Krooninen sairaus

tiivistelmä

Lisämunuaisen kuorikerroksen karsinooma (ACC) on harvinainen, mutta erittäin pahanlaatuinen kasvain alkuperä on tuntematon. Inhibiini α-alayksikköä (

Inha

) hiirten kehittää aluelennonjohtokeskusten seuraavat gonadectomy. Ihmisellä

INHAN

ilme vaihtelee suuresti eri ACC kudoksissa ja sen kiertävä peptidi inhibiini pro-aC on kuvattu uutena kasvaimen merkkiaine ACC. Me tutkimme, geneettiset ja epigeneettiset muutokset

INHAN

geenin ihmisen ACC kadota tai muunnelma

INHAN

ilme. Tätä varten, analyysit

INHAN

, promoottorin metylaation ja mRNA: n ilmentymisen suoritettiin ihmisen lisämunuaisen kuorikerroksen kudoksissa. Seerumin inhibiini pro-aC tasot mitattiin myös ACC potilailla.

INHAN

geneettinen analyysi 37 ainutlaatuinen aluelennonjohtokeskusten paljasti 10 romaani, heterotsygoottinen harvinaisia ​​muunnoksia. Niistä 3 koodaus emäkset vaikuttaa, yksi variantti oli synonyymi ja kaksi oli missense vaihtoehdot: S72F ja S184F. Vähäinen alleeli rs11893842 at -124 bp havaittiin pieni (24%) vuonna ACC näytteitä ja liittyi vähentynyt

INHAN

mRNA: 4.7 ± 1.9 mielivaltaisia ​​yksiköitä AA, verrattuna 26 ± 11 AG /GG genotyyppien (P = 0,034). Metylointi neljä proksimaalisen

INHAN

promoottori CpG: t oli poikkeuksellisesti kasvanut viidessä aluelennonjohtokeskusten (47,7 ± 3,9%), verrattuna normaaliin lisämunuaisissa (18,4 ± 0,6%, P = 0,0052), kun taas toinen 14 aluelennonjohtokeskusten tutkittu osoitti vähentynyt promoottori metylaatio (9,8 ± 1,1%, P = 0,020). CpG-metylaatio korreloi käänteisesti

INHAN

mRNA tasoilla aluelennonjohtokeskusten (r = -0,701, p = 0,0036), mutta ei liity seerumin inhibiini pro-aC tasoilla. Lopuksi poikkeava metylaatio ja yhteinen geneettinen vaihtelu

INHAN

promoottori esiintyy ihmisen aluelennonjohtokeskusten ja niihin liittyy vähentynyt

INHAN

ilme.

Citation: Hofland J, Steenbergen J , Voorsluijs JM, Verbiest MMPJ, de Krijger RR, Hofland LJ, et ai. (2014) Inhibiini Alpha-alayksikkö (

INHAN) B ilmentäminen Lisämunuaisen kuorikerroksen Cancer liittyy Geneettinen ja Epigeneettiset

INHAN

Promoottori vaihtelu. PLoS ONE 9 (8): e104944. doi: 10,1371 /journal.pone.0104944

Editor: Swati Palit Deb, Virginia Commonwealth University, Yhdysvallat

vastaanotettu 18 maaliskuuta 2014; Hyväksytty: 17 heinäkuu 2014; Julkaistu: 11 elokuu 2014

Copyright: © 2014 Hofland et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Data Saatavuus: Tällä kirjoittajat vahvistavat, että kaikki tiedot taustalla olevat havainnot ovat täysin saatavilla rajoituksetta. Kaikki tiedot ovat läsnä käsikirjoituksen ja Supplemental taulukossa.

Rahoitus: Kirjoittajat ole rahoitusta tai tukea raportti.

Kilpailevat edut: Prof. Wouter de Herder on PLoS One Toimitusneuvosto jäsen. Tämä ei muuta tekijöiden noudattaminen PLoS One Pääkirjoitus politiikan ja kriteerit.

Johdanto

Lisämunuaisen kuorikerroksen karsinooma (ACC) on harvinainen maligniteetti on huono eloonjäämisprosentti [1], [2] . Esiintyminen ACC on naisen voittopuolisesti ja bimodaalis- lisääntynyt esiintyvyys lapsilla ja aikuisilla yli 60 vuotta [3]. Perinnöllinen ACC tapahtuu yhteydessä geneettiset oireyhtymät, kuten Beckwith-Wiedemann oireyhtymä [4] ja Li-Fraumeni oireyhtymä [5]. Mutaatiot geeneissä taustalla nämä häiriöt ovat myös yhdistetty satunnaista ACC muodostumista, erityisesti kun kyseessä on

TP53

[6]. Yleisin muutos löytyy ACC on yli-ilmentyminen äidiltä painettu IGF-II-lokus [7]. Viime aikoina, mutaatiot Wnt /β-kateniinin reitin on osoitettu esiintyä lisämunuaiskuoren syövän etenemistä [8]. Geneettiset syyt ja rooli kromosomipoikkeavuuksia lisämunuaiskuoren kasvainten synnyssä edelleen suureksi osaksi tuntemattomia.

