Krooninen sairaus

tiivistelmä

α-solaniini, steroidista glykoalkaloidit vuonna perunaa, havaittiin lisääntymistä estäviä ja apoptoosia edistävien vaikutus useita syöpäsoluja, kuten klooni, maksan, melanoomaan syöpäsoluja. Kuitenkin antituumorivaikutuksen tehosta α-solaniini on haimasyöpä ei ole täysin arvioitu. Tässä tutkimuksessa, kysyimme osaksi antikarsinogeenisiä vaikutusta α-solaniini ihmisen haimasyövän soluja. Esillä olevassa tutkimuksessa olemme tutkineet anti-karsinogeenisen vaikutuksen α-solanine ihmisen haimasyövän soluja. In vitro, α-solanine inhiboi proliferaatiota PANC-1, sw1990, MIA PaCa-2-soluissa annoksesta riippuvalla tavalla, sekä Solujen migraation ja invaasion kanssa myrkytön annoksilla. Ekspression MMP-2/9, solunulkoisen indusoija matriksimetalloproteinaasi (EMMPRIN), CD44, eNOS ja E-kadheriinin oli tukahdutettu α-solanine in PANC-1-soluissa. Lisäksi merkittävästi vähentynyt verisuonten endoteelin kasvutekijä (VEGF), ilmentyminen ja putken muodostumiseen endoteelisolut havaita seuraavat α-solanine hoitoon. Tukahdutti fosforylaatiota Akt, mTOR, ja Stat3, ja vahvistaa fosforylaatiota β-kateniinin todettiin, sekä merkittävästi vähentynyt tran-ydin- NF-KB: n, β-kateniinin ja TCF-1. Annon jälkeen α-solaniini (6 ug /g 2 viikkoa) in ksenograftimallia, kasvaimen tilavuus ja paino pieneni 61% ja 43% (p 0,05) vastaavasti, josta esitetään laski MMP-2/9, PCNA ja VEGF ilmaisu. Lopuksi α-solaniini osoitti myönteisiä vaikutuksia haimasyövän in vitro ja in vivo, jotka voivat kautta tukahduttaa reitin leviäminen, angiogeneesi ja metastaasi.

Citation: Lv C, Kong H, Dong G, Liu L, Tong K, Sun H, et al. (2014) Antitumor tehokkuus α-Solaniini vastaan ​​Haimasyöpä In vitro ja in vivo. PLoS ONE 9 (2): e87868. doi: 10,1371 /journal.pone.0087868

Editor: Yu-Jia Chang, Taipei Medicine University, Taiwan

vastaanotettu: 2. lokakuuta, 2013 Hyväksytty: 26 joulukuu 2013; Julkaistu: 05 helmikuu 2014

Copyright: © 2014 Lv et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tutkimus sponsoroi Kiinan National Natural Science Foundation (nro 81070372, nro 81370563), Zhejiangin maakunnan Program viljely korkean tason Innovative Health kykyjä ja maakuntahallinto perinteisen kiinalaisen lääketieteen Zhejiangin maakunnassa Kiinassa (NO. WKJ2012-2 -033, No. 2011ZA072), piirin tutkimuksen ja kehittämisen ohjelma Longwan Piirin Wenzhoun, Zhejiang, Kiina (nro 2010YS5). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Haiman karsinooma on yksi aggressiivinen ja tappava syöpä puutteen vuoksi varhaisen diagnoosin, lääkeresistenssideterminantit ja huono ennuste, ja sellaisenaan on neljänneksi suurin syy syövän kuolleisuus kaikkialla maailmassa [1], [ ,,,0],2]. Nykyisin standardi hoito haimakarsinooma- riippuu leikkaus, säteily ja huumeet. Kuitenkin vain noin 25% haimasyövän potilaille diagnosoitu kokoisen muodossa liittämällä hyökkäyksen taudin [3]. Gemsitabiini standardi ensilinjan metastasoituneen haimasyövän puheenjohtajien, on laajalti käytössä, mutta näyttää huono terapeuttisen vaikutuksen hankkimiseksi chemoresistance ja erilaisia ​​haittavaikutuksia [4]. Niinpä etsivät uusia tehokkaita lääkkeitä contraposing parantaa antiangiogeenisen valmiudet ja hillitä etäpesäke tarvitaan kipeästi haimasyöpä, kohdistaminen sen pisimmälle vascularized ja invasiivisia kasvaimia.

