisia G-proteiinien PPAR-riippuvaista geenin transkription myöhemmin määritettiin mittaamalla luminesenssi solulysaateissa (Fig. 1A, B). Mielenkiintoista, ilmaus G

α16Q212L, mutta ei G

αi2Q205L, G

αoQ205L, G

αzQ205L, tai G

α12Q229L, johti neljän-kertainen PPAR-RE lusiferaasivaikutusta sekä testatut solulinjat, vaikutus on samanlainen kuin Wnt7a /Fzd9-stimuloitujen PPAR-RE lusiferaasiaktiivisuutta yksinään (Fig. 1A, B). Sillä positiiviset kontrollit, koska, H157 ja H2122-solut ovat vähentyneet tai ei Wnt7a ilmaisu, solut transfektoitiin Wnt7a ekspressioplasmideilla [5], [20]. H157-soluja transfektoitiin lisäksi Fzd9 plasmidilla, koska ne eivät ole ilmaista endogeenista Fzd9 [5], [20]. Oli myös mielenkiintoista huomata, että ilmaisua G

αqQ209L indusoi myös PPAR-RE-lusiferaasivaikutusta,

vaikkakin

tehottomammin kuin G

α16Q212L (Fig. 1A, B). Vaikutukset joko G

α16Q212L tai G

αqQ209L ilmentyminen olivat spesifisiä PPARy aktiivisuutta, mutta ei PPARS toimintaa, koska ilmentyminen G

α16Q212L, G

αqQ209L tai Wnt7a /Fzd9 in H157 ja H2122 ei stimuloida PPARS-RE lusiferaasiaktiivisuuden, erityisen toimittajana PPARS (tuloksia ei ole esitetty). Koska Wnt7a /Fzd9 signalointi ei stimuloida PPARa aktiivisuuden (tuloksia ei ole esitetty), siksi ei ole yrittänyt vaikutusten testaamiseksi G

α16Q212L, G

αqQ209L on PPAR-a aktivointia.

Effects of konstitutiivisesti aktiivinen G

α alayksikön Wnt7a /Fzd9 riippuvia read-out. NSCLC solulinjat, H157 (A) tai H2122 (B) transfektoitiin joko tyhjällä vektorilla, tai konstitutiivisesti aktiivinen G

α alayksiköistä G-proteiinien kanssa PPAR-RE-lusiferaasireportteri ja CMV-β-galaktosidaasi reportteri vektorit. 48 tunnin kuluttua solut hajotettiin ja lusiferaasiaktiivisuudet mitattiin, kuten on kuvattu menetelmät. NSCLC solulinjat, H157 (C) tai H2122 (D) transfektoitiin joko tyhjällä vektorilla, tai konstitutiivisesti aktiivinen G

α alayksiköistä G-proteiinien kanssa E-kadheriinin promoottori-lusiferaasi-reportteri ja CMV-β-galaktosidaasi toimittaja vektoreita. 48 tunnin kuluttua solut hajotettiin ja lusiferaasiaktiivisuudet mitattiin, kuten on kuvattu menetelmät. Luciferase arvot normalisoitiin CMV-β-galaktosidaasi-arvot ja olivat edustettuina kaaviossa. Konstitutiivisesti aktiivinen G

α-alayksikköä aiheuttama pPre riippuvaisen geenin transkription tai E-kadheriinipromoottorin aktiivisuus olivat edustettuina taitteen muutos yli tyhjän vektorin ohjaus. Data edustaa keskiarvoa ± SEM kolmesta erillisestä kokeesta. **,

p

0,01; verrattuna tyhjän vektorin ohjaus.

