Krooninen sairaus

tiivistelmä

Syöpäsolut voivat saada niiden kyky tunkeutua ja metastaaseja käymällä läpi epiteelin-to-mesenkymaalitransitioon ( EMT). Hyödyntäville mekanismin, jolla solu plastisuus, pahanlaatuiset solut voivat uudistaa niiden aktiinisytoskeletonin ja alas-säädellä proteiineja tarvitaan solujen solukontaktien. Mekanismit solun tukirangan uudelleenjärjestelyn seurauksena mesenkymaalisten morfologia ja lisääntynyt invasiivisia potentiaali tunnetaan huonosti. Actin Nukleoiva formins ovat sekaantuneet merkittävä asema EMT. Täällä analysoimme joka formins muutellaan levyepiteelikarsinooma liittyviä EMT. FHOD1, huonosti tutkittu formin, näytti selvästi voimistuvan kun EMT. Ihmisen kudoksissa FHOD1 oli ensisijaisesti ilmaistu mesenkyymisolujen, joilla on vain vähän ilmaisun epiteeli. Kuitenkin yksilöt suun levyepiteelisyöpä syövät osoittivat johdonmukaisesti FHOD1 säätelyyn ylöspäin mesenchymally transformoidut solut invasiivisia reunaan. Tämä kiihdytyssäätely vahvistettiin suullisesti levyepiteelikarsinooma syöpä malli, jossa FHOD1 ilmentyminen oli merkittävästi lisääntynyt, kun EMT on PI3K signalointi riippuvaisella tavalla. Vuonna EMT soluissa FHOD1 osaltaan kara-muotoinen morfologia ja mesenkymaalisten F-aktiini organisaatio. Lisäksi toiminnalliset analyysit osoittivat, että FHOD1 edistää solujen vaeltamiseen ja invaasiota. Lopuksi, FHOD1 ehtyminen vähentää kykyä EMT syöpäsolujen muodostaa invadopodia ja hajottavat soluväliaineen. Tuloksemme osoittavat, että FHOD1 osallistuu solun tukirangan muutoksiin EMT. Lisäksi osoitamme, että FHOD1 ylössäätely tapahtuu syöpäsolujen EMT

in vivo

, mikä osoittaa, että FHOD1 voivat myötävaikuttaa syövän etenemiseen.

Citation: Gardberg M, Kaipio K, Lehtinen L, Mikkonen P, Heuser VD, Talvinen K, et ai. (2013) FHOD1, joka on Formin yläreguloituja epiteelikasvaimet-mesenkymaalitransitioon, Osallistuu Cancer Cell Migration ja Invasion. PLoS ONE 8 (9): e74923. doi: 10,1371 /journal.pone.0074923

Editor: Pontus Aspenström, Karolinska Institutet, Ruotsi

vastaanotettu: 15 huhtikuu 2013; Hyväksytty: 07 elokuu 2013; Julkaistu: 26 syyskuu 2013

Copyright: © 2013 Gardberg et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukivat rahoituksella Suomen Akatemia, Finska Läkaresällskapet, Sigrid Juseliuksen säätiö, K Albin Johansson säätiö, Suomen Cancer Järjestöt ja TYKS Research Funds. Maria Gardberg on Ph.D. opiskelija tukee National Graduate School of Clinical Investigation. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

aktiinisytoskeletonin on erittäin muovinen rakenne kyky nopeasti uudistaa kun monet ekstra- ja intrasellulaarisen vihjeitä. Epiteeli–to-mesenkymaalitransitioon (EMT), epiteelisolut erottaa niiden solu-liittymissä, ja uudistaa niiden solun tukirangan muodostaa kara-muotoinen solu runsaasti stressiä kuituja. Se, että EMT mahdollistaa solujen olla liikkuvia hyödyntävät epiteelisyövissä saavuttaa invasiivisuus. EMT voidaan saada aikaan sekä ympäristötekijät, kuten hypoksia, ja ekstrasellulaaristen signalointimolekyylien, kuten TGF-β. Up-regulation EMT transkriptiotekijöiden, kuten Snail, Slug, ZEB1 ja ZEB2, johtaa EMT-määrittelyssä down-regulation of E-kadheriinin [1], [2]. Vaikka dramaattinen kasvu F-aktiini ja stressiä kuidut ja fibroblastien kaltaiset morfologia ovat tunnusmerkkejä EMT, aktiini nucleators mukana tässä solun tukirangan remodeling on huonosti tunnettu.

Formins ovat erittäin konservoituneita aktiini nukleoiva proteiineja, jotka ovat esiintyy kaikissa eukaryoottisissa organismeissa. Formin homologia 2 (FH2) domain on määriteosa formins. Reunustavat alueet vaihtelevat huomattavasti yksittäisten formin proteiinien, luultavasti johtaa eri solujen toimintoihin ja sääntelymekanismeja. Formins katalysoivat nukleaatiossa aktiini klo piikkilanka lopussa aktiinisäikeiden. Pidentämisen aikana dimerisoituneita formins pysyvät kiinni hehkulangan, minkä vuoksi se suojaa sitä katkaisemalla molekyyleistä [3]. Aktiivisuus formins säätelee Rho GTPaasit, molekyylikytkiminä joka uudistaa solun tukirangan eri solun osiin, ohjaamalla stressi kuitu kokoonpano, fokaalisen adheesion muodostumista ja tila liikkuvuuden syöpäsoluissa [4], [5].