Lisäksi induktio syöpäsolun apoptoosin ja nekroosin , soluproliferaation inhibointi, soluttautuminen ja etäpesäke on ensiarvoisen tärkeää. Kasvainetäispesäkkeiden on erittäin koordinoitua jota edistetään eri proteolyyttisten entsyymien halventava soluväliaineen (ECM) ja tyvikalvon (BM). Matrix (MMP) uskotaan hallitsevia osallistua kasvainsolun muuttoliike, kudosten ja metastaasit [5]. MMP-2 ja MMP-9 on keskeinen asema prosessissa etäpesäkkeiden keskuudessa MMP. Solunkiinnitysmolekyyli E-kadheriinin, säätelevät solujen napaisuus, erilaistuminen, proliferaatio ja migraatio kautta intiimi yhdistyksen aktiinisytoskeletonver- verkko [6], osoittaa alempaa ilmentymistä haimasyövän kuin normaalissa haima- kudoksessa [7]. Lisäksi Wnt /β-kateniinin signalointiryöpyn on ollut olennaisia ​​syöpää ja verisuonten lisääntymistä, kohtalo erittely ja solujen etäpesäke. Wnt ligandi sitoutuu sen Frizzled reseptoriin inaktivoimiseksi β-kateniinin tuhoa monimutkainen, mikä fosforyloitumaton β-kateniinin kerääntyminen sekä sytoplasmassa ja tumassa. Tumaan, β-kateniinin muodostaa heterodimeerisen kompleksin TCF /LEF perheen DNA: han sitoutuvia proteiineja, ja siten aktivoi transkription Wnt kohdegeenien, vaarantamatta c-Myc, surviviini, cyclinD1, ja MMP: [8]. Viimeaikaiset tutkimukset ovat osoittaneet, että inositoli-3-kinaasi (PI3K) -Akt /nisäkkään rapamysiinin kohde (mTOR) reitin osallistuu myös Haiman endokriiniset kasvaimet (PET) kasvaimen kehittymisen ja etenemisen [9], [10], solujen eloonjäämistä, soluadheesion ja etäpesäkkeiden [11], [12]. Kautta ylikuuluminen Wnt, NF-KB ja MAPK polkuja, Akt /mTOR aktiivisuus edistää syöpäsolujen lisääntymistä, estämällä apoptoosia ja etäpesäkkeiden [13], [14]. Lisäksi konstitutiivisesti aktivoitua Stat proteiineja löytyy useita kasvaimia [15], [16], [17], [18]. Lisäksi Wnt /β-kateniinin ja Akt /mTOR reitit säätelemään MMP mukaan transkriptiotekijöitä, kuten NF-KB: n [19], [20]. Todisteet asennus että NF-KB on keskeinen rooli leviämisen, apoptoosin estäminen ja angiogeneesiä haimasyövän [21]. Siten estämällä Wnt /β-kateniinin ja Akt /mTOR reitit sekä stat ja NF-KB tarjoavat potentiaalisia syövän terapeuttisia strategioita.

α-Solaniini, bioaktiivinen komponentti tärkeimmistä steroidisten glykoalkaloidien perunoissa on hyvin tutkittu sen vaikutusta antituumoriominaisuuksia. Monet tutkimukset ovat osoittaneet, että α-Solaniini näyttelyitä kasvun esto ja apoptoosin induktio useita syöpäsoluja [22], [23]. Osoittavat myös, α-solanine omaavan anti-inflammatorisia vaikutuksia in vitro vähentämällä interleukiini-2: n ja interleukiini-8 tuotantoa [24]. Tehoa ja siihen liittyvä molekyylitason mekanismeja johtuen a-solaniini vastaan ​​haimasyöpä ei ole arvioitu vielä. Siksi arvioimme tehoa α-solaniini hyödyntäen haimasyövän sekä in vitro että in vivo esillä olevassa tutkimuksessa.

Materiaalit ja menetelmät

Ethics lausunto

Tässä tutkimuksessa , eläinten hoito ja kokeet tehtiin mukaisesti hyväksytyn protokollan mukaan animal Experimental Ethical Inspection Laboratory animal Centre, Wenzhou Medical College (Luvan numero: wydw2013-0001). Kaikki Leikkaus suoritettiin nukutuksessa, ja yritettiin minimoida kärsimyksen.

1. Cell Line ja reagenssit

α-solaniini, dimetyylisulfoksidi (DMSO) hankittiin Sigma-Aldrich (St.. Louis, MO, U.S.A.). Proteiinimääritys kit saatiin Bio-Rad Labs (Hercules, CA, USA). Dulbeccon modifioitu Eaglen väliaine (DMEM) ja hankittiin Gibco /BRL (Gaithersburg, MD, USA). Matrigel oli BD Biosciences (Bedford, MA, USA). Kokonais-RNA Extraction Kit ja polymeraasiketjureaktion (PCR) sarja olivat Viogene (Sunnyvale, CA, USA). Vasta-aineita MMP-2, MMP-9, E-kadheriinin, TCF-1, STAT3 ja fosforyloitu STAT3 ostettiin Cell Signaling Technology (Danvers, MA, USA). Vasta-aineet β-aktiini, VEGF, PCNA, β-kateniinin, Akt, mTOR fosforyloitu proteiinit hankittiin Abcam (Cambridge, MA, USA). PANC-1, sw1990, MIA PaCa-2, ja ihmisen napalaskimon endoteelisolujen (HUVEC) saatiin ATCC: stä (Manassas, VA, USA). Haimasyövän solulinjoissa ylläpidetään DMEM, jossa oli 10% FBS: ää ja inkuboitiin 5% CO

2 kostutetussa inkubaattorissa 37 ° C: ssa, HUVEC viljeltiin M199 10% FBS: ää. a-Solaniini sulatettiin DMSO: hon ja laimennettiin elatusaineeseen (lopullinen DMSO-pitoisuus oli alle 0,1%).

