Krooninen sairaus

tiivistelmä

Kemiallisesti syntetisoitu Sirna (siRNA) on laajalle levinnyt molekyyli väline kaataa geenejä nisäkässoluissa. Kuitenkin suunnittelemalla voimakas siRNA edelleen haastava. Joukossa työkalut ennustamiseen siRNA tehoa, hyvin harvat ovat validoitu endogeeniseen tavoitteet realistisia koeolosuhteissa. Olemme aiemmin kuvattu apuna tehokasta siRNA suunnittelu (DSIR, muotoilija siRNA), joka keskittyy luontaisista ominaisuuksista siRNA järjestyksessä. Täällä arvioimme DSIR suorituskykyä systemaattisesti tutkimalla tehon siRNA se suunnittelee kohdistaa kymmeneen syöpään liittyvien geenien. mRNA pudotus mitattiin kvantitatiivisella RT-PCR: llä soluihin perustuvissa määrityksissä, paljastaa, että yli 60% siRNA-sekvenssejä suunnitteli DSIR vaimennettu niiden kohdegeenien vähintään 70%. Hiljentäminen teho säilyi, vaikka alhainen siRNA pitoisuuksia käytettiin. Tämä systemaattinen analyysi paljasti, erityisesti, että osajoukko geenien tehokkuuden siRNA-konstrukteja, lisää merkittävästi, kun sekvenssi sijaitsee lähempänä 5′-pään kohdegeenin koodaavan sekvenssin, mikä viittaa siihen, etäisyys 5′-päähän, kuten uusi ominaisuus siRNA teho ennustamiseen. Uusi versio DSIR sisältää nämä uudet havainnot sekä luettelo validoitu siRNA vastaan ​​testattu syöpää geenejä, on saatavilla verkossa (https://biodev.extra.cea.fr/DSIR).

Citation: FILHOL O, CIAIS D, Lajaunie C, Charbonnier P, Foveau N, Vert JP, et ai. (2012) DSIR: arviointi suunnittelu erittäin voimakkaita siRNA testaamalla Set of Cancer-Asiaa kohdegeenien. PLoS ONE 7 (10): e48057. doi: 10,1371 /journal.pone.0048057

Editor: Szabolcs Semsey, Niels Bohr Institute, Tanska

vastaanotettu: 01 elokuu 2012; Hyväksytty: 20 syyskuu 2012; Julkaistu: 30 lokakuu 2012

Copyright: © 2012 FILHOL et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ on osa kansallista ohjelmaa nimeltä ”Cartes d’Identité des Tumeurs” -ohjelma (CIT) rahoittama ja kehittänyt Ligue Nationale Contre le Cancer. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

RNA-interferenssi (RNAi) on prosessi, jonka avulla kaksijuosteinen RNA (dsRNA) aukoista geenin ilmentymisen, joko indusoimalla hajoamisen sekvenssi-spesifisiä komplementaarinen lähetti-RNA (mRNA) tai tukahduttaa käännös [1]. Endogeeninen nisäkkäiden RNAi koulutusjakson käyttää ei-koodaavaa MikroRNA (miRNA) moduloimaan geeniekspression translationaalisen tukahduttamisen ja /tai mRNA pilkkominen, kohdistamalla 3’alueet (3’UTRs) mRNA, joiden kanssa niillä osittaisia ​​täydentävät [2]. Mallina näistä miRNA, kemiallisesti syntetisoituja dsRNA reagenssien lyhyempi kuin 30 nukleotidiä havaittiin käynnistää sekvenssi-spesifinen RNAi-vasteen ilman indusoimalla solujen luontaista vastustuskykyä nisäkkään [3], [4]. Duplex pieniä häiritseviä RNA-molekyylejä (siRNA) teoreettisesti on mahdollista spesifisesti inhiboida ilmentymisen lähes mitään kohdegeenin. Siksi ne ovat hyvin yleinen molekyyli työkalu edustaa tehokas keino tutkia geenin toimintaan [5], [6]. Prekliiniset tutkimukset ja jotkut varhaiset kliiniset kokeet ovat jo osoittaneet, että siRNA on potentiaalia Uusien hoitomuotojen monenlaisia ​​sairauksia, kuten syöpää [7].

RNAi olevan luotettavia, siRNA: t on suunniteltava huolellisesti, jotta tehokkuuden varmistamiseksi ja spesifisyyden valitun sekvenssin sen kohdegeenin [6], [8]. siRNA teho on mitta yhteistyökumppanuuden välistä opas-lohkon ja RISC koneen johtavat mRNA pilkkominen. Sen sijaan siRNA spesifisyys vastaa tarkasti tunnustamista kohdesivustoluetteloon, välttää ei-toivottuja sivuvaikutuksia (esim. ”Off-kohde” vaikutus). Tutkimukset perustuvat sekä kokeelliset tiedot ja tietotekniikassa ovat raportoineet, että sekundaarinen rakenne tavoitteet ja niiden saavutettavuus olivat tärkeitä, vaikkakin vähemmän, määritettäessä siRNA toimintaa [9], [10], [11], [12].