E-kadheriinin on tunnettu markkeri epiteelisolujen erilaistumisen [21], [22], ja se on aikaisemmin osoitettu olevan tärkeä alavirrassa oleva kohde sekä Wnt7a /Fzd9 signaloinnin ja PPARy ilmaisun NSCLC [6], [23]. Siksi arvioitiin myös vaikutukset konstitutiivisesti aktiivinen G-proteiinien E-kadheriinipromoottorin aktiivisuutta NSCLC soluissa (H157 ja H2122). Samanlainen vaikutus PPAR toimintaan, ilmaus G

α16Q212L aiheuttama vahva kasvu E-kadheriinipromoottorin aktiivisuutta molemmissa testatuissa solulinjoissa verrattuna tyhjän vektorin valvontaa (Fig. 1 C, D). Vaikutukset G

αqQ209L ilme E-kadheriinin promoottorin aktiivisuutta, vaikka merkittäviä, olivat vähemmän tehokkaita kuin G

α16Q212L ilmentymistä (Fig. 1 C, D). Yhdessä nämä tulokset viittaavat vahvasti yhdistys G-proteiinien G

α16 ja G

αq, jossa aktivointi PPARy ja lisääntynyt solujen erilaistumisen, kuten on esitetty lisääntynyt E-kadheriinin ilmentymisen.

G

α16 Expression on menetetty NSCLC

Olemme tunnistaneet G

α16 ja G

αq tärkeinä välittäjinä PPARy ja E-kadheriinin ilmentymisen NSCLC solulinjoissa (Fig. 1). Oli mielenkiintoista panna merkille, että sekä G

α16 ja G

αq kuuluvat Gq perheen G-proteiineja. Koska G

αqQ209L ilmaisu ei vain osoitti tehottomampia vaikuttaa edullisesti PPAR aktiivisuus ja E-kadheriinin ilmentymisen mutta oli myös huono ja epäjohdonmukainen vaikutuksia NSCLC lisääntymistä ja kiinnittymisestä riippumattoman solujen kasvun (dataa ei esitetty), keskityimme arvioinnissa roolin G

α16, mutta ei G

αq. Jotta voidaan vahvistaa mahdollisen roolin G

α16 NSCLC, ensin probed ekspressiotasot G

α16 paneelissa NSCLC solulinjoissa käyttäen kvantitatiivista RT-PCR (qPCR, Fig. 2A). Näitä kokeita varten kokonais-RNA uutettiin ei-transformoitujen keuhkojen keuhkoputken epiteelisoluissa (Beas2B), keuhkon adenokarsinooma (A549, H2122), levyepiteelisyöpä (H157) ja suuri cell carcinoma solulinjoja (H661 ja H1299), käänteistranskriptio ja cDNA myöhemmin käytetään mittaamaan tasoa G

α16 ilmentymistä (Fig. 2A). Mielenkiintoista, G

α16 ilmentyminen oli vakavasti vaimentunut kaikissa NSCLC testatuissa solulinjoissa verrattuna ei-transformoitu keuhkoputken epiteelisolujen linja (Beas2B, Fig. 2A). Olemme myös päättäneet proteiinin tasot G

α16 ei-transformoitujen keuhkojen keuhkoputken epiteelisoluissa (Beas2B) ja NSCLC solulinjoja käyttämällä spesifistä vasta-ainetta G

α16 (Fig. 2B)

. Western blotting NSCLC solulysaateista paljasti täydellinen menetys ilmentymisessä G

α16 (Fig. 2B). Vaikka ei ole havaittavaa mRNA ilmaisun, H157 soluilla jonkin G

α16 proteiinin ilmentymisen. Vain spekulointia, havaittava ilmentyminen G

α16 vuonna H157 saattaa johtua alhaisen proteiinin vaihtuvuus. Päinvastoin, ei-pienisoluisen keuhkosyövän solulinjat ja Beas2B esittänyt vastaavia tasoja G

αo (Fig. 2B), G-proteiini, joka on spesifinen p-kateniinin riippuvainen signalointireitin [2], [24]. Koska Heterotsygotian menetys (LOH) on tärkeä rooli aikana inaktivoitumisen tuumorisuppressorigeeneille (APT), myös etsittiin LOH (segmentoidut genotyyppi intensiteetti) osoitteessa GNA15 /16 lokuksen (G

