Krooninen sairaus

tiivistelmä

epidermaalisen kasvutekijän reseptorin tyrosiinikinaasin estäjät (EGFR-TKI:), mukaan lukien gefitinibi, ovat tehokkaita ei-pienisoluisen keuhkosyövän (NSCLC) potilailla, joilla on

EGFR

mutaatioita. Nämä potilaat lopulta kehittää vastustuskykyä EGFR-TKI. Tavoitteena tässä tutkimuksessa oli selvittää osallistumista autophagy in gefitinibin vastarintaa. Kehitimme gefitinibi-resistenttien solujen (PC-9 /GEF) PC-9-solut (jotka sisältävät eksonin 19 deleetion

EGFR

) jälkeen pitkäaikainen altistuminen gefitinibin. PC-9 /gef soluja (B4 ja E3) olivat 200-kertaisesti enemmän resistenttejä gefitinibin kuin PC-9 /paino soluja. Verrattuna PC-9 /paino soluja, sekä PC-9 /gefB4 ja PC-9 /gefE3 solut osoittivat korkeampia pohjapinta LC3-II-tasoja, jotka estävät 3-metyyliadeniinin (3-MA, joka on autophagy estäjä) ja voimistaa klorokiinia ( SA, estäjä autophagolysosomes muodostuminen), osoittaen koholla autophagy PC-9 /GEF soluja. 3-MA ja CQ pitoisuus riippuvasti esti solujen eloonjäämistä sekä PC-9wt ja PC-9 /gef soluja, mikä viittaa siihen, että autophagy voi olla pro-selviytymisen. Lisäksi gefitinibi lisääntynyt LC3-II-tasoja ja autolysosome muodostumista sekä PC-9 /wt-soluja ja PC-9 /GEF soluja. PC-9 /paino soluja, SA voimisti sytotoksisuuden alhainen gefitinibin (3 nM). Lisäksi CQ voitti hankittu gefitinibi vastus PC-9 /gef soluja tehostamalla gefitinibin aiheuttama sytotoksisuuden, kaspaasi 3 ja poly (ADP-riboosi) polymeraasin pilkkominen. Käyttämällä

in vivo

mallissa ksenografti PC-9 /paino ja PC-9 /gefB4 soluja, suun kautta gefitinibin (50 mg /kg) esti täydellisesti kasvaimen kasvua PC-9 /paino, mutta ei PC -9 /gefB4cells. Yhdistelmä CQ (75 mg /kg, i.p.) ja gefitinibin oli tehokkaampi kuin gefitinibi yksinään vähentämään kasvaimen kasvua PC-9 /gefB4. Tuloksemme viittaavat siihen, että esto autophagy voi olla terapeuttinen strategia voittaa hankitun resistenssin gefitinibin

EGFR

mutaatio pienisoluista keuhkosyöpää.

Citation: Tang MC, Wu MY, Hwang MH, Chang YT, Huang HJ, Lin AM-Y, et ai. (2015) Chloroquine Parantaa Gefitinibi Sytotoksisuus in Gefitinibi hylkivät Nonsmall keuhkosyöpä solut. PLoS ONE 10 (3): e0119135. doi: 10,1371 /journal.pone.0119135

Academic Editor: Jung Weon Lee, Seoul National University, Korean tasavalta

vastaanotettu: May 1, 2014; Hyväksytty 26. tammikuuta 2015 Julkaistu 25 maaliskuuta 2015

Copyright: © 2015 Tang et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään

Data Saatavuus: kaikki asiaankuuluvat tiedot ovat paperi.

Rahoitus: NSC 101-2314-B-002 -090 -MY3 ministeriön Science and Technology, Taiwan. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Autophagy, joka tunnetaan itsestään syöminen mekanismi, on ominaista de novo syntetisoimalla kaksinkertainen kalvo autophagosomes joka eristää solun komponentteja kuten liiallinen tai tarpeeton proteiinia ja soluelimiin [1-3]. Fuusio autophagosomes kanssa lysosomeihin kuulemma huonontaa sytosolin sisältö tulee olennaisia ​​osia kierrätettäväksi. Fysiologisesti pohjapinta taso autophagy on elintärkeää solujen homeostaasin. Lisäksi autophagy on tiettävästi indusoidaan stressitilojen kuten hypoksiaa sekä ravinteiden puutteen ja pitää selviytymisstrategiana [1-3]. Sen sijaan, pro-kuoleman roolia autophagy on ehdotettu tyypin II ohjelmoidun solukuoleman kautta yli-aktivaation itse syöminen [4]. Todellakin, autophagy indusoijilla todettu vähentävän kasvaimen [5-7]. Kuitenkin esto autophagy tiettävästi aiheuttama syöpä solukuolemaa [8-10], mikä viittaa siihen, että autophagy näyttelee cytoprotective rooli syöpäsoluja. Tueksi tätä käsitystä, autophagy esto 3-metyyliadeniinin (3-MA), klorokiinin (CQ, joka on lysosomotropic aine, joka estää autophagolysosome muodostuminen) ja autophagy (ATG) liittyvien geeni 5 hiljentäminen havaittiin tehostavan sytotoksisten vaikutuksia kemoterapian ja tavoite hoito [11-16]. Niinpä autophagy tulee potentiaalinen kohde syöpähoitojen.

