Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

munasarjakarsinoomat koostuttava vähintään viidestä erillisestä sairaudet: laadukasta vakavien, matala-asteista vakavien, kirkas solu, endomet-, ja mucinous. Biomarkkereiden ja molekyylitason karakterisointi voi edustaa useampaa biologisesti relevantti perusta ryhmittelyyn ja hoitoon tämän perheen kasvaimia sijaan alkuperäisistä tiloista. Molecular ominaisuudet on tullut uusi standardi kliinisen patologian, mutta kehitys on räätälöity tyyppikohtaisia ​​hoitojen haittaavat vika perustutkimuksen tunnustaa, että mallia järjestelmiä käytetään tutkimaan näitä tauteja on myös kerrostunut. Etuyhteydettömät mallijärjestelmiin tehdä tarjous arvoa tutkimuksessa biokemiallisten prosessien mutta erityinen solujen yhteydessä on sovellettava arvioimaan asiaa hoitostrategioita.

Methods

Olemme keskittyneet tunnistaa selkeä solukarsinooman solulinjassa malleja. Paneeli 32 ”munasarjasyövän” solulinjoja on luokiteltu histotypes yhdistämällä mutaation profiileja, IHC mutaatio-korvikkeita, ja validoitu immunohistokemiallista malli. Kaikki solulinjat olivat henkilöllisyys todennetaan käyttäen STR analyysiä.

Tulokset

Monet kuvattu munasarjojen selvä solulinjoilla on luonteenomaisia ​​mutaatioita (mukaan lukien

ARID1A

ja

PIK3CA

) ja yleinen molekyyli- /immunologiseen profiilin tyypillistä primaarikasvainten. Mutaatiot

TP53

olivat läsnä useimmissa korkealaatuisesta vakavasta solulinjoissa. Advanced genomista analyysiä rehellisistä kirkas cell sinoomasolulinjoja myös tukea kopiomäärä muuttuu tyypilliseen biomarkkereiden tällaiseksi

MET

ja

HNF1B

ja puute toistuvat ilmaisi uudelleen järjestelyjä.

Johtopäätökset: kuten ensisijainen munasarjakasvainten, mutaatio asema syövän geenien kuten

ARID1A

ja

TP53

ja yleinen immunologiseen profiili palvella hyvin laatimista histotype munasarjasyöpäsolujen Kuvaamme erityinen biomarkkereita ja molekyylitason ominaisuuksia uudelleen luokitella yleinen ”munasarjasyöpäpotilailla” solulinjoja osaksi tyyppi tiettyjä. Tuloksemme kannattaa käyttää prototyypin selkeitä solulinjojen, kuten TOV21G ja JHOC-5, ja kysymyksiä käyttöä SKOV3 ja A2780 malleina korkealaatuisesta vakavasta syöpä.

Citation: Anglesio MS, Wiegand KC, Melnyk N, Chow C, Salamanca C, Prentice LM, et al. (2013) Tyyppi-Specific Cell Line mallit Type-Specific Munasarjojen Cancer Research. PLoS ONE 8 (9): e72162. doi: 10,1371 /journal.pone.0072162

Editor: Goli samimi, Kinghorn Cancer Centre, Garvan Institute of Medical Research, Australia

vastaanotettu: 19 huhtikuu 2013; Hyväksytty: 07 heinäkuu 2013; Julkaistu: 04 syyskuu 2013

Copyright: © 2013 Anglesio et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: tuki tämän projektin toimitettiin Munasarjojen Cancer Research Team BC (OVCARE; https://www.ovcare.ca) kautta BC Cancer Foundation, The VGH ja UBC sairaalat Foundation ja Kanadan Institutes for Health Research (CIHR) Kehittyvät Team Grant : Henkilökohtainen siRNA-Based Nanomedicines (FRN: 111627). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

munasarjasyöpä on monipuolinen joukko sairauksia ja lukeutuvat kliinisesti merkittävä, munasarjan epiteelin syövät (EOC), ainakin viisi erillistä yksikköä olemassa [1] – [9]. Tällä yleisellä tasolla ehdot tyypin I ja tyypin II EOCs sovelletaan usein, jolloin laadukkaat vakavien karsinoomien (HGSCs) ovat tyypin II ja kaikki muut histologialtaan ovat tyypin I syöpiä [8]. Kuitenkin jopa tyypin I, erillistä yksikköä olemassa, nimittäin huonolaatuisen vakavien karsinooma (LGSC), endomet- karsinooma (ENOCa), kirkas cell carcinoma (CCC) ja mucinous karsinooma (MUC). On merkittävää tietoa viittaa siihen, että suurin osa HGSC peräisin munanjohdin epiteelin [1], [10] – [13], kun taas heikompilaatuisen serous kasvaimet ovat yleensä vielä ajatellaan syntyvän munasarjojen pintaepiteelissä – vaikka tämä suhde on olla kyseenalaiseksi [7], [14]. ENOCa ja CCC kasvaimia esiintyy taustalla endometrioosi ja voisi edustaa kirjo joutuneiden, pahanlaatuisten endometrium [15] -. Lopuksi mucinous kasvaimet ovat erittäin harvinaisia ​​ja niiden todellinen alkuperä on vaikea varmistua alaryhmiä erillisiä histologia. Niiden yhdennäköisyys muiden mucinous epiteelin pahanlaatuisten kasvainten, etenkin syöpien, on lisännyt hämmennystä niiden alkuperästä [3], [21] – [23].