α16) meidän keuhkosyöpäsolua ratoihin Conan (Copy Number Analysis) työkalun (https://www.sanger.ac.uk/cgi-bin/genetics/CGP/conan/) päässä Sanger Cancer Genome Project. Voisimme havaita LOH vuonna H157, A549, H2122 ja H661. Lisäksi olemme myös etsittiin somaattisten kopioluvun vaihtelut (CNV) at GNA15 /16 lokuksen ihmisen keuhkosyövässä. Tätä tarkoitusta varten, CNV tiedot 493 keuhkojen adenokarsinooma ja 416 keuhkojen okasolusyöpä potilasta ladata Cancer Genome Atlas (TCGA) (https://cancergenome.nih.gov/) Project. Gene-tason kopioluvun arvioita myöhemmin käsitellään käyttäen GISTIC2 [25] ja TCGA Firehose putki. On silmiinpistävää, mutaatio asema GNA15 /16 lokuksessa oli 1,22% ja homotsygoottisia deleetioita ja 53.14% yhden kopion poistot ihmisen keuhkojen adenokarsinooma potilaista ja 0,96% varten homotsygoottisia deleetioita ja 41.34% yhden kopion poistot ihmisen keuhkojen levyepiteelikarsinooma syöpä potilaita. Nämä tiedot tarjoavat lisänäyttöä menetyksestä G

α16 in keuhkosyövässä.

, reaaliaikainen PCR analyysit ilmentymisen G

α16 ei-transformoitu ja NSCLC solulinjoissa. Kokonais-RNA uutettiin ei-transformoitu solulinja (Beas2B) tai NSCLC solulinjoja (H157, H2122, A549, H661 ja H1299) ja G

α16 ilmentyminen kvantifioitiin käyttäen sense: caccacgctagcctggtcatg ja anti-sense: gcgcccttcttgctgccctcggg alukkeita . β-aktiini käytettiin sisäisenä kontrollina normalisointia. Data edustaa keskiarvoa ± SEM kolmesta erillisestä kokeesta suoritettiin kahtena kappaleena.

##,

p

0,01; versus kontrolli (Beas2B). B, Western blot-analyysi G

α16 ilmentymistä ei-transformoitu ja NSCLC solulinjoissa. Yhtä suuret määrät kokosolulysaateille ei-transformoitu solulinja (Beas2B) tai NSCLC solulinjoja (H157, H2122, A549, H661 ja H1299) erotettiin SDS-PAGE-geeleillä, siirrettiin nitroselluloosalle blot-ja ”blotit” olivat myöhemmin koetettiin joko anti-G

α16, anti-G

αo tai anti-β-aktiini-aineita.

rooli G

α16 NSCLC Cell Proliferation ja Anchorage- itsenäinen Cell Growth

Aiemmat tutkimukset ovat osoittaneet merkittävä rooli PPARy NSCLC soluproliferaatioon, muunnettava kasvua, etäpesäkkeitä, ja epiteelin erilaistuminen [23], [26]. Samoin myös vahvistetaan, että on tärkeää Wnt7a /Fzd9 signalointia vähennetään muuttaneet kasvun ja solujen erilaistumista NSCLC vastaan ​​käynnistämällä PPAR [5], [20]. Jos G

α16 on tärkeä välittäjäaine Wnt7a /Fzd9 signalointi, me selvää, että G

α16 voi potentiaalisesti välittävät transformoidun solun kasvua NSCLC. Jotta kuulustella erityistä osallistumista G

α16 NSCLC solujen lisääntymisen ja muuttuu solujen kasvua, käytimme kaksi lähestymistapaa: (1) vaikutukset pienten häiriöiden RNA: iden (siRNA: t) spesifinen G

α16 ja (2) ilmaus konstitutiivisesti aktiivisen G

α16Q212L. Pienet häiriöt RNA: t (siRNA: t) on erityisesti suunnattu joko G

α16 tai G

αo suunniteltiin, testattiin niiden spesifisyys, ja sitten käyttää valikoivasti tukahduttaa G