inhibiini α-alayksikköä (koodaama

INHAN

) muodostaa inhibiini A tai B kytkemällä inhibiini βA- tai βB-alayksiköt, vastaavasti. Sen ilme on rajoitettu sukurauhasten, istukan ja lisämunuaisen kuorikerroksen. Pääasiallinen vaikutus verenkierrossa inhibiinien A ja B on inhibitio paikallista aktiviinin aiheuttama follikkelia stimuloivan hormonin (FSH) erittymistä aivolisäkkeestä [9]. Hiirimallissa Knockout malli, inhibiini α-alayksikkö havaittiin kasvaimen suppressiivinen rooli sukurauhaskudokseen [10], ja sen jälkeen, kun gonadectomy, että lisämunuaisen kuoren [11]. Yhdeksänkymmentäyhdeksän prosenttia

Inha

– /- hiirille kehittyi lisämunuaiskuoren steroidien erittämä karsinoomien jälkeen gonadectomy [11]. Pathways mukana tätä kuuluvat erilaistumista follikkeliepiteelisolujen kaltaisia ​​soluja ilme sikiön tai sukurauhasten markkereita, kuten

Gata4

,

LHR, Fshr

ja

CYP17A1

[12 ].

Inha-

liittyvän syövän syntymistä hiirillä on myös katsottu johtuvan laskenut activin signaloinnin potentiaalisia ja poikkeava ilme ja vaikutuksia TGF-β2 [13], [14].

Ihmisellä toiminta lisämunuaisen Inhibiineiksi ei tunneta, mutta sen vastine activin A on ollut kuvattu olla mukana vyöhykkeellä sääntely lisämunuaiskuoren steroidien [15]. Todisteet

INHAN

tuumorisuppressorina ihmisen ACC on ristiriitaisia. Useita mRNA ja proteiini analyysi tutkimukset ovat osoittaneet, ettei

INHAN

ilmentymisen potilaiden osuus, joilla ACC sekä

INHAN

yliekspressio toisessa osajoukossa [16], [17], [18] , [19], [20]. Viime aikoina olemme raportoitu, että seerumin vapaan peptidin muotoa α-alayksikköä, inhibiini pro-aC, oli suurempi potilailla, joilla lisämunuaiskuoren karsinoomien ja että nämä tasot voidaan hyödyntää niin tuumorimarkkeri [21]; inhibiini pro-aC tasoja voi olla hyödyllinen jaottelusta pahanlaatuisia ja hyvänlaatuisia lisämunuaiskuoren kasvaimet sekä seurantaan yksittäisten potilaiden. Vaikka suurin osa ACC potilaista osoittivat lisääntynyttä seerumin inhibiini pro-aC potilasalaryhmässä oli normaalia tasoa, edustaen mahdollisesti kasvaimia, jotka eivät ilmennä

INHAN

[21].

Useita DNA- muutokset tiedetään vaikuttavan geenin ilmentymisen aikana tuumorigeneesiä. Lukuun ottamatta geneettisiä muutoksia aiheuttavat poikkeava tai poissa ilme, epigeneettiset muutokset, kuten kromatiinin remodeling ja CpG metylaatio, voi vaikuttaa geenin transkription ja usein esiintyy syöpää [22]. Metylaation CpG saarten geenin promoottori alueet voivat aiheuttaa transkription hiljentämisen ja menetys geenin ilmentymisen häiriöiden vuoksi sitoutumisen kanssa transkriptiotekijöiden [23].

oivalluksia lakisääteisen valvonnan

INHAN

ilmaisu toisivat lisävalaistusta roolista

INHAN

ihmisen lisämunuaisen tuumorigeneesiin ja vaihtelevuutta seerumitonta kiertävän inhibiini tasoja, jotka voisivat toimia seerumin tuumorimarkkeri ACC potilailla. Jotta selvittää tämän selvitimme sääntelymekanismeja on

INHAN

ilmentymistä ihmisen ACC. Sekvensointi

INHAN

geeni tehtiin etsiä geneettisiä variantteja, jotka voivat vaikuttaa geenin toimintaan tai ekspressiotasoja. Lisäksi kvantitatiivinen metyloituvuutta

INHAN

promoottori suoritettiin, jotta voidaan tutkia, onko metylaation CpG: t edistää eroja ilmaisua. Nämä analyysit kytkettiin kasvain mRNA-tasoja inhibiini α-alayksikköä ja seerumin inhibiini pro-aC.