Lääkeaineresistenssi on ollut mielenkiinnon tutkimuksessa syövän hoidossa. Useat riviä todisteet ovat ehdottaneet osallistumista autophagy huumausaineiden vastus, sekä synnynnäinen lääkeresistenssin ja hankitun lääkeresistenssin. Esimerkiksi CQ: n on osoitettu voittamiseksi ensisijainen vastus epidermaalisen kasvutekijän reseptorin (EGFR) tyrosiinikinaasin estäjät (TKI) A549 keuhkosyövän soluja [16], ja trastutsumabi HER-2 rintasyöpä [17]. Useat

in vitro

tutkimukset ovat osoittaneet, että CQ ja bafilomysiini A1 palauttaa herkkyys crizotinib ja trastutsumabi hankituissa resistentit solut, vastaavasti [18-19]. Lisäksi 3-MA havaittiin parantaa sytotoksista vaikutusta sisplatiinin sisplatiinin-resistenttien solujen [20], mikä osoittaa, että inhibitio autophagy näyttää olevan terapeuttinen kohde hankitun lääkeresistenssin.

Ei-pienisoluisen keuhkosyövän (NSCLC) on yleisin syöpä maailmassa. Tällä hetkellä, epidermaalisen kasvutekijän reseptori (EGFR) tyrosiinikinaasin estäjät (TKI), mukaan lukien gefitinibi, erlotinibi ja afatinib, ovat erittäin tehokkaita hoidettaessa keuhkosyöpää potilaita, joilla on erityisiä

EGFR

mutaatioita niiden kasvaimen näytteiden, kuten eksonin 19 deleetio tai eksonin 21 L858R-mutaation [21-23]. Onnistumisesta huolimatta käyttäen EGFR-TKI hoidossa Itä-Aasian pienisoluista keuhkosyöpää, kaikki vastaaville potilaille lopulta kehittyi kehittynyt resistenssi EGFR-TKI: [24-27]. Esillä olevassa tutkimuksessa, osallistuminen autophagy että ostetun gefitinibin vastus

EGFR

mutaatio NSCLC-solut tutkittiin käyttäen PC-9 /paino kantavien solujen

EGFR

eksonin 19 deleetio ja hankitun gefitinib- kestävä PC-9 /gef soluja (PC-9 /gefB4 ja PC-9 /gefE3).

Materiaalit ja menetelmät

reagenssit ja vasta

käytetyt kemikaalit olivat gefitinibi (ystävällinen lahjoitus Astrazeneca, Alderley Park, UK), klorokiinin difosfaatti (CQ, Sigma, St. Louis, MO, USA), 3-metyyliadeniinin (3-MA, Sigma), ja Cremophor EL (Sigma). Ensisijainen-aineita olivat mikrotubuluksiin liittyvä proteiini 1 kevytketjun 3 (LC3, Cell Signaling Technology, Beverly, MA, USA, # 2775), kaspaasi 3 (Cell Signaling Technology, # 9668), ja PARP (Cell Signaling Technology, # 9542) , α-tubuliinin (Cell Signaling Technology, # 2144) ja β-aktiini-vasta-aine (Millipore, Bedford, MA, USA). Toissijainen vasta-aineet olivat piparjuuriperoksidaasi-konjugoidun sekundaarisen IgG: tä (Chemicon, Temecula, CA, USA).

