Krooninen sairaus

tiivistelmä

MikroRNA (miRNA) ovat luokan pienen Koodaamattomat RNA-molekyylejä, jotka tärkeä rooli syövän synnyn ja syövän etenemiseen. Tässä tutkimuksessa selvitimme roolit ja mekanismit miR-140 ihmisen ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC). Huomasimme, että miR-140 on merkittävästi vaimentua NSCLC kudoksissa ja solulinjoissa. Sekä voitto-of-function ja menettämisestä toiminnon tutkimukset osoittivat, että miR-140 tukahduttaa NSCLC solujen lisääntymisen, migraation ja invaasion in vitro. Tärkeää on, yli-ilmentyminen miR-140 tehokkaasti tukahdutettu kasvaimen kasvua ja etäpesäkkeiden paljaan hiiren malleissa. Integroitu analyysi tunnistettu IGF1 R välittömänä ja toiminnallinen kohteena miR-140. Knockdovvn IGF1 R estivät solujen lisääntymistä ja invaasiota, joka muistuttaa miR-140 yliekspressio, kun taas yli-ilmentyminen IGF1 R vaimenee toiminnan miR-140 NSCLC soluissa. Yhdessä meidän tulokset korostavat merkitystä miR-140 ja IGF1 R kehittämiseen ja etenemiseen NSCLC.

Citation: Yuan Y, Shen Y, Xue L, Tuuletin H (2013) miR-140 esti syövän kasvua ja etäpesäke ei-pienisoluinen keuhkosyöpä by Targeting Insuliini kasvutekijä 1 -reseptorin. PLoS ONE 8 (9): e73604. doi: 10,1371 /journal.pone.0073604

Editor: Stephanie Filleur, Texas Tech University Health Sciences Center, Yhdysvallat

vastaanotettu: toukokuu 26, 2013; Hyväksytty: 24 heinäkuu 2013; Julkaistu 10 syyskuuta 2013

Copyright: © 2013 Yuan et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Kirjoittajat ei ole rahoitusta tai tukea raportti.

kilpailevat edut: kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Keuhkosyöpä on numero yksi syy syöpää liittyvä kuolema maailmanlaajuisesti, ja ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC) kattaa vähintään 80% kaikista keuhkosyöpää [1,2]. Huolimatta viimeaikaisista edistysaskeleet diagnosointiin ja hoitoon tämän syövän, maailmanlaajuinen kuolleisuus NSCLC pysyy korkeana, ja 5 vuoden kokonaiselossaoloaikaa saaneiden NSCLC on synkkä 11% [3]. Koska tämä, hyvä käsitys molekyylitason mekanismeista NSCLC kehittymisen ja etenemisen tarvitaan kiireesti.

MikroRNA (miRNA) ovat luokan pienen Koodaamattomat RNA-molekyylien että negatiivisesti säätelemään kohdegeenien joko mRNA: n hajoamisen tai translaation estäminen [4]. miRNA voi säätelemään erilaisia ​​kohdegeenien; Siksi ne ovat mukana monenlaisia ​​biologisia prosesseja myös solujen jakautumista, apoptoosia, erilaistumista ja muuttoliike [5-7]. Viime aikoina yhä enemmän todisteita osoittaa, että epänormaali ilmentyminen miRNA korreloi erilaisia ​​syöpiä, ja että miRNA voivat toimia onkogeenien ja tuumorisuppressoreita [8,9]. Vuonna keuhkosyöpä, useita miRNA, kuten let-7 perhe, miR-200, miR-486 ja miR-146a on tunnistettu tuumorisuppressoreilla [10-14]; Toisaalta, miR-31, miR-212 ja miR-196a havaittiin edistää NSCLC karsinogeneesi [15-17].