Materiaalit ja menetelmät

Näytteiden kerääminen

parafinoidut kudos korttelin kerättiin patologinen arkistoista Erasmus MC. Kudosnäytteitä peräisin stä vuosina 1991 ja 2010 tässä sairaalassa. Diagnoosi lisämunuaiskuoren karsinooma tehtiin jos van Slooten indeksi ylitti 8 [24]. Tuumorin luokitus suoritettiin Euroopan Network for Study of lisämunuaiskasvain (ENSAT) pysähdyspaikan järjestelmä [1]. Hematoksyliinillä ja eosiini-värjättyä objektilasit arvioitiin patologi ja kohdat, joissa suuri osa elinkelpoisten kasvainsoluja microdissected lisäanalyysiä. Kudokset leikattiin ennen 2007 kerättiin patologinen arkistoista Erasmus MC. Tietoon perustuva suostumus toissijaisen käytön ylijäämän kudosta saatiin kaikista potilaista suullisesti ennen leikkausta. Potilaan kieltäytyminen tehdä kudosta tutkimukseen käytettävissä kirjattiin kirjallisesti ja nämä näytteet eivät olleet mukana tässä tutkimuksessa vastaavasti. Vuodesta 2007 alkaen, kerättiin prospektiivisessa tutkimuksessa lisämunuaiskasvain ja tietoisen kirjallisen suostumus saatiin kaikilta osapuolilta. Nämä näytteet myös lisämunuaisen kudoksista potilailta, joille tehtiin lisämunuaisten johtuu munuaissyövän, lisämunuaisen liikakasvu ja adenooma. Tuumorisektioiden kerättiin elinkelpoisen tuumorin osat ja pikajäädytettiin nestemäisessä typessä tai kuivajää pian resektion jälkeen. Ennen leikkausta seerumin inhibiini pro-aC mitattiin potilaiden alaryhmissä käyttäen entsyymi-immuno- määritys (Diagnostic Systems Laboratory, Webster, TX, USA). Tutkimus suoritettiin Alankomaiden säännösten käytöstä jäljellä kudosten ja hyväksytty lääketieteellisen eettisen komitean Erasmus MC.

DNA: n sekvensointi

DNA eristettiin DNA mini kit ( Qiagen, Venlo, Alankomaat) mukaan valmistajan protokollaa ja liuotetaan H

2O. Sen pitoisuus mitattiin käyttämällä Nanodrop annostelija (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA).

inhibiini α-alayksikön geenissä, joka sijaitsee 2q35, koostuu kahdesta eksonia (kuva 1). DNA-analyysiä varten parafiiniin upotetut kudokset alukepareja valittu monistamaan alueilla 200-250 bp. Sillä juuri jäädytetty kudosten alueilla jopa 500 emäsparia voitaisiin onnistuneesti monistaa. Primer sijainnit on esitetty yhteenvetona taulukossa 1. Alukkeet kattoivat koodaavan alueen, jopa -331 bps alkaen ATG (joka sisältää cAMP sitova, SF-1 vaste ja GATA elementtejä -151–112 bps [25], [ ,,,0],26]), ja ainakin 153 bps intronin vieressä eksoni-introni rajat (kuvio 1).

sijaitseva 2q35,

INHAN

koostuu kahdesta eksonia, joita erottaa 2 kb introni. Koodaava sekvenssi koostuu 1101 bps. Alueet sekvensoitiin tässä tutkimuksessa on osoitettu jatkuva nuolilla. Alueet tutkittiin metylaation ovat kuvata katkoviivoilla; CpG dinukleotidit onnistuneesti ominaista esitetään avoimina piireissä.

PCR amplication suoritettiin 30 ui 0,05 U /ul FastTaq polymeraasia (Roche Applied Science, Almere, Alankomaat), 1 ng /ul DNA: ta, 250 nM eteenpäin ja reverse-alukkeita, 200pM dNTP: eitä (Amersham Biosciences, Uppsala, Ruotsi) ja puskuria, joka sisältää MgCl

2 (Roche) on GeneAmp 9700 (Applied Biosystems, Nieuwerkerk aan den IJssel, Alankomaat) seuraavissa olosuhteissa: 7 minuuttia 95 ° C: ssa, mitä seurasi 40 sykliä 1 minuutin välein 95 ° C: ssa, 56-63 ° C: ssa ja 72 ° C, ja se päättyy 10 minuutin ajan 72 ° C: ssa. PCR-tuotteet puhdistettiin korkean Pure PCR Product Purification Kit (Roche).

sekä myötä- PCR-alukkeita käytettiin erillisissä järjestyksessä reaktioita kanssa BigDye Terminator v1.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems). Kolme ui puhdistettua PCR-tuotetta käytettiin 500 nM aluketta reaktiossa 1 minuutti 96 ° C: ssa ja 25 sykliä 30 sekuntia 96 ° C: ssa, 15 sekuntia 50 ° C: ssa, ja 4 minuuttia 60 ° C: ssa. Sekvenssi Reaktiotuotteet puhdistettiin käyttämällä Dye-Ex 96 Purification Kit (Qiagen) ja Micro-Bio-Spin Purification Pylväät (Bio-Rad, Veenendaal, Alankomaat). Sekvenssi havaitseminen suoritettiin käyttäen ABI PRISM 3100 Genetic Analyzer (Applied Biosystems). Sequencher-ohjelmisto (Genes koodit Corporation, Ann Arbor, MI, USA) käytettiin DNA-analyysiä varten.