Useat ohjelmat ja web-palvelimia on kehitetty automatisoida siRNA suunnitteluun. Nämä toteuttaa suunnittelusääntöjä perustuu nukleotidin mieltymysten tietyissä asemissa, sekvenssi ominaisuudet, mahdollisten hiusneula muodostumista, vakautta profiilit, energia ominaisuuksia, painotettu kuvioita ja toisen rakenne kohde-mRNA. Nämä siRNA ominaisuudet on koottu katsaukset [katso [13], [14]]. Optimaalinen siRNA ominaisuudet määritetään parhaiten perustuvat kokeelliset tiedot. Huesken et ai. [15] julkaisi joukon 2182 satunnaisesti valittua siRNA, joka määritettiin käyttäen suuren läpimenon loisteputki reportterigeenin järjestelmään. Tämä johti kehittämiseen uuden sukupolven algoritmin perustuu koneoppimismenetelmiä joka on merkittävästi parantanut siRNA muotoilu, jossa on raportoitu Pearsonin korrelaatiokerroin 0,66-0,67 välillä mitatun ja ennustetun tehon. Äskettäin arvioinnin eri siRNA-suunnittelussa työkaluja päätellä, että

Biopredsi

[15],

Thermocomposition

[16] ja

DSIR

laskennallinen kehittämää meitä, [ ,,,0],17] olivat hyvin tarkkoja ja luotettavia ennustajia aktiivisten siRNA [18], [19]. DSIR perustuu lineaarinen malli yhdistyvät erityisesti nukleotidin annettuja kantoja ja erityisiä kuvioita siRNA opas-lohkon, mukaan lukien 2-nt ulokkeita 3’loppuun [17]. Tämä yhdistelmä tarjoaa tehokkaan siRNA, johtunee korkeat RISC sitovia ja /tai Ago2 -välitteisen pilkkomisen kohde-mRNA komplementaarinen säie [18].

kuitenkin ominaisuuksia, jotka ovat ratkaisevia optimaalisen ennustamiseen tehokas siRNA edelleen keskustellaan [13], [14], [20]. Siksi näistä parannuksista huolimatta on vielä määriteltävä mikä algoritmi ja web työkalu on optimaalinen, ja kuinka hyvin ennustettu siRNA käyttäytyvät realistisia koeolosuhteissa. Yhtäältä mikään tällä hetkellä saatavilla siRNA suunnittelumenetelmiä kattaa koko siRNA-koneiden prosessi. Näin ollen vaikka suhteellinen osuus ominaisuuksia, kuten siRNA tehokkuutta, spesifisyyttä tai kohde saavutettavuus on tutkinut itsenäisesti niiden roolia tuloksena lopullinen knockdown, yksi yleinen tutkimus on vielä suoritettava. Toisaalta, hyvin heterogeeninen aineistot on käytetty suunnittelemaan useimmat näistä laskennallisten mallien ennustavat siRNA tehokkuus [21]. Nämä aineistot saatiin käyttämällä erilaisia ​​menetelmiä, joilla mitataan mRNA Knockdown, eri siRNA pitoisuudet ja pituudet (19-21 nt), ja käytettiin erilaisia ​​solutyyppejä tai transfektion järjestelmiä. Kaikki nämä erot on esitetty taulukossa 1. On huomattava, että Huesken aineisto, usein käytetään kehittämään siRNA suunnittelun algoritmeja [15], [16], [17], [22], valmistettiin käyttäen plasmidia, joka koodaa sekä eksogeenisen reportterigeenin laakeri kohde cDNA lisätään sen 3’alue (UTR), ja viittaus geeni [15]. Tämä mittausjärjestelmä ei ehkä sovellu tutkiessaan miten siRNA käyttäytyy kohti mRNA tavoitetta sen luonnollisessa solujen ympäristössä. Toinen ongelma kohdataan yhdistettäessä tietoja erillisistä lähteistä on puute on yksityiskohtaisia ​​tietoja kohdesekvenssin [23].

arvioimiseksi tarkkuus automaattisen siRNA suunnittelutyökalut realistisessa kokeellinen ympäristö, keskityimme DSIR suunnittelun työkalu ja systemaattisesti tutkittu, kuinka hyvin se käyttäytyy ”tosielämän” mittaamalla mRNA knockdown standardoidulla solututkimuksessa. Tätä varten perustimme hallinnassa, normalisoitu kokeellinen menettely siRNA transfektiota ja kvantitatiivinen reaaliaikainen PCR (qRT-PCR) mittaukset. Olemme arvioineet hiljentäminen teho joukko DSIR suunniteltu, 21-nt siRNA duplex sekvenssit kohdistuu kymmenen ihmisen syöpään liittyvien kohdegeenien. Tätä lähestymistapaa käyttäen olemme määrällisesti yleistä ennusteita siRNA suunnittelun algoritmin DSIR. Se antoi meille mahdollisuuden tutkia tarkemmin tekijöiden mahdollisesti parantaa DSIR suorituskykyä.