miR-140 on saanut paljon huomiota, koska se on mukana kehittämässä ja etenemiseen erilaisten syöpien, mukaan lukien rintasyövän, osteosarkooma, paksusuolen syöpä ja hepatosellulaarinen karsinooma [18-20]. Nämä havainnot viittaavat siihen, että miR-140 toimii kasvaimen vaimennin rooli näiden syöpien; kuitenkin tietojemme mukaan sen tehtävät ja mahdolliset mekanismit NSCLC jää epäselväksi. Tässä tutkimuksessa, tarjoamme ensimmäinen näyttöä rooli miR-140 NSCLC kasvainten synnyssä ja etenemisessä, ja osittain valottaa molekyylimekanismin taustalla tätä vaikutusta. Huomasimme, että miR-140 on vaimentua NSCLC kudoksissa ja solulinjoissa. Yli-ilmentymisen miR-140 esti kasvaimen kasvua, invaasio ja etäpesäkkeiden NSCLC soluja. Lisäksi tunnistimme IGF1 R tavoitteeksi geeni miR-140 ja vahvisti, että miR-140 kykenee sen vaikutus kasvaimen kasvun inhibition ja etäpesäkkeiden mukaan vähen- tämisessä IGF1 R. Meidän havainnot osoittavat uutta roolia miR-140 tuumorisuppressorina NSCLC.

Materiaalit ja menetelmät

Patient näytteiden ja solulinjojen

Ihmisen NSCLCs ja niiden vastaaviin normaaleihin kudoksiin (vähintään 5 cm: n päässä primäärikasvain) saatiin 30 potilasta Zhongshan sairaala, Fudanin yliopiston (Shanghai, Kiina). Kudokset olivat pikajäädytettiin nestemäisessä typessä ja säilytettiin -80 ° C: ssa, kunnes RNA. Kirjallinen suostumus saatiin kunkin potilaan ja tämän tutkimuksen hyväksyi Medical Ethics and Human Clinical Trial komitean Zhongshan sairaalassa. Viisi NSCLC solulinjoja (A549, SK-MES-1, H157, H520 ja H460) ja normaali keuhkojen keuhkoputken epiteelisolujen linja BEAS-2B hankittiin American Type Culture Collection ja viljellään DMEM (Thermo Scientific HyClone, Peking, Kiina) jota oli täydennetty 10% naudan sikiön seerumia, 100 U /ml penisilliiniä ja 100 mg /ml streptomysiiniä (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Kaikki solut inkuboitiin 5% CO

2 kosteassa ilmakehässä 37 ° C: ssa.

RNA: n eristys ja kvantitatiivinen reaaliaikainen PCR (qRT-PCR) B

RNA eristettiin kudoksista ja solulinjoja käyttämällä TRIzol-reagenssia (Invitrogen) mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Ilmaisu kypsä miRNA määritettiin käyttäen TaqMan MicroRNA määritykset (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Kaksivaiheinen qRT-PCR työllistetyt alukkeina miR-140 suunnitellut Applied Biosystems. U6 snRNA monistettiin sisäisenä kontrollina. qRT-PCR-analyysit

IGF1 R

ja

β-aktiini

suoritettiin käyttämällä SYBR Esiseos Ex Taq (Takara Bio, Dalian, Kiina). Käytetyt alukkeet olivat seuraavat: IGF1 R forward-aluke, 5′-GAGAAGGAGGAGGCTGAATACCG-3 ’; IGF1 R reverse-aluke, 5’-GTGATGTTGTAGGTGTCTGCGGC-3 ’; β-aktiini-forward-aluke, 5’-AGTGTGACGTGGACATCCGCAAAG-3 ’; ja β-aktiini reverse-aluke, 5’-ATCCACATCTGCTGGAAGGTGGAC-3 ’. Reaaliaikainen PCR suoritettiin käyttäen ABI 7900 reaaliaikainen PCR-kone. Suhteellinen ilmentyminen Kunkin geenin laskettiin ja normalisoitu käyttämällä 2

-ΔΔCt menetelmä suhteessa U6 snRNA tai β-aktiini.

lentivirustartunnat infektio ja oligonukleotidia transfektion

miR-140 esiaste ja IGF1 R siRNA ostettiin Origene (Rockville, Maryland, USA). Pre-miR-140-sekvenssi, ja IGF1 R siRNA-sekvenssi kloonattiin pCDH-CMV-MCS-EF1-coGFP konstruktit (System Biosciences, California, USA). Tuotanto ja puhdistus lentivirus suoritettiin aikaisemmin kuvatulla tavalla [21]. Kohdesoluja (1 x 10

6) infektoitiin 1 x 10

7 lentivirus muunninlaite yksiköiden että läsnä oli 10 ug /ml polybreeniä (Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA). Tyhjä lentivirusvektoriannos käytettiin kontrollina. MIR-140 estäjä ja negatiivinen kontrolli saatiin Genepharma (Shanghai, Kiina). Oligonukleotidi transfektio suoritettiin käyttäen Lipofectamine 2000 reagenssia (Invitrogen) mukaisesti valmistajan protokollaa. Solut kerättiin 48 tuntia transfektion jälkeen.