metylointi analyysi

Yksi ug DNA: ta, joka on saatu jäädytetyistä näytteistä, käsiteltiin bisulfiitti käyttäen EZ DNA: n metylaatio kit (Zymo tutkimus, Irvine, CA, USA), eluoitiin 100 ul: aan H

2O ja säilytettiin -80 ° C: ssa. Ui bisulfiittikäsiteltyä DNA: n promoottorin alueella

INHAN

monistettiin PCR: llä, kun taas T7-promoottorin otettiin käyttöön käänteisaluketta. Käyttämällä EpiDESIGNER ohjelmisto tarjoaa Sequenom (San Diego, CA, USA) kaksi alukesarjoista suunniteltiin joka peitti useita CpG dinukleotidit ylävirtaan

INHAN

aloittaa päällä (kuvio 1); alukesekvenssejä on kuvattu taulukossa 1.

PCR suoritettiin 5 ul: n tilavuudessa, joka sisälsi 0,04 U /ul Hotstar Taq-polymeraasia (Qiagen), 200 uM dNTP: itä, 200 nM sekä alukkeita, 1 ui bisulfiitin käsiteltyä DNA, Hotstar PCR-puskuria ja H

2O. 10 minuutin jälkeen 95 ° C: ssa, 35 sykliä 30 sekuntia 95 ° C: ssa, 30 sekuntia 53 ° C: ssa ja 45 sekuntia 72 ° C: ssa. Reaktio päättyi 7 minuutin pariutumisvaiheen 72 ° C: ssa. Vahvistamisen jälkeen PCR-tuote 2% aga- sisältävä geeli, tuote käsiteltiin 0,3 U: katkaravun alkalisella fosfataasilla 20 minuutin ajan 37 ° C: ssa ja 5 minuuttia 85 ° C: ssa.

Seuraavaksi,

in vitro

transkription ja pohja-spesifinen pilkkominen suoritettiin 7 ui seosta, joka sisälsi 20 U T7 R DNA-polymeraasi, T-pilkkoutumista mix, 3,14 mmol /l DTT: tä, RNaasi A, PCR-tuote ja T7-polymeraasia puskurissa (Sequenom ). Tuloksena olevat fragmentit laimennettiin H

2O ja 6 mg CLEAN hartsia lisättiin 10 minuutin poistamiseksi natrium ja kalium-ioneja. Tätä seosta sentrifugoitiin 3000 rpm 5 minuutin ajan ja annosteltiin on SpectroCHIP kanssa MassARRAY Nanodispenser RS-1000 väline (Sequenom). Kvantitatiivinen metylaatio havaittiin matriisin laserdesorptio /ionisaatio aika-of-lennon (MALDI-TOF) massaspektrometriin (MassARRAY Analyzer Compact, Sequenom) ja analyysi suoritettiin käyttäen mukana EpiTYPER ohjelmistoa.

Standardikäyrät näiden määritykset konstruoitiin määrittämällä seoksia sekoitetun DNA-näytteitä, jotka sisältävät 0%: sta 100% metylaation välein 10%. Metyloituvuutta onnistui 8 CpG: t

INHAN

promoottori: sijaitsee 149, 203, 241, 285, 558, 599, 719 ja 751 bps ylävirtaan

INHAN

alkaa päällä.

mRNA-analyysi

Kokonais-RNA eristettiin jäädytetyistä lisämunuaiskuoren kudoksista Trizol-reagenssia (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Käänteistranskriptaasi ja kvantitatiivinen polymeraasiketjureaktio on

INHAN

ja siivous geenit

HPRT1

ja

GAPDH

tehtiin kahtena aikaisemmin kuvatulla [16]. Sekvenssit alukkeiden ja koettimien on esitetty taulukossa 1. Expression tasot

INHAN

laskettiin suhteessa, että keskimääräisen kynnyksen (Ct) ja

GAPDH

ja

HPRT1

käyttämällä delta-Ct menetelmällä ja kerrotaan 1000.

tilastollinen

aineisto tämän tutkimuksen ovat taulukossa S1. Analyysit eroja ryhmien suoritettiin Chi-Square testien yksisuuntainen analyysit varianssi seurasi Tukeyn monivertailu testejä tai t-testejä käyttämällä Graphpad Prism-ohjelmiston (Graphpad Inc, La Jolla, CA, USA). mRNA-tasot olivat log-muunnettiin ennen analyysiä. Korrelaatiot analysoitiin Spearmanin korrelaatiokerrointa. Kaikki testit laskettiin kaksisuuntaisia ​​ja P-tason alle 0,05 pidettiin tilastollisesti merkitsevä.

Tulokset

Sekvenssianalyysissa

INHAN

järjestyksessä analysoitiin 37 ainutlaatuinen ACC kudosten (12 tuore, 25 parafinoidut). Tulokset sekvenssi analyysit on esitetty yhteenvetona taulukossa 2.