Materiaalit ja menetelmät

1 Target ja siRNA Selection

alunperin valittu kahdeksan ihmisen geenejä tiedetään olevan keskeinen molekyyli komponentit solun transformaatiossa ja syövän prosesseja (taulukko 2). Nämä geenit olivat säilyneet terapeuttiseen arviointiin prekliinisissä tutkimuksissa, jotka liittyvät erilaisiin kasvainmuodoista jonka ”siRNA konsortio”, rahoittamassa hankkeessa Ligue Nationale Contre le Cancer. siRNA kohdistettu alueilla täyspitkän kohde-mRNA-sekvenssi oli suunniteltu DSIR. 21-nt malli sisältyy 2-nt 3-ulokkeet [17]. siRNA: t, joissa on yli 80% ennustettu sukupuuttoon aktiivisuus säilytettiin, hylkäämättä siRNA sisältävän polynukleotidin kirjoituksia. Näistä siRNA sekvenssit, siRNA että päällekkäin tai olivat liian sulkee erillään siitä kohdesivustot jääneet jos mahdollista. Viimeinen koostui 88 siRNA-dupleksit. Positiivinen kontrolli siRNA kohdistaminen CSNK2B (aiemmin vahvistanut [24]), ja negatiivinen kontrolli siRNA vastaan ​​GFP olivat mukana myös tässä ensimmäisessä luettelossa siRNA.

toinen kierros kokeita, ylimääräinen sarja 40 vastaan ​​suunnattu siRNA kaksi kahdeksasta geenien suunnattu ensimmäisellä kierroksella, ERCC2 ja HDAC6, ja kaksi uutta kohdegeenien, PARP1 ja DNA-ligaasin 1 (LIG1) valmistettiin. Tämä sarja käytettiin tarkistaa osuus luontainen tavoite ominaisuuksia tunnistetaan ensimmäisellä kierroksella kokeiluja. Kriteerit siRNA sisällytettäväksi toisella kierroksella olivat: 80% sukupuuttoon aktiivisuus ennusti DSIR, paikkaan koodaussekvenssi (CDS) osa kohteena, ei polynukleotidin traktaatteja eikä mahdollisia off-kohteita sallittua, laajennettu paneeli tavoitekohdissa täydentävien kattavuuteen transkriptisekvenssi suhteessa siRNA järjestyksessä suunniteltu ensimmäiset. Tiedot kaksi siRNA luetellaan täydentäviä taulukossa 1.

siRNA synteesiä.

Kaikki siRNA varten Knockdown kymmenen ihmisen geenejä syntetisoitiin dupleksit Sigma Proligo kuin 21 jia ( Täydentävät Taulukko S2).

2 Soluviljely ja transfektio

HeLa-soluja viljeltiin Dulbeccon modifioidussa Eaglen väliaineessa (DMEM), joka sisälsi 10% naudan sikiön seerumia (FBS), 100 yksikköä /ml penisilliiniä, 100 mg /ml streptomysiiniä, kostutetussa inkubaattorissa 37 ° C: ssa 5% CO

2. Noin 1 x 10

5-solut ympättiin 12-kuoppalevyille ja viljeltiin 24 tuntia. Väliaine vaihdettiin 0,4 ml OPTI-MEM (Gibco) ennen solujen transfektoimiseksi 20 nM siRNA käyttäen Oligofectamine (Invitrogen) mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Transfektoituja soluja inkuboitiin 5 tuntia. Sen jälkeen solut pestiin kerran PBS: llä, DMEM 10% FBS: ää lisättiin, ja soluja viljeltiin vielä 72 h (paitsi BCL2L1, jossa soluja viljeltiin vain 24 h).