Kliiniset vasteet ja epidemiologiset erot näkyvät myös välillä histotypes. Korkeatasoinen serous syövät näyttää parhaat ensimmäinen vastaus hinnat nykyinen standardi kemoterapiakäytäntö platinan ja taksaanien [24], [25]. Perinnöllinen

BRCA1- /BRCA2

mutaatioita myös näyttävät pitkälti rajoitu tähän histologia [26] – [28]. Sitä vastoin pienet histotypes tehdään usein nuoremmassa potilasryhmässä ja useammin käytettäessä pientä vaiheessa [29] – [31]. Luettelo joidenkin enemmän tuntomerkeistä välillä histotypes tyyppien on esitetty taulukossa 1.

Riippumatta alkuperästä tai histologisia yhtäläisyydet ja erot, biologisten merkkiaineiden ja genomiset tutkimukset ovat onnistuneesti käytetty kuvaamaan eri histotype ja saattavat edustavat paljon biologisesti relevantti pohjan luokitteluun ja myöhemmin hoitoon EOCs. Vaikka tämä käsite on hyvin hyväksytty, ja saada pidon tulossa uusi kliininen standardi, epäselvä solulinja mallit jatkua läpi molekyylibiologian penkki tutkimus haittaavat kehitystä räätälöityjä tyyppikohtaista hoitoja. Ne käyttävät penkki kokeilu mallijärjestelmiin on tunnustettava, kuten primaarisyöpien, käytetyt mallit tutkia näitä sairauksia on myös kerrostunut. Vaikka biokemialliset tutkimukset voivat tuottaa hyödyllistä tietoa käyttäen erilaisia ​​liity mallin järjestelmien tauti erityisiä tutkimuksia tarvitse hakea Matkapuhelinyhteydessä. Valtaosa tutkimukseen työllistää toiminnallisia tutkimuksia ”munasarjasyövän” solulinjat ei oikein selvittää taustaa niiden mallin järjestelmiä. Tuloksena päätelmiä voi olla vaikea tulkita ja arvon mahdollisia terapeuttisia kohteita voi olla epävarmaa on tosi merkitystä tietyn sairauden.

Solun linja tutkimukset munasarjasyövän on vaikeuttivat johtuen puutteellisesta huomautus of ”munasarjojen” sinoomasolulinjoja. Kerran kulttuuri, soluissa ei enää ole helposti tunnistettavissa morfologisia piirteitä tukiin histologisia luokitus. Lisäksi inhimillinen virhe, väärän etiketöinnin ja yleinen ominaisuus ”epiteelin kaltainen” solulinjoja ovat johtaneet myös sekoittaa ups solulinjoja ja saastuminen, joka on johtanut YK-tulkittavassa data [32], [33]. Vuonna postgenomiikan aikakauden, biomarkkerit ja genomin ominaisuuksia munasarjasyövän alatyyppejä ovat hyvin vakiintunut. Seulonta tekniikoita koetta biomarkkereita ja tarkistaa genomista ominaisuudet ovat myös laajalti saatavilla. Tässä esitämme paneeli biomarkkereiden ja molekyylitason ominaisuuksia poikki 32 yleisesti käytetty ja talon peräisin munasarjasyöpäsolulinjoihin. Meidän alkuperäinen tavoite oli luoda bona fide luettelo CCC solulinjojen oman tutkimusohjelman, mutta ehdotamme perustamisesta tyyppi-spesifisiä näiden solulinjojen pitäisi tuli uusi standardi suunnittelussa ja toteutuksessa kokeita ympärillä tutkimuksen munasarjan epiteelin syöpä.

Methods

Soluviljely

Soluja pidettiin kosteutetussa inkubaattorissa 37 ° C 5% CO

2. Katso taulukko S1 on luettelo solulinjojen, viljelyolosuhteet ja edistää laboratorioiden ja arkistot. Jotkin solulinjat on johdettu talon (merkitty ”VOA #”) jatkuvan

in vitro

kulttuurin ensisijainen potilaan saatu aikaan OVCARE kasvain pankki. Kaikki potilaat, joilla kudos talletettu OVCARE kasvain pankki kunhan kirjallinen suostumus kokeellisiin tutkimuksiin kuten sekvensointi, IHC kuvaamista ja johtaminen pitkäaikaisen solulinjat kudosnäytteistä. OVCARE kasvain Pankki hyväksyi tutkimuksen alla University of British Columbia ja British Columbia Cancer Agency tutkimuseettiseltä H05-60119 protokollaa.