Koska modulaattorit soluorganisaatiota, liikettä ja kehitys, formins ovat hyviä ehdokkaita etsittäessä aktiini järjestäjille, jotka mahdollistavat syvällisiä sytoskeletaalisten muutoksia EMT. Kuitenkin rooli formins vuonna EMT ei tunneta yksityiskohtaisesti. Käyttämällä suullisen okasolusyöpä (SCC) EMT malli, osoitamme tässä, että FHOD1, ensisijaisesti mesenchymally ilmaistu formin, on nimenomaan upregulated aikana EMT. Lisätutkimuksissa, osoitamme, että FHOD1 ilmentyy myös

in vivo

leviämisrintamassa SCC ja että se on tarpeen huolto mesenkymaalisten morfologia, tehokas muuttoliike ja invaasio.

Materiaalit ja menetelmät

Solulinjat

Suun levyepiteelisyöpä (SCC) solulinja UT-SCC-43A oli peräisin ensisijainen ikenen kasvain on 75 vuotta vanha valkoihoinen nainen. Kasvain oli järjestetty niin T

4N

1M

0, ja oli histologisesti luokan 2 SCC [6]. UT-SCC-43B oli peräisin toistuva kasvain samasta potilaasta sädehoidon jälkeen ja kirurgia. Solulinja 43A-SNA on tuotettu transfektoimalla 43A soluja täyspitkän hemagglutiniini-koodattu cDNA hiiren Snail. Kolme solulinjat on perustettu aiemmin, ja on aiemmin havaittu osoittavan muutokset epiteelin solujen erilaistumisen ohjelma erilaisten mekanismien kautta E-kadheriinin tukahduttaminen [7]. Ennen perustamista sekä ensimmäisen solulinjojen UT-SCC-43A ja UT-SCC-43B tutkimusta, hyväksyntää sekakomiteassa etiikka Turun yliopiston ja Turun yliopistollisen sairaalan saatiin sekä kirjallinen suostumus luovuttajalta [ ,,,0],7]. Telome- kuolemattomiksi ihmisen mikrovaskulaarisia endoteelin solulinja (TIME) ja ihmisen ihon mikrovaskulaarisia endoteelisolujen linja (HMEC) oli ystävällinen lahjoitus MSc Johannes Keuschnigg (Turun yliopisto, Turku, Suomi; solulinjat perin ATCC). Muut solulinjat hankittiin ATCC: ltä ja huolletaan jakelijan ohjeita.

Transcriptomic microarray tiedot ja kvantitatiivisen tosiaikaisen PCR

Geenien ilmentyminen analysoitiin käyttämällä Illumina HumanHT-12 v4 Expression BeadChip klo suomi Microarray ja Sequencing keskus, Turku Center for Biotechnology. Kokonais-RNA uutettiin viljellystä soluista käyttämällä RNeasy Mini Kit (Qiagen) mukaisesti valmistajan protokollan ja käsitellään cDNA cDNA-synteesi-kitillä (Applied Biosystems, Foster City, CA). Array perustuvaa tietoa solulinjoissa on ladattu ArrayExpress (tulonumero E-MTAB-1420).

TaqMan qRT-PCR suoritettiin Applied Biosystems 7900HT väline (Suomi Microarray ja sekvensointi Centre). Koettimet ja alukkeet olivat Oligomer, Helsinki, Suomi. Kvantifiointi suoritettiin RQ Manager 1.2 ohjelmisto käyttäen ΔΔCT menetelmää (Applied Biosystems). Kolme samanlaiset näytteet tutkittiin havaitsemiseen kohde-mRNA: n ilmentymisen ja β-aktiini käytettiin endogeenista kontrolli. Määrät ilmaistiin n-kertainen ero suhteessa UT-SCC-43A-solulinja. Tulokset on esitetty keskiarvoina ± SD. Tilastolliset analyysit suoritettiin käyttäen Studentin

t

-testi ja Pearsonin korrelaatiokerrointa, ellei toisin ole mainittu. Alukkeilla olivat: DIAPH1 (eteenpäin 5′-cagtcaggggcagcattc-3 ’, reverse 3′-cactgttcttggacaccttgg-5’), FHOD1 (eteenpäin 5’cctcagctgacacctccag-3 ’, reverse 3′-cagcgcaacctgcttctc-5′), FHOD3 (eteenpäin 5’-ggccaggttggaaaggtc-3 ’, reverse 3′-tctgctgccagtgactcttg-5′), FMNL3 (eteenpäin 5’-ccatcgaggacatcatcaca-3 ’, reverse 3′-ccgagagggtctcagtgg-5’).