3 Reaaliaikainen PCR-määritys ja mittaukset

Kolmen vuorokauden kuluttua siRNA transfektiosta solut kerättiin ja RNA eristettiin käyttäen Ehdottomasti RNA miniprep kit (Stratagene). RNA-pitoisuus määritettiin käyttäen NanoDrop. Käänteinen transkriptio suoritettiin StrataScript QPCR cDNA Synthesis Kit (Stratagene), mukaan valmistajan ohjeiden. Gene-spesifisiä alukkeita (eteenpäin ja taaksepäin) on suunniteltu yhteensopivaksi yhdellä qRT-PCR terminen profiili siten, että useita transkriptit voitaisiin analysoida samanaikaisesti. PrimerQuest (https://www.idtdna.com/SCITOOLS/Applications/PrimerQuest/) käytettiin niiden suunnitteluun. Primer sekvenssit on lueteltu Täydentävä taulukossa S2. Kvantitatiivinen PCR suoritettiin FullVelocity SYBR Green QPCR Master Mix käyttäen alukekonsentraatiot taulukossa 2. PCR-olosuhteet (alukekonsentraatiot, cDNA määrä) on optimoitu ja PCR tehokkuus määritettiin kullekin kohdegeenin. PCR-reaktioseokset (25 ui) pantiin Mx3000P väline, jossa ne tehtiin seuraavat Sykliohjelma, optimoitu 96-lohko: 95 ° C 5 min, jota seurasi välittömästi 45 sykliä, 10 s 95 ° C: ssa ja 30 s 60 ° C: ssa. Lopussa, PCR-tuotteet hajotettiin inkuboimalla 1 min 95 ° C: ssa ja sitten 30 sekuntia 55 ° C: ssa, jonka jälkeen luiska 95 ° C: ssa. PCR laatu ja spesifisyys varmistettiin analysoimalla dissosiaatiokäyrä. Kunkin alukesetti, ei-mallia ohjaus (NTC) ja ei-reverse-vahvistus ohjaus (NAC) olivat mukana. qRT-PCR-reaktiot suoritettiin kolminkertaisina, ja kvantitointi suoritettiin käyttäen vertailevaa raja-syklin menetelmällä. Kvantitatiivinen PCR Aineisto verrattain analysoitiin MxPro ohjelmistoa (Stratagene, ”Vertaileva kvantifiointi” sovellus) joko 36B4 tai hHPRT vahvistusta signaali sisäisenä ”normalizer” (korjattu kokonais-RNA-pitoisuus) ja merkinnät mock transfektoiduissa näytteen ”kalibraattori”. Tulokset on ilmaistu suhteellinen muutos ilmentymisen kontrolliin verrattuna. Kokeet suoritettiin kolmena rinnakkaisena kullekin näytteelle.

4 Quantitative Reaaliaikainen PCR Data normalisointi ja Tilastollinen analyysi

Jokaisessa PCR ajaa sisälsi kolme biologista rinnakkaista kussakin käsittelyssä analysoitiin. Lisäksi kaikki kokeet toistettiin kolme kertaa itsenäisesti eri biologisista näytteistä. Koko menettely suoritettiin myös kahdesti kahdella eri normalisointi geenejä. 18 Sammutussuhde arvioiden

Q

* saatiin näitä tietoja, jotka perustuvat seuraaviin standardin kaavalla: missä on vahvistus nopeus alkuvaiheessa (ARES) prosessin varten kohdemolekyyli, on ARES varten normalisoi molekyyliä, ja

C

on syklien määrä joka tarvitaan saavuttamaan ennalta määritellyn tason signaalin. Olisi ollut kätevää yhdistää itsenäisyyden ja tasalaatuisuus oletuksia, määrittää luottamus alueille. Kuitenkin tässä tämä prosessi on selvästi kyseenalainen, koska jotkut parit kokeita jakaa rakenneolosuhteissa että muut eivät (esimerkiksi samassa ajossa, tai sama normalisointi geeni). Tästä syystä toinen analyysi suoritettiin, jonka yksityiskohdat löytyvät täydentävässä materiaalia. Ekstinktioarvojen kunkin siRNA-molekyyli annetaan Täydentävä taulukko S3.

5 Western blot -määritys

Kolmen vuorokauden kuluttua siRNA transfektion, HeLa-solut otettiin talteen proteiinin uuttamalla RIPA-puskuriin (Tris-HCl pH 7,4 10 mM, NaCl 150 mM, SDS 0,1%, Na deoksikolaatti 0,5%, EDTA 1 mM, Triton X100 1%, leupeptiini 5 ug /ml, aprotiniini 5 ug /ml). Proteiinit erotettiin elektroforeesilla 12% SDS-PAGE-geelissä ennen siirtoa PVDF-kalvolle 1 h 100 V Primary vasta-aineita: polyklonaalinen CK2alpha vasta-ainetta (αCoc) [25], ja monoklonaalisia Hsp90-vasta-aine (klooni 16F1 peräisin Stressgen) laimennettiin 1 /500 PBS: ssä, joka sisälsi 3% rasvatonta maitojauhetta. Vuohen anti-kani-tai anti-hiiri-IgG -peroxidase (Interchim) käytettiin sekundaarisia vasta-aineita, laimennettiin 1:5000 PBS: ssä. Toissijainen vasta-aineen sitoutumista paljastettiin käyttäen ECL plus reagenssit (Amersham, #RPN 2105).

6 TILASTOANALYYSI

Eri tekijöiden on siRNA tehosta mitattuna analysoitiin sovittamalla lineaarisia malleja ja testaus merkityksen jokaisen aikavälin käyttäen R tilastollisen analyysin ohjelmisto (https://www.r-project.org/). Merkitys kunkin mallin aikavälillä ja muita selittäviä muuttujia testattiin ANOVA tilastoja.