Kaikkiaan sekvensointi

INHAN

geenin 37 aluelennonjohtokeskusten paljasti 10 romaani harvinainen geneettinen variantit 8 aluelennonjohtokeskusten. Yksi ACC kanna kolme heterotsygoottinen variantteja (-77G A, -63A G ja -56G T) 5’UTR, kun taas heterotsygoottinen variantti heti lopetuskodonin (* 1G A) havaittiin toisessa ACC. Me lokalisoitu kolme introni variantteja, joka sijaitsee 179, 72 ja 9 bps ylävirtaan introni 1-eksoni 2 rajalla. Vuonna koodaava alue

INHAN

olemme havainneet 1 synonyymi nukleotidin muutos (75C T, Ala25Ala) ja 2 missense variantit, 3 erillistä aluelennonjohtokeskusten. Jälkimmäinen molemmat koostuivat heterotsygoottinen C → T variantteja, on bps 215 ja 552, mikä johtaa seriinin fenyylialaniinin muutoksia aminohappojen 72 ja 184, vastaavasti.

Meidän täydellinen sarja ACC näytteiden -124A G SNP, rs11893842, oli yleisin geneettinen vaihtelu, jonka pienempi alleelin taajuus (MAF) on 24%, verrattuna 44% vuonna vertailupopulaatioon (www.1000genomes.org [27]). Lisäksi pienet alleelin introni SNP IVS1-87G A (rs116399602) oli läsnä 16%: ACC näytteistä, näennäisesti suurempi kuin terveillä henkilöillä (2,8% MAF). Rs7588807 (IVS1-314G T) vasta mitattiin osajoukko jäädytetyn DNA-näytteitä. Vähäinen T-alleeli on aiemmin raportoitu esiintyvän 48% verrokeilla; aluelennonjohtokeskusten osoitti alempaa MAF on 29%. Rs35118453 (-16 ° C T) ja rs12720063 (532C T) olivat läsnä alhaisilla taajuuksilla, verrattavissa viite [27]: 9% ja 12%, vastaavasti. Rs144941390, rs374972575 ja rs148455844 sisällä

INHAN

geenissä kukin havaittiin yhdessä ACC näytteessä.

metylointianalyysi

Ensimmäinen sarja, jossa

INHAN

promoottori metylaatio tutkittiin, käsitti DNA 3 normaalista lisämunuaisten ja 12 aluelennonjohtokeskusten. Sillä 4 CpG dinukleotideissä 558, 599, 719 ja 751 bps ylävirtaan

INHAN

aloittaa sivuston alhainen metylaatio suhteet saatiin kaikissa testatuissa näytteissä: 4,4 ± 1,1%, 4,5 ± 0,8%, 1,7 ± 0,7% ja 2,5 ± 0,6% (keskiarvo ± SEM), tässä järjestyksessä. Lisäksi ei ollut eroja normaalin lisämunuaisen kudoksista ja aluelennonjohtokeskusten (tietoja ei ole esitetty). CpG: t läheisyyteen aloituspaikan metyloitiin suurempaa alaryhmässä näytteitä; Siksi olemme analysoineet vielä 7 aluelennonjohtokeskusten kanssa alavirran alukeparia vain.

tulokset metyloituvuutta CpG: t at -285, -241, -203 ja -149 on kuvattu kuviossa 2. Viisi aluelennonjohtokeskusten oli poikkeavasti korkea metylaatio hinnat kaikkien neljän proksimaalisen CpG: t tutkittiin

INHAN

promoottori. Keskimääräinen metylaatio suhde näiden aluelennonjohtokeskusten oli 47,7 ± 3,9%, verrattuna 18,4 ± 0,6% normaalin lisämunuaisissa (P = 0,0052) ja 9,8 ± 1,1% muiden aluelennonjohtokeskusten (P 0,0001). Ero metylaatio normaalin lisämunuaisissa ja muut aluelennonjohtokeskusten oli myös tilastollisesti merkittävä (P = 0,020). Prosenttiosuus

INHAN

promoottori metylaation ACC näytteissä ei liittynyt kasvain ominaisuuksia, kuten hormonaaliset ylituotanto, van Slooten indeksi tai ENSAT vaiheessa (tuloksia ei ole esitetty).

kvantitatiivinen metyloituvuutta neljä CpG dinukleotideissä

INHAN

promoottori suoritettiin 3 normaalissa lisämunuaiset ja 19 aluelennonjohtokeskusten. Yksittäiset CpG: t on merkitty x-akselilla, jonka emäsparin numero sijaitsee 5 ’päässä ATG. 0 osoittaa, ettei metylaatio DNA taas 1 osoittaa, että kaikki DNA testattu kudosnäyte on metyloitu. Yksittäiset datapisteet koostuvat keskiarvoa kolmesta mittauksia.