Plasmidi rakentaminen ja lusiferaasireportteri- määritykset

koodaava sekvenssi IGF1 R ostettiin Origene ja kloonattiin pcDNA3.1 (+) tuottamiseksi IGF1 R ekspressiovektoreihin. Villityypin IGF1 R 3 ’UTR (WT) monistettiin seuraavilla alukkeilla: 5′-ATACTCGAGTTTCCATGCAACCTCCTTCTGC-3′ (eteenpäin) ja 5’-AGCAAGCTTTCCATCTTCCAAGGAGGAGGCT-3 ’(taaksepäin). Endonukleaasi restriktiokohdat (

Xho

I /

Hin

HindIII) sisällytettiin alukkeiden helpottamaan ligaatiota pGL3 Basic Vector (Promega, Madison, WI, USA). Kohdennettu mutageneesi on miR-140 siemenen sekvenssin IGF1 R 3′-UTR (Mut) suoritettiin käyttäen QuikChange ™ Site-Directed Mutagenesis Kit (Stratagene, La Jolla, CA, USA). Lusiferaasin määrityksiä, toimittaja plasmidi kotransfektoitiin kontrollina Renilla sivektorissa A549 ja H157-soluissa, kun läsnä on joko miR-140 tai miR-ohjaus. 48 tunnin kuluttua solut kerättiin talteen, ja lusiferaasiaktiivisuus mitattiin käyttämällä Dual-Luciferase Reporter Assay System (Promega, Madison, WI, USA).

Solujen lisääntyminen, solusyklin ja apoptoosin analyysit

Soluja (2 x 10

3) ympättiin 96-kuoppaisille levyille 100 ul: ssa viljelyalustaa ja viljeltiin. Leviämisen solujen määritettiin ilmoitetuissa aikapisteissä käyttämällä CCK-8 Kit (Dojindo Laboratories, Kumamoto, Japani) mukaan valmistajan ohjeiden. Solusyklin analyysi tartunnan tai transfektoidut solut kiinnitettiin 75% etanolilla ja värjättiin 50 ug /ml propidiumjodidia (PI). Solusyklin jakautumisen analysoitiin FACScan fl ow sytometrillä (BD Biosciences, Bedford, MD, USA). Solujen apoptoosin analyysit suoritettiin käyttämällä anneksiini V-FITC /PI Apoptosis Detection Kit (BD Biosciences). 1 x 10

4 solut värjättiin mukaan valmistajan protokollaa ja sitten analysoitiin virtaussytometrialla (BD Biosciences) varustettu CellQuest ohjelmisto (BD Biosciences).

Haavojen paraneminen ja invaasio määritykset

Solun muuttoliikettä arvioitiin haavan paranemista määrityksiä. Solut siirrostettiin kuusi-kuoppalevyille ja viljeltiin 100% konfluenssiin. Haavat syntyy yksisolukerroksen käyttäen muovista pipetin kärkeä. Sitten solut huuhdeltiin PBS: llä ja viljeltiin vielä 48 tuntia. Leviäminen haavan havaittiin ja valokuvattiin mikroskoopilla. Sillä invasion määrityksiä, 1 x 10

5 soluja seerumittomassa alustassa lisättiin ylempään kammioon insertin esipäällystetty matrigeelin (BD Bioscience). Alempi kammio täytettiin DMEM, jossa on 10% naudan sikiön seerumia. Sen jälkeen kun oli inkuboitu 48 tuntia, solut jäljellä yläpinnalla kalvon poistettiin, kun taas solut, jotka olivat tunkeutuneet kalvon läpi, värjättiin 20% metanolia ja 0,2% kristalliviolettia, kuvaamisen, ja laskettiin mikroskoopilla (Olympus, Tokio, Japani).