7 Toissijainen rakenne Target mRNA ja saavutettavuus

Target sivusto saavutettavuus on arvioitu järjestelmällisesti joko käyttämällä SFold web-palvelin ( https://sfold.wadsworth.org), jossa todennäköisyys profiilia ennakoi maalin saavutettavuus voidaan silmämääräisesti käyttäen siRNA moduuli (katso täydentävä kuva S2). Vaihtoehtoisesti RNAplfold ohjelma (Wien paketti release 1.7.2) käytettiin aiemmin määritellyn optimaalisen taitto parametrit (W = 80, L = 40 ja u = 16), kuten on kuvattu [22]. Mitä korkeampi RNAplfold todennäköisyydellä helpommin kohdepaikan on. RNAplfold todennäköisyydet kullekin siRNA järjestyksessä luetellaan Täydentävä taulukossa S3.

8 Mahdolliset Off-kohde Haku

Mahdolliset off-kohdegeenin Knockdown havaittiin soveltamalla in-house toteuttamiseen Wu -Manber algoritmi, variantin Baeza-Yates shift-lisätä menetelmä [26]. Toisin Blast, tämä ohjelma suorittaa tarkka etsimään tiettyä mallia (lyhyt siRNA-sekvenssin) sarjana tietopankkiin (NCBI RefSeq jako, vapauta 32) mahdollistavat epäsuhta. Tutkimuksessamme oletusarvo määrän epäsuhta sallittu asetettiin kolme suosituksen [13]. Identiteetti välillä mRNA ja siRNA siemen-alueesta, jotka nukleotidit 2-8 antisense-juosteen laskettiin. Tämä mukana käynnissä Wu-Manber toteuttamiseen ilman epäsuhta sallita, ja tarkistamalla heptameerin siemenet sekvenssit vastaan ​​3’UTR mRNA-sekvenssin tietopankin (rakennettu ihmisen geenit luetellaan RefSeq, vapauta 48). Määrä 3’UTR sekvenssit Hyväksytty globaalissa transcriptome, siementen määrä vastaavat 3’UTR järjestyksessä yksi, kaksi ja kolme tai useampia kertoja kaikki raportoida (täydentävä taulukko S3). Nämä ominaisuudet on ehdotettu liittyvän RNAi off-tavoitteet [27], [28].

Tulokset

1 koejärjestely

päätavoitteena Tämän tutkimuksen oli arvioida tehoa siRNA sekvenssit suunnitellut DSIR. Tehoa arvioitiin endogeenisesti mittaamalla prosentuaalinen jäljellä, ei-uurteinen mRNA suhteessa kontrolliin, ei-kohdennettu mRNA. Standardoidun menettely perustettiin välttää harhojen vuoksi koeolosuhteissa (ts solutyyppi, transfektio olosuhteet, keskittyminen, kvantitatiivinen reaaliaikainen RT-PCR, jne). Ensimmäisellä kierroksella kokeita, keskityimme kahdeksaan kohdegeenien liittyvät syöpään. ERCC1 ja ERCC2 tiedetään osallistuvan nukleotidin Leikkauskorjauksessa (NER) reitin ja ovat välttämättömiä korjaamiseen sisplatiinin aiheuttaman DNA adduktit (Leikkauskorjauksessa rajat täydentävät jyrsijä korjaus puutos) [29]. HDAC6 näyttää histonideasetylaasiaktiivisuutta ja repressoi transkription [30]. BCL2L1 (Bcl-X

L) on antiapoptoottisten Bcl-2-perheen jäsen ja avainsäätelijä apoptoottisessa prosessissa [31]. HIF1A (HIF1α) on transkriptiotekijä aiheuttama hypoksia [32]. Näiden, lisäsimme kolme alayksikköä proteiinikinaasi CK2, (i) CSNK2A1 (CK2α), (ii) CSNK2A2 (CK2α ”) ja (iii) CSNK2B (CK2β) [33]. Näiden mRNA: n kohdegeenien on kuvattu, niiden ominaisuuksia, ja vastaava määrä siRNA reagensseja testattiin on lueteltu taulukossa 2. Kaikki nämä geenit ovat luonnollisesti ilmaistaan ​​ihmisen HeLa-solut, joiden tiedetään olevan helposti transfektoituvat. Nämä solut valittiin, jotta vältetään ylimääräinen vaihtelun vuoksi transfektion vaiheeseen. Kunkin kohde, 10 tai enemmän 21-nt siRNA suunniteltiin DSIR, ja on valittu, kuten on kuvattu materiaalit ja menetelmät. Koska korkea siRNA konsentraatio voi johtaa off-tavoite vaikutuksia, ja alhainen pitoisuus voi aiheuttaa havaittavan geenien, tavoitellut kompromissia vahvistamalla siRNA pitoisuus 20 nM. Fold-muutoksia geenien ilmentyminen määritettiin ΔΔCt menetelmällä, jossa normalisointi joko 36B4 tai HPRT talon pitäminen geenejä. Tämä normalisointi strategiaa, joka perustuu kahteen viite geenejä, on osoitettu olevan luotettavampi kuin normalisointi yhden viite geeni [34]. HeLasoluista transfektiotehokkuutta tarkastettiin kaikissa kokeissa mittaamalla vaikutuksesta aiemmin validoitu siRNA [24] kohdistaminen CSNK2B. Kokeilu pidettiin validoitu, kun positiivinen kontrolli siRNA alassäädetty CSNK2B vähintään 80%. Olemme myös kehittäneet uuden mallin, joka mahdollistaa normalisointi kahden taloudenhoito geenejä, 36B4 ja HPRT, yhdessä. Meidän analyyttinen lähestymistapa mukana normalisoinnin käyttämällä useita viite geenejä välistä ja run kalibrointi. Tämä auttoi välttämään virheiden lisääntyminen ja poikkeama levyjen väliin (katso yksityiskohdat täydentävä materiaali). Lopuksi, koska vaikutus siRNA lopulta tarvitaan tuotteen tasolla, western blot määritys CSNK2A1 proteiinia käytettiin vahvistamaan havaintomme. Kaikki nämä tulokset ja niiden täydellinen analyysi on esitetty kuviossa 1 tämän geenin (ja täydentävä kuviossa S1 muille kohdegeenien).