Kehittäminen gefitinibin vastustuskykyisten PC-9-soluja

PC9 /gefB4 ja PC9 /gefE3 soluja kehitetty laboratoriossamme ja julkaistu aiemmin [26]. PC-9 /paino-soluja, ihmisen keuhkon adenokarsinooman solulinjan kätkeminen deleetion eksonissa 19

EGFR

[28], viljeltiin kostutetussa ilmakehässä, jossa 5% CO

2 37 ° C: ssa RPMI (Roswell Park Memorial Institute) väliaineessa, joka sisälsi 10% naudan sikiön seerumia, 4,5 g /l glukoosia, ja 1% (v /v) penisilliini /streptomysiiniä. PC-9 /wt-soluja kasvatettiin viljelmässä väliaineessa, joka sisältää kasvavia pitoisuuksia gefitinibin. Kun 6 kuukauden kohtia, soluja, jotka voivat kasvaa mikromolaarisina pitoisuuksina gefitinibin pidettiin huumeeton media 2 viikkoa ja kloonattiin. Kaksi kloonia (PC-9 /gefB4, ja PC-9 /gefE3) saatiin tuleville tutkimuksille.

Kasvun estäminen määrityksessä

kantaliuokset gefitinibin ja 3-MA valmistettiin dimetyyli sulfoksidi kun CQ oli ddsH

2O. Viisitoista sata Solut laitettiin 96-kuoppaisille, tasapohjaisille levyille ja niitä viljeltiin 24 tuntia. Perustaa IC

50 gefitinibin, erilaisia ​​pitoisuuksia gefitinibin sisällytettiin viljelyväliaineessa 96 tuntia. Käyttäen sulforodamiini B-määritys [29], solujen elinkelpoisuus määritettiin jakamalla absorbanssiarvot käsiteltyjen solujen kuin käsittelemättömien solujen. IC

50 lasketaan pitoisuus-vaste-käyrä määritettiin konsentraatio gefitinibin, jossa 50% kasvun esto saatiin. Vaikutuksiin 3-MA ja CQ, kasvun inhibitio mitattiin sen jälkeen, kun 96-tunnin inkuboinnin 3-MA (0,1, 0,3 tai 1 mM) tai CQ (5, 10 tai 15 uM). Vaikutuksella CQ gefitinibiryhmässä aiheuttamaa solukuolemaa, kasvun estäminen määritettiin kuluttua 96-tunnin inkuboinnin gefitinibin plus CQ (5 tai 10 uM).

Western blot -määritys Proteiinien

arvioida osallistuminen autophagy PC-9 /paino ja gefitinibin-resistentit solut, solut käsiteltiin gefitinibin plus 3-MA tai CQ 24 tuntia. Käsitellyt solut otettiin talteen, pestiin fosfaattipuskuroidulla suolaliuoksella (PBS), ja hajotettiin radioimmunosaostuskokeella (RIPA) lyysipuskuria, joka sisälsi 20 mM Tris-HCI, 150 mM NaCI, 1% (v /v) NP-40, 1% (w /v) natriumdeoksikolaatti, 1 mM etyleenidiamiinitetra (EDTA), 0,1% (w /v) natriumdodekyylisulfaattipolyakryyliamidia (SDS) ja 0,01% (w /v) natriumatsidia (pH 7,5) 20 minuutin ajan jään päällä. Lysaatit sentrifugoitiin 12000 rpm: llä 10 minuutin ajan, ja proteiini pitoisuudet supernatantissa määritettiin BCA Protein Assay Kit. Proteiininäytteet (30 ug) ajettiin 12-13,5% SDS-polyakryyliamidigeelielektroforeesilla ja siirrettiin polyvinylideenidifluoridi (Bio-Rad, USA) 90 V: ssa 120 min. Blotit primaarisilla vasta-aineilla yli yön 4 ° C: ssa. Jälkeen primaarisessa vasta-aineessa inkuboinnin jälkeen membraani pestiin ja niitä inkuboitiin sekundaarisen vasta-aineen (1: 3000) 1 tunnin ajan huoneenlämpötilassa. Immunoreaktion visualisoitiin käyttäen Amersham Enhanced Chemiluminescence (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, USA). Tämän jälkeen tunnistus, sitoutunut ensisijainen ja toissijainen vasta-aineet on poistettu inkuboimalla kalvo strippaus-puskuria (100 mM 2-merkaptoetanolia, 2% SDS) 50 ° C: ssa 45 min. Kalvo uudelleenseulottiin ensisijaisen vasta-ainetta β-aktiini (1: 5000) /α-tubuliinin (1: 5000).