2. Solunelinkykyisyysmääritys ja Colony määritys

Seeding 20000 soluja kunkin syövän solulinja kuhunkin kuoppaan 96-kuoppalevyllä ja korvaamalla viljelyväliaine, joka sisälsi eri konsentraatioita α-solanine (3,6,9,12 ug /ul) 24 tunnin kuluttua. Kehittää edelleen 24 ja 48 tuntia, sitten väliaine korvattiin tuoreella elatusaineella sisällyttäminen 10% CCK8 (Dojindo Laboratories, Kumamoto, Japani). Jälkeen 1-4 tuntia, supernatantit mitattiin spektrofotometrisesti 450 nm: ssä.

Anchorage riippumaton solujen kasvua arvioidaan suorittamalla -pesäkemääritys (GENMED SCIENTIFECS INC, USA) valmistajan ohjeiden mukaisesti. Lyhyesti, 1,5 ml Base Agar Matrix Layer annostellaan kuhunkin kuoppaan 12-kuoppalevyllä (näytteet määritettiin kolmena kappaleena). Levy jäähdytettiin huoneen lämpötilassa, kunnes kiinteä aine. Sitten 1,5 ml: n kasvu agar-kerros, joka koostuu 2500-soluja lisättiin kuhunkin kaivoon. Levyä jäähdytettiin huoneenlämmössä uudelleen ennen kuin kasvu kerros hyytynyttä. Lisäksi 500 ui elatusaineet, jotka sisältävät erilaisia ​​pitoisuuksia α-solanine lisättiin päälle kasvun kerroksen. Inkuboi soluja 37 ° C: ssa ja 5% CO

2 2 viikkoa ja yhteensä pesäkkeet laskettiin.

3. Cell Migration ja Invasion Analyysit

Solun muuttoliikettä tutkittiin suorittamalla haavan paranemista määrityksiä. 10000 solua kutakin haimasyövän solulinjaa maljattiin korkean 35 mm μ-ruokia kulttuuri insertit (Ibidi, Martinsried, Saksa). Kun solut kasvoivat konfluenssiin, insertit poistettiin sitten steriilillä pinseteillä luoda haava alan noin 500 mikrometriä. Poistamisen jälkeen solujäte PBS: llä, solut altistettiin eri pitoisuuksia α-solanine 24 tuntia. Solumigraation kokivat nämä käänteismikroskooppi ja valokuvattiin (100-kertainen suurennus). Haava-alue oli skaalataan Image Pro Plus. Haava sulkeminen prosentti laskettiin yhtälöllä: haavan sulkeminen% = [1- (haavan alueella sen jälkeen 24 h /haavan alueella sen jälkeen 0 h) x 100%.

Cell invasion määritykset toteutettiin käyttäen 6,5 mm: n transwell kammiot varustettu 8,0 um huokoskoko polykarbonaatti kalvoja. Näissä määrityksissä, ylempi Champers pinnoitettiin ensin 50 ui Matrigel klo 1:05 laimennus, ja inkuboitiin 37 ° C: ssa 2 tuntia. Sen jälkeen käsitelty α-solaniini 24 tuntia, seerumittomassa soluja (10000 solua /kuoppa) suspensioalustaa kunkin haimasyövän solulinjaa lastattu ylä- kammioon Transvvell-. Alakammioissa täytettiin 500 pl DMEM 10% FBS: ää. Kun oli inkuboitu 37 ° C: ssa 6 h, ei-invasiivisia soluja fyysisesti raaputettiin kalvon kanssa vanupuikoilla. Invasiivisen solut värjättiin DAPI 5 minuutin ajan ja havaittiin fluoresenssimikroskoopilla (Leica Microsystems, Wetzlar, Saksa). Fluoresoivat solut laskettiin käyttäen Image Pro Plus.

4. In vitro angiogeneesimääritys

analyysi hiussuonten muodostumista suoritettiin käyttäen putken muodostumiseen määrityksiä (Ibidi, Martinsried, Saksa) mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Lyhyesti, 15-kuoppaisille μ-diat päällystettiin 10 ui Matrigel, jonka annettiin kiinteytyä 37 ° C: ssa. Arvioida vaikutuksen α-solaniini, PANC-1-soluja käsiteltiin eri pitoisuuksilla α-solanine 24 tuntia, sitten vakioitu väliaine kerättiin. HUVEC otettu μ-Slide hyvin ja inkuboitiin kasvualusta on PANC-1-soluissa 6 tuntia. Sukupolvi solukkoverkkojen valokuvattiin ja kvantitatiivisesti arvioida Image Pro Plus.