HeLa-solut transfektoitiin kymmenen siRNA kohdistamista CSNK2A, ja kaksi ohjaus siRNA, (GFP negatiivisena kontrollina ja CSNK2B kuin positiivinen kontrolli), jonka lopullinen pitoisuus on 20 nM käyttäen Oligofectamine reagenssia. Lisävalvontatoimenpiteenä koostui mock solujen muuntaminen (ilman siRNA). Kolme päivää myöhemmin, RNA ja proteiinit uutettiin lisäanalyysiä varten. A. Vaikutus siRNA hoidon tyypillisestä kokeesta. Kunkin siRNA suhteellinen määrä kohde-mRNA HPRT (musta) tai 36B4 (harmaa) piirrettiin käyttämällä vertailevan analyysin moduuli MxPro ohjelmisto (Stratagene). B. transfektio tehokkuuden valvontaan. Kutakin koetta varten, transfektiotehokkuudet tarkastettiin mittaamalla geenien suhteessa kontrolliin siRNA tunnetun tehokkuuden. Tulokset kokeista, joissa tämä valvonta ei vaientaa ilmaisua yli 70% jätettiin aineisto koska transfektiotehokkuutta pidettiin huono. C. rasiakuvaaja edustus siRNA hyötysuhde 10 sekvenssit. Kunkin siRNA, tehokkuus ennusti DSIR ja mitata tehokkuutta on merkitty. Mitattu tehokkuus oli tilastollisesti määritettiin kolmena RT-qPCR kvantifiointiin kohde-mRNA jälkeen siRNA hoidon, joka perustuu kolmen erillisen kokeen. Ekspressiotasot normalisoitiin HPRT (musta) ja 36B4 (punainen) house-pitäminen geenejä. Log (Q) = 1 merkitsee ei heikkene kohde-mRNA hoidon jälkeen ja log (Q) = 1/4 vastaa noin 75% hyötysuhde. Katso kohta 2.6 lisätietoja tilastollisen analyysin. Kaiken siRNA tehokkuutta ja merkitystä arvot annetaan oheismateriaalia. D. Western blot analyysi hiljentäminen tehokkuuden, käyttäen anti-CK2alpha vasta-aine. Proteiini lastaus normalisoitui varten Hsp90 tasoilla.

2 arviointi DSIR Design by Measuring siRNA Activity

Maailmanlaajuinen siRNA hyötysuhde kohti kohdegeenin on yhteenveto taulukossa 3. arvioida, miten onnistuneesti DSIR suunnittelu malli suunnittelee siRNA: t, kehitimme luokitusjärjestelmä. siRNA että tuotti vähintään 70% kohdegeenin pudotus koettiin erittäin tehokas; muut siRNA pidettiin joko kohtalaisen tehokas (50-70%) tai tehottomia ( 50%). Tämän sijoitusta, koko siRNA aineisto sisältää yli 56% erittäin tehokas, ja 25% kohtalaisen tehokas siRNA. Tämä yleinen onnistumisprosentti osoittaa, että DSIR suoriutuu hyvin todellisia kokeiluja.

