Krooninen sairaus

tiivistelmä

ihmiskauppa proteiini hiukkanen kompleksi 4 (TRAPPC4) on sekaantunut rakkula välittämän liikenne, mutta sen yhteys tauti on harvoin raportoitu. Tutkimme sen potentiaali vuorovaikutus ERK2, osa ERK1 /2 kompleksin solunulkoisessa Signal-säännelty Kinase /mitogeeniaktivoidut proteiinikinaasi (ERK-MAPK) reitin, hiivan kaksoishybridiseulonnassa ja varmistettiin samanaikainen immunosaostus (Co -IP) ja glutationi S-transferaasi (GST) pull-down. Lisäksi tutkimuksessa havaittiin, että kun TRAPPC4 oli tyhjentynyt, aktivoitu ERK1 /2 nimenomaan laski tumassa, joka oli mukana solun kasvua vaimentava ja apoptoosin peräsuolen syöpä (CRC) soluja. Yliekspressio TRAPPC4 edistetään solujen elinkelpoisuuden ja aiheutti aktivoitu ERK1 /2 lisäämään yleistä, mutta varsinkin tumassa. TRAPPC4 ilmaistiin pidemmälle tumaan CRC soluja kuin normaalissa paksusuolen epiteelin tai adenooman mikä vastasi tumavärjäystä on pERK1 /2. Osoitamme tässä, että TRAPPC4 voi säädellä solujen lisääntymisen ja apoptoosin CRC vuorovaikutuksella ERK2 ja myöhemmin fosforyloivaan ERK1 /2 sekä moduloimalla subsellulaariseen sijainti pERK1 /2 aktivoimaan asiaankuuluvat signalointireitille.

Citation: Zhao SL, Hong J, Xie ZQ, Tang JT, Su WY, Du W, et al. (2011) TRAPPC4-ERK2 vuorovaikutus aktivoi ERK1 /2, Moduloi Sen Nuclear lokalisointi ja säätelee leviämisen ja apoptoosin peräsuolen syövän solut. PLoS ONE 6 (8): e23262. doi: 10,1371 /journal.pone.0023262

Editor: Mikhail V. Blagosklonny, Roswell Park Cancer Institute, Yhdysvallat

vastaanotettu: toukokuu 12, 2011; Hyväksytty: 10. heinäkuuta 2011; Julkaistu: 03 elokuu 2011

Copyright: © 2011 Zhao et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat avustuksia National Natural Science Foundation of Key Program (nro 30830055) ja J-YF (https://www.nsfc.gov.cn/Portal0/default106.htm) sekä avustuksia National Natural Science Foundation of Youth Program S-LZ (nro 31000634) (https://www.nsfc.gov.cn/Portal0/default106.htm), Shanghai komission tiede ja teknologia S-LZ (nro 10ZR1419000) (http : //www.stcsm.gov.cn/structure/index.htm), Shanghai Health Bureau nuorille S-LZ (nro 2009032) (https://wsj.sh.gov.cn/website/), Shanghai Jiao Tong University School of Medicine Foundation for Science and Technology S-LZ (09XJ21065) (https://www.shsmu.edu.cn/). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

TRAPPC4, ihmisen ortologi hiivan Trs23p, joka tunnetaan myös nimellä synbindin, tunnetaan yleisesti hermosolujen sytoplasmisen proteiinin alun perin tunnistettiin hiivan two hybrid seulonta käyttäen syndekaani-2 (joka kuuluu perheeseen, solun pinnan heparaanisulfaattiproteoglykaanit joka säätelee solujen käyttäytymiseen signaalintransduktioreitteihin [1], [2], [3]) sytoplasmadomeenissa syöttinä [4]. Sitä pidetään fysiologinen ligandi syndekaani-2 tuojahaarakkeet joka osallistuu syndekaani-2 indusoi selkärangan muodostumisen rekrytoimalla solunsisäisten rakkuloiden kohti postsynaptista sivustoja rotan hippokampuksen neuronien. TRAPPC4 on havaittu CD34 + hematopoieettisten kantasolujen /kantasolujen (HSPCs) ja näin ollen tunnetaan myös HSPC172.

TRAPPC4 jäsenenä on kaupan proteiinin hiukkasen (Trapp) perheen proteiinien on osallisena rakkulan-välitteisen kuljetuksen , prosessi suorittaa lähes jokainen solu ja tarvitaan asianmukaista kohdentamista ja proteiinien eritys. Tällä hetkellä on olemassa 10 tunnettua hiivan TRAPP alayksiköt (Bet5p, 3p, Trs20p, 23p, 31p, 33P, 65p, 85 p, 120p, 130p), ja korkeampien eukaryoottien on ortologeihin kahdeksan näistä (TRAPPC1~5,6a, 6b, 8,9) [5]. Yhdessä ne muodostavat kaksi mutisubunit komplekseja: Trapp I ja Trapp II. Hiiva, nämä kompleksit toimivat useita prosesseja, mukaan lukien endoplasmakalvostossa-to-Golgi liikenteen (Trapp I) ja huonosti määritelty vaihe trans-Golgissa verkon (Trapp II) [6], [7], [8] . Tutkimukset normaalipainoisilla rottamunuaisen (NRK) solut ja HeLa-solut osoittivat myös, että TRAPP kompleksi on rooli aikana ER-Golgin liikenteen [9], [10]. PDZL verkkotunnus TRAPPC4 on yksi ainutlaatuisia ominaisuuksia selkärankaisten monimutkainen verrattuna hiiva TRAPP I toimintahäiriöstä TRAPP alayksiköitä ovat sekaantuneet ihmisten sairauksia. Mutaatiot TRAPPC1 (MUM-2) on raportoitu johtavan ilmentymisen antigeenisten peptidien melanooman [11], ja mutaatiot TRAPPC2 (sedlin) on yhdistetty Spondyloepiphyseal dysplasia tarda (SEDT) [12]. Kuitenkin rooli TRAPPC4 sairauden on harvoin tutkittu.