FHOD1 vasta

FHOD1 kaniinin anti-ihmisen polyklonaalista monospesifistä vasta-aine tuotettiin Human Protein Atlas-ohjelma (HPA) [8], ja on tällä hetkellä yleisesti saatavilla (HPA024468, Atlas Antibodies, Tukholma, Ruotsi). Edelleen vasta-luonnehdinta on kuvattu Tulokset osiossa. Joissakin kokeissa, toinen polyklonaalinen FHOD1 vasta-ainetta (Millipore, Bedford, MA, USA) käytettiin. Reaktiivisuutta kahden vasta-aineen oli identtinen Länsi-blottauksella ja immunovärjäyksin.

Western ja Northern-blottauksella ihmisen solulinjojen

solulinjat MDA-MB-231 (rinta syöpäsoluja), WM164 (melanooma solut), A431 (levyepiteelikarsinooma solut), U138MG (glioblastoomasolut), HUVEC (ihmisen napalaskimon endoteelisolujen), HMEC (ihmisen ihon mikrovaskulaarisia endoteelisoluja), TIME, UT-SCC-43A, UT-SCC-43B ja 43A -SNA kerättiin ja lyysattiin RIPA-puskurissa, johon oli lisätty proteaasi-inhibiittoreita. Kutakin koetta varten, näytteet normalisoitiin proteiinipitoisuus ja yhtä suuret määrät materiaalia Laemmlin näytepuskurissa alistettiin SDS-PAGE: lla ja siirrettiin nitroselluloosasuodattimille. Immunoblottaus HPA anti-FHOD1 vasta-ainetta inkuboitiin yön yli 1:2000 laimennoksena BSA /TBS /Tween 0,1%, minkä jälkeen sekundaarinen vasta-aine [HRP-konjugoitua sian anti-kani (Dako, Glostrup, Tanska)]. Sitoutuneet proteiinit havaittiin tehostetulla kemiluminesenssin. Peptidi kilpailun kokeilla vasta-inkuboitiin ensin 100-kertainen molaarinen ylimäärä GST-FHOD1 fuusioproteiini, joka sisältää antigeeniset epitoopit 1 tunnin ajan, tai GST kontrollina. Proteiinimäärän tarkistettiin immunoblottauksella, jossa on α-tubuliinin-vasta-ainetta (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Epiteelin /mesenkymaaliset transdifferentation tarkistettiin immunoblottauksella anti-E-kadheriinin ja anti-N-kadheriinin vasta-aineita (BD Biosciences, San Jose, CA, USA).

Northern blot -analyysi suoritettiin, kuten on kuvattu [9]. Sekvenssin koettimen mukana suurimman osan vasta-aineen epitoopin (NCBI RNA RefSeq klooni GenBank NM_013241.2, emäkset 1517-1810).

inhibitio MAPK /ERK ja PI3K signalointireitteihin

UT- SCC-43B-solut maljattiin täydelliseen alustaan ​​ja viljeltiin 24 tunnin ajan, ennen kuin väliaine korvattiin seerumittomalla väliaineella ja inkuboitiin yön yli. Seuraavaksi soluja inkuboitiin 4 päivää 10 uM MEK 1/2 estäjä U0126 (Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA) tai PI3-kinaasi-inhibiittori LY294002 (Tocris Bioscience, Bristol, UK), 1% seerumia väliaineessa U0126 ja 10 % seerumia väline LY 294002. valvonta-soluja käsiteltiin samalla tilavuudella ajoneuvon. Inkuboinnin jälkeen tehoa MAPK-reitin inhibition tarkistettiin immunoblottauksella, kuten edellä on kuvattu 1:1000 laimennosten polyklonaalista anti-Phospho-p44 /42 MAPK (Thr202 /Tyr204) (p-ERK 1/2) (Cell Signaling Technology) ja polyklonaalinen anti-ERK 2 (MAPK 2) vasta-aineen (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA). PI3K koulutusjakso esto tarkistettiin immunoblottauksella monoklonaalisella anti-Phospho-Akt (Ser473) (p-Akt), monoklonaalinen anti-Akt (pan) (molemmat Cell Signaling Technology).

geenien

FHOD1 ilmentyminen lyhytaikaisesti pudotettiin MDA-MB-231, TIME ja UT-SCC-43B-soluihin käyttämällä

SMART

allas siRNA (Dharmacon Research, Boulder, CA). Non-kohdistaminen Pool siRNA (Dharmacon) käytettiin verrokkina. Solut transfektoitiin Dharmafect 1 (Dharmacon) mukaan valmistajan ohjeiden. FHOD1 tasot tutkittiin solulysaateista 72 tuntia transfektion jälkeen immunoblottauksella.

In silico

transkriptomiikka analyysi

GeneSapiens tietokanta käytettiin tutkimaan FHOD1 mRNA: n ekspression kaikissa ihmisen normaaleissa kudoksissa [10]. Näytteet Tietokannan sisältämien on analysoitu Affymetrix alustan ja koska ainutlaatuinen normalisointi ja tiedon laadun tarkastukset, geeniekspressioprofiilien kerätty eri tutkimukset voidaan yhdistää tuottamaan yleiskuva ilmaisun profiilin ihmisen kudoksissa.

