Krooninen sairaus

tiivistelmä

Erottuva genotyyppistä ja fenotyyppisten ominaisuuksien munasarjasyövän kautta epiteelin-mesenkymaalitransitioon (EMT) ovat korreloineet lääkeresistenssin ja tauti uusiutuu. Me tutkimme, terapeuttinen käänteinen EMT voisi uudelleen herkistää munasarjasyöpäsoluja (OCCS) nykyiseen kemoterapiaa. Me raportoimme että epimorphin, joka on morfogeeninen proteiini, on keskeinen määräysvalta mesenkymaalisten versus epiteelisolujen linjaa päätös oletetun OCCS. Altistuminen epimorphin indusoi morfologiset muutokset muistuttavat mesenkymaalisten-to-epiteelin siirtymistä (MET), mutta annoksesta riippuvaisella tavalla, eli 10 ug /ml epimorphin solujen saataisiin mesenkymaaliset kaltainen morfologia, kun taas 20 ug /ml epimorphin solut näyttää epiteelin morfologia. Jälkimmäinen muutosten lisäksi laadittu tukahduttaminen mesenkymaalisten markkereita, kuten vimentiinistä (~8-kertainen ↓,

p

0,02), Twist1 (-7-kertainen ↓,

p

0,03), dystroglycan (~ 4-kertainen ↓,

p

0,01) ja palladinin (~ 3-kertainen ↓,

p

0,01). Toisaalta merkittävä kohoaminen Klf4 (noin 28-kertainen ↑,

p

0,002), β-kateniinin (~6-kertainen ↑,

p

0,004), EpCAM (~ 6-kertainen ↑,

p

0,0002) ja occludin (-15-kertainen ↑,

p

0,004) mRNA: t osana sitoutuminen epiteelisolujen linjaa havaittiin vastauksena 20 ug /ml eksogeenisen epimorphin. Muutokset occludin mRNA mukana oli rinnakkainen, vaikkakin heikompi ilmaisu proteiinitasolla (-5-kertainen ↑,

p

0,001). Samoin hankinta epiteelin kaltaisia ​​ominaisuuksia, kuten mucin1, CK19, ja β-kateniinin geenin ilmentymistä, saatiin myös seuraavat epimorphin hoitoa. Edelleen, MMP3 tuotanto havaittiin alennetaan taas laminiinin eritystä voimakkaasti monistettiin, kun epimorphin aiheuttama MET. Nämä tulokset viittaavat olemassa annos ikkuna toimista epimorphin on solujen erilaistumisen, jossa se voi joko estää tai parantaa epiteelin erilaistumista OCCS. Tärkeää on, induktio epiteelityyppinen fenotyypit mukaan epimorphin johti suurempi herkkyys karboplatiinin. Kaiken kaikkiaan olemme osoittaa, että epimorphin voi palata OCCS poissa mesenkymaalisten fenotyyppi ja kohti epiteelin fenotyyppi, mikä parantaa niiden herkkyyttä etulinjan kemoterapeuttista ainetta.

Citation: Yew KH, Crow J, Hirst J, Pressetto Z, Godwin AK (2013) Epimorphin aiheutetun MET herkistää munasarjasyöpäsoluja Platinum. PLoS ONE 8 (9): e72637. doi: 10,1371 /journal.pone.0072637

Editor: Chunming Liu, University of Kentucky, Yhdysvallat

vastaanotettu: 10 huhtikuu 2013; Hyväksytty: 11 heinäkuu 2013; Julkaistu: 09 syyskuu 2013

Copyright: © 2013 Yew et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tutkimus tuettiin osittain ohjelman hanke apurahan Munasarjojen Cancer Research Fund (https://www.ocrf.org), apurahan Kansas Bioscience Authority Eminent Scholar Program, ja avustusta NCI (R01CA140323) AKG Tekijät haluavat myös antaa tunnustusta tukea Kansasin yliopistosta Cancer Center (KUCC) (P30 CA168524) jaettuja resursseja ja Kansasin yliopistossa Endowment Association. A.K.G on Chancellors Distinguished Chair in Biomedical Sciences KUCC. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