fluoresoiva ja immunofluoresenssivärjäyksellä määritys

Autolysosomes värjäys: Soluja käsiteltiin gefitinibin kanssa 24 tuntia ja sitten alusta korvattiin tuoreella alustalla, joka sisälsi 50 nM Lysotracker Red (LysoTR, LysoTracker Red DND-99, Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) ja inkuboitiin 37 ° C: ssa 30 minuutin ajan. Sen jälkeen solut huuhdeltiin PBS: ssä ja kiinnitettiin 3,5% paraformaldehydillä (PBS: ssä) 10 minuuttia, läpäiseviksi 0,5% Triton X-100 TBS: ssa 30 minuutin ajan, ja käsiteltiin 2% BSA: ta TBS: ssä 1 h, huoneen lämpötilassa . Sitten näytteet inkuboitiin LC3 vasta-aineella (1: 200) yön yli 4 ° C: ssa, huuhdeltiin kolme kertaa 0,01% Triton X-100 TBS: ssä, ja inkuboitiin 30 minuutin ajan sekundaarisen vasta-aineen (FITC-konjugoitua kanin IgG 1: 250 ) 37 ° C: ssa. Jälkeenpäin solut värjättiin edelleen DAPI ja sitä tarkasteltiin konfokaalimikroskopia (Olympus FV1000, Olympus America Inc., Center Valley, PA, USA).

Vieraslajisiirteen hiirimallissa

Sixty- kolme 6 -week-vuotias mies Balb /c-nude-hiiriin, joiden paino 25-30 g, käytettiin. Eläin protokolla hyväksyi Institutional Animal Care ja käyttö komitea Taipei Veterans General Hospital, Taipei, Taiwan. (Luvan numero: 2011-037) .Tumors indusoitiin injektoimalla PC-9 /paino ja PC-9 /gefB4 soluja (10

7 solua 100 ul: ssa PBS: ää), ihon alle selkään hiirillä. Saamiseksi kasvaimen kasvukäyrä, päivittäinen mittaus kasvaimen suoritettiin. Kohtisuora halkaisija digitaalisen paksuus ja tilavuudet laskettiin (pituus x leveys

2) /2. Kun kasvaimet kasvoivat 200 mm

3, hiiret satunnaistettiin 4 ryhmään suun kautta vehikkeliä (10% Cremophor EL /10% etanoli /4% dekstroosia DDH

2O), gefitinibi yksin (50 mg /kg, jonka letkulla), SA yksin (75 mg /kg, ip) ja gefitinibin plus SA. Gefitinibin valmistettiin 10% Cremophor EL /10% etanoli /4% dekstroosia ja CQ liuotettiin PBS: ään.

Tilastot

Kaikki tiedot ilmoitetaan keskiarvona ± S.E.M. Tilastollinen vertailut solujen elävyyden tehtiin käyttäen Independent-Samples T Test SPSS. P-arvo alle 0,05 pidettiin tilastollisesti merkitsevä.

Tulokset

Kohonnut pohjapinta autophagy PC-9 /gef solujen

Opiskella autophagy ja lääkeresistenssi, taso LC3-II, tunnusmerkki proteiinia autophagy, mitattiin PC-9 /paino, PC-9 /gefB4 ja PC-9 /gefE3 soluja. Western blot-määritys osoitti korkeampia pohjapinta tasoja LC3-II PC-9 /gef soluja (B4 ja E3), kun taas verrattuna PC-9 /wt-soluja (kuvio. 1A). Yhdenmukainen Western blot analyysissä Immunovärjäyksen tutkimus osoitti enemmän LC3 immuunifluoresenssivasta puncta PC-9 /gefB4 soluja verrattuna PC-9 /wt-soluja (kuvio. 1 B). Lisäksi 3-MA ja CQ käytettiin luonnehtia autophagy. Huomasimme, että 3-MA laski (Fig. 1 C), kun taas CQ lisäsi pohjapinta LC3-II tasot PC-9 /paino, PC-9 /gefB4 soluja ja PC-9 /gefE3 kuluttua 24 h lääkehoitoon (Fig. 1D ). Nämä tiedot osoittavat, että PC-9 /gef (B4 ja E3), solut on suurempi perustason taso autophagy kuin PC-9 /wt-soluja. Lisäksi solujen selviytymistä määrityksessä käytettiin hahmotella roolin autophagy käyttäen 3-MA ja SA. SRB-määritys osoitti, että 3-MA ja CQ pitoisuus-riippuen vähensi solujen eloonjäämistä PC-9 /paino, PC-9 /gefB4 ja PC-9 /gefE3 soluja (Fig. 2), mikä viittaa siihen, että autophagy soittaa pro-selviytymisen rooli soluproliferaatiota.