seuraavaksi keskittyneet kohde erikseen määritellä onnistumisprosentti sukupuuttoon laskemalla tehokkaan siRNA sekvenssiä kokonaismäärä siRNA testattiin kunkin geenin (taulukko 3). Tämä data osoittaa silmiinpistävä heterogeenisyys onnistumisprosentti yhdestä kohdegeenin seuraavaan, mikä viittaa eri reaktiot siRNA-välitteisen hiljentäminen reitin. Todellakin, qRT-PCR mittaukset seuraavista transkriptien, ERCC1, CSNK2B, CSNK2A1, CSNK2A2, osoittavat tyydyttävää vaiennettu profiili (jossa 9/10, 7/10, 7/10 ja 10/10 tehokas siRNA, vastaavasti). Sen sijaan, ERCC2 ja HDAC6 (4/15 ja 3/13, vastaavasti) näyttävät olevan varsin vastustuskykyisiä hiljentäminen, vain muutamia tehokkaita siRNA huolimatta suurempi määrä siRNA reagensseja testattu. Intermediate menestys on havaittu HF1A ja BCL2L1, tehokkaat siRNA aktiivisuus 5/9 ja 7/12 tapauksissa vastaavasti. Tämä poikkesi kuva korostetaan, että suhteen hiljentämisen, kaikki geenit eivät ole samanarvoisia. Tämä oli hieman yllättävä, koska ekspressiotasoja kaikista näistä kohdegeenien oli dokumentoitu olevan samanlainen alhainen. Näin ollen, jos hylätä kohde- geenejä, jotka ovat refraktorisia hiljentämiseltä ERCC2 ja HDAC6, DSIR ennustaa yli 70% erittäin tehokas siRNA-sekvenssejä. Nämä havainnot korostavat huomattavissa asema kohde-mRNA, kun arvioidaan laskennallisten mallien ennustavat siRNA tehoa.

3 suhde siRNA Tehoa ja mahdolliset off-tavoite Effects

On osoitettu, että siRNA voivat epäspesifisesti kohdistaa jotka eivät liity geenien esittää vain osittainen sekvenssikomplementaarisuutta. Tätä kutsutaan off-tavoite vaikutuksia (OTE). Kahdenlaisia ​​OTE nyt erottaa [35]. Ensimmäinen näistä on OTE välittämien Ago2 vaikuttamalla tavoitteet, jotka ovat hyvin samanlaisia ​​kuin todellinen siRNA tavoitteet. Tämä näyttää olevan hyvin voimakas, vaikka tämäntyyppisen tavoitteen ulkopuolella vaikutus on suhteellisen harvoin esiintynyt. Toinen OTE on havaittu tavoitteista, jotka sisältävät siemenet otteluiden niiden 3’UTR alueella [36]. Tämä liittyy mekanismi, joka näyttää olevan samanlainen kuin miRNA asetuksen [27], [36], [37]. Koska OTE voisi selittää alemman tehokkuuden laimennusvaikutusta, tutkimme tätä näkökohtaa seulomalla järjestelmällisesti kunkin siRNA mahdollisia off-kohteita sivustoja. Ensin havaitsimme, ettei lukuisia osittaisia ​​täydentäviä off-tavoitteita, eikä määrääviä tekijöitä, jotka liittyvät siementen täydennys taajuusluokan merkittävästi liittyvät siRNA tehokkuuteen (katso jäljempänä 3.4). Lisäksi, Du et al. [38] ilmoitetaan, että asema epäsuhta sisällä duplex ja identiteetin pohjan muodostavien epäsuhta voi vaikuttaa siRNA toiminnallisuutta. Tutkia vaikutuksia epäsuhta välillä siRNA ja mRNA tavoite tarkemmin suhteessa RNAi vaientaminen toimintaa, olemme keskittyneet rajat reaktio, joka voi olla välillä CSNK2A2 geenikohteen ja vastaan ​​suunnattu siRNA CSNK2A1, joille kolme siRNA sekvenssit meidän aineisto ( si_031, si_034 ja si_035) on tunnistettu olevan potentiaalista OTE (katso kuva 2A). Vaikka näitä kolmea siRNA on osoitettu vähentää huomattavasti CSNK2A1 ilmaisua, yksikään niistä ei ollut mitään vaikutusta tasoon CSNK2A2 transkriptin, joka käy ilmi qRT-PCR (katso kuva 2B). Lisäksi huomasimme, että asema epäsuhta kunkin siRNA opas-juostesekvenssi (si_031: 6,19,21; si_034: 3,6,12; si_035: 2,5,8) sisällä CSNK2A2 transkriptio eivät välttämättä kanssa siedettyjä riippuvaa epäsuhta kuvattu aiemmin [38]. Esimerkiksi, kanta 12 havaittiin heikosti siedetty, kun taas kannat 1, 2, 5, 7, 8, 18 ja 19 havaittiin olevan hyvin siedetty. Meidän tapauksessa aktiivista siRNA (si_035) sisältää kolme korkean toleranssin kantoja, jotka voisivat myös voinut aiheuttaa CSNK2A2 knockdown. Kuitenkin mitään vaikutusta ei havaittu. Tämä viittaa siihen, että tämä yhdistelmä ei suvaita, tai että OTE vuoksi lähes täydellinen täydentävät on paljon monimutkaisempi.

. Kolme siRNA sekvenssit kohdistettu CSNK2A1 tunnistettiin mahdollisiksi off-tavoitteet CSNK2A2, kolme epäsuhta eri asemissa (pienillä kirjaimilla). HeLa-solut transfektoitiin kolme siRNA vastaan ​​CSNK2A1 (CK2α) (si_31, si_34 ja si_35), vastaan ​​tai CSNK2A2 (CK2α ’) (si_41) ja GFP-ohjaus siRNA. Kaikki siRNA: t käytettiin lopullisessa pitoisuudessa 20 nM, ja transfektoitiin käyttäen Oligofectamine reagenssia. Valetransfektoidut solut (ilman siRNA) on myös mukana. Kolme päivää myöhemmin, RNA uutettiin lisäanalyysiä varten. B. Suhteellinen CSNK2A2 mRNA määrä määräytyy qRT-PCR. Kunkin siRNA määrä kohde (tai off-kohde) mRNA suhteessa HPRT (musta) tai 36B4 (harmaa) piirrettiin.