Immunohistokemia

Normaali kudokset otettiin talteen, kiinteät ja immunohistokemiallisesti värjättiin, kuten on kuvattu [9]. Kokoelma normaaleissa kudoksissa Tämän tutkimuksen hyväksyi sekakomitean etiikka Turun yliopiston ja Turun yliopistollisen sairaalan sekä kirjallinen suostumus luovuttajilta. 10 parafiiniin suun SCC kerättiin kudoksesta arkisto patologian osaston TYKSin suostumuksella sekakomiteassa etiikka Turun yliopiston ja Turun yliopistollisessa sairaalassa. Mukaan Suomen lainsäädäntö (laki käytöstä kudosnäytteiden tutkimusta, [11, 20 §]), lupaa käyttää kerätyt näytteet diagnoosia varten, myönnetty paikallisista institutionaalisten viranomaisten tilanteissa, joissa potilas tieto ei sisälly. Siksi potilaiden ei ole suostunut, mutta lupa on myönnetty paikallinen eettinen komitea ja lääketieteellinen johtaja Turun yliopistollisessa sairaalassa. HPA FHOD1 vasta-ainetta käytettiin klo 1:250 laimennus. Yksittäiset kudokset ja solutyyppejä arvioitiin pisteyttämällä värjäytymisen intensiteettiä porrastamalla 0 (ei värjäystä) ja +++ (voimakas värjäytyminen).

Immunofluoresenssimikroskopia ja kvantifiointiin F-aktiini

UT -SCC-43A ja UT-SCC-43B soluja viljeltiin liivatteen kuorrutettu peitelaseja, ja kiinnitettiin 4% paraformaldehydillä 15 minuutin ajan. Solut permeabilised kylmällä asetonilla 4 min. 30 min kuluttua 1% naudan seerumin albumiinia (BSA) PBS: ssä, soluja inkuboitiin 1 h: n FHOD1 vasta-aineella (1: 250), mitä seurasi sekundäärinen vasta-aine, Alexa 568-konjugoitua vuohen anti-kani (1:500 , Molecular Probes, Eugene, OR, USA). F-aktiini visualisoitiin Alexa 488-konjugoidun phalloidin (Molecular Probes). Asennusosa väliaine sisälsi DAPI värjäystä ytimet (Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA). Invadopodia visualisoitiin immunofluoresenssivärjäyksen anti-cortactin 1:200 (Millipore). Plasma solut tunnistettiin anti-CD138 mAb (Ventana Medical Systems, Tucson, Arizona, USA). Alexa Fluor 568-konjugoitu vuohen anti-hiiri käytettiin sekundaarisena vasta-aineena (Molecular Probes). Solut kuvattiin kanssa immunofluoresenssimikroskoopilla tai Zeiss LSM 510 Meta -konfokaalimikroskoopilla (Carl Zeiss, 63 x Plan Apochromat tavoite, Göttingen, Saksa). Kuva J 1.42q (NIH, USA) ohjelmiston käytettiin kuvan analyysejä. Kvantifiointi F-aktiini in UT-SCC-43B-soluissa tehtiin analysoimalla Alexa 488-konjugoidun phalloidin värjäys alkaen konfokaali kuvia 20 solujen kussakin kokeessa. Keskimääräisellä fluoresenssin intensiteetit mitattiin solun sytoplasmaan. Merkitys kokeen laskettiin opiskelijat riippumattomia näytteitä

t

-testissä.

Haavojen paraneminen ja invaasio määritykset

Migration of UT-SCC-43B käsiteltyjä soluja FHOD1 tai ei-kohdistaminen siRNA tutkittiin gelatiini-päällystetyn 24-kuoppalevyillä. Haava luotiin käsin kaapimalla yksikerroksista solujen kanssa 10 ui pipetin kärki. Solut pestiin PBS: llä, ja suodatettu väliaine lisättiin. Kuva solujen kulkeutuminen haava oli otettu 10 minuutin välein 24 tuntia. ImageJ ohjelmistoa käytetään mittaamaan haava-alue 1 tunnin välein. Haavat analysoitiin toistettujen mittausten varianssianalyysi (rmANOVA). Time pidettiin toistuvina vaikutus ja ryhmään kiinteä vaikutus. Tilastolliset analyysit tehtiin käyttäen SAS järjestelmän Windows, versio 9.2 (SAS Institute Inc., Cary, NC, USA). Vaikutus FHOD1 hiljentäminen invasiivisista kapasiteetin UT-SCC-43B soluihin tutkittiin käyttämällä IncuCyte reaaliaikainen kuvantamisjärjestelmä (Essen BioScience, Ann Arbor, Michigan, USA). UT-SCC-43B: llä käsiteltyjen solujen FHOD1 siRNA tai ei-koodaava siRNA ja käsittelemätön kontrolli solut maljattiin 96-kuoppaisille levyille (ImageLock levy, Essen BioScience, MI) päällystettiin 50 ui 10% Growth Factor Reduced Matrigel (BD Biosciences) jälkeen jossa solujen annettiin kiinnittyä o /N + 37 ° C: ssa. Haava oli naarmuuntunut poikki jokaiseen koloon (Wound Maker, Essen BioScience) ja kasvualustojen poistettiin. Sitten solut varovasti peitettiin 50 ui 25% Matrigel normaalissa kasvualustassa ja inkuboitiin 37 ° C: ssa 2-3 tunnin ajan, jotta geeliytymistä, minkä jälkeen 100 ui elatusainetta lisättiin varovasti kuhunkin kuoppaan. Nopeus invaasion (haavan kautta matriisi) seurattiin hourly Incucyte kuvankäsittelyohjelma (Essen BioScience) 72 tuntia. Invasion tehokkuus määritettiin prosentteina suhteessa haavan yhtymäkohta verrattuna vastaavaan negatiiviseen kontrolliin (pidettävä 100%).