5. Kvantitatiivinen reaaliaikainen polymeraasiketjureaktio

Yhteensä RNA eristettiin PANC-1 TRIzol Reagent (Ambion, Carlsbad, Kalifornia, USA) valmistajan ohjeiden mukaisesti. Kokonais-RNA (1 ug) kustakin näytteestä tehtiin oligo-dT-aloitettu RT ReverTra Ace qPCR RT-pakkausta (Toyobo, Osaka, Japani). Reaaliaikainen polymeraasiketjureaktio (PCR) suoritettiin kvantitatiivinen analyysi MMP-2, MMP-9, VEGF, EMMPRIN, E-kadheriinin ja CD44 mRNA ilmaisun käyttämällä SYBR Green reaaliaikainen PCR Master Mix (Toyobo) on 7500 Real Time PCR System (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). PCR-olosuhteet olivat seuraavat: 95 ° C 1 min, 40 sykliä 95 ° C: ssa 15 s ja 60 ° C: ssa 60 s. Aluke sekvenssejä GAPDH, MMP-2, MMP-9, VEGF, ENOS, EMMPRIN, E-kadheriinin ja CD44 syntetisoitiin Invitrogen ja lueteltu taulukossa 1. Analyysi kvantitatiivinen reaaliaikainen PCR tietoja suoritettiin ACt-arvoja.

6. Proteiinin uuttaminen ja Western Blot -analyysi

PANC-1-soluja lyysattiin radioimmuunisaostuspuskurissa määrityksessä (RIPA), joka sisälsi proteaasi ja fosfataasi-inhibiittori (Roche, Basel, Sveitsi). Nuclear ja soluliman proteiinit uutettiin ydin- ja Sytoplasmiset Extraction reagenssit (Beyotime, Jiangsu, Kiina) mukaan valmistajan ohjeiden. Proteiinit fraktioitiin natriumdodekyylisulfaatti-polyakryyliamidigeeleillä elektroforeesilla ja siirrettiin PVDF-kalvolle (Solarbio). Membraanit blokattiin 5% rasvatonta kuivamaitoa inkuboitiin asiaan vasta yön yli 4 ° C: ssa. Sitten kalvot pestiin kolme kertaa TBST: llä ja inkuboitiin toissijaisen vasta-aineiden 1 tunnin ajan huoneenlämpötilassa. Kun oli pesty kolme kertaa TBST-liuoksella, tavoite vyöhykkeet havaittiin käyttäen ECL (Advansta, Menlo Park, Kalifornia, USA) ja valotettiin filmille. Tiheys Proteiinivyöhykkeet mitattiin Määrä One.

7. Analyysi MMP-2 ja MMP-9 Toiminta gelatiinitsymografialla

toiminta MMP-2 ja MMP-9 analysoitiin gelatiinitsymografialla. PANC-1-soluja inkuboitiin seerumittomassa elatusaineessa eri pitoisuuksilla α-solanine 24 tuntia. Esikäsitelty väliaine kerättiin talteen ja väkevöitiin. Jokainen näyte (20 ug) sekoitettiin latauspuskuriin ja altistettiin uudelleen 10% SDS-polyakryyliamidigeelissä, joka sisälsi 0,1% gelatiinia. Elektroforeesi suoritettiin 100 V: ssa 1,5 h 4. Sitten geelit pestiin pesupuskurilla (2,5% Triton X-100, 50 mmol /L Tris-HCI, 5 mmol /L CaCl

2, pH 7. 6), mitä seurasi inkubointi 37 ° C: ssa reaktiopuskuria (50 mmol /l Tris – HCI: ää, 5 mmol /CaCI 2, 0 02% Brij-35, pH 7,6). Jälkeen 42 h, geelit värjättiin Coomassie blue (0,05% Coomassie blue, 30% metanolia, 10% etikkahappoa), 3 tuntia ja väri poistettiin värinpoistoliuos (20% metanolia, 10% etikkahappoa, 70% ddH 2O: lla), kunnes selkeää bändejä visualisoitiin.

8. Eläimet ja kasvaimet

Kateenkorvattomia (nu /nu) nude-hiiret saatiin Shanghai Lab. Animal Research Center (Shanghai, Kiina) ja sijoitetaan tavanomaisissa laboratorio-olosuhteissa (pathogenfree olosuhteissa 12 h valo /12 h pimeäjaksoilla). Tuottaa kasvaimen eläimiä, 5 x 10

6 PANC-1-soluja injektoitiin ihonalaisesti kylkiin neljän viikon ikäisiä kateenkorvattomia nu /nu-uroshiiriä. Kun kasvaimet olivat mitattavissa, hiiret jaettiin kahteen ryhmään (6 /ryhmä) satunnaisesti. Eläinten hoito ja kokeet tehtiin mukaisesti hyväksytyn protokollan Animal Experimental eettinen tarkastus Laboratory Animal Centre, Wenzhou Medical College.