epiteelikasvaimet munasarjasyöpä (EOC) on johtava kuolinsyy naisilla, mikä johtuu usein myöhäisvaiheen tunnustamista ja aggressiivinen kasvain uusiutumisen. Korkea potilas sairastuvuus johtuu osittain toistuvia kasvua jäljellä munasarjojen syöpäsolujen tulleet vastustuskykyisiksi standardin kemoterapia-hoitoja, ja sitten aggressiivisesti lisääntyvät ja leviävät tai etäispesäkkeitä useita sivustoja. Viimeaikaiset tutkimukset ovat osoittaneet, että munasarjasyöpäsoluja epiteelin ominaisuudet ovat itse asiassa herkempiä kemoterapiahoitoihin verrattuna kasvainsolujen mesenkymaalisten piirteet [1], [2], [36]. Kuitenkin, kun nämä solut läpikäyvät epiteelisolujen-to-mesenkymaalitransitioon (EMT), ne ovat vähemmän herkkiä tavanomaisiin hoito-[1] – [3], [36]. EMT, aiheuttama laaja valikoima ärsykkeitä ja sytokiinien, on tullut näkyvästi liitetty keinona, joka erottaa EOCs tehdään fenotyyppinen muuntaminen, joka liittyy menetys epiteelin ominaisuudet (esimerkiksi, occludin) ja hankinta mesenkymaaliset markkereita (esim vimentiinista). Näin ollen, käänteinen EMT (eli MET) voi tehdä syöpäsolut alttiimmiksi ensilinjan syöpälääkkeiden ja voimistaa apoptoottisen tiettyjen kemoterapeuttisten aineiden.

Epimorphin, joka tunnetaan myös nimellä syntaksiini-2, on tärkeä välittäjä lukuisten perusprosesseihin alkionkehityksen, ja usein ratkaiseva rooli alueella mesenchyme-epiteelin vuorovaikutukset [4] – [8]. Myöhemmät tutkimukset ovat myös osoittaneet, että epimorphin välittää epiteelin kuviointi ja morfogeneesiä monissa kudoksissa, kuten haiman kanavat [5], rintarauhasen [6], keuhkosyöpä [7], ja ohutsuolen epiteelissä [8]. Vaikka epimorphin näyttää ilmaistava nisäkkään munasarjoissa ja kiveksissä [9], tarkkaa mekanismia, jolla tämä mesenkymaalisten morfogeenipolypeptidi kykenee sen sääntelyn vaikutuksia ihmisten sukuelimiin edelleen suurelta osin tuntemattomia.

Vaikka sukulais epimorphin reseptorin ja sen alavirran signalointia mekanismia ei ole vielä tunnistettu, epimorphin on havaittu sitoutuvan aV-integriinin reseptoreihin nisäepiteelisoluissa [10]: n ja EGF-reseptorien suolen epiteelisolujen [11], jotka aktivoivat transkriptiotekijöiden CCAAT /tehostajan sitova proteiini (C /EBPα ja β) [12], [15] ja NF-KB: n [13]. Mielenkiintoista, Krueppelin kuten tekijä 4 (Klf4), sinkki-sormen transkriptiotekijän ilmaistuna epiteelisoluissa useiden elinten [16], on osoitettu sitoutuvan suoraan C /EBPβ promoottori [17] ja vuorovaikutuksessa NF-KB-alayksikön p65 [18], jotka säätelevät keuhkojen epiteelin erilaistumista organogeneesin aikana [19] ja rintaepiteelisolulinja haarautuvia [20], tässä järjestyksessä. Lisätutkimukset ovat osoittaneet, että epimorphin voivat aiheuttaa epiteelisolujen morphogenesis säätelemällä urokinaasi plasminogeeniaktivaattori (uPA) [13], [14] sekä involukriiniä ja sytokeratiinia [15].

Koska ehdotettu roolia epimorphin kuin pro-epiteelin tekijä eri kudoksissa [5] – [8], arvioimme onko epimorphin signalointi voi pystyä indusoimaan munasarjasyöpäsoluja mesenkymaalisten piirteet kohti epiteelisolujen linjan ja onko tämä muuntaminen voi johtaa suurempi herkkyys standardin kemoterapeuttisten aineiden .

Materiaalit ja menetelmät

reagenssit

FBS, SYBR Green, Reference Dye for Quantitative PCR, ja proteaasiestäjäseostabletit saatiin Sigma-Aldrich (St. Louis , MO). RPMI Medium 1640 saatiin Gibco /Invitrogen. RNeasy Mini Kit, Sensiscript® käänteiskopioijaentsyymin Kit, QIAamp DNA Micro Kit, ja QIAquick Gel Extraction Kit ostettiin kaikki yhtiöltä Qiagen (Valencia, CA). AmpliTaq Gold GeneAmp 10x PCR-puskuria ja MgCl

2 liuos saatiin Applied Biosystems (Foster City, CA).