α16 tai G

αo in Beas2B soluissa. SiRNA reagenssit erikseen vaimentaa joko G

α16 tai G

αo, saavuttaa 70% tai enemmän ilmentyminen vähenee jokaisen proteiinin (Fig. 3A). Salatut siRNA suunnitellut kaupallinen toimittaja testattiin kontrolleina joissakin alaryhmissä; he eivät osoittaneet kykyä tukahduttaa joko G

α16 tai G

αo lauseke (Fig. 3A). Treatment of non-transformoitujen keuhkoputken epiteelisolujen (Beas2B, jossa G

α16 ilmaisu), jossa G

α16-spesifisiä siRNA: ita lisäsi merkittävästi solujen lisääntymistä määritettynä klonogeenisten (Fig. 3B) ja MTS soluproliferaatiomääritykset (Fig. 3C). Vaikka hoito Beas2B solujen G

αo-spesifisiä siRNA: ita, joka on G-proteiini, joka on spesifinen β-kateniinin-riippuvaisen signalointireitin [2], [24], ei ollut lainkaan tai vähäinen vaikutus soluproliferaation taso, vertailu hallita siRNA käsiteltyjä soluja, määritettynä klonogeeniset (Fig. 3B) ja MTS solukasvukokeissa (Fig. 3C), mikä osoittaa tiettyä yhdistys G

α16 ja NSCLC-solujen lisääntymisen. Jos meidän hypoteesi, että G

α16 välittää NSCLC-solujen lisääntymiseen totta, niin ilmaus konstitutiivisesti aktiivinen, GTPaasi puutteellinen (Q212L) mutantin G

α16 NSCLC soluissa tulisi tuottaa tuloksena vähentynyttä solujen lisääntymistä, vaikka puuttuessa Wnt7a. Todellakin, ohimenevä ilmentyminen G

α16Q212L, mutta ei G

αoQ205L, ja H2122-soluissa johti alentuneeseen solujen lisääntymisen määritettynä klonogeenisten (Fig. 3d), MTS soluproliferaatiomääritykset (Fig. 3E), ja /tai 5 päivän solukasvun käyräanalyysi (Fig. 3F). Lisäksi stabiili ilmentyminen G

α16Q212L vuonna H2122 soluissa esti myös kyvyt H2122 solut voivat kasvaa pehmeällä agarilla, joka on

in vitro

mitta solutransformaatioon (Fig. 3G). Näin käyttämällä useita erillisiä ja voimakas määritykset, osoitamme, että G

α16 mutta ei G

αo säätelee NSCLC solujen lisääntymisen ja muuttuu solujen kasvua.

. Beas2B solut transfektoitiin joko ohjaus siRNA tai siRNA spesifinen G

α16 tai G

αo. Kokonais-RNA eristettiin ja analysoitiin ilmentyminen G

α16 tai G

αo käyttämällä kvantitatiivista PCR: ää. Normalisoitu G

α16 tai G

αo mRNA-tasoja kuin β-aktiini-mRNA oli edustettuna kuvaajia.

##,

p

0,01; versus kontrolli siRNA. Beas2B-solut transfektoitiin joko ohjaus siRNA tai siRNA-spesifinen G

α16 tai G

αo ja soluproliferaatiota hinnat myöhemmin määritettiin joko käyttämällä klonogeenisten määritystä (B) tai MTS-määritys (C), kuten on kuvattu menetelmät. Ylempi paneeli edustaa keskiarvo ± SEM kahdesta itsenäisestä erittäin toistettavia kokeita, kun taas edustavat kuvat olivat esillä alemmassa paneelissa. Data edustaa keskiarvo ± SEM kolmesta itsenäisestä hyvin toistettavissa kokeissa. *,

p

0,05; **,

p

0,01; versus kontrolli siRNA. H2122-solut transfektoitiin joko tyhjällä vektorilla tai konstitutiivisesti aktiivinen G

α16Q212L tai G

αoQ205L ekspressiovektorit ja soluproliferaatiota hinnat myöhemmin määritettiin käyttämällä joko klonogeenisten määritys (D), MTS-määritys (E) tai viisi- päivä solujen kasvukäyrän analyysi (F), kuten on kuvattu menetelmät. Ylempi paneeli edustaa keskiarvo ± SEM kahdesta itsenäisestä erittäin toistettavia kokeita, kun taas edustavat kuvat olivat esillä alemmassa paneelissa. Data edustaa keskiarvo ± SEM kolmesta itsenäisestä hyvin toistettavissa kokeissa.