Kaikkia solulinjoja altistettiin identiteetin testaus käyttäen STR genotyypitys (AmpFlSTR Identifiler, Applied Biosystems) osoitteessa College of American patologi n (CAP) akkreditoitu keskus Translational ja Applied Genomics (CTAG) kohti valmistaja direktiivien. Vain linjat profiilien Vastaavia julkisia arkiston kirjaa, raportoitu STR [32], ja /tai alkuperäiset potilaan kasvaimia (jos kyseessä on in-house solulinjat) säilyivät lisätutkimuksia varten.

immunohistokemia ja Laskin alatyypin Prediction (COSP) B

Solulinjat kaavittiin viljelmälevyiltä, ​​pestään 2 x PBS: llä ja pelletöityä. Solusakat suspensoitiin uudelleen ~500 ui 10% Neutral puskuroituun formaliiniin (NBF) ja annettiin kiinnittyä yön yli. Solut pelletoitiin jälleen ja uudelleen suspendoitiin Histo-geeli (Thermo Fisher) pistoke ennen parafiiniin. Kudos mikrosiru (TMA) rakennettiin, kuten aiemmin on kuvattu [4] otetaan 3 x 2 mm ydintä solulinjasta tulpat. Immunohistokemiallinen (IHC) suoritettiin 4 um: n leikkeitä Ventana Discovery XT järjestelmä kuten aikaisemmin on kuvattu [2], [34], katso taulukko S2 lisätietoja vasta käytetty. Histotype ennustus tehtiin käyttäen Laskin alatyypin Prediction (COSP) [2] kasvaimen pankkien tilassa. Kasvainten pankki tila valittiin luonteesta johtuen kiinteiden solulinjojen ja ohjataan kiinnittäminen ajan samanlainen kasvain pankki prosessi, johon tämä ennustaja oli koulutettu. Pisteytys kriteerit IHC tehtiin visuaalisesti ja seurasi tarkka ehdotettuja suuntaviivoja alkuperäisessä COSP paperin [2]. IHC for mismatch korjaus (MMR) proteiinit (taulukko S5) suoritettiin, kuten on kuvattu [35], täydellinen puuttuminen värjäyksen tahansa MMR proteiini aiheutti pistemäärä 0 (negatiivinen), ja oletetaan johtavan MMR puute.

mRNA-transkriptien

RNA uutettiin solulinjoista käyttämällä Qiazol-miRNeasy (Qiagen) protokolla ja primaarikasvaimista, 12 satunnaisesti valittua kustakin histotype, käyttäen miRNeasy FFPE (Qiagen). RNA-transkriptin tasot mitattiin käyttäen NanoString NCounter järjestelmän [36], ja tiedot normalisoidaan nSolver ohjelmisto v1.1 (NanoString Inc.) käyttäen endogeenisen kontrolligeenin (

ACTB, SDHA, RPL19, POLR1B, PGK1

), kuten per valmistajat direktiivejä. Kun kyseessä on

TFF3

mRNA katsoimme tahansa näytteen havaittavissa transkriptien olevan positiivinen ja substituoidut pistemäärä ”1” sijasta TFF3 IHC käytettäessä COSP. Havaitsemisen kynnys (DT) ja mRNA pidettiin maksimilukemaan peräisin piikki-negatiivisessa kontrollissa antureista (kaikissa solu- näytteitä) plus 2 standardipoikkeamaa. Tilastolliset testit laskettiin käyttäen GraphPad Prism v6.0c ohjelmisto.

mutaatio testaus ja Perimän analyysi

Genominen DNA uutettiin käyttämällä standardimenetelmiä (Gentra Puregene kit, Qiagen). Alueet kattavat mutaatioita tunnettujen merkitys (Cancer hotspot) olivat Sanger sekvensoitiin käyttämällä M13-merkitty alukkeita. Sekvenssointi

ARID1A

tehtiin yhdistämällä mukautetun hybridi talteenoton ja transcriptome sekvensointi koskevasta Illumina GAII seuraavan sukupolven sekvensointi (NGS) järjestelmä kuten aiemmin on kuvattu [16], [37]. Associated raakadata on talletettu NCBI Sequence Lue Archive alle BioProjects PRJNA209481, PRJNA209482, ja PRJNA209484. Kaikki pani muunnokset joko varmistettiin Sangerin sekvensoinnilla tai pidetä validoitu jos kirjattu Cancer Cell Line Encyclopedia (CCLE) [38] ja /tai COSMIC tietokantaan [39]. Ilmaistuna uudelleen järjestelyjä ennustettiin transcriptome sekvenointitulosten CCC solulinjojen TOV21G, JHOC-5, JHOC-7, JHOC-9, ja RMG-2 käyttäen laukaisemiseksi [40] (taulukko S3).