peräsuolen syöpä (CRC) on yksi tärkeä syy sairastuvuutta ja kuolleisuutta kaikkialla maailmassa [13]. Peräsuolen syövän synnyn on monimutkainen monivaiheinen prosessi, johon hajoaa progressiivisesti suolen epiteelisolujen-solujen lisääntymistä, apoptoosin, erilaistumisen ja selviytymisen mekanismien [14]. Ekstrasellulaarisen Signal-säännelty Kinase /mitogeeniaktivoidut proteiinikinaasi (ERK-MAPK) reitti on yksi tärkeimmistä signaalitransduktioreaktioteihin solujen fysiologiaa, ja useita keskeisiä kasvutekijöitä ja esikasvaintekijät edistää kasvua ja erilaistumista kautta Cascade [15] . Kun Aktivoinnin ERK1 /2 kompleksin kulkeutuu tumaan, jossa se fosforyloi useita transkriptiotekijöitä, jotka säätelevät geenien lisäämiseksi soluproliferaatiota ja moduloivat apoptoosia [16]. Kuitenkin yksityiskohtaiset mekanismit aktivaation ja tumaansiirtymiseen ERK1 /2 ei ole täysin selvitetty.

Nykyisessä tutkimuksessa, hiivan kaksoishybridiseulonnassa suoritettiin tunnistamiseksi ERK1 ja ERK2 sitovia proteiineja. TRAPPC4 havaittiin sitoutuvan ERK2. Olemme vahvistaneet vuorovaikutusta ja tutki tarkemmin roolia TRAPPC4-ERK2 vuorovaikutuksen CRC.

Tulokset

TRAPPC4 otettiin esimerkiksi ERK2-vuorovaikutuksessa kerroin kahden hybridin seulonta

fosforylaatio ja ydinvoiman pääsyn ERK1 /2 on kriittinen aktivointi ERK-MAPK-reitin. Tunnistaa liittyvät tekijät prosessi, hiiva kaksoishybridiseulonnassa suoritettiin ERK1 ja ERK2 syötteinä (täyspitkä) yhdessä ihmisen HeLa MATCHMAKER cDNA-kirjastosta. Pesäkkeiden kasvaa Leu-Trp-His levyjä, jotka seulottiin, 57/61 olivat positiivisia ERK2 ja 12/32 varten ERK1 on ß-galaktosidaasi määrityksessä. Plasmidit Näistä pesäkkeistä poimittiin, monistettiin bakteerien ja kotransformoituja takaisin hiivaa yhdessä syötti plasmidien lisätestejä SS-galaktosidaasi määrityksessä. Yksitoista kloonit vahvistettiin olevan myönteinen vuorovaikutus ERK2 ja kaksitoista kanssa ERK1. Näistä plasmideista, jotka olivat positiivisia osumia ERK2 ja ERK1, TRAPPC4 todettiin viisi ja kuusi sekvensseistä, vastaavasti, sen jälkeen sekvensointi. Tämä oli ensimmäinen kerta, TRAPPC4 todettiin mahdollisena vuorovaikutuksessa olevaa proteiinia ERK2.

validointi TRAPPC4-ERK2 vuorovaikutus

edelleen varmistamiseksi vuorovaikutusta TRAPPC4 ja ERK2 samanaikainen immunosaostus ja GST avattavasta kokeita suoritettiin. Sillä samanaikainen immunosaostus täyspitkän TRAPPC4 cDNA saatiin ja kloonattiin pCDEF-Myc, kun taas ERK2 sekvenssi kloonattiin pCDEF-Flag. Saatu pCDEF-Myc-TRAPPC4 ja pCDEF-Flag-ERK2 vektorit validoitu sekvensoimalla ja co-transfektoitiin 293T-solulinjassa. Western blot-analyysi (Fig. 1A) osoittivat, että plasmidit voivat ilmaista merkittäviä määriä proteiineja. Jälkeen käyttäen anti-Myc-vasta-aineen samanaikainen immunosaostus, sekä TRAPPC4-myc kaistalla ja ERK2-lippu band havaittiin päässä pCDEF-Myc-TRAPPC4 ja pCDEF-Flag-ERK2 co-transfektoiduissa soluissa, mikä osoittaa, on olemassa vuorovaikutusta TRAPPC4 ja ERK2. Vuonna positiivinen kontrolli näyte kotransfektoitiin pCDEF-Myc-P16 ja pCDEF-Flag-TSSK1 vektoreita, sekä p16-Myc band ja TSSK-lippu band havaittu, mikä osoittaa, että proteiinit voisivat toimia immunosaostettiin meidän protokolla perustuu tunnetut vuorovaikutus p16 ja TSSK1. Vain TRAPPC4-myc detektoitiin kun pCDEF-Myc-TRAPPC4 oli ko-transfektoitiin tyhjällä lipun vektori, kun taas mitään detektoitiin kun pCDEF-Flag-ERK2 oli ko-transfektoitiin tyhjä Myc vektori, mikä viittaa siihen, että vuorovaikutukset havaittiin edellä ovat erityisiä ja ei välitä proteiini tageja.