9. Hoidon Menetelmä ja tuumoriksenografteja Study

kontrolliryhmässä, jossa 1 ul /g (paino hiirtä) DMSO injektoitiin vatsaonteloon kunkin hiiren; solanine ryhmä, jossa 1 ul /g (paino hiirtä) solanine injektoitiin samalla tavalla. Pitoisuus solanine on 5 ug /ul. Solaniini oli merkittävä turvallisuutta annoksella 5 ug /g (paino hiiriä), ja niillä ei ollut kliinisiä ja histologisia eroja hoidon ja kontrolliryhmien [25]. Kukin ryhmä käsiteltiin lääkkeen 1 kerran päivässä kahden viikon ajan. Kehon paino hiiriä ja niiden kasvainten koot mitattiin joka päivä. Hiiret tapettiin 2 viikon kuluttua lääkkeen antamisesta ja kasvaimet erotettiin varovasti ja punnitaan. Kasvaimen tilavuus laskettiin kaavalla: 0,5236 L1 (L2)

2, jossa L1 on pitkä halkaisija, ja L2 on lyhyt halkaisija. Osa kasvaimen käytettiin Western blot ja varastoidaan 4% paraformaldehydi immunohistokemiaan, ja loput jäädytettiin nestemäisessä typessä.

10. Western Blot MMP-2 ja MMP-9 ja immunohistokemiallinen värjäys PCNA: n ja VEGF

-tuumoriksenografti proteiinin uutto- ja käsittelemällä prosesseja on sama kuin edellä mainittu. Peräkkäisiä 4-um: n leikkeitä leikattiin parafiiniin kasvainkudoksista immunohistokemiaa. Osiot blokattiin vuohen seerumia ja immunovärjättiin jälkeen deparaffinization ja nesteytys. Sitten leikkeitä inkuboitiin 1/200 laimennoksella primaarisen vasta-aineen vasten PCNA tai VEGF yön yli 4 ° C: ssa, minkä jälkeen inkuboimalla sekundaarisia vasta-aineita 60 minuutin ajan huoneenlämpötilassa. Lasit kehitettiin diaminobentsidiinillä ja vastavärjättiin hematoksyliinillä. Lisääntyminen indeksi (per 400 × mikroskooppinen kenttä) määritettiin useita PCNA-positiivisten solujen /Solujen kokonaismäärä x 100. Integroitu optinen tiheys (IOD) analysoitiin VEGF kvantifiointiin. 6 kentät valittiin satunnaisesti kussakin osiossa. Keskimääräinen IOD tasot kahden ryhmän välillä verrattiin. Image-Pro Plus 6.0 ohjelmistoa käytettiin analyysiin.

11. Tilastollinen analyysi

Kaikki analyysi suoritettiin SPSS17.0 ohjelmisto. Esitetyt tiedot edustavat kuvia tai ilmaistaan ​​keskiarvoina ± S.E.M. kunkin ryhmän. Ero ryhmien välillä solujen analysoitiin käyttämällä ANOVA, ja Independent näyte T testiä käytettiin analyysiin ryhmien välillä in vivo. P 0,05 katsottiin tilastollisesti merkitsevä.

Tulokset

1. α-solanine vaikuttaa solujen elinkykyyn ja estää Colony Formation

Huomasimme, että hoito α-solanine (3,6,9 ug /ul) 24 tuntia tai 48 tuntia ei muuttanut elinkelpoisuutta PANC-1 , sw1990 ja MIA PaCa-2-soluissa merkittävästi (Fig. 1A). Solujen elinkelpoisuus heikkeni merkittävästi käsittelyn jälkeen α-solaniini 12 ug /ul. Tulokset paljastivat, että sytotoksisuus soluja kustakin solulinjasta eivät johtuneet α-solaniini 3, 6, 9 ug /ul: ssa 24 tuntia ja 48 tuntia. Käytimme myrkyttömiä annoksia α-solanine kokeissa in vitro.

(A) Solujen kumpaakin syövän solulinja käsiteltiin eri pitoisuuksilla α-solanine 24 h ja 48 h. (B) Kuvat kiinnittymisestä riippumattoman solujen kasvun PANC-1 (100-kertainen suurennus). (C) Siirtokunta määrä kvantitoitiin ja tiedot laskettiin kolmen erillisen kokeen. Kukin pylväs keinoja ± SEM (N = 3). ** P 0,01, verrattuna kontrolliryhmään.

Valaistaan ​​toimintoja α-solanine kiinnikkeessä riippumatonta kasvua haimasyövän soluja, käytimme pehmeä agar määrityksessä. Soluja ilman α-solanine käsitelty muodostuu enemmän ja suurempia pesäkkeitä kuin a-solanine käsitellyt solut (Fig. 1 B, C), mikä osoittaa, että kiinnittymisestä riippumattoman kasvun haimasyöpäsoluissa estyi α-solanine annoksesta riippuvalla tavalla.

2. α-Solaniini Estää Cell Migration and Invasion

Haavan paranemista määritys ja siirtokuoppaan invaasiomääritys suoritettiin tarkkailla vaikutusta α-solaniini solun maigratoin ja invaasiota. Tulokset osoittivat, että α-solanine tukahdutetaan muuttoliike ja invaasion haimasyövän soluja annoksesta riippuvaisella tavalla (kuvio. 2).