Western blotting

Western blotting -analyysi suoritettiin, kuten aikaisemmin on kuvattu [22]. Lyhyesti, proteiinit uutettiin RIPA puskuriin täydennetty proteaasinestäjien sekä määrällisesti BCA-menetelmällä (Beyotime, Jiangsu, Kiina). Lysaatit (25 ug) erotettiin SDS-PAGE: lla ja sitten sähköllä nitroselluloosakalvoille (Whatman, Maidstone, UK). Membraanit blokattiin 2 tunnin ajan huoneen lämpötilassa 5% rasvatonta kuivamaitoa liuosta ja sitten immunoblotattiin yön yli 4 ° C: ssa primaaristen vasta-aineiden IGF1 R ja β-aktiini (Santa Cruz Biotechnology Inc., Santa Cruz, CA, USA). Pesun jälkeen kalvoja koetettiin HRP-konjugoidulla sekundaarisella vasta-aineita. Signaalit visualisoitiin Enhanced Chemiluminescence Plus Kit (GE Healthcare).

Eläinkokeet

Kaikki eläinkokeet hyväksyttiin eettinen komitea eläinkokeille yliopiston Fudanin Animal Care komitea, Shanghai, Kiina. Kasvaimen kasvun määrityksiä, A549-soluja infektoitiin joko miR-140-yliekspressoivassa lentivirus tai ohjaus lentivirus injektoitiin ihonalaisesti oikeaan lapaluiden nude-hiirten (5 viikkoa vanhoja BALB /c-nu /nu, 5 per ryhmä, 1,5 × 10

6 solua kutakin hiiren). Hiiriä tarkkailtiin yli 5 viikkoa kasvaimen muodostumista. Kasvaimen tilavuus (V) seurattiin viikoittain ja lasketaan kaavalla: V = 0,5 × pituus × leveys

2. In vivo etäpesäkkeiden määrityksissä, 1,5 x 10

6 A549-miR-140 tai A549-miR-ohjaus solut injektoitiin häntälaskimoon nude-hiirten (5 ryhmää kohti). Jälkeen 6 viikkoa, hiiret tapettiin, ja keuhkojen metastaattisen kolonisaatio seurattiin ja kvantifioitiin.

Tilastollinen analyysi

Data ilmaistiin keskiarvona ± SD vähintään kolmesta itsenäisestä kokeesta. Ero ryhmien välillä analysoitiin käyttäen Studentin

t

-testiä, kun verrataan vain kaksi ryhmää tai yksisuuntaisen varianssianalyysin verrattaessa enemmän kuin kaksi ryhmää. Korrelaatio miR-140 ja IGF1 R ilmentyminen arvioitiin käyttämällä Spearmanin korrelaatiota analyysi.

P

0,05 katsottiin tilastollisesti merkitsevä.

Tulokset

Expression of miR-140 on vähentynyt NSCLC kudoksissa ja solulinjoissa

Tutkia ilmaisun ja merkityksen miR-140 NSCLC karsinogeneesin mittasimme ilmaus miR-140 30 paria NSCLC kudosten ja niiden vastaaviin normaaleihin keuhkokudokset käyttämällä kvantitatiivista käänteistranskriptaasia PCR (qRT-PCR). Tulokset osoittivat, että miR-140 ilmentyminen oli merkittävästi vähentynyt NSCLC kudoksissa verrattuna niiden vastaaviin normaaleihin kudoksiin (kuvio 1A). Lisäksi, ekspression miR-140 viidestä NSCLC solulinjoissa määritettiin. Kuten kuviossa 1B on esitetty, suhteelliset ekspressiotasot miR-140 näissä NSCLC-solut olivat merkittävästi vähentynyt verrattuna normaalin solulinjan BEAS-2B. Lisäksi korrelaatio miR-140 ekspressiotasot ja ennusteeseen viittaavia parametreja analysoitiin. Tilastollinen analyysi osoitti, että downregulation miR-140 korreloi merkitsevästi kasvaimen vaiheen ja etäpesäkkeiden kun taas mitään merkittävää korrelaatiota ei havaittu muiden parametrien (taulukko 1). Yhdessä nämä tulokset viittaavat siihen, että downregulation miR-140 voi tärkeitä rooleja NSCLC karsinogeneesissä ja etenemiseen.