Expression analyysin

INHAN

mRNA: n ilmentymisen tasot mitattiin normaalin lisämunuaisen (n = 10), lisämunuaisen kuorikerroksen liikakasvun (n = 20), adenooma (ADA, n = 11) ja ACC (n = 25) kudoksiin. Kohortti sisältyi 10 normaalin lisämunuaisen, 4 lisämunuaisen liikakasvu ja 14 ACC näytteitä, joissa

INHAN

suurenemista ilmoitettiin ennen [16]. Tästä selvityksestä kävi ilmi puuttuminen

INHAN

ilmaus 3 ACC taas toinen aluelennonjohtokeskusten osoitti monenlaisia ​​ilmaisun 0,080-220 mielivaltaista yksikköä (A.U.). Kaiken kaikkiaan ei ollut merkittäviä eroja tasojen

INHAN

ilmentymistä kaikissa ryhmissä tutkittiin (kuvio 3A). Lisäksi, mRNA-tasot on

INHAN

in aluelennonjohtokeskusten eivät liity kasvainten ominaisuuksiin (tuloksia ei ole esitetty).

(A) Quantitative

INHAN

mRNA analyysi oli verrattavissa normaaliin lisämunuaiset (Nl, n = 10), lisämunuaiskuoren liikakasvun (Hyp, n = 20), adenoomien (ADA, n = 11) ja karsinoomien (ACC, n = 25). ACC näyte kätkeminen S184F variantis näkyy avoimena ympyrä. Palkki edustaa keskiarvoa. (B) muutos rs11893842 (-124A G) liittyi muutoksiin

INHAN

geeniekspressiota. Pylväät edustavat välineet, * P 0,05. (C) Negatiivinen assosiaatio promoottorin metylaation

INHAN

geeni ja

INHAN

mRNA: n ilmentymisen (r = -0,701, p = 0,0036). (D) puuttuminen korrelaatio

INHAN

mRNA ilmaisun ja seerumin inhibiini pro-aC Z-arvosanat ACC potilailla (r = -0,473, p = 0,10).

Niistä 3 ACC näytteitä harvinaisia ​​geneettisiä variantteja

INHAN

eksonit, vain yksi oli käytettävissä ilmentymisanalyysiä; Tämän ACC kätkeminen S184F muutos osoitti normaalin

INHAN

mRNA (15 A.U., kuvio 3A, avoin ympyrä). Kun ositettu viiden yhteinen SNP vain rs11893842 geeni vaihtelu oli yhteydessä muutoksiin

INHAN

mRNA: tarkoittaa ilmaus kudoksiin AA genotyyppi oli 4,7 ± 1,9 A.U., verrattuna 26 ± 11 A.U. että AG /GG genotyyppien (P = 0,034, kuvio 3B).

Yhdistetty mRNA ja metylaation analyysit olivat käytettävissä 15 kudoksiin. Kaiken kaikkiaan oli merkittävä negatiivinen assosiaatio keskimääräisen metylaatio suhde proksimaalisen CpG-saarekkeiden ja

INHAN

mRNA ilmaisu (kuvio 3C, r

s = -0,701, p = 0,0036).

Seerumin inhibiini pro-aC tasot olivat saatavilla potilasryhmässä. Ei ollut merkittäviä suhteita seerumin inhibiini pro-aC Z-lukujen ja toisaalta metylaation suhteen (n = 9, r

s = -0,10, p = 0,81, tuloksia ei ole esitetty) tai mRNA: n ilmentymisen (n = 13, r

s = -0,47, p = 0,10, kuvio 3D) välillä. Inhibiini pro-aC tasot olivat vain yhden ACC potilaalla on harvinainen

INHAN

vaihtoehdot: tämä premenopausaalista naispotilas kolme harvinainen variantteja 5’UTR

INHAN

oli erittäin lisääntynyt inhibiini pro- aC tasot 3000 ng /l (normaali 780 ng /l).

keskustelu

inhibiini α-alayksikköä on liitetty lisämunuaiskuoren kasvainten synnyssä, koska havaittiin, että gonadectomized

Inha

– /- hiirille kehittyi lisämunuaiskuoren karsinoomien kanssa lähes täydellinen penetrance [11]. Menetys

INHAN

ilmentyminen on havaittu vain pieni alaryhmä ihmisen aluelennonjohtokeskusten [16], [17], [18], [20], [28], [29] vedoten vastaan ​​merkittävä kasvain vaimennin rooli

INHAN

ihmisen lisämunuaisen kuorikerroksen karsinogeneesissä. Tämä on ensimmäinen tutkimus, joka osoittaa, että suuret vaihtelut

INHAN

ilmentyminen aluelennonjohtokeskusten johtuu osittain metylaation ja yhteinen geneettinen vaihtelu

INHAN

promoottori ja se ei johdu harvinaisia ​​geneettisiä variantteja.

hiiren tyrmäys mallia,

Inha

uskotaan altistavan subkapsulaarista lisämunuaisen kuoren solut läpikäyvät fenotyyppisiä kytkin Gonadaalisesta kaltaisia ​​soluja [11], [12], [14]. Tämä on oletettu johtuvan parempi saatavuus TGF-β tyypin III reseptorin betaglycan johtaa lisätyn TGF-β2 signalointi [13]. Samanaikaista nousua verenkierrossa gonadotropiinin tasot voitaisiin varmistaa leviämisen Lisämunuaiskuoren solujen kautta sykliini D2-riippuvaisen reitin [30]. Vaikka histologia näistä kasvaimista muistuttaa Lisämunuaiskuoren karsinooman mies [11] ne ovat toiminnallisesti enemmän verrattavissa estrogeeni-erittävät sukurauhasakselin kaltaisia ​​soluja [12]. Olipa paikallinen knockdovvn

INHAN

ihmisen lisämunuaisen kuorikerroksen soluissa vaikuttaa lisämunuaisen kuoren kasvaimien syntyyn ei tunneta. Koska esiintyminen aluelennonjohtokeskusten osoittaa valta postmenopausaalisilla naisilla, jotka ovat nostaneet gonadotropiinia tasoa, tämä mekanismi voisi tapahtua tässä potilasryhmässä.