Soluja käsiteltiin eri pitoisuuksilla α-solanine 24 tuntia. (A) Solut valokuvattiin (100-kertainen suurennus). (B) Haava-alue kvantitoitiin neljään kenttään Kunkin käsittelyn, ja tiedot laskettiin kolmen erillisen kokeen. (C) Solut valokuvattiin (100 x maginfication). (D) tunkeutuneet solut kvantitoitiin laskemalla fo DAPI-värjäytyneiden solujen. Kukin pylväs keinoja ± SEM (N = 3). * P 0,05, ** p 0,01, verrattuna kontrolliryhmään.

3. α-Solaniini Inhibioitu Tube muodostuminen PANC-1 aiheuttama hankittua ja ilmentäminen VEGF

Huomasimme, että elatusaineen PANC-1-solujen aiheuttama putken muodostumiseen HUVEC, kun taas vakioitua elatusainetta PANC-1 hoitaa α-Solaniini tukahdutti putken muodostumiseen HUVEC annoksesta riippuvalla tavalla (kuviot. 3A, 3B). VEGF, kuten angiogeeninen tekijä, edistää angiogeneesiä. Tuloksemme osoittivat myös, että α-Solaniini (3, 6 ja 9 ug /ul) väheni merkittävästi mRNA ja proteiini VEGF: n ilmentyminen in PANC-1-solujen annoksesta riippuvalla tavalla (kuviot. 3C, 3D ja 3E). Data osoitti, että α-Solaniini estää angiogeneesin hillitsemällä VEGF ilme.

(A) edustaja micrographs (100 x) putken käsittelyn jälkeen kunnostettua alustaa 6 tuntia. HUVEC-solut maljattiin Matrigel-pinnoitetuille kuoppiin ja niitä viljeltiin saadun sopeutetun elatusaineen PANC-1-soluja käsiteltiin 24 tunnin ajan. (B) putki pituudet mitattiin Image-ProPlus 6,0. (C) mRNA: n ekspressio VEGF esitettiin keskiarvoina ± S.E.M. kolmen itsenäisen kokeen. (D) Western blot analyysi VEGF: n ilmentymistä. GAPDH: ta käytettiin latauskontrollina. (E) kvantifiointi Western blot tulosta suoritettiin laskemalla arvon suhde kontrolliryhmään. * P 0,05, ** p 0,01, verrattuna kontrolliryhmään.

4. α-Solaniini Kiinnostavuus ilmentäminen Metastasis Associated Molecule

Expression liittyvien geenien etenemisen ja etäpesäkkeiden suoritettiin kvantitatiivinen reaaliaikainen PCR (kuviot. 4A). Aktivointi MMP on ratkaiseva askel ECM hajoamista, joka indusoi solujen invaasiota. Tulokset osoittivat, että α-Solaniini tukahdutetaan mRNA MMP-2, MMP-9, ENOS, EMMPRIN ja CD44 annoksesta riippuvaisella tavalla. Proteiini MMP-2 ja MMP-9 myös tukahdutettiin annoksesta riippuvalla tavalla (kuviot. 4B, 4D). Gelatiinitsymografialla määritys osoitti myös, että MMP-9 ja MMP-2 toiminta oli merkittävästi vähentää 6 ja 9 ug /ul α-Solaniini (kuviot. 4E, 4F). Lisäksi, α-Solaniini säätele ilmentymisen E-kadheriinin (kuviot. 4C, 4D), mikä voi lisätä adheesiota solujen välillä. Näin ollen, α-Solaniini voi estää etäpesäkkeiden vaikuttamalla proteolyyttisen aktivaation ja liima-kapasiteettia.

(A) mRNA: n MMP-2/9, EMMPRIN, CD44, ENOS ja Ecadherin esitettiin keskiarvoina ± S.E.M. kolmen itsenäisen kokeen. (B) Ilmauksia MMP-2 ja MMP-9-proteiinia analysoitiin Western blot. (C) Ilmauksia on Ecadherin proteiinin suoritettiin Western blot. (D) kvantifiointi Western blot tulokset suoritettiin laskemalla arvon suhde kontrolliryhmään. (E) aktiivisuutta MMP-2 ja MMP-9 analysoitiin gelatiinitsymografialla. (F) kvantifiointi gelatiinitsymografialla tulokset tehtiin laskemalla arvon suhde kontrolliryhmään. * P 0,05, ** p 0,01, verrattuna kontrolliin. GAPDH käytettiin latauskontrollina.