#

p

0,05; G, H2122-soluja transfektoitiin joko tyhjällä vektorilla tai konstitutiivisesti aktiivinen G

α16 Q212L ja kyvyt transfektoidut solut kasvamaan pehmeässä agarissa myöhemmin tutkittiin. Data edustaa keskiarvo ± SEM kolmesta itsenäisestä hyvin toistettavissa kokeissa.

##,

p

0,01; versus tyhjän vektorin ohjaus.

Wnt7a stimuloimaa ERK5 Aktivointi on G

α16 Riippuu

aiemmin havaittu, että ilmentyminen Wnt7a /Fzd9 NSCLC soluissa johtaa vankka aktivointi ERK5 [5]. Seuraavaksi testasimme, jos rekombinantti hWnt7a stimulaatio Beas2B solujen on myös kykenee aktivoimaan ERK5; immunoblottauksella SDS-PAGE-geeli-blotteja spesifisillä vasta-aineilla fosfo-ERK5 (Fig. 4A). Stimulaatio Beas2B viljelmien rWnt7a johti nopeaan aktivointi ERK5 saavutti huippunsa 15 minuutin kuluessa hoidon (Fig. 4A). Selvittääkseen, Wnt7a /ERK5 signalointi toimi kautta G

α16, olemme käyttäneet G

α16 erityisiä siRNA (Fig. 4B). Näissä tutkimuksissa Beas2B solut ko-transfektoitiin G

α16-spesifinen siRNA: t, joko kanssa tai ilman Wnt7a ekspressiovektoreita (Fig. 4B). Mielenkiintoista, hoito G

α16 erityisiä siRNA poisti kyvyn Wnt7a stimuloida ERK5 aktivointi (Fig. 4B). Jos ehtyminen G

α16 voisi estää Wnt7a aktivaatio ERK5, niin ilmaus konstitutiivisesti aktiivisen muodon G

α16 (Q212L) pitäisi indusoida ERK5 aktivointi. Jotta testata tätä hypoteesia, teimme käyttö MEF2-C-riippuvainen lusiferaasireportteri konstrukti [27]. Tämä toimittaja mittaa ERK5 kinaasiaktiivisuutta, koska se on velvoittaa aktivoimiseksi MEF2-C-riippuvaista geenin transkription [27]. Ohimenevä ilmentyminen konstitutiivisesti aktiivisen muodon G

α16Q212L yhdessä MEF2-C-lusiferaasireportteri plasmidien johti voimakkaaseen kasvuun lusiferaasiaktiivisuudet määritetty molemmissa H157 (Fig. 4C) ja H2122 (Fig. 4D) NSCLC solulinjat. Lisäksi G

α16Q212L aiheuttama MEF2-C-riippuvainen lusiferaasiaktiivisuudet olivat herkkiä hoitoon PD98059, joka estää MEK 1, 2, ja 5 (Fig. 4C, D), mutta ei sen MEK1 /2-estäjän U0126 (tuloksia ei ole esitetty), mikä osoittaa spesifisyyden meidän määrityksessä. Yhdessä nämä tiedot selvästi, että G

α16 funktio on kriittinen Wnt7a-välitteisen ERK5 aktivoitumisen.