(A) ekspressiotasot miR-140 30 paria NSCLC kudosten ja niiden vastaaviin normaaleihin keuhkojen kudokset mitattiin qRT-PCR. U6 snRNA käytettiin sisäisenä kontrollina. (B) ilmentymisen tasot miR-140 normaalissa keuhkojen epiteelisolujen linja (BEAS-2B) ja 5 NSCLC solulinjoissa (A549: Adenokarsinoomasolulinja; H157, SK-MES1, H520: squamous syöpäsolulinjoissa; H460: storcell tasyöpäsolulinja). *

P

0,05, **

P

0,01.

Number

Mediaani ilmaisu

Characteristicof casesof asennuspalveli- 140

P

Ikä (years)≥60180.4214±0.04680.4336 60120.3751±0.0291SexMale210.3972±0.04810.5377Female90.4226±0.0352Smoking statusNo80.4219±0.03930.1834Yes220.3723±0.0436HistologyAC160.3854±0.05020.3670SCC140.3578±0.0440StageI70.5539±0.03570.0059II130.3737±0.0406III100.3005±0.0251MetastasisNo130.4932±0.04560.0008Yes170.3104±0.0413Table 1. Suhde miR-140 ilmaisun ja ennusteeseen viittaavia parametreja NSCLC.

CSV Lataa CSV

miR-140 inhiboi NSCLC soluproliferaatiota in vitro

paremmin ymmärtää roolin miR-140 on kehittäminen NSCLC, ensin rakennettu lentivirusvektori ekspressoi miR-140 ja vakaa solulinjat, merkitään A549-miR-140 ja H157-miR-140 jälkeen lentivirus infektion. Onnistunut yliekspressio kypsän miR-140 näissä soluissa vahvistettiin qRT-PCR: llä (kuvio 2A). Kuten on esitetty kuviossa 2B, yliekspressio miR-140 suppressoi merkittävästi solujen lisääntymistä A549 ja H157-soluja verrattiin niiden vastaavan valvonnan. miR-140 yliekspressio havaittiin myös indusoida apoptoosia A549 ja H157-soluja (kuvio 2C). Johdonmukaisesti näiden tulosten kanssa, miR-140 yliekspressio laukaissut solujen kerääntymiseen G1 vaiheessa, ja vähensi solujen S-vaiheessa molemmissa solulinjoissa (kuvio 2D). Sen sijaan knockdovvn miR-140 käyttäen anti-miR-140 H520-soluissa edistää solujen kasvua, kun taas mitään merkittävää muutosta solusyklin ja solu- apoptoosin havaittiin (kuva S1). Yhdessä nämä tulokset osoittavat, että miR-140 pystyy säätelemään NSCLC solun kasvua.

(A) A549 ja H157-solut infektoitiin miR-140 tai miR-ohjaus lentivirus, ja ilmaus miR-140 analysoitiin qRT-PCR. (B) solujen elinkelpoisuuden määritys (CCK-8). (C) solujen apoptoosin määrityksiä. (D) solusyklin analyysi. *

P

0,05, **

P

0,01.

miR-140 estää NSCLC solujen vaeltamiseen ja invaasiota in vitro

Tutkimme lisäksi onko miR-140 voi myös estää solujen vaeltamiseen ja hyökkäyksen NSCLC. Käyttämällä haavan paranemista määrityksessä havaittiin, että yli-ilmentyminen miR-140 dramaattisesti esti tuumorin solujen liikkuvuuden A549 ja H157-soluissa verrattuna niiden vastaaviin kontrolleihin (kuvio 3A). Vastaavasti, transwell testeissä, joissa Matrigelillä osoittivat, että miR-140 merkittävästi vähensi invasiivisen kapasiteetti A549 ja H157-soluja (kuvio 3B). Sen sijaan, haavan paranemista ja invaasion H520-solujen lisääntynyt, kun endogeenisen miR-140 on vaiennettu anti-miR-140 (kuvio S1). Yhdessä nämä tulokset viittaavat siihen, että miR-140 voi estää NSCLC solujen vaeltamiseen ja invaasiota in vitro.