Soluviljely ja hoito

Ihmisen munasarjasyöpäsoluja (OCCS) , A1847, A2780 ja OVCAR10 on kuvattu aikaisemmin [21], ja niitä käytettiin kaikissa kokeissa. Soluja kasvatettiin RPMI-1640-alusta täydennettynä 10% (v /v) vasikan sikiön seerumia, 2 mM L-glutamiinia, 0,2 yksikköä /ml ihmisen insuliinia, 50 yksikköä /ml penisilliiniä, 50 ug /ml streptomysiiniä, 37 ° C: ssa kosteassa kunto 95% ilmaa ja 5% CO

2. A1847 ja A2780 maljattiin tiheydellä 5 x 10

4 solua /ml 24-kuoppaisille levyille ja käsiteltiin joko 10 ug /ml tai 20 ug /ml epimorphin (R Cell Signaling Tech., Danvers, MA) kosteassa kammiossa yön yli 4 ° C: ssa. Seuraavana päivänä solut huuhdottiin PBS: llä. Usean pesun jälkeen, peitinlaseista sisältäviä soluja kiinnitettiin liukuu VECTASHIELD® kiinnitysväliaine DAPI (Vector Labs, Inc., Burlingame, CA). Fluoresenssi digitaalisia kuvia otettiin käyttäen Nikon Eclipse 80

i

(Melville, NY) mikroskooppi kiinnitetty Nikon Q-kuvantamisen kameran sovitin. MetaMorph Kuva-analyysi (versio 7.7.0.0) käytettiin hankkia ja analysoida kuvia.

SDS-PAGE ja Western blot -analyysi

Proteiinit erotettiin 10% Tris-HCl Ready Gel ( Bio-Rad, Hercules, CA), siirrettiin nitroselluloosamembraaneille ja inkuboitiin hiiren monoklonaalisella [ab6276] ja p-aktiini-laimennoksena 1/5000, hiiren monoklonaalinen [ab28081] musiiniantigeeneille-1 laimennoksella 1/1000 , hiiren monoklonaalinen [ab7754] ja sytokeratiini 19 (CK-19) laimennoksena 1/1000 tai kanin polyklonaalista [ab31721] ja occludin laimennoksena 1/250 2 h RT: ssa. Kaikki western blot-vasta-aineita saatiin Abcam (Cambridge, MA). Inkuboinnin jälkeen kalvot pestiin 3X 15 minuuttia pesupuskurissa (PBS-0,05% Tween 20) ja inkuboitiin sekundäärisen anti-hiiri (β-aktiini, musiinin-1, vimentiinin, palladinin, ja sytokeratiini 19) tai anti- kani (occludin) vasta-aine, joka on kytketty piparjuuriperoksidaasiin (Vector Labs, Burlingame, CA) 1 tunnin ajan RT: ssä. Sitten membraanit pestiin 3X 15 minuuttia pesupuskurilla, ja immunoreaktiivisuus normalisoitiin kemiluminesenssin (Amersham, ECL + Plus Kit) mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Kalvot valotettiin Kodak tieteellinen kuvantaminen elokuvia (Rochester, NY) 1 minuutin kuluessa havaitsemiseen. Pixel tiheydet blot kuvien laskettiin Image-J ohjelmisto (NIH). Muutokset proteiinin tasot normalisoitiin kontrolleihin ja ilmaistaan ​​kertainen muutos suhteessa kontrolleihin.

mittaus Sytokiinit

seulomiseksi epimorphin aiheuttama soluväliaineen eritystä, A1847 OCCS (4 x 10

4 solua /ml 24-kuoppaisilla levyillä) inkuboitiin pelkässä elatusaineessa (negatiivinen kontrolli), 10 ug /ml tai 20 ug /ml epimorphin varten 3 päivää. Laminiini (Millipore, Temecula, CA) ja MMP3 (R OVCAR10 maljattiin tiheydellä 2 x 10

4 solua /ml 48-kuoppaisille levyille ja viljeltiin epimorphin pitoisuudessa 20 ug /ml 3 päivää. Epimorphin-käsitellyn ja käsittelemättömän solut viljeltiin serial annoksen karboplatiinia (Selleck Chemicals, Houston, TX, USA) lisää 3 päivää. Karboplatiini annosalue epimorphin-käsitellyn ja käsittelemättömän A1847 olivat 1 uM, 10 uM, 50 uM, 100 uM, 200 uM, ja 400 uM. Karboplatiini annosalue epimorphin-käsitellyn ja käsittelemättömän A2780 olivat 1 uM, 10 uM, 50 uM, 100 uM, 150 uM ja 200 uM. Karboplatiini annosalue epimorphin-käsitellyn ja käsittelemättömän OVCAR10 olivat 50 uM, 100 uM, 150 uM, 200 uM, 400 uM, ja 500 uM. Solujen elinkelpoisuus määritettiin mittaamalla metabolinen aktiivisuus käyttäen CellTiter-Blue® Promega ja levyt kuvannetaan Tecan-fluorometri. Data oli sitten normalisoidaan inhibitioprosentti ja IC