(A) edustaja Western blot tiedot osoittivat pohjapinta LC3-II tasot PC-9 /paino ja PC-9 /gef soluja (B4 ja E3). (B) immunofluoresenssivärjäyksellä suoritettiin käyttäen LC3 vasta-ainetta osoittaa LC3 puncta PC-9 /paino ja PC-9 /gefB4 soluja. (C ja D): PC-9 /paino, PC-9 /gefB4 ja PC-9 /gefE3 soluja käsiteltiin 3-metyyliadeniini (3-MA, 10 mM) ja klorokiinin (CQ, 1 ja 10 uM) 24 h. Kokonaisproteiinia käsiteltyjen solujen on korjattu; LC3-I ja II tasot analysoitiin Western blot -määritys. Kukin kaista sisälsi 30 ug proteiinia kaikissa kokeissa. Tulokset toistettiin itsenäisestä kokeesta.

PC-9 /paino, PC-9 /gefB4 ja PC-9 /gefE3 soluja käsiteltiin (A) 3-MA (0,1-1 mM) ja (B) CQ (5-15 uM) 96 tuntia. Solujen elinkyky määritettiin käyttämällä SRB-määritystä. Arvot ovat keskiarvo ± SEM (N = 3). *

P

0.05 tilastollisesti merkitsevä 3-MA tai CQ-hoidetuilla ryhmillä verrattuna kontrolleihin.

Gefitinibi aiheuttama autophagy

in vitro

osallistuminen autophagy vuonna gefitinibin aiheuttama sytotoksisuuden tutkittiin. Western blot-määritys osoitti, että gefitinibi pitoisuudesta riippuvaisella kasvoi LC3-II tasot PC-9 /paino, PC-9 /gefB4 ja PC-9 /gefE3 soluja (Fig. 3A). Immunofluoresenssivärjäyksellä tutkimukset osoittivat, että 24-tunnin inkuboinnin gefitinibin (1 uM) koholla LC3 puncta sekä PC-9 /paino ja PC-9 /gefB4 soluja (Fig. 3B). Lisäksi kolokalisaation LC3 immunofluoresenssilla ja LysoTR fluoresenssi havaittiin gefitinibin-käsitelty PC-9 /WT ja PC-9 /gefB4 solut (Fig. 3B), mikä osoittaa, että gefitinibi kykenee indusoimaan autophagy ja autolysosome muodostumista.

(A) PC-9 /paino, PC-9 /gefB4 ja PC-9 /gefE3 soluja käsiteltiin gefitinibin (nM) eri pitoisuuksilla 24 tunnin ajan. Kokonaisproteiinia käsiteltyjen solujen on korjattu; LC3-I ja II tasot analysoitiin Western blot -määritys. Kukin kaista sisälsi 30 ug proteiinia kaikissa kokeissa. Tulokset toistettiin itsenäisestä kokeesta. (B) PC-9 /paino ja PC-9 /gefB4 soluja käsiteltiin gefitinibin (1 uM) 24 tuntia. Immunofluoresenssivärjäyksellä ja fluoresenssivärjäys suoritettiin käyttäen LC3 vasta-ainetta ja LysoTracker punainen (LysoTR) vastaavasti näyttämään puncta soluissa. Green, FITC-leimattu LC3; punainen, LysoTR; sininen, DAPI-leimattu tumaan.

Koska gefitinibin-kohonnut autophagy, vaikutus CQ gefitinibiryhmässä aiheuttamaa sytotoksisuutta tutkittiin. Kaksikymmentäneljä tuntia sen jälkeen, kun lääkehoidot, CQ entisestään gefitinibin aiheuttama LC3-II tasoa PC-9 /paino ja PC-9 /gefB4 solut (Fig. 4A). Solujen eloonjääminen tutkimukset osoittivat, että gefitinibi (100 nM) yksinään indusoi syvällinen solukuolemaa PC-9 /wt soluja; kuitenkin, SA (5 ja 10 uM) ei pystynyt edelleen parantaa gefitinibin aiheuttama sytotoksisuuden (Fig. 4B). Koska PC-9 /gefB4 soluja, gefitinibi (100 nM) yksinään indusoi lievästi solukuolemaa; CQ merkittävästi voimisti gefitinibin aiheuttama sytotoksisuuden (Fig. 4C), so, SA voitti gefitinibi vastustusta PC-9 /gefB4 soluja. Edelleen testata voimistaa CQ PC-9 /paino solua, pieni annos gefitinibin (3 nM) käytettiin. Kun taas 96-tunnin inkuboinnin gefitinibin (3 nM) indusoi merkityksettömän sytotoksisuus PC-9 /paino-solut, co-inkubointi CQ (10 nM) ja gefitinibin vähensi täysin solun eloonjäämistä (Fig. 4D). CQ aiheuttama voimistaa gefitinibin-indusoidun sytotoksisuuden tutkittiin tarkemmin mittaamalla apoptoosin liittyvät proteiinit, kuten kaspaasi-3 ja poly (ADP-riboosi) polymeraasi (PARP) tasot. Huomasimme, että gefitinibin (0,1 uM) aiheuttaman apoptoosin näyttämällä kaspaasi 3 aktivointi ja PARP pilkkominen PC-9 /wt soluja; SA (10 uM) johdonmukaisesti ei lisätä gefitinibi aiheuttaman apoptoosin PC-9 /wt-soluja (kuvio. 5). Sen sijaan, kun gefitinibi tai CQ yksinään pystynyt indusoimaan apoptoosin PC-9 /gefB4 ja PC-9 /gefE3 soluja, CQ ja gefitinibi merkittävästi indusoi kaspaasi 3 aktivointi ja PARP pilkkominen sekä PC-9 /gef solut (Fig. 5 ).