Kopioi numero analyysi

DNA kopioluku oli päätellä Affymetrix SNP 6,0 genominlaajuisten mikrosiruja. Arrays ajettiin kohti valmistajien direktiivien ja kopioluvun suhde syntyy parittoman viite. Havaitseminen kopioluvun muuttunut alueilla tehtiin käyttäen segmentointialgoritmi. Kaikki analysointi ja visualisointi toteutettiin Partekin Genomics Suite 6.6, raakadata on saatavilla NCBI GEO [liittymistä GSE48351].

Tulokset

Histotype mukaan COSP munasarjasyövän solulinjoissa

Munasarjasyöpä solulinjoja viljelmässä eivät ilmaise histologisia fenotyypit, jotka ovat hyödyllisiä luokittelun avulla merkittävä sairaus tyyppejä. Ryhmämme on kuvattu suuri määrä immunohistokemiallisella biomarkkerit, jotka osoittavat tiettyjen profiilien poikki näiden histotypes [4], [41] – [43]. Ydin paneeli 9 IHC markkereita yhdistettynä ennustavan algoritmin Laskin Munasarjojen alatyypin Prediction (COSP), voidaan luotettavasti erottaa tyyppien [2]. Olemme aiemmin osoittaneet korkeaa välistä yhdenmukaisuutta ennakoivaan immuuni-luokittelija ja konsensus asiantuntija gynecopathological tarkastelu [2],. Aluksi, olemme soveltaneet tätä paneelia (kuvio 1A-B), ja COSP ennustavan algoritmin, 32 munasarjasyövän solulinjoissa epäselvä histotype luoda, jos solulinjoja säilytetään edustaja ominaisuudet riittävät siihen solulinjat todellisen taudin alkuperän ja mahdollistavat tyyppi erityisiä munasarjasyöpä mallin kehittämiseen. TFF3 IHC merkki, joka on tavallisesti vahvasti liittyy mucinous tyyppiä ja nähty kohtalainen taajuus ENOCa ja LGSC [2], oli negatiivinen kaikissa näytteissä (taulukko S4), mikä viittaa tämän erittyy tekijä, jos ilmaistu ollenkaan, voidaan karkottaa nopeasti soluista ja pestä pois mediassa. Näin ollen, TFF3 IHC voi olla luotettava biomarkkeri mittaus käytettäväksi soluviljelmässä. Kuitenkin esiintyvyys

TFF3

mRNA perusnäytteiden näytti samankaltainen kuin IHC [2], [44], jossa jatkuvasti suurempi ilmaisua mucinous karsinoomia (p 0,01; Fig. 1 C). Meillä on siis korvannut havaittavissa

TFF3

mRNA IHC ja teki mitä tahansa solu- linjassa havaittavissa mRNA kuin ”1” meidän COSP algoritmin (Fig. 1D ja taulukko 2).

(A-B) edustaja IHC tyypillisestä korkealaatuisesta serous munasarjasyöpäsolulin- linja, Kuramochi, ja selkeä cell carcinoma solulinjassa, TOV21G. Sen lisäksi, että 9-markkeri COSP paneeli, IHC varten ARID1A (BAF250a) on esitetty myös mutaation korvike. (C)

TFF3

mRNA-ilmentymisen 60 munasarjasyöpä näytteitä (12 kustakin histotype). Kuten aikaisemmin on korkea ekspressio on yleisin MUC, minkä jälkeen ENOCa ja LGSC [2], [4]. Expression meidän pilot kohortin ehdottaa korkeimman TFF3 MUC, joka oli huomattavasti korkeampi kuin kaikki muut ryhmät (Tukeyn oikaistu p 0,01); ei muuta pareittain vertailut oli p 0,05. (D)

TFF3

mRNA havaittiin munasarjasyövän solulinjoissa sijasta käytettiin sellaisen IHC pisteet kuin eritetyn TFF3 pidettiin huono biomarkkeri soluviljelmässä olosuhteissa. Mikä tahansa solulinjan mitattavissa

TFF3

mRNA yläpuolella NanoString Erotuskynnys (katso menetelmät) katsottiin positiiviseksi (pistemäärä 1 käytettäväksi COSP algoritmi).

Monet aiemmin kuvattu CCC linjat osoittivat varustelu ominaista niiden odotetaan alkuperää. Lisäksi COSP 9-markkeripaneelissa, lisäsimme IHC varten ARID1A (BAF250a). Koska voimakas negatiivinen yhdistyksen mutaatiostatus ja havaittavaa proteiinin ilmentyminen [16] me pidetään tässä määrityksessä korvikkeena mutaatiotesti hyödyllinen erottelevat endometrioosia liittyvät munasarjasyövän muista alatyyppeihin, erityisesti korkea-asteen vakavien, kuten

ARID1A

mutaatiot näyttävät olevan erittäin harvinaista tässä alatyypin [16], [45].

mutaatioiden: Tyhjennä solu erityisiä molekyyli ominaisuuksia

seuraavaksi testasimme solulinjojen mutaatioita yhteiseen munasarjasyövän liittyy geenien (taulukot 2 ja S5). Koska jotkut solulinjat testasimme myös osa suurempaa Cancer Cell Line Encyclopedia (CCLE) arkiston datajoukon [38], me rajat validoitu meidän mutaatio testauksen tällä tietokantaa sekä COSMIC-tietokannan [39]. Keskityimme alueisiin tunnettujen merkitystä yleisin syöpä geenien myös kuormittajat

BRAF, KRAS, sääntelyviranomaisten, erbB2, EGFR, CTNNB1, PIK3CA, PPP2R1A

ja

DICER1

. Kaikki koodaus eksonit

TP53

tarkastettiin kaikissa solulinjoissa.