A, Beas2B soluja seerumia 2-PAGE-geeleissä ja myöhemmin koestettiin ERK5 aktivoinnin koettamalla nitroselluloosa blotit anti-pERK5 vasta-aineet ja normalisoitu yhdenvertaista lastaus testauksella anti-ERK5 vasta-aineita. B, Beas2B solut transfektoitiin joko ohjaus siRNA tai G

α16 erityisiä siRNA: t yhdessä tai ilman Wnt7a ekspressiovektoriin. 48 tunnin kuluttua solut hajotettiin ja analysoitiin ERK5 aktivoinnin koettamalla blotit anti-pERK5 ja ERK5 vasta-aineita. NSCLC solulinjat, H157 (C) tai H2122 (D) transfektoitiin joko tyhjällä vektorilla tai G

α16Q212L yhdessä MEF2-C-riippuvainen lusiferaasireportteri, jota seuraa käsittely joko ilman tai MEK: n estäjä PD98059 (20 pM ). 24 tunnin kuluttua, lysaatit määritettiin lusiferaasiaktiivisuus, kuten on kuvattu menetelmät. Data edustaa keskiarvoa ± SEM kolmesta erillisestä kokeesta. **,

p

0,01; versus tyhjän vektorin ohjaus.

##,

p

0,01; versus G

α16 Q212L.

G

α16 Säätelee Wnt7a stimuloimaa PPARy Activation

Seuraava kuulusteltu jos ehtyminen G

α16 estää myös pitkälle alavirtaan signalointi efektori Wnt7a /Fzd9 signalointi

nim.

PPARy [5]. H157 ja H2122-solut kotransfektoitiin G

α16-spesifinen siRNA: t, joko kanssa tai ilman Wnt7a ekspressiovektoreihin ja PPAR-RE lusiferaasireportteri vektori (Fig. 5A, B). Ehtyminen G

α16, mutta ei G

αo, salvata valikoivasti Wnt7a stimuloimaa PPARy aktivaation molemmissa testatuissa solulinjoissa (Fig. 5A, B). Johdonmukaista vaikutukset G

α16 heikentymisen Wnt7a stimuloimaa PPARy aktivaation, ilmaus konstitutiivisesti aktiivisen G

α16Q212L, mutta ei G

αoQ205L, vuonna H157 tai H2122 solulinjoista aiheuttama vahva kasvu PPARy aktiivisuuden ( kuva 5C, D). Lisäksi G

α16Q212L aiheuttama antiproliferatiivisia vaikutuksia H2122 solujen kasvuun kumottiin myrkytyksessä transfektoitujen solujen kanssa PPARy-estäjä (T007090) sekä H157 (Fig. 5E) ja H2122 solulinjat (Fig. 5F). Nämä tiedot viittaavat vahvasti siihen, että anti-proliferatiiviset vaikutukset G

α16 NSCLC välittyvät ERK5 (Fig. 4) ja PPARy (Fig. 5).

NSCLC solulinjat, H157 (A) tai H2122 (B) transfektoitiin joko ohjaus siRNA tai G

α16 erityisiä siRNA: t yhdessä PPAR-RE-lusiferaasireportteri ja joko ilman tai Wnt7a ekspressiovektorilla. 48 tunnin kuluttua, lysaatit määritettiin lusiferaasiaktiivisuus, kuten on kuvattu menetelmät. Data edustaa keskiarvoa ± SEM kolmesta erillisestä kokeesta. **,

p

0,01; versus tyhjän vektorin ohjaus.

##,

p

0,01; versus Wnt7a. NSCLC solulinjat, H157 (C) tai H2122 (D) transfektoitiin joko tyhjällä vektorilla tai konstitutiivisesti aktiivinen G

α16 Q212L tai G

αo Q205L ekspressiovektorit yhdessä PPAR-RE-lusiferaasireportterilla. 48 tunnin kuluttua, lysaatit määritettiin lusiferaasiaktiivisuus, kuten on kuvattu menetelmät. Data edustaa keskiarvoa ± SEM kolmesta erillisestä kokeesta. **,

p

0,01; versus tyhjän vektorin ohjaus. NSCLC solulinjat, H157 (E) tai H2122 (F) transfektoitiin joko tyhjällä vektorilla tai konstitutiivisesti aktiivinen G

α16Q212L. 24 tunnin kuluttua soluja käsiteltiin joko kanssa tai ilman PPAR inhibiittoria (T0070907, 10 uM) kuten on kuvattu menetelmät. Soluproliferaatiota hinnat myöhemmin määritettiin käyttäen MTS-määritystä, kuten on kuvattu menetelmät. Data edustaa keskiarvo ± SEM kolmesta itsenäisestä hyvin toistettavissa kokeissa.