Measurement soluväliaineen hajoamista ja invadopodia kvantifiointiin

analysoimiseksi vaikutuksen FHOD1 knockdown on soluväliaineen (ECM) hajoaminen ja invadopodia muodostumista UT-SCC-43B-soluissa, soluja käsiteltiin ei-koodaava siRNA ja FHOD1 siRNA kuten edellä on kuvattu ja maljattiin 8-kuoppaisille objektilaseille esipäällystetty Cy3-leimattua gelatiinia mukaan valmistajan ohjeiden (QCM Liivate Invadopodia Assay (punainen), Millipore). 24 tunnin inkuboinnin jälkeen 37 ° C: ssa solut kiinnitettiin 4% paraformaldehydillä ja värjättiin immunofluoresenssimikroskoopilla anti-cortactin tai phalloidin. ECM hajoaminen näkyi tumma pesäkkeitä vailla fluoresenssin. Kuvat otettiin Olympus BX60 fluoresenssimikroskooppia (Olympus mikroskoopit, Essex, UK). Hajoaminen onteloita tuottamat solut valokuvattiin ja resorption alueilla solua kohti (px) mitattiin ImageJ ohjelmisto. Kunkin ryhmän keskimääräinen hajoaminen 100-solut kahdeksaan kuoppaan verrattiin. Arvioida invadopodia muodostumista, solut tarkastettiin aktiini-rikas comet- tai rengas ulkonemia positiivisella cortactin värjäytymisen ventraalisesta pinnalla. Prosenttiosuus, jotka sisältävät invadopodia laskettiin 10 eri alojen kussakin ryhmässä. Erot ryhmien testattiin merkitys ANOVA (Tukey post hoc) molemmissa kokeissa.

Tulokset

Transcriptional sääntely formins aikana syöpään liittyvien EMT

Käytimme kolme mallia solulinjat arvioida muutoksia formin ilmaisun aikana syöpään liittyvien EMT. UT-SCC-43A on suullinen SCC solulinja primäärikasvain ja UT-SCC-43B on linja samasta kasvain toistuvia leikkauksen jälkeen ja sädehoidon. Toistuva kasvain on läpikäynyt spontaani EMT, mistä ovat osoituksena useat markkereita [7]. Kolmas solulinja, 43A-SNA, perustettiin transfektoimalla UT-SCC-43A solun Snail aiheuttavan EMT.

Transcriptomic analyysi paljasti, että mesenkymaaliset solulinjat UT-SCC-43B ja 43A-SNA ovat 35 up-geenien (logFC ≥2, p≤0.001) ja 153 alas geenien (logFC ≤ -2, p≤0.001) kautta (kuvio 1 A; geeni luettelot esitetään taulukossa S1). UT-SCC43B ja 43A-SNA, perustettu EMT-markkereita, kuten N-kadheriinin, vimentiinistä ja kollageenien oli säädelty (kuvio 1 B), kun taas epiteelin markkereita, kuten E-kadheriinin, keratiineista, integriinit ja laminiinit olivat samanaikaisesti alas- säännelty osoittaa, että transcriptomic muutokset ovat yhdenmukaisia ​​EMT.

A) Microarray transcriptomic profilointi UT-SCC-43A, UT-SCC-43B ja 43A-SNA soluissa. Tekstitystiedostojen merkittävästi muuttunut UT-SCC-43B soluihin verrattuna UT-SCC-43A solut merkitty sinisellä ympyrällä ja selostukset muuttunut 43A-SNA soluissa verrattuna UT-SCC-43A on merkitty vihreällä ympyrällä. Geenien lukumäärän muuttunut molemmissa vertailuissa on esitetty päällekkäisellä alueella. Määrä jopa geenien näkyy ylhäältä ja alas geenien pohjassa. B) mRNA-tasolla muutoksia valituille epiteelin (ylhäällä) ja mesenkymaaliset (alhaalla) geenejä. Kuvattu geenit koodaavat seuraavat proteiinit: CDH1 = E-kadheriinin, CLDN3 = Claudin 3, CLDN 7 = Claudin 7, KRT5 = keratiini 5, KRT6B = keratiini 6b, CDH2 = N-kadheriinin, VIM = vimentiinistä. C) mRNA-tasot formins merkittäviä muutoksia sekä UT-SCC-43B ja 43A-SNA soluja, jotka myöhemmin varmistettiin RT-PCR. D) mRNA-tasot formins varmistettiin RT-PCR: llä.