(A) PC-9 /paino ja PC-9 /gefB4 käsiteltiin gefitinibin (100 nM) ja klorokiinin (CQ, 5, 10 uM) 24 tunnin ajan. Kokonaisproteiinia käsiteltyjen solujen kerättiin. LC3-II tasot analysoitiin Western blot -määritys. Kukin kaista sisälsi 30 ug proteiinia kaikissa kokeissa. Tulokset toistettiin itsenäisestä kokeesta. (B) PC-9 /paino ja (C) PC-9 /gefB4 soluja viljeltiin gefitinibin (100 nM) ja CQ (5, 10 uM) 96 tuntia. (D) PC-9 /wt-soluja viljeltiin gefitinibin kanssa (3 nM) ja CQ (5, 10 uM) 96 tuntia. Solujen elinkyky määritettiin käyttämällä SRB-määritystä. Arvot ovat keskiarvo ± SEM (N = 3). *

P

0.05 tilastollisesti merkitsevä gefitinibin tai CQ saaneissa ryhmissä kontrolleihin verrattuna; # P 0,05 tilastollisesti merkittävä gefitinibin plus CQ-hoidetuilla ryhmillä verrattuna gefitinibin vain ryhmiä.

PC-9 /paino, PC-9 /gefB4 ja PC-9 /gefE3 soluja käsiteltiin gefitinibin (100 nM ) ja klorokiinin (CQ, 10 uM) 24 tunnin ajan. Kokonaisproteiinia käsiteltyjen solujen kerättiin. Prokaspaasi 3, aktiivinen kaspaasi 3, PARP pilkkominen tasot analysoitiin Western blot -määritys. Kukin kaista sisälsi 30 ug proteiinia kaikissa kokeissa. Tulokset toistettiin itsenäisestä kokeesta.

Gefitinibi plus CQ voimistaa gefitinibin-indusoi anti-kasvain aktiivisuuden PC-9 /gefB4 ksenografteja

CQ-indusoitu voimistumisen anti-kasvain aktiivisuus gefitinibin tutkittiin tarkemmin käyttäen Balb /c nude-hiirissä PC-9 /paino ja PC-9 /gefB4 ihmisen tuumoriksenografteja (Fig. 6). CQ yksin ei muuttanut kasvaimen kasvua PC-9 /paino ja PC-9 /gefB4 ihmisen tuumorin ksenografteja (Fig. 6). Verrattuna apuaineella hoidettuun kasvaimen kasvua, gefitinibi monoterapiana inhiboi merkittävästi kasvaimen kasvua PC-9 /paino ksenografteja; Samanaikaisesti annettu CQ voinut lisätä anti-kasvain vaikutus gefitinibin PC-9 /wt ksenograftit (Fig. 6A). Täydellinen tuumorin kasvun PC-9 /paino ksenografteja kesti kokeen loppuun (Fig. 6A). Sen sijaan, gefitinibi merkityksettömän vähensi kasvainten kasvua PC-9 /gefB4 ksenografteja verrattuna PC-9-ksenografteja (Fig. 6B; p = 0,07). PC-9 /gefB4 kasvaimet kasvoivat uudelleen 15 päivän kuluttua gefitinibin annon (Fig. 6B). Yllättäen CQ plus gefitinibi merkittävästi tukahdutti kasvaimen kasvua PC-9 /gefB4 ksenografteja verrattuna gefitinibin vain (Fig. 6B; p 0,05).