##,

p

0,01; versus tyhjän vektorin ohjaus. **,

p

0,01; versus G

α16 Q212L + T007090.

Novel Role for ROR1 /2 in Wnt7a /Fzd9 Signaling

On hyvin tunnettua, että aktivoituminen Wnt /β-kateniinin riippuva signalointi vaatii co-reseptorien alhaisen tiheyden lipoproteiinien (LRP5: stä /6) ja G-proteiini, G

αo [24], [28] – [30]. Koska olemme laatineet G

α16 kriittinen välittäjänä Wnt7a /Fzd9 signalointi (Fig. 1, 2, 3,4), me seuraavaksi arvioitu rooli koreseptorit, jos ollenkaan, välittämisessä Wnt7a /Fzd9 signalointia. Näissä tutkimuksissa, H157 ja H1299-solut transfektoitiin joko tyhjällä vektorilla tai Wnt7a ja Fzd9 ilmentämisplasmideja. Mielenkiintoista on, hyvää solulysaateista ilmentävät Wnt7a /Fzd9 paljasti vahvan ekspression lisääntymisen tyrosiinikinaasi-proteiinikinaasin orporeseptoreiksi, ROR1 /2 (Fig. 6A). Hetken koreseptorit kardinaali että Wnt /β-kateniinin riippuvaisen signalointireitin, LRP6 tai sen aktivoitu muoto (fosfori-LRP6-S1490) ei vaikuta (Fig. 6A). Vuonna vahva tuki havaintomme, Wnt7a /Fzd9 signaloinnin myöskään stimuloimaan TOPFLASH toiminnan, Wnt /β-kateniinin-specific read-out (Fig. 6B). Vaikka samanlaisissa olosuhteissa, Wnt7a /Fzd9 stimuloi vankka kasvu PPAR-RE-riippuvaista geenin transkription, odotetusti (Fig. 6C). Yhteensä, nämä tiedot viittaavat siihen, että Wnt7a /Fzd9-signalointireitin, toisin kuin β-kateniinin riippuvaisen signaloinnin mekanismi, voi olla merkki kautta G-proteiinin, G

α16 ja co-reseptorit, ROR1 /2.

, H157 ja H1299 solut joko transfektoitu tyhjällä vektorilla tai Wnt7a ja Fzd9 ekspressiovektorit. Sen jälkeen, kun 48-β-aktiini-vasta-aineita. H157-soluja transfektoitiin joko tyhjällä vektorilla tai Wnt7a ja Fzd9 ekspressiovektorit yhdessä joko M50-TOPFLASH lusiferaasireportteri (B), tai PPAR-RE-lusiferaasireportteri (C). Positiiviset kontrollit, joita käytetään M50-TOPFLASH toimittaja kokeissa on β-kateniinin ekspressiovektoriin ja kun kyseessä ovat PPAR-RE-lusiferaasi-vektori on PPARy-ekspressiovektoriin. 48 tunnin kuluttua, lysaatit määritettiin lusiferaasiaktiivisuus, kuten on kuvattu menetelmät. Data edustaa keskiarvoa ± SEM kolmesta erillisestä kokeesta. **,

p

0,01; versus tyhjän vektorin ohjaus.