ARID1A

mutaatioita testattiin käyttämällä mukautettua NGS geeni hybridi kaapata strategia [37] in RMG-1, RMG-2, JHOC-5, JHOC-7, JHOC-9, TOV21G, ja ES-2; Kaikkien muiden solulinjojen käytimme

ARID1A

tietoja COSMIC ja CCLE lisäksi IHC kuin

ARID1A

mutaatio-testaus korvike (taulukko 2).

Kuten meidän IHC data useimmat CCC linjat ylläpitänyt profiilin sopusoinnussa CCC histotype lukien mutaatiot

PIK3CA

ja

ARID1A

. Edelleen, menetys ARID1A ilmaisun osoituksena IHC, osoitti hyvää yhteensopivuutta läsnäollessa tunnettujen lyhennetty mutaatioita, kuten totesi primaarikasvaimen yksilöiden [16]. Kuten odotettua IHC p53 korreloivat hyvin mutaatioiden. Sillä solulinjoja, joissa on tallennettu mutaatio (at toimitettaessa) joko CCLE tai COSMIC kaikki havaitut mutaatiot Hyväksytty arkistosta kirjaa, lukuun ottamatta homotsygoottinen /hemizygous 127 emäsparin deleetio

TP53

havaittu MCAS. Oletamme, että 127-emäsparin deleetio MCAS (lopussa eksoni 4, Fig. S1) on saattanut jäädä huomaamatta, että CCLE eksonin sekvenssointistrategia kuin kokemuksemme vääriä negatiivisia ovat yleisiä NGS aineistoja. Kaiken lisäksi mutaatio tiedot olivat erityisen hyödyllinen tukemassa alkuperäisen luokittelun COSP (taulukko 2).

pani merkille, että useat solulinjoja käytetään usein korkealaatuista serooseista malleja tai yleisesti nimitystä ”munasarjasyöpäpotilailla ”oli molemmat

ARID1A

mutaatioita ja immunologiseen profiilien sopusoinnussa endomet- tyyppiä, kolmanneksi yleisin kirjanpito alle 10% munasarjan karsinoomien [3], [4]. Yhdessä immunologiseen luokittelu läsnäollessa

ARID1A

mutaation avulla on saatu näyttöä kuin HGSC alkuperää. Ilmaantuvuus

TP53

ja

ARID1A

mutaatio oli lähellä toisiaan poissulkevia poikkeuksin on IGROV1 ja 2008. IGROV1 kannattaa kahta kehyssiirtymän mutaatiota

ARID1A

(p.M274fs /p.G1847fs) ja mutaation tuntemattomien merkitystä

TP53

(p.Y126C (het)), vaikka p53 ilmentymistä IHC vaikuttivat normaaleilta. Vuoden 2008 solulinja oli havaittavissa ARID1A, mikä viittaa lakkaa toimimasta, ja teki myös kaksi

TP53

mutaatioita (c.572_574 delCTC (het) /c.673-1 G T (het, silmukoitumiskohta)) ja vastaava p53 IHC yli-ilmentymisen. Nämä epätyypillinen yhdistelmiä mutaatio voisi uskottavasti selittää taipumus kerääntyä mutaatioita solulinjoissa DNA mismatch korjaus (MMR) puutteet, kuten on raportoitu IGROV1, SKOV3, ja A2780 [46], [47]. Olemme validoitu MMR-reitin proteiinin ilmentymisen IHC varten MLH-1, PMS-2, MSH-2, ja MSH-6 (taulukko S5) ja havaittiin menetys kahden tai useamman MMR proteiineja IGROV1, SKOV3, A2780 TOV21G, COLO-704 ja COLO-720E; no MMR proteiini puutos todettiin vuonna 2008 solulinjassa.

Kopioi numero profiilien selvä solulinjojen

Koska meidän ensisijaisena tavoitteena oli kuvata CCC solulinjojen muodostimme kopiomäärä profiilit bona fide CCC solulinjoja käyttämällä Affymetrix SNP6.0 mikrosiruja. Yhdenmukaisia ​​aiempien raporttien primäärikasvain näytteitä, CCC linjat osoittivat kohtalaisesta kopioluvun poikkeavuuksia, mikä viittaa genomin, joka on tehty jonkin verran perimän epävakaisuuden.