50 pitoisuudet karboplatiinin määritettiin epimorphin käsiteltyjen ja käsittelemättömien solujen jonka SigmaPlot kuvaajien ohjelma (Systat Software). Solukuolema tai apoptoosi kvantitoitiin käyttäen guava neksiini anneksiini V määrityksen kautta guava EasyCyte HT virtaussytometrillä (guava Technologies, Hayward, CA). Neksiini määrityksessä käytetään kahta väriainetta: 7-AAD, solun läpäisemätön väriaine, indikaattorina kalvon rakenteellisen eheyden ja anneksiini V-PE havaita fosfatidyyliseriinin ulkoisen kalvon apoptoottisten solujen. Näytteet valmistettiin kohti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Data normalisoitiin valvontaa ja esitetään keskiarvoina ± S.D.

Tilastollinen analyysi

Tiedot analysoitiin käyttämällä Microsoft Office Excel 2010 ja ilmaistaan ​​keskiarvoina ± S.D. tarvittaessa. Kaksi ryhmää vertailut arvioitiin käyttäen paritonta Studentin t-testiä. Arvot p 0,05 katsottiin tilastollisesti merkitsevä.

Tulokset

Morfologiset ja Molecular vaikutukset Epimorphin Associated kanssa MET in munasarjasyöpäsoluja

Aiemmat teokset ovat sekaantuneet epimorphin välittäjinä epiteelin morfogeneesissä eri elimissä ja solujen [4] – [13]. Kuitenkin tiedetään vähän mekanismi, jonka epimorphin välittävät tällaiset vaikutukset munasarjasyöpäsoluja. Ensin käytettiin ELISA Kit verrata tasoa epimorphin eri munasarjasyövän solulinjoissa rasva-johdettujen mesenkymaalisten kantasolujen, joita käytettiin positiivisina kontrolleina. Endogeenisen epimorphin tuotanto oli suhteellisen alhainen (vaihteluväli: 0,1-0,3 ng /ml) kaikissa munasarjasyövän solulinjoissa testattu verrattuna rasva- johdettuja mesenkymaaliset kantasolut (vaihteluväli: 10-12 ng /ml) (tietoja ei esitetty). Sitten määritetään optimaalinen aika ja annos epimorphin hoidon aiheuttavan markkinatalouskohtelu munasarjasyövän solulinja, A2780. Viimeaikaiset tutkimukset ovat osoittaneet, että 20 ug /ml epimorphin pystyi aktivoimaan MEK-ERK1 /2-reitin (11) ja indusoivat MMP: erilaistumista (13). Arvioida annoksesta riippuvainen vaste munasarjasyöpäsoluja, ensin suoritetaan laaja annos-vaste (2-20 ug /ml) epimorphin käyttäen A2780-soluja. Löydettiin jälkeen 3 päivän ajan 20 ug /ml epimorphin, A2780-soluissa tehtiin merkittäviä morfologisia muutoksia (mesenkymaalisista epiteeli-) analysoituna faasikontrastimikro- valomikroskoopilla, immunoblottauksen ja reaaliaikainen kvantitatiivinen RT-PCR: llä kun taas 2 ug /ml epimorphin herättänyt ei soluvasteita (tuloksia ei ole esitetty). Me seuraavaksi arvioidaan optimaalisen annoksen epimorphin ja todettiin, että sekä A2780 ja A1847 käsitelty pienemmällä annoksella (10 ug /ml) epimorphin osoitti enemmän stellate ja pitkänomainen mesenkymaalisten ulkonäkö (Fig. 1 B 1E). Vertailun vuoksi suurempi annos (20 ug /ml) johtaa monipuolisemman epiteelin muotoisia, kuten tarkasteltiin faasikontrastimikro- mikroskooppinen tutkimus (Fig. 1 C 1F). Nämä tulokset viittaavat kaksivaiheinen vaikutus epimorphin ja kapea annos ikkunan optimaalisesti palata mesenkyymisolujen entistä epiteelin morfologia. Lisäksi poistimme eksogeenisen epimorphin korvaamalla soluviljelmän kanssa tuoretta väliainetta, kun epimorphin aiheuttama MET vielä 3 päivän inkuboinnin jälkeen. Epimorphin aiheuttama MET munasarjasyövän solujen pysyi epiteelisolujen fenotyyppi analysoituna faasikontrastimikroskoop- valomikroskopialla ja reaaliaikaista kvantitatiivista PCR: ää (tietoja ei ole esitetty). Edelleen luonteen arviointi Tätä mittasimme tasoja aV-integriinin, joka on ”epimorphin reseptori” in A1847 ja totesi, että vakaan tilan tasoja aV-integriinin olivat alhaiset, mutta indusoitui 9-kertainen 20 ug /ml epimorphin (Fig. 2A). Samanlainen aV-integriinin reseptorin tasoilla loppupään välittäjiä, esimerkiksi transkriptiotekijöiden C /EBPβ (~9-kertainen ↑,