V: Co-immuunisaostuksessa TRAPPC4 ja ERK2. 293T-solut transfektoitiin tyhjällä pcDNA vektoriin tai pcDNA vektorina ilmentämään Flag tagged ERK2 (42 kD) tai Myc merkitty TRAPPC4 (26 kD). Solulysaatit altistettiin immunosaostukselle anti-Flag-HRP-vasta-ainetta tai anti-Myc-HRP-vasta-ainetta. Läsnäolo ERK2-Flag ja TRAPPC4-Myc solun poimii ennen immunosaostus ohjataan käyttäen anti-Flag ja anti-Myc-vasta-aineita (Input). Kotransfektion ilmentämisvektoreita p16-Myc ja TSSK1-Flag käytettiin positiivisena kontrollina (kaista 1). B: Havainnollinen tulokset GST pulldown validointi kokeita. (A) immunoblot-analyysi GST, ja GST-ERK2: n proteiineja, käytettiin negatiivisena kontrollina (kaista 2) ja syötti (lane3) ja avattavan määrityksessä. Proteiinit havaittiin käyttäen anti-6 x HIS-vasta-ainetta SDS-PAGE ja kalvon siirtoa. Kaista 1 osoitti sokeakoekuoppaa ilman GST tai GST-ERK2. (B) ERK2 ilmaistaan ​​GST fuusioproteiinina bakteereista sitoutui helmiä ja inkuboitiin TRAPPC4 ilmaistuna 6 × His-TRAPPC4 fuusioproteiinin avattavasta kokeilu. GST-ERK2-proteiinia (lane1), GST-proteiinia (lane2) ja TRAPPC4 proteiini (lane4) havaittiin Coomassie-värjäyksellä. Lane3 osoitti markkeri.

Koska on mahdollista, että TRAPPC4 ja ERK2 vuorovaikutus voi olla epäsuoraa, koska muut proteiinin tekijöitä kokosolu-uutetta voi olla mukana välittämässä vuorovaikutus, esim. joka toimii ”siltana” tekijöihin, tutkimme seuraavaksi mahdollista suoraa vuorovaikutusta kahden proteiinin välillä käyttäen GST avattavan määrityksissä. TRAPPC4 purettiin GST-ERK2 fuusioproteiinit (Fig. 1 B, kaista c), mutta ei pelkän GST (Fig. 1 B, kaista b), mikä osoittaa, että TRAPPC4 ja ERK2 nimenomaisesti tarkoitettu suoraan vuorovaikutuksessa

in vitro

.

TRAPPC4 säätelee ERK1 /2 fosforylaation SW1116 solulinjassa

fosforylaatio ERK1 /2 on kriittinen vaihe ERK signalointireitin. Nyt kun olimme osoittaneet, että TRAPPC4 vuorovaikutuksessa ERK2, tutkimme seuraavaksi suhteellinen osuus TRAPPC4 in ERK1 /2 fosforylaatio. Sen jälkeen vähentää ekspressiotason TRAPPC4 in SW1116-soluissa RNAi tai yli-ilmentävät sitä transfektoimalla plasmidi, joka koodaa täyspitkää geeniä, päätimme muutos Perk tasot Western-blottauksella. Havaitseminen GAPDH käytettiin latauskontrollina. Vaikka oli havaittu eroja proteiinin veren kokonaiskolesterolia ERK1 /2 kaikissa ryhmissä (Fig. 2), fosforylaatiota taso ERK1 /2 oli alassäädetty jälkeen siRNA-välitteinen väheneminen TRAPPC4 (Fig. 2A) ja ylöspäin -regulated sen jälkeen, kun yli-ilmentymisen (Fig. 2B). Lisäksi olemme käsiteltiin molempien ryhmien solujen verihiutaleista johdettu kasvutekijä (PDGF), joka on yksi aktivaattorit ERK-MAPK-reitin, ja totesi, että taso ERK1 /2-fosforylaation käsittelyn jälkeen ei ollut merkitsevästi erilainen ryhmien välillä, huolimatta niiden erot TRAPPC4 tasossa (Fig. 2).