Rajallinen määrä kirjallisuutta tapahtumat ovat osoittaneet geenien mutaatioita, yliekspressio ja /tai vahvistusta keskuudessa ensisijainen CCC, jotkut joiden suhde selviytymisen tai edenneen taudin [4], [16], [45], [48] – [59]. Kuten havaitaan mutaatio profiileja, meidän rehellisistä CCC solulinja paneelissa edusti selkeää-soluun kopioluvun muutoksia (kuvio 2, taulukko 3). Useimmat osoittivat vaatimaton kopioluku voittoja

HNF1B

(5/7) ja

MET (4/7) B, joista yksi korkean tason vahvistusta (JHOC-5), samanlainen kuin aikaisempien raporttien CCC kasvaimia [53], [56], [57]. Vaikka 3/7 CCC linjat osoittivat kopiomäärä voitto

erbB2

, kaikissa tapauksissa amplikonin segmentti kattaa myös läheisen CCC biomarkkereiden

HNF1B

, eikä kukaan oli positiivisia HER2-proteiinin ilmentyminen IHC ( ei näytetty). Kopioi numero menetys noin

TP53

havaittiin vain yksi CCC solulinja (OVMANA; heterotsygoottinen tappio) ja, kuten edellä mainittiin, kaikki CCC rivit näytti olevan normaali-ilmaisun malli p53 (IHC pisteet 1 ).

laaja valikoima kopioluvun muutoksia havaitaan myös tyypillisiä CHR8 voitot ja CHR 17 voitot ympäröivä CCC biomarkkereiden

HNF1B

geeni, katso myös taulukko 3.

transcriptome profiilia selkeä solulinjojen

Kuten muidenkin munasarjasyöpäpotilailla tyyppejä, toistuvat translokaatiot joukossa CCC ei ole kuvattu, vaikka vain pieni määrä tutkimuksia on tehty [16]. Meidän transcriptome sekvensointi tietoja RMG-1, RMG-2, JHOC-5, JHOC-7, JHOC-9, TOV21G, ja ES-2 viittaa toistuvat ilmaisi uudelleenjärjestelyt ovat ainakin harvinaisia ​​ja ei havaittu joukossa näistä solulinjoista. Kohtalainen määrä ilmaistaan ​​sekä yksilöiden välinen kromosomi uudelleenjärjestelyt olivat havaittavissa (taulukko S4), vaikka kaikki olivat ainutlaatuisia sellaisenaan kunkin solulinjan; jotkut olivat nähtävissä monivärisiä FISH (kuva 3). Sekä ilmaistuna ja ei-ilmaistu translokaatiot johtaen geenin voitto /tappio toiminto tai promoottorin vaihto voi toimia vaikuttaa reitin aktivointi, ja ilmaisee yleisesti, profiilit CCC. Systemaattinen analyysi katsottiin kuulu tämän tutkimuksen ja tällä hetkellä puuttuminen vastaavan tietopohjaa johdetut CCC kasvaimista vertailua.

Useat Translokaatiokantajat ja uudelleenjärjestelyjen näkyy jokaisessa edustavassa klooni. Monimutkainen karyotype Kunkin hallitseva kloonia huomautetaan alle vastaavan 24-väri FISH tuloksia. Kaikkia johdannainen kromosomia tunnistettavissa jolloin suuri määrä epäselvä translokaatioita ja fragmentit (merkitty kysymysmerkkejä karyotyypin merkinnät). (B) Circos käyrä RNAseq data ja purkaa analyysi kuvaa ilmaistu genomista uudelleenjärjestelyjä vuonna JHOC-9 solulinjan. Translokaatioita nähdään 24-väri FISH profiilin näkyvät myös ilmaistu selostukset lukien t (8; 19) havaittiin sekä 2 N ja 4N hallitseva klooneja. Ei toistuva toiselle siirtäminen nähtiin koko meidän sarja (katso myös taulukko S3).

Keskustelu ja päätelmät

Koska meidän ensimmäinen tavoite oli tunnistaminen bonafide CCC solulinjojen, meillä on ilo ilmoittaa että suurin osa raportoitu CCC riviä edustivat primäärikasvaimissa ”molekyyli- ja patologisia fenotyypin. Meidän immuno-luokitus järjestelmä, COSP, ennustaa useimpien mielestä CCC ja oma mutaatio tiedot, samoin kuin kosmisista ja CCLE, ehdotti toimintakyvyn menetystä

ARID1A

mutaatiot olivat yleisempiä näissä solulinjoissa. Vaikka kolme CCC riviä ei ole tunnistettavissa

ARID1A

mutaatiot, vain JHOC-5-solut näyttivät olevan sekä villityypin sekvenssin ja havaittavissa proteiinin ilmentymiseen. Määrä ARID1A ”normaali” CCC linjat on alhaisempi kuin voitaisiin olettaa taajuus

ARID1A

mutaatioita (ja negatiiviset IHC) havaittiin ensisijaisen CCC [16], [45] ja saattaa ilmoittaa joidenkin etuuskohteluun valinta

ARID1A

null CCC linjat sopeutua

in vitro

kulttuuriin. Kuitenkin, koska vain pieni otoskoko se saattaa hyvinkin olla sattumaa ja ei näytä olevan merkittäviä. Muut havaitut mutaatiot (

PIK3CA

,

PTEN

,

KRAS

,

PPP2R1A

) ovat kaikki yhdenmukaisia ​​vaihtelevia taajuuksia CCC.