p

0,056) (Kuva. 2B) ja Klf4 (noin 28-kertainen ↑

p

0,002) (Kuva. 2C), havaittiin merkittävästi koholla, mikä viittaa siihen, että C /EBPβ ja Klf4 voi olla keskeinen säätelijöitä epimorphin välittämän MET. Samoin mRNA: n tasot β-kateniinin (~6-kertainen ↑,

p

0,004) (Fig. 2D), occludin (-15-kertainen ↑,

p

0,004 ) (Fig. 2E) ja EpCAM (~6-kertainen ↑,

p

0,0002) (Fig. 2F) havaittiin voimakkaasti voimistunut korkeimmalla annoksella epimorphin, jälleen osoittaen tukee konvertoinnin epiteelin kaltainen fenotyyppi. Molekyylimarkkereita mesenkymaaliset fenotyypin, kuten TWIST1 (Fig. 2G), vimentiinistä (Fig. 2 H), dystroglycan (Fig. 2 I) ja palladinin (Fig. 2J), tukahdutettiin 20 ug /ml epimorphin mutta kasvoi huomattavasti, kun stimulaatio A1847 pienemmällä annoksella epimorphin, mikä tarkoittaa, että vaihtaa mesenkymaalisten ja epiteelin fenotyypit on todennäköisesti annoksesta riippuvaista.

A2780 ja A1847 inkuboitiin 10 ug /ml tai 20 ug /ml epimorphin 3 päivää. A-F: Epimorphin (20 ug /ml) indusoi pyöristetty mukulakivi, epiteelin ulkonäön sekä A2780 (C) ja A1847 (F). Vertailun vuoksi epimorphin 10 ug /ml johtaa entistä pitkänomainen mesenkymaaliset morfologian sekä A2780 (B) ja A1847 (E) verrattuna käsittelemättömiin kontrolleihin (A Fisher Scientific).

A ja B: aV-integriinin -reseptorin (A) ja C /EBPβ (B) osoitti merkittävän nousun, mRNA: n tasoja vasteena 20 ng /ml epimorphin. C-F: Epiteelin markkereita, kuten Klf4 (C), β-kateniinin (D), occludin (E), ja EpCAM (F) havaittiin voimistuvan eksogeeninen 20 ug /ml epimorphin. G-J: Expression mesenkymaalisten markkereita TWIST1 (G), vimentiinistä (H), dystroglycan (I) ja palladinin (J) on vaimentua hoidon jälkeen epimorphin (20 ug /ml). Kuitenkin kaikki neljä mesenkymaaliset markkereita (G-J) havaittiin voimistuvan 10 ug /ml epimorphin (keskiarvoja ± SD, n = 3) [*

p

0,05 verrattuna ohjaus].