Solut hajotettiin, ja yhtä suuret määrät proteiinia analysoitiin Western blot-analyysillä käyttäen vasta-aineita fosfo-ERK1 /2 (pERK1 /2), tai ERK1 /2, tai TRAPPC4. Tiheys Western blot bändejä normalisoitiin määrä GAPDH-proteiinin. Esitetyt tiedot edustavat kolmea koetta uudestaan. *,

p

0,05. A. Solut transfektoitiin TRAPPC4 siRNA (siTRAPPC4) ja pudotus TRAPPC4 ilmentymisen tai negtive ohjaus siRNA (siControl) kontrollina; Lisäksi soluja käsiteltiin PDGF aktivoida ERK-MAPK-reitin, tai sen liuotinta (PBS + 0,1 BSA) kontrollina. B. Solut transfektoitiin pCDEF-myc-TRAPPC4 vektori ilmentää voimakkaasti TRAPPC4 proteiinia tai pCDEF-myc vektorin kontrolli; Myös soluja käsiteltiin PDGF aktivoida ERK-MAPK-reitin tai sen liuottimella (PBS + 0,1 BSA) kontrollina.

TRAPPC4 säätelee alueellista jakautumista fosforyloidun ERK1 /2

Koska olimme osoittaneet, että TRAPPC4 voisi vaikuttaa aktivointistatuksen ERK1 /2, halusimme määrittää sen vaikutus solunosasijaintia pERK1 /2. Seuraavaksi verrattiin pERK1 /2 ja ERK1 /2: n ilmentymisen on erotettu sytoplasman ja ydinvoiman jakeet, kun TRAPPC4 oli kulunut loppuun tai yli-ilmentyy, kuten edellä on kuvattu. Jälleen, GAPDH käytettiin lastaus ohjaus sytoplasmisen proteiinin tulo, ja TBP käytettiin kontrollina tumaproteiini tulo.

Western blotting, olemme huomanneet, että sen jälkeen, kun TRAPPC4 siRNA hoidon taso pERK1 /2 merkittävästi vähentynyt tumassa (kuvio. 3A). Samaan aikaan, ei ole merkittävää eroa pERK1 /2 havaittiin sytoplasmassa, kun määrällisesti, vaikka pientä kasvua ehdotettiin visuaalisesti (Fig. 3B). Toisaalta, kun TRAPPC4 yliekspressoitui, pERK1 /2 ilmentyminen säädeltiin merkittävästi tumassa (Fig. 4A). Kun taas sytoplasmaan, tuloksemme osoittivat hieman visuaalista kasvua ilman merkittäviä eroja, kun määrällisesti (Fig. 4B).

SW1116-solut transfektoitiin TRAPPC4 siRNA (siTRAPPC4) ja pudotus TRAPPC4 ilmentymisen tai negtive ohjaus siRNA (siControl ) kontrollina; Lisäksi soluja käsiteltiin PDGF aktivoida ERK-MAPK-reitin, tai sen liuotinta (PBS + 0,1% BSA) kontrollina. Sytoplasmassa ja tumauutteita valmistettiin, kuten on kuvattu kokeellisissa menettelyissä, ja yhtä suuret määrät proteiinia analysoitiin Western blot-analyysillä käyttäen vasta-aineita fosfo-ERK1 /2 (pERK1 /2), tai ERK1 /2, tai TRAPPC4. Tiheys Western blot bändejä normalisoitiin määrä GAPDH-proteiinin sytoplasmaan proteiinia tai TBP ydin- proteiiniin. Esitetyt tiedot edustavat kolmea koetta uudestaan. *,

p

0,05.

SW1116-solut transfektoitiin pCDEF-myc-TRAPPC4 vektori ilmentää voimakkaasti TRAPPC4 proteiinia tai pCDEF-myc vektorin kontrolli; Lisäksi soluja käsiteltiin PDGF aktivoida ERK-MAPK-reitin, tai sen liuotinta (PBS + 0,1% BSA) kontrollina. Nuclear (A) ja sytoplasmassa (B) uutteet valmistettiin, kuten on kuvattu kokeellisissa menettelyissä, ja yhtä suuret määrät proteiinia analysoitiin Western blot-analyysillä käyttäen vasta-aineita fosfo-ERK1 /2 (pERK1 /2), tai ERK1 /2, tai TRAPPC4 . Tiheys Western blot bändejä normalisoitiin määrään TBP ydin- proteiinin tai GAPDH proteiinia sytoplasmaan proteiinia. Esitetyt tiedot edustavat kolmea koetta uudestaan. *,

p

0,05.

PDGF voi aktivoida ERK-MAPK-reitin kautta reseptorityrosiinikinaaseilla [17]. Kun SW1116-solulinja stimuloitiin PDGF, väheten pERK1 /2 havaittu silmämääräisesti tumafraktios- jälkeen TRAPPC4 knock-down, mutta se ei ollut merkittävää upon kvantifiointiin. Samaan aikaan, mitään merkittävää muutosta pERK1 /2 on määrällisesti solulimafraktio, vaikka pientä kasvua ehdotettiin visuaalisesti (Fig. 3). Kuitenkin, PDGF stimulaatio yliekspressoivien solujen TRAPPC4 johti merkittävään pERK1 /2 kiihdytyssäätely tumassa, mutta ei sytoplasmaan (Fig. 4).