TP53

mutaatiot ovat huomattavasti poissa kaikessa validoitu CCC solulinjoista, kuten de-facto ominainen piirre, ja vain yksi CCC linja oli heterotsygoottinen kopiomäärä menetys mutta silti säilyttänyt normaalin kaltainen p53 IHC.

sekä CCC ja ENOCa näyttävät kertyvän taustalla endometrioosi. Epätyypilliset endometrioosi vieressä, tai sen vieressä, joko histotype ei ole epätavallista myöskään CCC tai ENOCa [16], [60], [61]. Co-esiintyminen (joskus vierekkäin) sekä CCC ja ENOCa histologialtaan mixed-solutyyppiä kasvain on raportoitu [62] (ja tohtori Blake Gilks, henkilökohtainen tiedonanto). Mutaatioiden lukien

ARID1A

ja

PIK3CA

, ovat yhteisiä molemmille, yleinen tukemalla liittyvä alkuperä ja samanlainen reitti muutosta [16], [45], [48], [49] . Huomasimme, että molemmat ES2 ja OVISE solulinjoissa, kuulemma peräisin CCC, pitkälti muistutti immunologiseen profiilit ENOCa. Käänteisesti 2008 solulinjaa, kuulemma peräisin vakavasta kohdunkaulan [63], vaikka usein kutsutaan ENOCa [64], esiintyi enemmän CCC kaltaisia ​​päässä COSP yksin. Vuoden 2008 linja ei näytä mutantti p53 värjäystä ja kaksi vahvistanut

TP53

mutaatioita, epätyypillisiä totta CCC. IHC oli negatiivinen ARID1A, joka tukee ei-serous alkuperää. Suosimme toimeksiantona ENOCa pohjan pitkälti

TP53

mutaatio kuitenkin huomata, että tämä solulinja on varsin epätyypillinen, sillä se voi kuljettaa lakkaa toimimasta muutosten ARID1A, mutaation

TP53

, ja on positiivinen CCC biomarkkereiden HNF1B. Todennäköisesti virheet solulinjassa histotype raportit voidaan selittää yksinkertaisesti historiallisen huono toistettavuus solutyypissä tehtävän, vaikka se ei ole ennalta arvaamaton, että biologinen suhde CCC ja ENOCa voitaisiin vaikuttamalla nämä fenotyypit. Kun otetaan huomioon korkea verran päällekkäisyyttä mutaatioprosessiin ominaisuuksien CCC ja ENOCa, meidän paneeli ei voinut entisestään eristää tai selventää tätä ilmeistä sekaannusta. SKOV3 on toinen ainutlaatuinen asia, koska se on immunoblottaus fenotyyppi lähimmin HGSC, mutta se karieksen Typistävä mutaatio

ARID1A

, mutaatio, joka ei ole havaittu HGSC huolimatta laajalti testaus [16], [45]. Aiemmat tutkimukset SKOV3 ovat osoittaneet selvän kennomainen histologia kun kasvanut ksenografti [64], ja tämä voi myös suosia endometrioosi liittyvä munasarjasyövän diagnoosia tekee läsnäollessa

PIK3CA

mutaatio. Lopuksi TOV112D solulinja esittää myös poikkeuksellisesti jossa kohtalaisen vahva ennusteen HGSC immunologiseen fenotyyppi. Tästä huolimatta havainto ehdotamme tämän linjan on tyypillinen

TP53

mutantti ENOCa, joka perustuu läsnä ENOCa ominaisuus

CTNNB1

mutaatio, patologinen tarkastelu primaarikasvaimen materiaali peräisin laboratorion ja ilmaisun profilointi kokeet tukevat tätä päätelmää [65]. Ehdotamme, että nämä epätyypillisiä CCC /ENOCa voivat olla käyttökelpoisia tutkimiseen joitakin yhteisiä endometrioosi liittyvä munasarjasyövän biologia vaikka hoito olisi tehtävä, jotta asianmukainen tulosten tulkintaa.