Effects of Epimorphin Gene Expression fenotyyppejä A1847

Kun pyritään edelleen vahvistamaan induktiiviset vaikutukset epimorphin Fenotyyppiresistenssitutkimuksiin muutoksia, immunoblotting ja ELISA suoritettiin määrittämään proteiinin ilmentymisen profiilia sekä epiteelin ja mesenkymaaliset markkereita. Kvantitatiivinen analyysi occludin proteiinin A1847 osoitti, että hoito korkeampia annoksia epimorphin kasvoi occludin ilmentymisen viiden taittuu (Fig. 3) verrattuna hoitamattomiin, yhdenmukainen tulos nähty mRNA-tasot (kuvio. 2E). Samalla tavalla, samanlaiset korotuksia saatiin CK-19 ja limaa 1 (Fig. 3), jälleen ymmärtää, että epimorphin hoidetuilla A1847 läpikäyvät fenotyyppisiä muutoksia, jotka liittyvät MET. Ilmaisulla mesenkymaalisten geenien, palladinin ja vimentiinin (kuvio S1) kasvoi 1- ja 2-kertainen, vastaavasti, A1847 käsiteltiin 10 ug /ml epimorphin jälleen viittaa siihen, että induktio EMT tai MET vastauksena epimorphin on kaksisuuntaisen riippuen käytetystä annoksesta. Me seuraavaksi suoritetaan ELISA-määrityksissä sen määrittämiseksi vapautumisen liittyvien proteiinien epiteeli- ja mesenkymaalisten fenotyyppejä. Mielenkiintoista on, että eritys laminiinin (Fig. 4A), solunulkoinen glykoproteiini olennaista kehitystä epiteelisolujen polariteetin, todettiin olevan kohonneita merkittävästi, kun hoito A1847 kanssa epimorphin. Toisaalta, tuotanto MMP3 (Fig. 4B), joka on mesenkymaaliset markkeri tärkeä syöpäsoluinvaasiota ja muutto havaittiin pienentyneen sen jälkeen, kun 20 ug /ml epimorphin hoitoa, mutta voimakkaasti säädelty 10 ug /ml. Yhdessä nämä tiedot osoittavat, että on olemassa progressiivinen sitoutuminen munasarjojen kasvainsolujen kohti epiteelin linjaa, kun viljellään riittävän annoksen epimorphin.

Proteiinin ekspressiota epiteelin liittyvän markkereita, esim musiinin-1, CK -19 ja occludin arvioitiin immunoblottauksella ja bändi tiheydet kvantitoitiin Image-J-ohjelmisto. Kertainen nousu proteiinin ilmentymisen käsiteltiin (20 ug /ml epimorphin) versus käsittelemättömien A1847: 2,5-kertainen lisäys CK-19; 1,5-kertainen lisäys Musiini-1, ja 4,5-kertainen lisäys occludin. β-aktiini toimi latauskontrollina. (Keskiarvo ± S.D., n = 3). [*

p

0,05 verrattuna ohjaus].

eritys laminiinin (epiteelin markkeri) ja MMP-3 (mesenkymaalisten markkeri) oli toimenpidettä ELISA käsittelyn jälkeen A1847 munasarjojen syöpäsolut epimorphin ja 3 päivää (10 tai 20 ug /ml). Altistuminen epimorphin (20 ug /ml) lisäsi merkittävästi laminiinin tuotannon ja johtaa MMP-3 eritystä verrattuna kontrolliin. Vertailun, MMP-3: n vapautumista parantaa, kun A1847 käsiteltiin alhaisempi pitoisuus epimorphin (10 ug /ml), jälleen viittaa epimorphin voivat aiheuttaa fenotyyppisiä muutoksia munasarjasyövän solujen annoksesta riippuvalla tavalla (keskiarvoja ± SD, n = 3 ) [*

p

0,05 verrattuna ohjaus].

epiteelikasvaimet eriytyminen vastaus Eksogeeninen Epimorphin

β-kateniinin, joka on keskeinen tekijä Wnt signalointireitin, on osoitettu määrittämiseksi epiteelisolujen kohtalon alkionkehityksen aikana munasarjasyöpä [23]. Menetys β-kateniinin myöhään alkion kehityksen aiheutti syvällinen puutteita epiteelin kypsyminen aikuisuuteen [24]. Tutkia tarkemmin, onko epimorphin-välitteinen MET liittyy lisääntynyt endogeenisen ilmentymisen β-kateniinin, käytimme immunovärjäys β-kateniinin arvioida epiteelisolujen erilaistumisen epimorphin käsitellyn A1847. Sekä käsittelemättömän A1847 ja OVCAR10 oli muutama β-kateniinin-positiivisten solujen; mutta osoitti näkyvä laajeneminen alueella ja niiden ympärillä solu-solu liittymissä, merkittävimmin epimorphin saaneilla A1847 ja OVCAR10 (Fig. 5). Kasvu β-kateniinin-positiivisten solujen nähdään epimorphin-käsitelty A1847 ja OVCAR10 edustaa eräänlaista annos-vaste näiden solujen 20 ug /ml epimorphin. Tämä kokeellista näyttöä viittaa rooli epimorphin signaloinnin induktio β-kateniinin eriyttäminen, joka voi olla tärkeä tekijä epiteelin sukua sitoutumisen munasarjojen kasvainsoluissa. Lisäksi FACS-analyysi tunnisti Saharan osa A1847 solujen ilmen- tymisen lisääntymisen EpCAM (epiteelin markkeri) ja vaimentua vimentiinista (mesenkymaaliset markkeri) minkä 20 ug /ml epimorphin (kuva S2 S3).