Keskustelu

Wnt7a on aiemmin osoitettu olevan välttämättömiä normaalin epiteelin muodostumista ja säilyttää normaali epiteelin fenotyyppi keuhkoissa [31]. Lisäksi Wnt7a ilme on usein menetetään NSCLC [32]. Olemme aiemmin osoittaneet, että uudelleen ilmentäminen Wnt7a päinvastainen solutransformaatioon laski ankkurista riippumaton kasvu, ja indusoi epiteelin erilaistumista in NSCLC soluissa kautta vastaavan reseptorin Fzd9 [5], [20]. Tämä vaikutus välittyy, ainakin osittain, kautta ERK5-riippuvainen aktivaatio PPARy: [5]. Tärkeää on, Wnt7a /Fzd9 ei aktivoi kanoninen Wnt /β-kateniinin signalointireitin. Frizzleds jäsenet GPCR-superperheen [33], ovat monessa maamerkkejä havaittiin lähes kaikissa GPCR: t, mukaan lukien läsnä seitsemän hydrofobista transmembraanisen segmentit ennustetaan muodostavan a-kierteitä, ja kolme intrasellulaarista silmukkaa sekä sytoplasminen häntä [33] , [34]. Huomattavaa on, että Fzds myös raportoitu olevan tiiviisti sovittimen molekyylejä, kuten että β-arrestins, tunnettu sovitin proteiini osallistuu GPCR de-herkistymistä [35] ja sääntelyviranomaisten G-proteiinin signalointi (RGS, [ ,,,0],36]).

G-proteiinit ovat kardinaali GPCR signalointi ja on osoitettu olevan osallisena kanoninen Wnt /β-kateniinin signalointi, ei-kanoninen Wnt /Ca

2 + /cGMP -systeemi ja tasomainen solun polariteetti reittejä [34]. Toistaiseksi G

αo ja G

αq osoitettiin olevan kriittinen aikana nisäkkäiden kehityksen ja teratokarsinooma kantasolujen erilaistumista vastauksena kasvaimia Fzd1 stimulaatio [24]. Kuitenkin kasvaimen suojaava tehtävä G-proteiinien, jos niitä on, ei ole tunnistettu. Esillä olevassa tutkimuksessa olemme tunnistaneet G

αq perheen G-proteiinien uutena alavirran välittäjinä Wnt7a /Fzd9 aktivaatio ERK5 ja tuumorisuppressorigeenin PPARy. Ensimmäistä kertaa, osoitamme, että G

αq perheenjäsenet, erityisesti G

α16, voi aktivoida uusi ei-kanoninen Wnt signalointia. Signalointi cascade alavirtaan G

α proteiineja mukanaan erilaisia ​​ja monimutkaisia ​​kinaasien, jotka johtavat lopulta säänneltyä geenin transkription ja muutoksia solujen fysiologian. Jokainen G

αq perheenjäsen on liitetty säätelemiseksi yhden tai useamman mitogeeniaktivoidun proteiinikinaasin (MAPK) reittejä soluviljelmissä, vaikka tarkkaa mekanismia /s signalointi on edelleen epäselvä. Esillä olevassa tutkimuksessa olemme osoittavat myös, että G

α16 on alavirtavaikuttajainhibiittorit Wnt7a /Fzd9 signaloinnin, joka johtaa aktivaatioon ERK5. Mielenkiintoista, muut tutkimukset ovat osoittaneet, että GPCR: t voivat myös stimuloida ERK5 mekanismien kautta, joissa G

αq ja G

α12 /13 riippumatta Rho, Rac1 ja Cdc42 [37]. Emme kuitenkaan näe mitään aktivoitumista PPARy G

α12 lauseke (Fig. 1). Toistaiseksi G

αq-välitteisen MAPK signalointi on rajoitettu aktivointi JNK1 /2 tai ERK1 /2, mutta ei ERK5. Tässä tutkimuksessa olemme myös osoittavat, että jäsen G

αq perhe, G

α16, uutena säätelijänä ERK5. On tunnettua, että G

αq perhe (G

αq, G

α11, G

α14, G

α15 /16), aktivoituessa, sitoo ja stimuloi PLC-β- välittämä inositolifosfaatin signalointikaskadissa, joka johtaa kalsiumin mobilisaatio ja PKC-a-aktivaation kautta fosfolipidin fosfatidyyli bisfosfonaatti (PIP2), inositolitrifosfaatin (IP3) ja diasyyliglyserolin (DAG, [38]). Samassa linjat, Wnt7a /Fzd9 signaloinnin myös stimuloi PLCβ ja PKC (tietoja ei ole esitetty).