Aiemmat ilmaisun tutkimukset ovat paljastaneet, että inhibiini α-alayksikköä ei ilmenny pieni joukko ACC näytteiden [16], [17], [18], [20], [28], [29]. Sen sijaan,

in vivo

tutkimukset ovat paljastaneet kohonneeseen inhibiini α-alayksikön seerumissa potilailla, joilla on ACC [21], [31], [32]. Nämä havainnot ovat todennäköisesti seurausta suuren vaihtelun kasvaimen

INHAN

ekspressiotasot, nykyisen tutkimuksen yli 1000-kertainen. Syyt menetys tai vaihtelu

INHAN

ilme olivat tuntemattomia.

Yksi edellinen tutkimus on selvittänyt

INHAN

geneettisiä variantteja aluelennonjohtokeskusten. Longui

et al.

[19] tutkittu lapsipotilailla ACC potilaalla on ituradan

TP53

mutaatioita ja löysi 3 harvinainen, heterotsygoottinen

INHAN

variantit 6 ulos 46 (13%) potilailla. Näistä kolme uutta variantteja, yksi (G227A, rs12720061) myöhemmin osoitettiin olevan yhteinen SNP ja ei tapahtunut meidän ACC kohortissa. Implications kahden muun perimä (P43A ja A257T) ei tunneta; niiden ei todettu tässä tutkimuksessa satunnaista aluelennonjohtokeskusten. Mielenkiintoista, edellä mainitussa tutkimuksessa löytyi Heterotsygotian menetys (LOH) läheisyydessä

INHAN

geeni kahdeksassa yhdeksästä aluelennonjohtokeskusten tutkittu [19], mikä viittaa siihen, että LOH voi aiheuttaa vähentynyt ekspressiotasoja. Lisäksi vertaileva genominen hybridisaatio analyysejä ihmisen aluelennonjohtokeskusten kuvattu satunnaista kromosomi menetys

INHAN alue

klo 2q33-36, joista suurin lapsuudessa kasvaimissa [33], [34], [35]. Toisaalta, inhibiini α-alayksikkö on aiemmin osoitettu olevan yli-ilmentynyt lapsipotilailla aluelennonjohtokeskusten [21].

Nykyisessä tutkimuksessa kaksi uutta heterotsygoottinen missense geneettisiä variantteja havaittiin. Seriini ja fenyylialaniini substituutioita aminohapoissa 72 ja 184 saattavat vaikuttaa toiminnan tuloksena inhibiini α-alayksikköä, mutta koska toiminta inhibiini ihmisen lisämunuaisen ei tunneta [36], on vaikea tutkia vaikutuksia mahdollisesti muuttaa aktiivisuutta. Kasvain kätkeminen S184F muutos ilmaistaan ​​normaalitasolla

INHAN

mRNA, mutta toiminto tai proteiinien hajoaminen voidaan vielä vaikuttaa käyttöönotto bentsyylisivuketjuja rengas. Geneettinen variantit sijaitsee 179, 72 ja 9 bps ylävirtaan introni-eksoni rajalla voi johtaa vaihtoehtoisen silmukoinnin on

INHAN

geeni. Mikä tärkeintä, ei homotsygoottinen variantteja havaittu vedoten vastaan ​​yhteensä tyrmäys

INHAN

johtaa ACC muodostumiseen. Valitettavasti meillä oli vain yksi potilas, jolla

INHAN

variantteja ja samanaikaisesti käytettävissä seerumin inhibiini pro-aC tasolle. Tässä, korkea seerumin havaittiin huolimatta kolme vaihtoehtoa promoottorialueella nostaa todennäköisyyttä lisääntynyt promoottorin aktiivisuutta. Koska alhainen taajuus

INHAN

geneettisiä variantteja Satunnaista ja perinnöllistä aluelennonjohtokeskusten [19], nämä DNA muutokset saattavat vain olla mukana lisämunuaiskuoren tuumorigeneesiä pienessä määrässä ACC potilaista. Useita yhteisiä

INHAN

SNP havaittiin meidän potilailla. Minor alleelien rs11893842 ja rs758807 havaittiin esiintyvän ACC potilailla alemmilla taajuuksilla kuin aiemmin raportoitu terveillä ikäluokat, mikä voisi viitata siihen, että suuret alleelit näistä SNP osansa lisämunuaisen oncogenesis. Kiehtovan, vähäinen alleelin rs11893842 sijaitseva promoottorialueen lähellä ratkaiseva säätelysekvensseihin [25], [26], liittyi alhaisempi