TRAPPC4 moduloi lisääntymistä ja vähenemistä TRAPPC4 indusoi apoptoosin SW1116-solulinja

aktivointi ERK-MAP-kinaasien on yhdistetty soluproliferaation [16]. Lisätutkimuksia toimintaa TRAPPC4 CRC-soluissa, vertasimme soluproliferaatiota SW1116 soluja TRAPPC4 ilmentyminen väheni siRNA tai yli-ilmennetään täyspitkän TRAPPC4 geenin transfektio, että mock valvontaa. Tulokset Cell Counting Kit (CCK) -8 määritys paljasti merkittävän kasvun esto jälkeen TRAPPC4 ehtyminen ja kasvua solujen elinkelpoisuuden kun TRAPPC4 yliekspressoitui molemmat alkaen 24 h transfektion jälkeen (kuvio. 5A).

V: CCK-8 määrityksessä. SW1116-solut ympättiin 96-kuoppalevylle, kunnes subkonfluenteista. Elävät solut määritettiin CCK-8-määrityksessä. Kolme riippumatonta aikaa tehtiin kolmena kappaleena. Soluja käsiteltiin TRAPPC4 siRNA on pudotus TRAPPC4 ilmentymisen tai negtive ohjaus siRNA käytettiin kontrollina (a), sekä tranfered kanssa pCDEF-myc-TRAPPC4 vektori ilmentää voimakkaasti TRAPPC4 proteiinia tai pCDEF-myc vektorin kontrolli (b). *,

p

0,05. B: Apoptosis analyysi. Jälkeen SW1116-soluja käsiteltiin TRAPPC4 siRNA tai negtive ohjaus siRNA käytettiin kontrollina 48 tuntia. Apoptoosi suoritettiin käyttämällä anneksiini V-määrityksellä propidiumjodidilla counterstaining mahdollistaa määrän virtaussytometrialla. Kolme riippumatonta aikaa tehtiin kolmena kappaleena. Tiedot esitettiin keskiarvoina ± keskihajonta (SD). Oli merkitsevä ero kahden ryhmän välillä (

p

0,01).

TRAPPC4 kertyminen tumaan liittyy pERK1 /2-värjäys ihmisen paksusuolen ja peräsuolen syöpiä

kuten vähän tiedettiin ilmaisun ja lokalisaation TRAPPC4 kolorektaalisyövässä

in vivo

, me verrataan sen ilmentymistä normaalissa paksusuolen epiteelin, adenooma ja adenokarsinooma kudosten immunohistokemiallisesti kuten on kuvattu materiaaleissa ja menetelmissä. Normaalissa paksusuolen epiteelissä, TRAPPC4 värjäytyminen rajoittui sytoplasmaan (Fig. 6A). 4,55% soluista on adenooma näytteet osoittivat tumavärjäystä, kun se oli 55.89% vuonna adencarcinoma näytteissä (

p

0,01). Merkittävää eroa ei esitetty yhteensä TRAPPC4 ilmaisun välillä kolmeen ryhmään (normaali paksusuolen epiteelin ryhmä = 85,7%; adenooma ryhmä = 72,7%; adenokarsinooma ryhmä = 79,4%;

p

0,05). (Tab. 1 ) b

(A), pERK1 /2 (b) ja ERK1 /2 (C) normaalissa paksusuolen epiteelin (a), adenooma (b), ja adenokarsinooma (c). Polygrams (d) esittävät ilmaus proteiinien sytoplasmaan (vaaleanpunainen), nucleus (keltainen), ja yhteensä (sininen). V: Expression of TRAPPC4 ei ole merkittävää eroa kolmen ryhmän joukosta, mutta kasvaa tuma a-c. B: pERK1 /2 sijaitsevat pääasiassa tumassa, ja sen taso nousee merkittävästi a-c. C: n ilmentäminen ERK1 /2 ei ole merkittävää eroa kolmen ryhmän joukosta, mutta kasvaa tuma a-c. Alkuperäinen suurennus × 200.

Lisäksi olemme analysoineet yhdistyksen välillä TRAPPC4 ja pERK1 /2 tai ERK1 /2 värjäytyminen normaalissa paksusuolen epiteelin, adenooma ja adenokarsinooma. Kun taas ERK1 /2 värjäytymistä havaittiin sekä sytoplasmassa ja tumassa (Fig. 6C), sen värjäytyminen tumassa kasvoi merkittävästi adenokarsinooma ryhmässä verrattuna kahteen muuhun ryhmään. Lisäksi pERK1 /2 aktivoitu proteiinit sijaitsevat tumassa, ja oli merkittäviä eroja kolmen ryhmän (Fig. 6B). Siten tuloksemme osoittavat merkittävää korrelaatiota ydin- TRAPPC4 ilmaisun ja pERK1 /2 tasoa (

r

= 0,996), ja myös välillä ydin- TRAPPC4 ilmaisun ja ERK1 /2 tasoa (

r

= 0,994 ).