5. α-Solaniini säädelty Associated Signaling Proteiinit

Tutkimus osoitti, että Wnt /β-kateniinin, Akt /mTOR ja JAK /STAT reittejä ovat mukana ilmaus MMP ja asiakkuutta etäpesäke. α-Solaniini indusoidun ilmentymisen fosforylaation β-kateniinin ja inhiboi fosforylaatiota STAT3 annoksesta ja ajasta riippuvalla tavalla (kuviot. 5). Tiedot osoittivat myös, että α-Solaniini vähensi fosforylaatiota Akt ja mTOR annoksesta ja ajasta riippuvaisella tavalla (kuviot. 6). Lisäksi α-Solaniini alassäädetty tasolle β-kateniinin ja TCF-1 nucleus (kuviot. 7). Näin ollen, α-Solaniini voi tukahduttaa solujen invaasiota ja MMP-2/9 ilmentymisen osittain kautta estämällä Wnt /β-kateniinin, Akt /mTOR ja JAK /STAT reittejä.

PANC-1-soluja käsiteltiin eri annoksilla α-solanine 24 tuntia, tai 9 ug /ul α-solanine varten 6,12,18,24 h. Fosforylaation taso β-kateniinin (A, B), Stat3 (C, D) määritettiin Western blot. GAPDH: ta käytettiin latauskontrollina. (E, F, G, H) kvantifiointi Western blot tulokset tehtiin laskemalla arvon suhde kontrolliryhmään. * P 0,05, ** p 0,01, verrattuna kontrolliryhmään.

PANC-1-soluja käsiteltiin eri annoksilla α-solanine 24 tuntia, tai 9 ug /ul α- solaniini varten 6,12,18,24 h. (A, C) fosfory- taso Akt ja mTOR määritettiin Western blot. GAPDH: ta käytettiin latauskontrollina. (B, D) kvantifiointi Western blot tulokset tehtiin laskemalla arvon suhde kontrolliryhmään. * P 0,05, ** p 0,01, verrattuna kontrolliryhmään.

PANC-1-soluja käsiteltiin eri annoksilla α-solanine 24 tuntia. (A, C) taso NF-KB /p65, β-kateniinin ja TCF-1 nucleus määritettiin Western blot. Laminb1 käytettiin tumaproteiini loading ohjaus. (B, D) kvantifiointi densitometrinen tulokset tehtiin laskemalla arvon suhde kontrolliryhmään. * P 0,05, ** p 0,01, verrattuna kontrolliryhmään.

6. α-Solaniini vähensi Expression of NF-KB /p65 in Nucleus of PANC-1 solut

Suhteellinen ydin- taso NF-KB /p65 in PANC-1-soluissa määritettiin käyttämällä Western blot -määritys. Olemme havainneet, että käsittelemällä α-Solaniini merkittävästi decreasd ekspressiota NF-KB: n /p65: n in PANC-1-soluissa (kuviot. 7A, 7B). Konstitutiivisen NF-KB voi edistää soluproliferaatiota, estävät solujen apoptoosia, ja säätelevät geenien ilmentymistä, jotka liittyvät angiogeneesiin. Näin α-Solaniini voisi parantaa estämällä solujen kasvua ja lisääntymistä ja edistää haiman syövän solujen apoptoosia estämällä ilmentymistä NF-KB: n.

7. α-Solaniini vaimentaa in vivo kasvu haimasyövän Cell PANC-1 tuumoriksenografteja

anto solaniini että nude-hiirten esti ksenografti kasvua PANC-1 kasvain (kuviot. 8). Lopussa 14 päivän tutkimuksen PANC-1 ksenografti, solaniini vähentynyt kasvaimen tilavuus /hiiri 701,97 ± 157,86 mm

3 kontrolliryhmän 273,54 ± 57,27 mm

3, mikä vastaa 61% (P 0,05) väheneminen tuumorin paino. Havaitsimme oli vähän lasku kehon paino sekä kontrolliryhmässä ja solaniini käsitellyssä ryhmässä. Syynä on, että ei ole vielä selvää.

PANC-1-soluja ihon alle ruiskutettiin paljaiden hiirien kylkiin. Kun kasvaimet olivat mitattavissa, hiiriä annettiin DMSO: ssa tai α-solanine varten 2 viikkoa. (A) Kasvaimen tilavuus /hiiri, koska ajan funktiona. (B) Hiiren kunkin ryhmän seurattiin ruumiinpainoa kerran päivässä. Tarkoittaa kehon paino /hiiri, koska ajan funktiona. (C) Kasvaimen tilavuus /hiiri ja (D) tuumorin paino /hiiri lopussa tutkimuksen analysoitiin. * P 0,05, verrattuna kontrolliryhmään.