Balb /c nude hiirillä PC-9 /paino (A ) ja PC-9 /gefB4 (B) -ksenografteja käsiteltiin ajoneuvot kontrollina (○, n = 4 PC-9 /paino ja PC-9 /gefB4, vastaavasti), gefitinibi (50 mg /kg /päivä letkuruokintaneulan , ◆; n = 5 PC-9 /paino ja PC-9 /gefB4, vastaavasti), klorokiinin (CQ, 75 mg /kg, ip ▲; n = 4 PC-9 /paino ja PC-9 /gefB4, vastaavasti), tai molempia (■, n = 5 PC-9 /paino ja PC-9 /gefB4, vastaavasti) .Tumors annettiin kasvaa 200 mm

3 ennen lääkehoitojen. Arvot ovat keskiarvo ± SEM (N = 4-5). ** P 0,001, tilastollisesti merkitseviä gefitinibin ja gefitinibin plus CQ ryhmissä verrattuna vehikkeliryhmässä PC-9 /paino tuumoriksenograftien. * P 0,05, tilastollisesti merkitseviä gefitinibin plus CQ ryhmässä verrattuna vehikkeliryhmässä; # P 0,05 tilastollisesti merkitseviä gefitinibin plus CQ ryhmässä verrattuna gefitinibin yksin PC-9 /gefB4 tuumoriksenografteja Independent-Samples T Test. (C) edustaja tiedot osoittavat 4 hiirten PC-9 /paino ksenografteja ja 4 hiirtä PC-9 /gefB4 ksenografteja joka sai vehikkeliä, SA vain, gefitinibi vain ja gefitinibin plus SA.

keskustelu

Autophagy ja lääkeresistensseihin

kehittää terapeuttisia strategioita hankittu resistenssi aiheuttama gefitinibi, käytimme PC-9 /gefB4 ja PC-9 /gefE3 soluja, joilla IC

50 gefitinibin noin 200-kertaisesti enemmän kuin PC-9 /wt soluihin [26]. Western blot analyysissä ja immuunifluoresenssivasta tutkimus osoitti korkeampia pohjapinta tasoilla autophagy sekä PC-9 /gefB4 ja PC-9 /gefE3 soluja. Käyttämällä 3-MA ja CQ heikentää muodostumista ja toimintaa autophagy, mekanismi koholla pohjapinta autophagy in gefitinibin-resistentit solut ehdotetaan. Selvitäkseen epäsuotuisa korostaa, so jatkuva altistukseen, syöpäsoluja kasvoi autophagy ylläpitää metabolisen homeostaasin ja asianmukaista solujen kasvua [4]. Solunelinkykyisyysmääritys paljasti, että autophagy oli pro-eloonjääminen, koska 3-MA ja CQ vähentynyt eloon jäämistä sen PC-9 /paino ja PC-9 /gef soluja (B4 ja E3). Lisäksi gefitinibin vastus, aiemmat tutkimukset ovat raportoineet, että trastutsumabi tulenkestävä rintasyövän soluja ja sisplatiini kestävä keuhkosyöpä solut ovat korkeammat autophagy verrattuna herkkien syöpäsolujen [19-20]. Samoin 3-MA ja bafilomysiini A1 (inhibiittori autolysosome kypsymisen) havaittiin solujen elävyys vähenee näiden resistenttien solujen [19-20]. Toisin kuin 200-kertainen ero IC

50 gefitinibin [26], 3-MA ja CQ solukuolema samassa määrin PC-9 ja PC-9 /gef solut, mikä osoittaa, PC-9 /gefB4 solut eivät olleet resistenttejä 3-MA ja CQ aiheuttama sytotoksisuuden.

rooli autophagy in gefitinibin aiheuttama sytotoksisuuden

Eri hoidot, mukaan lukien sädehoito [20], solunsalpaajahoitojen [30] ja kohde hoitoja [16, 31], on raportoitu indusoivan autophagy. Tutkimuksemme vahvisti käsitystä, että gefitinibi lisääntynyt autophagy pitoisuudesta riippuvalla tavalla PC-9 /paino ja PC-9 /gef soluja (B4 ja E3). Rooli autophagy in gefitinibin aiheuttaman sytotoksisuuden edelleen rajattu yhdistelmällä CQ ja gefitinibin. Johdonmukaista edellisessä tutkimuksessa [26], gefitinibi (100 nM) yksinään indusoi merkitty sytotoksisuutta in PC-9 /paino soluja. Sytotoksinen mekanismi gefitinibin tiedetään kilpailla ATP sitoutumiskohta PC-9 /paino kantavien solujen