INHAN

mRNA ilmaisun. Alempi taajuus tämän SNP ACC näytteitä näyttää olevan ristiriidassa hypoteesi, että

INHAN

on tuumorisuppressorina ihmisen ACC.

metylointi promoottorialueet tuumorisuppressorigeeneille on yhteinen mekanismi osallistuu syövän synty [23]. Vähentynyt

INHAN

ilmentymistä aluelennonjohtokeskusten voi johtua lisääntynyt metylaatio

INHAN

promoottori. Metyloinnin follistatin, mukana activin ja inhibiini signalointireitille kuin aktiviinin antagonisti, aiemmin löydetty ihmisen ACC solulinjassa H295R [37]. Nyt osoittavat, että osajoukko ihmisen aluelennonjohtokeskusten (21%), on lisääntynyt metylaation suhteen useita CpG: t

INHAN

promoottori, toisin kuin useimmissa aluelennonjohtokeskusten, jotka osoittavat alentunut metylaatio

INHAN

promoottori verrattuna normaaliin lisämunuaisen kudokseen. Tämä laaja valikoima metylaation oletettavasti osuus osa laaja

INHAN

ilmaisun alueella, mikä näkyy käänteinen suhde

INHAN

promoottori metylaatio ja

INHAN

mRNA ilmaisun. Tämä epigeneettiset muutos

INHAN

promoottori ja rs11893842 saattaa myös olla mukana lakisääteisen valvonnan

INHAN

ilmentymistä muissa

INHAN

ilmentävä kudoksissa, eli sukurauhasten ja istukan.

tasot metylaation

INHAN

promoottorin ja

INHAN

mRNA: n ilmentymisen ei liittynyt seerumin inhibiini pro-aC tasoilla. Lisäksi olemme aiemmin ei löytänyt yhdistyksen välillä pro-aC tasoilla ja kasvaimen vaiheessa tai koko [21]. Siksi nämä tasot voivat olla ensisijaisesti riippuvainen (post) muutokset translaation, kasvaimen solujen toimintaa, tai välys verenkierrosta.

Tutkimus rajoituksia ovat pienen otoskoon epävarmuus läsnäolo LOH ja onko romaani variantit ovat ituradan tai somaattiset. Koska erittäin alhainen esiintyvyys

INHAN

geneettisiä variantteja tässä merkittävä joukko 37 aluelennonjohtokeskusten, on hyvin epätodennäköistä, että

INHAN

mutaatioita on merkittävä rooli ACC muodostumiseen ihmisillä. Vaikka LOH ei ole tutkittu suoraan näistä näytteistä esiintyminen heterotsygoottinen variantit aluelennonjohtokeskusten vetoaa vastaan ​​täydellinen tyrmäys geenin. Tärkeää on vain homotsygoottinen

Inha

knock-out hiirille kehittyi lisämunuaiskuoren kasvaimia [11] pyytäen vastaan ​​Tuumorigeenisuustutkimuksissa yhden kopion numeron poisto. Lopuksi pariksi sekvensointi normaalin ja kasvainkudoksen voisi paljastaa, onko aiemmin aiemmin kuvaamaton variantit on ituradan tai somaattiset alkuperää, mutta tämä ei ollut saatavilla olevassa tutkimuksessa. Nämä havainnot osoittavat uudenlainen yhteys metylaatio ja ilmaus inhibiini. Knockdown inhibiini α-alayksikköä aikana ACC muodostumisen metylaatio saattaa altistaa yksimielisesti paracrine TGF-β tai aktiviinista toimia lisämunuaiskuoren leviämiseen tai steroidogeneesiin. Palauttaminen inhibiini ja myös follistatin [37] tasoa ACC demetyloimalla aineet saattavat edistää antiproliferatiivisia ja steroidien, joita on esiintynyt DNA: n metylaatio estäjän 5-atsa-2′-deoksisytidiini in lisämunuaiskuoren soluissa [38]. Kääntäen, metylaatio inhibiini promoottori voi olla yhteinen sääntelymekanismin inhibiini ilmaisun sukurauhasten, lisämunuaisen ja istukkakudos ja hoito demetyloivan aineilla voitaisiin spekuloitu vaikuttavan inhibiini tuotantoa näissä elimissä.

Yhteenvetona poikkeava metylaatio ja yhteinen geneettinen vaihtelu sisällä promoottorialueen

INHAN

geeni liittyy

INHAN

mRNA: n ekspression ihmisen ACC. Nämä geneettiset ja epigeneettiset

INHAN

muutokset saattavat edistää ihmisen lisämunuaisen kuoren kasvaimien syntyyn, samanlainen tilanne hiiren

Inha

tyrmäyksellä malli. Harvinaiset

INHAN

vaihtoehdot eivät näytä olevan mukana patofysiologiassa satunnaista ACC.

tukeminen Information

Taulukko S1.

Study aineisto.

doi: 10,1371 /journal.pone.0104944.s001

(XLSX) B