13 formin perheenjäsenten sisältyvät array (DAAM1, DAAM2, DIAPH1, DIAPH2, DIAPH3, FHOD1, FHOD3, FMN1, FMN2, FMNL1, FMNL2, FMNL3, INF2), kaksi olivat johdonmukaisesti säädelty ja neljä oli alassäädetty aikana EMT. Merkittävimmät ylössäätöä nähtiin FHOD1, joka nousi 2,3-kertaisesti UT-SCC-43B ja 3,2-kertaisesti 43A-SNA verrattuna UT-SCC-43A (kuvio 1 C). Merkittävät transkription erot edelleen todentaa qRT-PCR, joka osoitti säätelyä formins FHOD1 ja FMNL3 ja downregulation FHOD3 ja DIAPH1 sekä UT-SCC-43B ja 43A-SNA soluja (kuvio 1 D).

karakterisointi ihmisen FHOD1 ja sen ilme kuvio

Koska FHOD1 oli kaikkein säädelty formin in EMT, päätimme vielä tutkia tätä huonosti tunnettu proteiini. Ilmaisu profiili ihmisen FHOD1 ei tiedetä, mikä johtuu suurelta osin puuttuu sopivia vasta-aineita. Otimme etu FHOD1 vasta-esittämiä Human Protein Atlas projekti. Vuonna Western blotting, vasta reagoi useiden ihmisen endoteelisolujen ja syöpäsolun linjat. Yksi kaista 145 kDa, mikä on hieman suurempi kuin ennustettu 127 kDa, havaittiin kaikissa testatuissa solulinjoissa (kuvio S1 A). Samanlainen bändi nähtiin myös toisen FHOD1 vasta-aineella. Leveä reaktiivisuus on linjassa aiempien havaintojen osoittavat FHOD1 ilmentymistä useimmissa kuolemattomia solulinjoja [11].

edelleen testata spesifisyyden HPA vasta-aineen reaktiivisuus blokattiin antigeenisen GST-FHOD1 fragmentti tai GST . Kuten FHOD1 katsotaan olevan endoteelin formin [12], käytimme lysaatit kolmesta endoteelisolujen riviä: HMEC, TIME ja HUVEC. Inkuboitu GST-FHOD1-peptidi käytännössä poisti havaitseminen 145 kDa bändejä kaikissa solulinjoissa (kuvio S1 B), kun taas inkubointi GST ei ole mitään vaikutusta. Lopuksi vahvisti spesifisyys transfektoimalla MDA-MB-231-solujen FHOD1 pieniä häiritseviä (si) RNA tai ei-kohdistuksen ohjaus siRNA. Jälkeen FHOD1 siRNA hoidon, vasta-reaktiivisuus oli merkittävästi vähentynyt kun taas reaktiivisuus transfektoiduissa soluissa ohjaus siRNA ei ollut vaikutusta (kuvio S1 C).

FHOD1 transkriptin solulinjoissa analysoitiin Northern-blottauksella. Analyysi paljasti yhden 4,0 kb transkripti kaikissa viidessä solulinjoissa, yhteensovitus johtuvat Western blot-analyysi (kuva S1 D).

systemaattisesti tutkia joka kudoksissa ja solutyypeissä ilmaista FHOD1, immunohistokemiallisella värjäyksellä käyttäen HPA FHOD1 vasta-aine tehtiin 26 eri ihmisen kudoksista. Lähes kaikissa näytteissä hiussuonten endoteelisolut olivat immunoreaktiivisia, vaikka vaihtelevalla värjäytymisen intensiteettiä. Intensiivisin FHOD1 värjäytymistä nähtiin pienten verisuonten perna (kuva 2 A), kohdun limakalvo (kuva 2 B), munasarjassa (kuvio 2 C) ja vatsakalvon alusten alle mesothelium. Useimmissa kudoksissa ja solutyypeissä parenkymaalisolut osoitti vähän tai ei lainkaan FHOD1 reaktiivisuutta. Esimerkiksi aivot, ei hermosolujen eikä gliasoluissa ilmaistaan ​​FHOD1 (kuvio 2 D). Endoteelisolujen aivojen hiussuonia, sen sijaan, ilmaistuna FHOD1. Pieni alijoukko lymfosyyttien imusolmukkeiden (kuva 2 E), perna, luuydin (kuvio 2 F) ja suolen limakalvon (kuvio 2 G) värjätään voimakkaasti. Keuhkoissa, kohtalainen ilmentyminen havaittiin alveolaarisissa makrofageissa (kuvio 2 H). Tulokset immunohistokemiallista analyysiä on esitetty taulukossa 1. Sen jälkeen värjäys lymfosyyttien alatyypin-spesifisten paljasti, että osajoukko lymfosyyttejä, jotka ilmaistaan ​​FHOD1 koostui CD138-positiiviset plasmasolut (kuviot 2 I ja J).