Valitettavasti COSP työkalu ei pysty erottamaan LGSC . Perustuu asiantuntija uudelleentarkistusta perusmateriaali olemme tietoisia kaksi johdetut solulinjat LGSC primaarikasvaimia. Siksi luottavaisesti suosivat tätä luokittelua VOA1056_CL ja VOA1312_CL huolimatta ennustuksia HGSC tai ENOCa saatu COSP. VOA1056_CL rivi kantaa Ras-reaktiotien mutaatio kuten voisi olettaa olevan LGSC kasvain, mutta tämä on sääntelyviranomaisten Q61R aktivoiva mutaatio. Aktivointi sääntelyviranomaiset mutaatiot äskettäin kuvattu LGSC vuoden 2012 AACR vuosikokouksessa [66] kuitenkin, tämä edustaa ensimmäistä validoitua raportista

sääntelyviranomaisten

mutantti LGSC kasvain ja ensimmäisen validoitu LGSC solulinjaa kuljettaa tämän mutaation. Kosminen tietokanta ehdottaa solulinjoista LK-1 (G12D; määritellään munasarjasyövän jota ei ole yksilöity) ja TYK-nu (G12D ja Q61K; määritellään munasarja- ”serous karsinooma”) myös suorittaa aktivoimalla

sääntelyviranomaisten

mutaatioita emme kuitenkaan pysty hankkimaan näissä solulinjoissa vahvistamaan /hylätä niiden histologista identiteettiä. Kun on kyse LGSC solulinjoissa in-house, mutaatiot

TP53

ei havaittu, sopusoinnussa IHC perustuu kirjallisuuteen raporttien mukaan tämä on suuri molekyyli diskriminaattorin välillä HGSC ja LGSC [67].

Lopulta vain yksi solulinja mallistomme oli raportoitu olevan mucinous syöpä alkuperää. Mutaatio profiili Tämän solulinjan on sopusoinnussa tämän diagnoosin, mukaan lukien 127 emäsparin

TP53

homotsygoottinen poisto, yliekspressio IHC, ja

KRAS

G12V mutaatio.

Cell line kirjaa munasarjan epiteelin syöpä on viime aikoina kyseenalaiseksi useita saastunut ja tarpeeton solulinjoja myönsi tuoreessa tutkimuksessa [32]. Selkeimmin 2008 (aka. Ov2008) oli kuitenkin usein kontaminoitunut tai mislabeled versio, HPV-positiiviset ME-180-solulinja (ATCC HTB-33), ”todellinen” HPV-negatiivinen 2008 linja määritellään raportti Korch et al. [32], on se, jota käytettiin tutkimukseen. Ylläpitäminen asianmukaiset tiedot, testaus ja, mikä tärkeintä, uudelleen testaus identiteetin solulinjojen kussakin laboratoriossa varastot pitäisi olla ensiarvoisen vaikka solulinjat saadaan suoraan arkistot. Kirjoittajat raportoivat vain solulinjoilla joka vastasi peräisin arkiston STR DNA tai STR profiilia niiden peräisin primaarikasvaimia (jos kyseessä on in-house peräisin riviä). Huolimatta oman parhaansa meidän harjoitus teki saadaan löytö 3 solulinjojen omissa varastoja, jotka olivat joko luokiteltu väärin tai pilaantunut myös meidän alkuperäinen varasto 2008 solulinjan edellä mainittiin. Saastunut linjat on sittemmin hylätty /korvattu. On huomattava, että yksikään määritykset on suunniteltu tai testattu syrjiä munasarjojen ei-munasarjojen maligniteettien, ja vaikka STR analyysi olisi poistanut mitään ilmeisesti uros syöpiä (kautta havaitseminen Chr Y markkereita), jonkin verran tarkkuutta arkistossa raportoitu alkuperä of ”munasarjojen” on oletettava. Siinä tapauksessa, että enemmän epätyypillisten solulinjoissa on mahdollista nämä voivat olla ei-munasarjojen alkuperää, esim. endometriumin karsinoomien tai muiden vatsakalvon syöpien tuntemattomien ensisijainen, emme tällä hetkellä pysty arvioimaan tätä ajatusta. Lisäksi meidän analyysi voidaan sekoitti hallitseva laajeneminen harvinainen kasvain sub-klooneja [68], hankinta spontaaneja mutaatioita kasvatuksen aikana, ja MMR puute (joko hankittu tai läsnä peräisin primaarikasvaimen). MMR puutteet on raportoitu olevan vallalla endometrioosi liittyvän munasarjojen syöpiä (CCC ja ENOCa) [69] – [72] ja mahdollisen hankinnan mutaatioiden seurauksena MPR puute voi vaikuttaa joihinkin enemmän epäselvä biomarkkereiden fenotyypit Tässä ryhmässä sekä havaita epätyypillinen mutaatio kuvioita. Totesimme MMR puutteita ei-vakavien linjat TOV21G, SKOV3, A2780, ja IGROV1 sekä HGSC solulinjat COLO-704 ja COLO-720E (taulukko S5). MMR-proteiinin puutteita ei havaittu meidän talon peräisin LGSC solulinjoja (tai niiden vastaavat primaarikasvaimille) tai mucinous karsinooma linja MCAS.

kirjossa munasarjojen karsinoomat, viimeaikaiset todisteet tukee voimakkaasti diagnoosia ja kohtelu viisi suurta histotypes syöpäkasvainten erillisinä sairauksia.