Haavanparantamislaite määritykset (A) ja invaasio määritykset (B) A549 ja H157-solut infektoitiin miR-140 tai miR-ohjaus lentivirus. Invaasio määritykset määritettiin käyttämällä TranswellTM määrityksiä kanssa Matrigeliä. Suurennus: 100 x. **

P

0,01.

miR-140 inhiboi kasvaimen kasvua ja etäpesäkkeiden NSCLC soluissa nude-hiirissä

edelleen vaikutuksen määrittämiseksi asennuspalveli- 140 NSCLC kasvaimen kasvua ja etäpesäkkeiden in vivo, A549-miR-140-solut ja A549-miR-ohjaus soluja istutettiin ihonalaisesti kylkeen nude-hiirten ja eläimiä seurataan tarkasti tuumorikasvulle 5 viikon ajan. Tulokset on esitetty, että miR-140-yli-ilmentävät kasvaimet olivat merkittävästi pienempiä ja kasvaimen tilavuuden kontrolliin verrattuna kasvaimia (kuvio 4A ja B). Lisäksi tutkimme vaikutus miR-140 ilmentymisen vaikutus NSCLC etäpesäkkeitä in vivo. A549-miR-140-solut ja A549-miR-ohjaus solua injektoitiin paljaisiin hiiriin by kaudaalilaskimoon injektiot. Hiiret tapettiin 6 viikkoa injektion jälkeen, ja niiden keuhkot irrotettiin tarkkailla metastaattinen Nidi pinnalla niitä. Kuten on esitetty kuviossa 4C, määrä keuhkojen etäpesäkkeiden kyhmyjä on laskenut huomattavasti A549-miR-140 ryhmässä verrattuna A549-miR-kontrolliryhmään. Yhdessä nämä tulokset osoittavat, että miR-140 yli-ilmentyminen voi estää kasvaimen kehittymisen ja etäpesäkkeiden NSCLC-solujen in vivo.

(A) valokuvaus kasvainten muodostunut. (B) kasvukäyrän piirretty mittaamalla kasvaimen volyymit ilmoitettu päivinä. (C), joka edustaa H 0,01.

miR-140 downregulates IGF1 R suoraan kohdentamalla sen 3 ’UTR

Valaistaan ​​molekyylitason mekanismeja, joilla miR-140 suorittaa sen toiminnon, etsimme mahdollisia kohteita miR-140 eri laskennallisia menetelmiä, kuten TargetScan ja Miranda. Erityisesti olemme keskittyneet onkogeenien. IGF1 R todettiin yksi ehdokas kohteena miR-140, koska komplementaarisen sekvenssin miR-140 tunnistettiin sen 3 ’UTR mukaan TargetScan analyysi (kuvio 5A). Huomasimme, että keskimääräinen ekspressiotaso IGF1 R oli merkittävästi korkeampi NSCLC kudoksissa kuin vastaaviin normaaleihin kudoksiin (kuva S2). Lisäksi tilastollisesti merkitsevä käänteinen korrelaatio havaittiin Spearmanin korrelaatio analyysi välillä ekspressiotasot miR-140 ja IGF1 R mRNA (kuvio 5B). Lisäksi qRT-PCR: llä ja Western blot-analyysi osoitti, että yli-ilmentyminen miR-140 oleellisesti vähentynyt ilmentyminen IGF1 R A549 ja H157-soluja, ja että pudotus on miR-140 lisääntynyt IGF1 R ilmentymistä H520-soluissa (kuvio 5C ja D). Vahvistaa, onko IGF1 R on suora alavirtaan kohteena miR-140, fragmentti, IGF1 R 3 ’UTR, joka sisältää otaksutun miR-140 sitoutumiskohta kloonattiin lusiferaasireportteri- vektori. Lusiferaasireporttiterilla analyysit osoittivat, että säätely ylöspäin miR-140 vähensi merkittävästi suhteellinen lusiferaasiaktiivisuus IGF1 R-3’UTR A549 ja H157-soluissa, mutta ei ollut vaikutusta mutantin IGF1 R-3’UTR (kuvio 5E). Yhdessä nämä tulokset viittaavat siihen, että miR-140 down-regulation IGF1 R ilmentyminen suoraan kohdentamalla sen 3 ’UTR.