parafiiniin upotettuja ihmisen normaalia kudokset värjättiin FHOD1 vasta-aineella. EN) pernan, endoteelisolujen verisuonten osoittavat intensiivinen FHOD1 immunoreaktiivisuus. B) Kohdun limakalvon strooman ja rauhaset ilmaista vähän FHOD1. Endoteelisolujen verisuonten seinämiin värjätään voimakkaasti (nuolenpäät). C) Kun munasarja, varhaismunasolujen (o) ja follikkelia soluja (tähti) ilmaisemaan vähän FHOD1. D) Aivoissa ei hermosoluissa eikä glial solut näyttävät FHOD1 värjäytymistä. Endoteelisolujen minuutin kapillaareja (nuolet) tahra heikosti. E) Kun imusolmuke, useimmat lymfosyytit värjäytyvät heikosti. Satunnainen voimakkaasti värjäämällä solut on plasma solujen morfologia (avoimet nuolenpäät). F) Kun luuytimen erytropoieettisia solut eivät ilmennä FHOD1. Myelopoietic soluja ja megakaryosyyttien (M) tahra heikosti. Satunnaisesti pieniä soluja, jotka ilmentävät FHOD1 voimakkaasti (avoimet nuolenpäät) ovat plasman soluja. G) Vuonna paksusuolen limakalvon, epiteelisolujen osoittavat vain heikkoa FHOD1 värjäystä. Strooman plasman soluja (avoin nuolenpäitä) ilmaista FHOD1 voimakkaasti. H) Alveolaarinen epiteelin keuhkoissa tahroja heikosti varten FHOD1, kun taas keuhkorakkuloiden makrofageissa (MP) maltillista FHOD1 värjäytymistä. I, J) Double immunofluoresenssivärjäyksen of FHOD1-positiivisia tulehdussolujen osoittaa, että samat solut ekspressoivat CD138 (nuolenpäät). Solun morfologia ja CD138 ilmoittaa, että he ovat plasman soluja. A-H asteikko bar = 100 pm.

Olemme päätellä, että FHOD1 ilmentyy monissa kudoksissa mutta vain rajoitettu solutyyppejä. Huomattavaa on, että kaikki voimakkaasti värjäystä solutyyppejä ovat mesenkymaaliset. Tämä vastaa

in silico

mRNA profiili on saatu GeneSapiens tietokantahaku [10] (kuva S2). Alhainen läsnä FHOD1 ilmentymistä kaikissa normaaleissa kudoksissa voi johtua ilmentymistä endoteelisoluissa. Suurempi ekspressio voidaan nähdä kudoksissa, joissa parenkyymisoluissa myös värjättiin immunohistokemiallisesti,

so.

Luustolihasten, rinta-, ja munasarja. Vaikka mRNA: n tasolla mesothelial kudosnäytteistä on suhteellisen korkea, mesoteelisolujen ei värjäytynyt kanssa FHOD1 vasta-aineella. Korkeat mRNA-tasot johtuvat todennäköisesti runsaiden endoteeliin kapillaareja alla mesothelium. Tällaisissa alukset, immunohistokemiallisella FHOD1 värjäys oli vahva.

EMT johtaa PI3K polku riippuvaisten FHOD1 säätelyä ja morfologisten muutosten

Vaikka immunohistokemiallinen tuloksia ja

silico

mRNA profiilin ehdotettu minimaalinen FHOD1 ilmentyminen epiteelin solutyypeissä, meidän transkriptomiikka tulokset ja GeneSapiens bioinformatiikan tutkimus karsinoomien (ei esitetty) osoittivat kohtalaista mRNA-tasot tietyissä syövissä. Esimerkiksi keskimääräinen normalisoitu ilmaus arvo keuhkoadenokarsinooma oli 850 verrattuna 400 hengityselimiä, ja arvo suun SCC oli 800 verrattuna 100 normaalissa ihossa (arvot suun limakalvon ei ollut saatavilla). Tutkia, onko säätelyä FHOD1 tapahtuu suun kliininen SCC, me satunnaisesti valitsi kymmenen suun SCC yksilöitä immunohistokemiallista analyysia varten. Kuten EMT arvellaan esiintyvän

in vivo

klo invasiivisia reunalla epiteelisyöpien, kudossiruina ei voitu käyttää. Olemme löytäneet mitään reaktiivisuutta ei-neoplastisia kerrostettu levyepiteelillä suun limakalvon tapauksiin, kun taas kohtalainen vahva FHOD1 värjäys johdonmukaisesti nähtävissä invasiivisia SCC solut mesenkymaalisten kara-muotoinen morfologia (kuvio 3 A). Mielenkiintoista, FHOD1 immunoreaktiivisuus oli lievä tai poissa hyvin eriytetty alueilla kohdunkaulan syöpä, mikä osoittaa, että kasvain pääosa, joka koostuu solujen alueilla epiteelin erilaistumista ilmaisee vähän FHOD1.