Käsittelemättömät ja 20 ug /ml epimorphin käsitellyn A1847 ja OVCAR10 analysoitiin β-kateniinin, joka on merkkiaine epiteelin erilaistumista, immunovärjäyksellä. β-kateniinin (vihreä), DAPI (sininen) ja yhdistää (neon vihreä) käsittelemättömissä A1847 (A-C) ja OVCAR10 (G-I); epimorphin-käsitelty A1847 (D-F) ja OVCAR10 (J-L). Immunovärjäys analyysi osoitti lisääntyneen ekspression β-kateniinin-positiivisten solujen epimorphin-käsiteltyjen A1847 (D F) ja epimorphin käsitellyn OVCAR10 (J L). Oli runsaasti β-kateniinin positiivisia soluja ja noin solu-solu liitosten epimorphin aiheuttaman A1847 ja OVCAR10 (F L) verrattuna käsittelemättömiin kontrolleihin (C I).

elinkykyyn ja anneksiini-V Activity aikana Carboplatin-induced Apoptosis in Epimorphin-käsitelty OCCS

sen määrittämiseksi, karboplatiini voi edullisesti tappaa munasarjasyöpäsoluja enemmän epiteelin kaltainen morfologioita, vertasimme kyky karboplatiinin indusoimaan solukuolemaa seuraavat epimorphin- hoitoon. Kuten kuvassa 6, karboplatiinin altistuminen johtaa merkittävään väheneminen elävien solujen seuraavista epimorphin aiheuttama MET varten A1847 (

p

= 0,005) (Kuva. 6A) ja A2780 (

p

= 0,007) (Fig. 6B) verrattuna kontrolleihin. Vaikka suuntaus oli samanlainen, muutos herkkyys OVCAR10 (Fig. 6C) kanssa tai ilman epimorphin ei ollut tilastollisesti erilainen (

p

= 0,170), johtuen mahdollisesti puutteesta annoksen asteikon yläpäähän on alue piirtämistä ja mallintamiseen vastetiedot. Fluorokromileimattuja anneksiini V käytettiin tunnistamaan apoptoottisten solujen [25], [26]. Kuten on esitetty kuviossa 6D-6F, apoptoosin induktio havaittiin kolmen epimorphin käsitellyn OCCS, mukaan lukien entistä karboplatiini kestävä solulinja, OVCAR10 verrattuna käsittelemättömään OCCS. Prosenttiosuus apoptoottisten solujen lisääntynyt epimorphin käsiteltyjä soluja kasvavien pitoisuuksien kanssa karboplatiinin (Fig. 6D-6F). Nämä tulokset viittaavat siihen, että OCCS mesenkymaalisten ominaisuuksia yhä herkemmin karboplatiini aiheuttamaa apoptoosia epimorphin Associated eriytetty epiteeliosaan kaltainen tila. Tärkeää on, kun sitä arvioidaan käyttäen 10 ug /ml epimorphin, joka ei indusoi MET, kolme munasarjasyövän solulinjoissa arvioidaan (eli A1847, A2780 ja OVCAR10) osoittivat lisääntyneen resistenssin karboplatiini mitattuna CellTiter® Blue (kuvio S4). Nämä tulokset korostavat, että käänteinen EMT voi osaltaan auttaa edelleen herkistää uusiutuva sairaus etulinjassa hoitoja. Koska kohonnut solujen proliferaatio voi dramaattisesti vaikuttaa karboplatiinin kestävyys ja platina huumeiden vain vahingoittavat soluja aikana S-vaiheen solusyklin, manuaalinen solumäärät hemosytometrillä on suoritettu seurata leviämisen lopussa viljelmän. Little-to-mitään muutoksia solujen kasvun havaittiin epimorphin-käsitelty verrattuna käsittelemättömiin OCCS (tuloksia ei ole esitetty).

AF: A1847, A2780, ja OVCAR10 käsiteltiin 20 ug /ml epimorphin varten 3 päivää. Jälkeen 3 päivää, epimorphin-käsitellyn ja käsittelemättömän OCCS viljeltiin kolmena kappaleena, joiden sarjanumero annoksia karboplatiinia vielä 3 päivää. Solujen elinkyky kvantitoitiin käyttäen CellTiter Blue® määrityksessä (A-C). Apoptoosi kvantifioitiin käyttäen guava neksiini määritys (D-F). A-C: IC

50-arvot osoittavat, karboplatiini indusoi enemmän solujen elinkelpoisuutta menetyksen kaikissa kolmessa epimophin-käsitelty OCCS kuin käsittelemättömien kontrollien annoksesta riippuvalla tavalla. D-F: Detection apoptoottisten vasteita havaittiin lisäävän kaikissa kolmessa epimorphin-käsitelty OCCS kasvaessa sisplatiinin verrattiin käsittelemättömien kontrollien. Data normalisoitiin valvontaa ja esitetään keskiarvoina ± S.D. [*

p

0,05 verrattuna ohjaus]. Kuvia apoptoottisia soluja jää 10x suurennus, jossa on vähintään 3 kuvaa per kuoppa käyttäen pystyssä faasikontrastimikroskoopissa (T3.15A; Fisher Scientific).