(A) otaksuttu sitovia sekvenssejä miR-140 on IGF1 R 3′ UTR. Mutaatio tuotettiin IGF1 R 3 ’UTR muta- 3 nt joka on tunnustettu miR-140. Joko villityypin (WT) tai mutantti (Mut) IGF1 R 3 ’UTR subkloonattiin dual-lusiferaasireportteri- vektori. (B) tilastollisesti käänteinen korrelaatio miR-140 ja IGF1 R mRNA tasot NSCLC kudoksissa Spearmanin korrelaatio analyysi. (C, D) ilmentymistä IGF1 R A549, H157 ja H520-solujen infektion jälkeen tai transfektion mitattiin qRT-PCR: llä ja Western blottauksella. (E) Lusiferaasianalyysi A549 ja H157-solut ko-transfektoitiin miR-140 ja lusiferaasireportteri- sisälsi IGF1 R 3’-UTR (WT) tai mutantti (Mut). Lusiferaasiaktiivisuudet mitattiin 48 tuntia transfektion jälkeen. **

P

0,01.

IGF1 R on mukana miR-140 aiheuttama tukahduttaminen NSCLC solujen kasvua ja invaasiota

edelleen tutkia asennuspalveli- 140 kykenee sen tuumorisuppressoriproteiinia toimintoa downregulation IGF1 R, suoritimme voitto-of-function ja menettämisestä toiminto analysoi. Ensinnäkin, A549-soluja infektoitiin lentiviruksen konstrukteja, jotka sisältävät IGF1 R siRNA tai negatiivinen kontrolli. Western blotting-analyysi vahvisti, että ilmentyminen IGF1 R on tukahdutettu (kuvio 6A). Kuten odotettua, IGF1 R pudotus esti merkitsevästi solujen kasvua, indusoi G1 pidätys, ja lisääntynyt apoptoosi A549-solut (kuvio 6B, C ja D). Lisäksi TranswellTM tutkimukset osoittivat, että IGF1 R downregulation tukahdutti solujen invaasion A549-solut (kuvio 6E). Nämä tulokset olivat samankaltaisia ​​vaikutuksia miR-140 yli-ilmentymisen. Sen jälkeen, A549-miR-140-solut transfektoitiin IGF1 R plasmideilla puuttuu 3 ’UTR. Kuten kuviossa 6B on esitetty, C ja D, yliekspressio IGF1 R merkittävästi pelastettiin miR-140-indusoidun solujen kasvun inhibitio, solusyklin pysähtymisen ja apoptoosin. Inhiboiva vaikutus miR-140 solujen invaasio myös antagonisoi IGF1 R yli-ilmentyminen (kuvio 6E). Yhdessä nämä tiedot osoittavat, että IGF1 R on toiminnallinen kohde miR-140.

A549-soluja infektoitiin erityisiä si IGF1 R, tai transfektoitu IGF1 R plasmidi, josta puuttuu 3′-UTR yhdessä miR-140. (A) Western blotting-analyysi. (B) solujen elinkelpoisuuden määritys (CCK-8). (C) solusyklin analyysi. (D) solujen apoptoosin määrityksiä. (E) TranswellTM invaasio määritykset. *

P

0,05, **

P

0,01.

Keskustelu

miRNA on raportoitu tärkeitä rooleja syövän synty ja syövän etenemistä [23,24]. Korjauksilla miRNA ilmaisun ovat sekaantuneet lähes kaikista syövän biologian, kuten solun kasvussa, apoptoosin, muuttoliike ja /tai hyökkäyksen, ja ne voivat toimia joko tuumorisuppressoreilla tai onkogeenien [25]. Esillä olevassa tutkimuksessa olemme keskittyneet miR-140, joka on osoitettu olevan mahdollinen tuumorisuppressori ihmisen malignances. Song et ai. osoitti, että yli-ilmentyminen miR-140 esti solujen lisääntymistä sekä osteosarkooman ja paksusuolen syövän solulinjat [19]. Viime aikoina, Yang ja kollegat raportoitu, että miR-140-5p on merkittävästi vähentynyt HCC kudoksissa ja solulinjoissa, ja sen yli-ilmentyminen estää kasvaimen kasvua ja etäpesäkkeiden kohdistamalla transformoiva kasvutekijä β-reseptori 1 ja fibroblastikasvutekijän 9 [20]. Tähän mennessä on kuitenkin rooli miR-140 NSCLC karsinogeneesissä ja molekyylitason mekanismit, joilla miR-140 kykenee sen toiminnot ovat edelleen epäselviä.