keskustelu

kaksi komponenttia ERK1 /2 kompleksin löytyvät aina kanssa yhteisesti lokalisoitu peräsuolen karsinoomat [17], [18], [19], [20] ja ERK1 ja ERK2 MAPK ovat herättäneet voimakasta tutkimusta kiinnostavia johtuen niiden kriittistä osallistumista solujen jakautumisen ja surviva [17]. Aktivoitu ERK: t fosforyloivat ja säännellä toimintaa yhä kasvava lista alustoja, joita arvioidaan muodostavan yli 160 proteiinit [21]. Siksi ERK1 ja ERK2 käytettiin syöttinä kahden hybridin-hiiva seulonta ihmisen Hela cDNA-kirjaston ensimmäisessä vaiheessa tämän tutkimuksen. Tämän seurauksena, yksi 23 sitovia proteiineja (11 ERK2 ja 12 ERK1), mahdollinen vuorovaikutus TRAPPC4 ja ERK2 mutta ei ERK1 paljastui ensimmäisen kerran. Meidän samanaikainen immunosaostus ja GST-alasveto kokeet vahvistivat lisäksi TRAPPC4 kuin ERK2 vuorovaikutuksen kumppanin.

Koska vähän todisteita TRAPP proteiinien CRC on raportoitu, ja rooli TRAPPC4-ERK2 vuorovaikutus on vielä tuntematon, me ensimmäinen analysoi vaikutusta TRAPPC4 on fosforyloidun ERK1 /2 aktivoitu muoto ERK1 /2. Olemme havainneet, että, koko, yliekspressio TRAPPC4 aktivoitu ERK1 /2, kun taas sen loppuminen laski pERK1 /2 tasot paksusuolen syöpä-solulinjaa SW1116. Näin ollen, TRAPPC4 toimii positiivisena säätelijänä varten pERK1 /2.

Vaikka jotkut ovat sytoplasmassa havaittava, että suurin osa ERK substraatit ovat tumaproteiineja [22]. Aktivoitu ERK: t voivat tumaan, jossa ne fosforyloivat ja säädellä eri transkriptiotekijöiden, kuten Ets perheen transkriptiotekijöiden, lopulta johtaa muutoksiin geenien ilmentyminen [23]. Edelleen arviointi soluliman ja ydin- jakeet osoittivat, että sijainnin pERK1 /2 myös muuttunut yhdessä TRAPPC4 ekspressiotasoja. Kun TRAPPC4 pudotettiin, ydin- pERK1 /2 taso oli selvästi alassäädetty, mutta ei merkittävää eroa osoitettiin sytoplasmassa. Kun yliekspressoituina pERK1 /2 ilmaus kasvoi sekä tumassa ja sytoplasmassa, mutta lisää huomattavasti tumassa. Siten TRAPPC4 on mukana paitsi fosforylaation ERK1 /2, mutta myös sen alueellista jakautumista peräsuolen epiteelisolujen. Trapp-proteiinien tiedetään olevan osa suurta multi-proteiini-kompleksi osallistuu ER-to-Golgin ja Golgin laitteen sisäisen kaupan [5], [7], [8]. Ne esittävät useita isoformeja, jotka eroavat toisistaan ​​alayksiköissä, funktio, ja sijainti. Esimerkiksi TRAPPCI on mukana rekrytointi ER-johdettujen rakkulat cis-Golgi [8], ja TRAPPCII [7] vaaditaan taaksepäin kuljetusta endosomeissa. Eva Loh

et al.

Paljasti, että Bet3, kaikkein konservoitunut osa Trapp monimutkainen, on ilmaistu kahdeksan eri hiiren kudoksissa, on olemassa kaksi erillistä allasta sytosoliin ja toiminnot aikana ER-Golgin liikenteen [10] . Siksi TRAPPC4 voi olla rooli nucleocytoplasmic liikenteen peräsuolen syöpä, mutta tämä mekanismi vaatii lisäselvityksen.

PDGF voi viestiä läpi ERK-MAPK-reitin ja aktivoi ERK Cascade kautta reseptorityrosiinikinaaseihin. Olemme havainneet, että hoidon jälkeen PDGF, vaikutus TRAPPC4 on pERK1 /2 oli kokonaan tai osittain peitettynä. Tulokset antoi meille osoitus siitä, että TRAPPC4 voi osallistua tiettyjen vaiheiden PDFG-välitteisen ERK1 /2 Cascade. Kuten ERK1 /2-fosforylaation, vaikutus TRAPPC4 ei ehkä ole yhtä voimakas kuin PDGF. Kuitenkin yksityiskohtaiset mekanismi on vielä tutkittava perusteellisesti.

Lisäksi olemme havainneet, että TRAPPC4 vaikuttaa solujen lisääntymistä sekä solukuoleman. Ehtyminen TRAPPC4 esti solujen kasvua ja indusoi apoptoosin, kun taas sen yliekspressio osaltaan solun kasvua. Kerrottiin, että aktivoitu ERK1 /2 vuorovaikutuksessa joitakin alustoille, kuten fosfoproteiinin rikastunut astrosyytit 15 (PEA-15), ja kuolema liittyvät proteiinikinaasi (DAPK), ja on eristäytynyt sytoplasmaan [24]. Poistaminen PEA-15 selvästi stimuloi ERK-riippuvaisen proliferaation ja geenin transkriptio; kun PEA-15 yli-ilmentyminen estää leviämisen kautta sen kyky sitoa ja sitoa ERK1 /2 sytoplasmassa [25]. DAPK sequesters ERK1 /2 sytoplasmassa vuorovaikutuksessa ERK kautta D-verkkotunnuksen sen kuolemadomeenille. ja vuorovaikutus edistää proapoptoottiset funktio DAPK [26]. Siksi esto ERK1 /2 tumaanohjaussignaali heikentää ERK1 /2-välitteistä eloonjääntisignaaleja ja lisäksi augments proapoptoottiset signaaleja. Tutkimuksessamme jälkeen knockdovvn TRAPPC4, lasku aktivoinnin ERK1 /2 vastasi vähemmän ydinvoiman lokalisointi, jotka voivat lopulta johtaa kasvun surpression ja apoptoosin. Katsovat, enemmän ydinvoiman lokalisointi kun TRAPPC4 yliekspressoidaan voi edistää solujen kasvua.