Keskustelu

Asennus todisteet tukevat kriittisen roolin EMT orchestrating alkionkehityksen kudosregeneraatiossa ja syövän etäpesäkkeiden [1] – [3], [16], [27], [30] – [35]. Geneettinen muutos ja morfologisia muutoksia moduloidaan aikana syövän etäpesäkkeiden kuten menetys epiteelisolujen identiteetin (esim occludin ja EpCAM) ja hankkiminen mesenkymaalisten ominaisuuksia (esim vimentiinistä ja TWIST1) [1] – [3], [27]. Kehitystyössä, EMT ja käänteinen prosessi, MET ovat olennainen mekanismi sääntelyn fenotyypin plastisuus, joka luonnehditaan solu- ja molekyylitason tapahtumia mukana toisikseen välillä epiteelin ja mesenchyme alkionkehityksen aikana kokoonpanon ja remodeling. Kuitenkin syövän, fenotyypin plastisuus voi vaikuttaa syövän etenemiseen ja lääkeaineiden tehoon ylläpitämällä mesenkymaaliset, invasiivisen fenotyypin syöpäsolujen jotka ovat läpikäyneet EMT vastauksena monipuolisista solunulkoisen ärsykkeiden tai kasvun johdannaisia.

Ensisijainen munasarjan epiteelin syövät ovat suurimmaksi osaksi erityisen herkkä platina-pohjainen hoitoja. Lisäksi uusiutuva sairaus usein vastaa lisäkierroksia kemoterapiaa; kuitenkin, etenemisen väliajan lyhenee jokaisen syklin, koska chemoresistance kasvaa, kunnes tauti tulee parantumaton. Johtavien mekanismien lääkeresistenssi ovat monimutkaisia; Kuitenkin viimeaikaiset tutkimukset osoittavat, että EMT läheisesti liittyy hoitovaste ja yleistä tai ilman taudin etenemistä. Uskotaan, että luontaiset tekijät, jotka ovat peräisin kasvaimeen mikroympäristössä aiheuttaa epiteelisolujen OCCS tehtävä syvällinen fenotyyppinen muuntaminen epiteelin (pyöreä) ja mesenkymaalista (kara-muotoinen) morfologia vastaa EMT [16], [27], [30] – [ ,,,0],35]. Viimeaikaiset tutkimukset ovat osoittaneet, että OCCS epiteelin ominaisuudet ovat herkempiä kemoterapiahoitoihin verrattuna mesenkymaaliset kasvainsoluihin [1], [2]. Kuitenkin epiteelin OCCS meneillään EMT ne aiheuttavat todennäköisesti kehittynyt resistenssi ja jumiutua tavanomaisiin lääkehoidot [1] – [3], [35]. Täten oletamme, että käänteinen EMT fenotyypin voisi auttaa voittamaan platinaa liittyvä kestävyys.

Harvat strategioita on käytetty edistämään muuntaminen mesenkymaalisten syöpäsolujen kohti epiteelin kaltainen fenotyyppi kuin ominaista menetys mesenkymaalisten fenotyyppisen ominaisuuden ja hankinta epiteelin merkkiaineiden [28] – [30]. Park ja työtovereiden [28] ovat osoittaneet, että kohdunulkoinen ilmaisu MikroRNA (miRNA), kuten miR-200, voi johtaa säätely ylöspäin E-kadheriinin syöpäsolulinjoissa ja vähensi peristaltiikan kohdistuvat E-kadheriinin transkriptiorepresso-,

ZEB1

(TCF8 /δEF1) ja

ZEB2

(Smad-vuorovaikutuksessa proteiini 1 [SIP1] /ZFXH1B) selostukset. He myös raportoitu merkittävä korrelaatio E-kadheriinin ja miR-200 ilmentymisen kahdet potilaan näytteitä johdetut serous papillaarisen munasarjasyöpä [28]. Samanlaisia ​​tuloksia on raportoitu, kun miR-429 yliekspressoituu metastaattisen munasarjasyövän soluihin [29].