Tässä tutkimuksessa osoitimme, että miR-140 ilmentyminen oli merkittävästi vähentynyt NSCLC kudoksissa ja solulinjoissa. Yli-ilmentymisen miR-140 voi tehokkaasti estää NSCLC soluproliferaatiota, aiheuttaa solusyklin pysähtymisen, apoptoosin tehostamiseksi, ja tukahduttaa kasvaimen kasvua nude-hiirissä. Lisäksi miR-140 yliekspressio merkittävästi tukahdutettu soluliikkuvuus ja invaasiota in vitro ja kasvaimen etäpesäke in vivo. Niinpä knockdovvn miR-140 edistänyt soluproliferaatiota ja invaasiota. Nämä tulokset viittaavat siihen, että miR-140 saattaa olla uusi kasvain-vaimennin miRNA NSCLC.

Valaistaan ​​taustalla olevien mekanismien mukana miR-140 inhiboivan on NSCLC kasvun ja etäpesäkkeiden, käytimme eri ennustus algoritmeja ennustaa geenikohteet mir-140. Insuliinin kaltaisen kasvutekijä-1-reseptorin (IGF1 R) onkogeeni, joka on usein yli-ilmennetään monissa maligniteettien ja toimii tärkeänä säätelijänä solun lisääntymistä, eloonjääntiä ja etäpesäkkeiden [26-29], on todettu kriittinen alavirran kohde miR -140, ja tätä päätelmää tukevat seuraavat todisteet: (A) täydentävä sekvenssi miR-140 on tunnistettu 3 ’UTR: IGF1 R mRNA; (B) yli-ilmentymisen miR-140 vähensi merkittävästi IGF1 R tasoja NSCLC soluissa, kun taas pudotus Mir-140 enhancedIGF1R ilmaisu; (C) miR-140 yliekspressio vähensi aktiivisuutta lusiferaasireport-, joka sisältää villin tyypin 3 ’UTR: IGF1 R-mRNA: n; (D) estovaikutukset miR-140 NSCLC soluproliferaatioon, apoptoosin, ja invaasio palautettiin yliekspressio IGF1 R; (F) IGF1 R oli yläreguloituja NSCLC kudoksissa ja kääntäen korreloi ekspressiotasoja miR-140. Yhdessä nämä tiedot viittaavat vahvasti siihen, että miR-140 estää NSCLC kasvua ja etäpesäkkeiden kautta vähen- tämisessä IGF1 R.

Yhteenvetona esillä tutkimus osoitti, että miR-140 on merkittävästi vaimentua NSCLC kudoksissa ja solulinjoissa. Yli-ilmentymisen miR-140 kasvaimen kasvu estyy ja etäpesäke NSCLC kautta suoraan kohdistaminen IGF1 R. Tuloksemme viittaavat siihen, että usein vaimentua miR-140 johtaa lisääntyneen ilmentymisen IGF1 R ja puolestaan ​​edistää kehittymistä ja etenemistä NSCLC.

tukeminen Information

Kuva S1.

Konckdown Mir-140 edistää solujen lisääntymisen, migraation ja invaasion H520 soluja. (A) H520-solut transfektoitiin anti-miR-140 tai anti-ohjaus, ja ilmaus miR-140 analysoitiin qRT-PCR: llä. (B) solujen elinkelpoisuuden määritys (CCK-8). (C) solujen apoptoosin määrityksiä. (D) solusyklin analyysi. (E) Haavan paranemista määritykset. (F) TranswellTM invaasio määritykset. *

P

0,05, **

P

0,01.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0073604.s001

(TIF) B Kuva S2 .

IGF1 R on yliaktiivista NSCLC kudoksissa. Ilmentyminen IGF1 R in NSCLC kudoksissa ja vastaaviin normaaleihin keuhkokudokset mitattiin qRT-PCR. **

P

0,01.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0073604.s002

(TIF) B