Suurin osa aiemman tutkimuksen Trapp Family keskityttiin hiiva- ja normaalin nisäkkäiden solujen tai kudosten [4], [5], [8] , [10]. Tietääksemme ainoa ilmaisu TRAPPC2 on tutkittu sairaus SEDL [27]. Tähän mennessä, sijainti Trapp alayksiköiden on lähinnä todettu sytoplasmassa nisäkässoluissa [9], [10]. TRAPPC4 oli tiettävästi sijaitsee piikit hippokampuksen viljeltyjen neuronien [4], mutta vähän tietoa sen roolista tauti on saatu. Täällä analysoimme TRAPPC4 ilmentymistä ihmisen normaalia paksusuolen epiteelin, adenooma, ja adenokarsinooma kudokset immunohistokemiallisesti. Tulokset paljastivat, että ydin- TRAPPC4 tulee näkyviin, kun normaali epiteelikudosta etenee adenooma ja adenokarsinooma. Siten muutos lokalisoinnin TRAPPC4 voi liittyä paksusuolen ja peräsuolen syövän synnyssä. Herää kysymys, onko se voi olla mikä tahansa geenimutaatioita tai rakenteellisia muutoksia syntyvä TRAPPC4 aikana peräsuolen syövän synnyn. Samaan aikaan, pERK1 /2, joka on tumassa tutkimuksessamme, kasvoi adenokarsinooma verrattuna adenooma kudoksiin ja normaaleissa epiteelikudoksissa. Kuten edellä mainittiin, päätehtävä Trapp Family on sääntelyn vesicular liikenteen ja TRAPPC4 osallistuu kalvokuljetuksessa in postsynaptista sivustoja hermosoluissa. Voitaisiin kysyä mekanismi ydinvoiman lokalisoinnin TRAPPC4 CRC on merkitystä kuljetukseen pERK1 /2 sytoplasmasta tumaan. Itse asiassa, Trapp kompleksi osoitettu toimimaan guaniininukleotidiä vaihto tekijä (GEF) ja Ypt1 ja Ypt31 /32-GTPaasit sekä

in vitro

ja

in vivo

[28], [29 ]. Vaikka Ypt1 GTPaasina vaaditaan cis-Golgi kohdentamiseen ja fuusio ER-johdettujen rakkuloiden [30], [31], toiminnot Ypt31 /32 GTPaasit ovat välttämättömiä myös muodostumista trans-Golgi rakkuloiden [32] . Jää nähtäväksi, onko samanlainen molekyylimekanismin olemassa TRAPPC4 in CRC vielä lisätutkimuksia.

Yhteenvetona Tutkimuksemme osoitti vuorovaikutusta TRAPPC4 kanssa ERK2. Kolorektaalisyövässä, se ei vain säätelee aktivointia ERK1 /2, mutta vaikuttaa myös jakelu aktivoitujen ERK1 /2. Se muuttaa solujen lisääntymisen ja apoptoosin CRC soluissa. Korvauksena aiempien tutkimusten kanssa, me spekuloida, että CRC, TRAPPC4 sitoo ja aktivoi ERK1 /2 sekä osallistuu ydinaseiden kuljetukseen pERK1 /2. Kun TRAPPC4 on tyhjentynyt, vähemmän ERK1 /2 on fosforyloitu, ja suhteellisesti enemmän pERK1 /2 pysyy sytoplasmassa, mikä johtaa solujen proliferaatio ja apoptoosi. Kun TRAPPC4 on yli-ilmentynyt, lisää ERK1 /2 on aktivoitu, ja vielä kuljetetaan tumaan, lopulta johtavat lisääntyneeseen solun kasvua (Fig. 7). Tulevaisuuden tutkimuksia tarvitaan selvittämään tämän ehdotetun molekyylimekanismin.

Solunulkoisilla signaaleja, kuten PDGF, aktivoi ERK kaskadeja (RAS /RAF /MER /ERK) kautta reseptori (RTK: t) ja Loppujen lopuksi vie- lä säätelevät solujen lisääntymistä ja apoptoosin. TRAPPC4 sitoo ja aktivoi ERK1 /2 sekä osallistuu ydinaseiden kuljetukseen pERK1 /2. Kun TRAPPC4 on tyhjentynyt, vähemmän ERK1 /2 on fosforyloitu, ja suhteellisesti enemmän pERK1 /2 pysyy sytoplasmassa, mikä johtaa solujen proliferaatio ja apoptoosi. Kun TRAPPC4 yli-ilmennetään, lisää ERK1 /2 aktivoituu, ja vielä kuljetetaan tumaan, lopulta mikä lisää solujen kasvua.