) Tavanomaisissa tai ei-neoplastisia kerrostunut levyepiteeli, ei FHOD1 voidaan havaita (ylhäällä). Invasiivisen okasolukarsinoomia, kohtuullisesta voimakkaaseen FHOD1 immunoreaktiivisuus nähdään kara-muotoinen solujen leviämisrintamassa että morfologinen syistä ovat läpikäyneet EMT (alhaalla; yksityiskohdat upotus). Kasvaimen irtotavarana, joka koostuu solujen kanssa epiteelin morfologian, vain heikkoa immunoreaktiivisuutta on läsnä. Mitta-asteikko: 200 um. B) Western blot analyysi solulinjojen osoittavat, että epiteelin SCC solulinja UT-SCC-43A ei ilmaise havaittavissa FHOD1, kun sekä spontaani EMT solulinja UT-SCC-43B ja Snail aiheuttama EMT solulinja 43A-SNA express FHOD1. UT-SCC-43A ilmaisee epiteelin merkki E-kadheriinin mutta ei N-kadheriinin, kun taas UT-SCC43-B ja 43A-SNA express N-kadheriinin mutta ei E-kadheriinin. C) F-aktiini järjestäminen UT-SCC-43A (ylempi paneeli) on tyypillisesti epiteelin, jossa erilliseen solun submembraneous säikeitä ja niukat stressiä kuituja. UT-SCC-43B näyttää piirteitä mesenkymaalisten järjestön (keskimmäinen paneeli). Solu-solu-kontaktien on vähän, solut ovat pitkänomaisia ​​ja niissä on lamellopodia, filopodia ja rasitukseen liittyviä säikeitä. Insertti (alapaneeli) esittää, että vain murto-osa FHOD1 lokalisoituu stressiä kuitujen UT-SCC-43B-solujen (nuolenpäät). Tumat värjätään DAPI (sininen). D) FHOD1 säätelyyn ylöspäin UT-SCC-43B soluihin riippuu PI3K signalointi. Hoito MEK 1/2 estäjän U0126 vähentää fosforylaation ERK 1/2 mutta ei vaikuta FHOD1 ilmaisua. Sen sijaan, PI3K esto LY294992 vähentää merkittävästi FHOD1 ilmaisua. Vähentäminen p-Akt osoittaa, että polku on tehokkaasti estetty.

Seuraavaksi tutkitaan, FHOD1 ilmentyminen liittyi morfologiset ja toiminnalliset muutokset EMT. Kolmesta suun SCC solulinjoissa, havaittava FHOD1 nähtiin UT-SCC-43B ja 43A-SNA muttei UT-SCC-43A, mikä osoittaa, että myös proteiinia tasolla, FHOD1 ylössäätöä esiintyy EMT sekä spontaania ja snail aiheuttama mallin (kuva 3 B). Kuten odotettua, UT-SCC-43A ilmaistu E-kadheriinin mutta ei N-kadheriinin, vaikka UT-SCC-43B ja 43A-SNA ilmaistaan ​​N-kadheriinin mutta ei E-kadheriinin (kuva 3 B).

solulinjat osoittivat myös selvästi morfologisia ominaisuuksia ja organisointi aktiinisytoskeletonin. UT-SCC-43A-solut oli tyypillinen epiteelin fenotyyppi, koska ne on muodostettu arkkeja solujen solu-solu-kontaktien ja niukasti rasitukseen liittyviä säikeitä (kuvio 3 C, ylempi paneeli). UT-SCC-43B, toisaalta, koostuivat hieman pitkänomainen solujen monien filopodia ja runsas stressi kuidut (kuva 3 C, keskimmäinen paneeli). Jakautuminen FHOD1 oli osittain pistemäinen ja sytoplasman, mutta se myös selvästi lokalisoitu korostaa kuituja (kuva 3 C, alempi paneeli).

suun SCC, signalointireiteissä yleisesti aktivoituna EMT kuuluu fosfatidyyli-s- Kinase (PI3K) ja mitogeenin aktivoiman proteiinikinaasin (MAPK /ERK 1/2) polkuja [13]. Sen tutkimiseksi, onko FHOD1 upregulation on riippuvainen aktivaatio joko näiden signalointireittien, soluja käsiteltiin PI3K ja MEK1 /2-estäjät. Estyminen MEK1 /2 ei vaikuttanut FHOD1 ilmaisua, vaikka koulutusjakso on tehokkaasti estetty. Sen sijaan, PI3K inhibitio vähentää huomattavasti FHOD1 ilmentymistä (kuvio 3 D). Tämä havainto osoittaa, että FHOD1 ilmentymistä UT-SCC-43B on riippuvainen PI3K signalointi.

FHOD1 Knockdown tukahduttaa mesenkymaalisten morfologia, muuttoliike ja hyökkäyksen UT-SCC-43B solujen

toiminnallinen merkitys