Toinen tapa minimoida OTE on alentaa siRNA pitoisuus. Meidän validointi suoritettiin 20 nM siRNA, mutta testasimme myös pienempiä määriä arvioimaan edelleen tehokas sekvenssit. Kuten kuviossa 3 on esitetty, alhaisina pitoisuuksina kuin 1 nM ovat yhtä tehokkaita kuin 20 nM kolme siRNA-sekvenssejä vastaan ​​suunnattuja CSNK2B ja kaksi siRNA-sekvenssejä vastaan ​​suunnattuja LIG1 (geenikohteen lisätään toisella kierroksella testit, katso alla). Nämä tulokset osoittavat, että siRNA suunnitellut DSIR voi olla tehokas jopa ”fysiologinen” olosuhteissa, joissa pitoisuudet voivat olla niinkin alhainen kuin 1 nM.

konsentraatioalueella kolmen siRNA: iden suunnattu CSNK2B, joissa kaikissa on korkea kokonaistehokkuutta (siRNA_26, _29 ja si_30) (paneeli A), ja kaksi vastaan ​​suunnattu siRNA LIG1 (siRNA_133 ja _137) (paneeli B), transfektoitiin HeLa-solujen välisen suhteen määrittämiseen yleistä tehokkuutta ja määrää transfektoitiin. siRNA_GFP käytettiin negatiivisena kontrollina. Kuvaaja osoittaa, keskiarvot +/- keskihajonnat RT-qPCR kvantifiointiin kaksi erillistä koetta normalisoida HPRT talon pitäminen geeni.

4 Exploring ominaisuudet vaikuttavat siRNA Potency

kaikki siRNA suunniteltu käyttäen DSIR oli ennustettu teho on vähintään 80%. Osuus ja merkitys useiden aiemmin julkaistu siRNA suunnittelun perusteet tai tekijöitä, joiden arvellaan olevan rooli geenien, ja joita ei nimenomaisesti huomioon, että DSIR mallin, analysoitiin. Vaikutus joitakin näistä ominaisuuksista vaihtelut havaittiin tehokkuudet on 88 siRNA testattu ensimmäisellä kierroksella kokeissa analysoitiin. Voit tehdä niin, me ensin sovitettu lineaarinen malli selittää siRNA tehokkuusvertai- mitattuna funktiona 13 ominaisuuksia: (1) DSIR pisteet, (2) kohdegeenin, (3) asema kohdegeenin (BP suhteellinen 5′-päähän), (4) sijainti on kohdegeenin (5 ’UTR, CDS tai 3’ UTR), (5) lukumäärä mahdollisia off-tavoitteita siRNA, (6) ei ole tai läsnä polynukleotidi suolikanavan (jossa = 4 samanlaista peräkkäistä nukleotidia) on siRNA, (7) osumien määrä varten siRNA maailmanlaajuiseen ihmisen transcriptome, (8-10) määrä mRNA-sekvenssien vastaavat niiden 3’UTR alueella (11) pituus kohde eksonin, (12), kun läsnä on eksonin eksonin junction kohdepaikassa, ja (13) kohdepaikassa saatavuutta, lasketaan, kuten on kuvattu Materiaalit ja menetelmät. Kaikki tämä tieto annetaan täydentäviä taulukossa S3. ANOVA testejä merkitys raja on 5% P-arvot paljasti, että vain kolme näistä kolmestatoista covariates korreloi merkitsevästi teho; Nämä olivat seuraavat: identiteetti kohdegeenin, asema kohde-geenin, ja sijainti kohdegeenin (kuten edellä on määritelty). Erityisesti on kapealla alueella yli 80% ja DSIR pisteet ei näytä merkittävästi suhteessa tehoon mitattuna, mikä viittaa siihen, että sitä tulisi käyttää vain valita siRNA kynnysarvoa, mutta ei asettaa ne. Lisäksi yksikään toinen covariates jotka on ehdotettu suunnittelun perusteet (lukumäärä off-tavoitteita, läsnäolo polynukleotidin suolikanavan, kohdesivustoa saavutettavuus) osoitti todisteita mahdollisuus ennakoida tehoa mitataan meidän joukko siRNA (ei näy ).

siis arvioidaan uudelleen lineaarinen malli, jossa on vain kolme parannetaan merkittävästi kovariantteja. Ensinnäkin sijainti kohdepaikkaan 5’UTR, CDS tai 3 ’UTR on merkittävä vaikutus tehoon mitattuna (PVAL 0,0003).