Materiaalit ja menetelmät

Plasmidit ja transfektioihin

täyspitkä ERK1, ERK2 ja TRAPPC4 cDNA saatiin PCR: llä ihmisen cDNA-kirjastosta. Hiivan kahden hybridin määritykset, täyspitkät fragmentteja ERK1 ja ERK2 cDNA kloonattiin kumpikin kehyksessä

Sfi

I sivusto pGB plasmidiin. Sitoutumismäärityksiä varten, täyspitkä TRAPPC4 cDNA kloonattiin pCDEF-Myc, ja täyspitkän ERK2 cDNA kloonattiin pCDEF-Flag. ERK2 subkloonattiin pGEX-5x tuottamaan glutationin

S

-transferase (GST) fuusioproteiineja, ja TRAPPC4 subkloonattiin pET-28a tuottamaan Hänen fuusioproteiineja.

samanaikainen immunosaostus kokeet alla, 1,6 x 10

6 solua /kuoppa 6-cm: n maljoihin kotransfektoitiin vektoreilla pCDEF-Myc-TRAPPC4 ja pCDEF-Flag-ERK2 ilmentävät TRAPPC ja ERK2: n, vastaavasti, käyttäen plasmidia: transfektioreagenssia suhde 01:04 (4 ug kutakin plasmidia). Tyhjä vektori kontrollit olivat pCDEF-Myc tai pCDEF-Flag (molemmat Shanghaista Genomics).

Hiiva kahden hybridi määrityksissä

Hiiva kahden hybridi seulonta suoritettiin tunnistamiseksi ERK1 ja ERK2 vuorovaikutuksessa proteiinien käyttämällä Clontech Matchmaker Two-Hybrid System (Cat. # K1612-1) mukaan valmistajan ohjeiden. Syötti plasmidit PGB-ERK1-G ja PFI-ERK2-G transformoitiin hiivakantaan Y190. Myrkyllisyyttä ja itse aktivointi suoritettiin käyttäen β-galaktosidaasi-määrityksessä. Hiiva transformoitiin syötti plasmideilla viljeltiin ja seulottiin ihmisen HeLa Matchmaker cDNA-kirjasto (Clontech, Cat # HL4048AH) ja sitten kasvatettiin Leu-Trp-His levyt valinta ja validointi käyttäen ß-galaktosidaasi määrityksessä. Plasmidit positiivisista pesäkkeistä poimittiin, monistettiin bakteerien ja kotransformoituja takaisin hiivaa yhdessä syötti plasmidien lisätestejä SS-galaktosidaasimäärityksissä. Plasmidit positiivisia osumia sekvensoitiin ja analysoitiin.

samanaikainen immunosaostus (co-IP) ja GST-alasveto analyysi

Co-immunosaostus suoritettiin kuten aiemmin on kuvattu [33]. Sekä tulo ja IP-näytteet analysoitiin Western blot käyttäen erilaisia ​​vasta-aineita, on seuraavina laimennoksina: Flag-vasta-aineen (1:1000), Myc-vasta-aineen (1:1000) Flag-HRP-vasta-aineen (1:4000), Myc-HRP-vasta-aineen (1 :2000) (kaikki Shanghaista Genomics, Shanghai, Kiina) ja vuohen anti-hiiri-IgG-HRP-vasta-aineen (1:5000) (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, USA). Kotransfektion ilmentämisvektoreita p16 ja TSSK1 (Shanghai Genomics, Shanghai, Kiina) käytettiin positiivisena kontrollina samanaikainen immunosaostus.

GST-proteiinia ja GST-ERK2: n fuusioproteiineja ilmennettiin ja puhdistettiin valmistajan ohjeiden (GE Healthcare, London, UK). Jotta pull-down-määritys, 1-5 mg GST tai GST-fuusioproteiineja sekoitettiin 40 ml: aan 50%: ista suspensiota glutationi-Sepharose 4B: ssa 2 h sitoutumispuskuriin [25 mM HEPES-NaOH: ta (pH 7,5) , 12,5 mM MgCl

2 10% glyseroli, 5 mM DTT, 0,1% NP-40, 150 mM KCI ja 20 mM ZnCI2: a]. Sitten 1-5 mg 6 x His-TRAPPC4 fuusioproteiinien lisättiin, jonka jälkeen inkuboitiin vielä 2 tuntia. Pelletit pestiin laajasti, ja tunnistettiin western blottauksella 6 × His Antibody (1:1000) (Abcam, Cambridge, UK).

Soluviljely

paksusuolen syöpä peräisin oleva solu line SW1116 (ostettu Cell Bank of Type Culture Collection of Kiinan tiedeakatemia, Shanghai Institute of Cell Biology, Kiinan tiedeakatemia) ylläpidettiin peräkkäistä kertaa RPMI 1640, joka sisälsi 10% lämpöinaktivoitua vasikan sikiön seerumia (FCS), 100 yksikköä /ml penisilliiniä ja 100 ug /ml streptomysiiniä.