EGFR

eksonin 19 deleetio [32] ja siten indusoida apoptoosin kautta [26, 33-35]. Voimistaminen by CQ ja gefitinibin PC-9 /wt-soluja havaittiin ainoastaan ​​silloin, kun gefitinibin pienennettiin 3 nM, mikä osoittaa, että CQ voidaan käyttää täydentämään gefitinibin-indusoitua apoptoosia in PC-9 /wt-soluja. Yksi kliininen tutkimus gefitinibin ja hydroksiklorokiini on meneillään on edennyt NSCL potilaille potilaille [36], meidän tiedot viittaavat siihen, että kun samanaikaisesti annettaessa ja SA ja sen analogit, pienemmillä annoksilla gefitinibin saattaa riittää potilaille, joilla on gefitinibin herkkiä keuhkosyövässä vähemmällä puoli vaikutukset [37].

Autophagy ja hankittu lääkeresistensseihin

verrattuna PC-9 /paino solut, 200-kertainen ero IC

50 gefitinibin tunnistettiin PC-9 /gefB4 soluihin [26]. Aikaisemmat tutkimuksessa todettiin, että MEK-inhibiittorit (AZD6244 ja CI1040) syvällisesti kääntänyt hankittu vastusten gefitinibille PC-9 /gefB4 soluihin [26]. Johdonmukaisesti, gefitinibi (100 nM) yksinään pystynyt indusoimaan merkittävää sytotoksisuutta PC-9 /gefB4 (Fig. 4C), PC-9 /gefE3 ja PC-9 /gefE7 [26]. Kuitenkin, esillä oleva tutkimus osoitti, että gefitinibi plus CQ merkittävästi indusoi kaspaasi 3 aktivointi ja PARP pilkkominen sekä PC-9 /gefB4 ja PC-9 /gefE3 solut, mikä osoittaa, että CQ valoherkkä PC-9 /gef soluja (B4 ja E3) ja gefitinibin . Verrattuna 200-kertainen ero IC

50 gefitinibin, gefitinibi ei ilmennyt merkittäviä eroja LC3-II korkeus ja solukuolemaa in PC-9 /paino soluja, PC-9 /gefB4 ja PC-9 /gefE3 solua , mikä osoittaa autophagy ei voi olla vastuussa hankitun gefitinibin vastus. Siitä huolimatta meidän

in vitro

tulokset osoittivat, että CQ heikennetty selviytyminen PC-9 /gefB4 soluja, mikä osoittaa, että gefitinibi ja CQ voi olla tehokas voittaa gefitinibin vastarintaa. Lisäksi useat

in vitro

tutkimuksissa on raportoitu, että autophagy inhibitio näyttää parantavan sytotoksisuuteen crizotinib-resistenttien solujen [18], trastutsumabi-resistenttien solujen [19] ja sisplatiini-resistenttien solujen [20]. Toistaiseksi rajoitettu

in vivo

tutkimukset ovat keskittyneet terapeuttista vaikutusta CQ hankitun lääkeresistenssin [18]. Meidän havainnot

in vivo

ksenograftimallia tukea

in vitro

tietoja että gefitinibi johdonmukaisesti esti PC-9 /paino kasvaimen kasvua ja CQ ei tehostanut syövän vaikutusta Gefitinibin. Mitä tulee kasvaimen kasvua PC-9 /gefB4 ksenografteja, SA plus gefitinibi merkittävästi viivästynyt kasvaimen kasvua PC-9 /gefB4 ksenografteja verrattuna gefitinibin monoterapiaan, mikä osoittaa, että CQ pystyy herkistävän PC-9 /gefB4 solujen gefitinibille ja sitten vähentää kasvaimen kasvua PC-9 /gefB4 ihmisen -ksenografteja.

Johtopäätöksenä EGFR-TKI, kuten gefitinibi, tiedetään hoitoon keuhkosyövässä merkittäviä efficacies. Aikaisemmat tutkimus palveluksessa yhdistelmä gefitinibin ja ERK estäjien ja menestyksekkäästi osoittanut merkittävää terapeuttista potentiaaleja hankitun vastustuskyvyn gefitinibin [26]. Esillä olevassa tutkimuksessa osoitimme, että autophagy voi olla cytoprotective rooli kasvainten synnyssä ja hankitun resistenssin. Lisäksi CQ näyttää olevan terapeuttisesti hyödyllinen sekä gefitinibin-herkkä ja kestävä NSCLC, mikä viittaa siihen, että CQ ja sen analogit voivat olla lupaava syövän hoidossa [38-39] keuhkosyöpään potilailla, joilla on

EGFR

mutaatio, jotka kehittävät on kehittynyt resistenssi saatuaan gefitinibiä hoitoa.