8. α-Solaniini vaimentaa etäpesäke, Cell Proliferation ja Angiogeneesi ksenoqraftit Model

MMP-2 ja MMP-9 on keskeinen asema prosessissa etäpesäkkeiden keskuudessa MMP. Tutkimme haiman -tuumoriksenografti Western blot ja löysi α-Solaniini voidaan merkittävästi vähentää MMP-2 ja MMP-9 (kuviot. 9A, 9B). Proliferaation ja angiogeneesin ovat kaksi laajalti käytetty biomarkkereita, joita on käytetty mittaamiseen aggressiivisuus kiinteitä kasvaimia. Siten kasvaimet analysoitiin anti-leviämisen ja anti-angiogeneesin α-Solaniini by PCNA ja VEGF värjäys kautta immunohistokemiallisia menetelmiä. PCNA värjäys ja VEGF värjäys kasvaimia oli huono immuunivaste solaniini hoidetussa ryhmässä verrattuna hallita ryhmään (kuviot. 9B, 9C). Kvantifiointia osoitti 78 ± 4% PCNA-positiivisten solujen kontrolliryhmässä verrattuna 29 ± 3% solaniini hoidetussa ryhmässä osuus pieneni 63% (p 0,01), ja keskimääräinen IOD VEGF värjäys suoritettiin 70%: n lasku (p 0,01) in solaniini hoidetussa ryhmässä verrattuna kontrolliryhmään. Tämä tutkimus vahvisti kasvaimia in vivo torjuvaa mekanismi solaniini tehosta vastaan ​​PANC-1 kasvaimen kasvua.

Kun tuumoriksenografteja oli erotettu, osaa kasvaimen käytettiin Western blot ja immunohistokemia. (A) Ilmaisut MMP-2 ja MMP-9-proteiinin analyzede Western blotilla. (B, C) Kasvaimen tissus oli innunohistochemically analysoitiin PCNA-positiivisia soluja ja VEGF värjäys tiheys. Edustavia valokuvia IHC värjäytymisen PCNA ja VEGF: ään 400 x suurennoksilla. Mitta-asteikko: 50 um. Tiedot esitetään keskiarvona ± SE. * P 0,05, ** p 0,01, verrattuna kontrolliryhmään.

Keskustelu

α-Solaniini on eräänlainen steroidi alkaloideja, jotka on tuotettu kasveista sloanaceae perheen . Korkea pitoisuus α-Solaniini voi tuottaa sytotoksisia vaikutuksia, jotka indusoivat nopeasti vahinkoa solukalvon aiheuttaa tappavan häiriö aineenvaihdunnan [26]. Useat tutkimukset osoittavat, että α-Solaniini estää preimplantaatioal- alkionkehityksen [27], [28], ihmisen normaalit maksasolut [22]. Lisäksi, α-Solaniini on osoitettu vähentävän sytokiinin ja typpioksidi-tuotantoa Con A-indusoidun Jurkat-solut ja LPS-stimuloiduissa Raw makrofageissa [24], estävät tuumorinekroositekijä-α (TNF-α) ja interleukiini (IL) -6 hiiren peritoneaalimakrofageille johtuen tukahduttaminen p38, JNK ja ERK1 /2 [29]. Viimeaikaiset tutkimukset ovat osoittaneet, että α-Solaniini suorittaa antituumoriteholla, kuten rajoittamiseen leviämisen syöpäsolulinjoissa ja apoptoosin indusoimiseksi ja vähentää p53: n mutaatio mahalaukun syövän solulinjat [22], [23], [30]. Tässä tutkimuksessa käytimme ei-toksinen pitoisuus α-Solaniini (3, 6 ja 9 ug /ul), ja havaitsivat, että α-Solaniini estää etäpesäkkeiden in vitro, kuten invaasio, siirtymän ja angiogeneesiä, mikä osoittaa, että inhiboiva vaikutus α-Solaniini on etäpesäkkeitä ei ollut sen sytotoksisen funktion. Ensin arvioitiin tehoa α-Solaniini in vivo ja löysi α-Solaniini voi estää proliferaatiota, angiogeneesiä ja etäpesäkkeiden -tuumoriksenografti kateenkorvattomissa nude-hiirissä.

Syöpä etäpesäke on monitahoinen prosessi, joka geneettisesti epästabiili syöpäsoluja kehittää sopeutumista ja ecesis kudokseen mikroympäristölle joka on etäällä primaarikasvaimen [31], johon menetys soluadheesiota, lisääntynyt maahanmuutto ja invaasio, kierto verisuoniston /imunestejärjestelmään ja itävyys siirtomaa kasvaimia kaukaisiin kohtiin [32], [33] . Hajoamista ECM ja BM proteolyyttisten entsyymien ja nojalla hyökkäys ovat välttämättömiä etäpesäke [34]. MMP ovat tärkeitä proteolyyttisiä entsyymejä, jotka hajottavat ECM ja BM. Niistä, MMP-2 ja MMP-9 ovat erittäin ilmaistaan ​​haimasyövän [35]. Esto haiman syöpäsolumetastaasi välittämän vähen- tämisessä ilmentymistä MMP-2 ja MMP-9: [36], [37]. EMMPRIN, stimuloiva peritumoraalista fibroblastit tuottamaan MMP, suoritetaan erityinen voimakasta ilmentymistä haimasyövän solussa [38]. Haiman syöpäsoluinvaasiota ja etäpesäkkeiden voitaisiin vaimentaa kautta anti-EMMPRIN hoito [39]. CD44, läpäisevä glykoproteiini, jossa sitovat toimialueet hyaluronihappoa, joka on olennainen osa ECM, ilmentyy vahvasti haimasyövän [40].