Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

Devil Kasvojen Kasvainten Disease (DFTD) on ainutlaatuinen klonaalinen syöpä, joka uhkaa maailman suurin lihansyöjä pussieläin, Tasmanian paholainen (

Sarcophilus harrisii

) sukupuutto. Tämä tarttuvien syöpä on kulunut yksittäisten perkeleitä soluistutusryhmä aikana sosiaalinen vuorovaikutus. Kasvain tuli esiin Schwannin solun yhden paholaisen yli 15 vuotta sitten ja siitä lähtien on laajentunut kloonaamalla, osoittamatta merkkejä monistus vanhenemista; jyrkässä ristiriidassa somaattisen solun, joka näyttää rajallinen kapasiteetti replikointiin, joka tunnetaan nimellä ”hayflickin raja”.

Menetelmät /Principal Havainnot

Tässä tutkimuksessa tutkimme roolin telomeeripituuden mitattuna Telomeeri Kopioi numero (TCN), ja telomeraasi ja shelterin geenin ilmentymisen, sekä telomeraasiaktiivisuus ylläpitämisessä hyperproliferaatio Devil kasvojen Kasvaimen (DFT) soluja. Tuloksemme osoittavat, että DFT solut ovat lyhyitä telomeres. DFTD TCN ei eroa eri maantieteellisillä alueilla tai kantojen välillä. Kuitenkin TCN on lisääntynyt ajan myötä. Rajoittamaton soluproliferaatiota on todennäköisesti saatu aikaan havaitun säätely ylöspäin katalyyttisen alayksikön telomeraasin (

TERT-

) ja samanaikainen aktivointi telomerase. Up-regulation keskeinen osatekijä shelterin,

TRF1

-intercating Nukleaaritekijä 2 (

TINF2

) tarjoaa DFT mekanismin telomeeripituuden homeostaasiin. Korkeampi ilmentymä molemmat

TERT-

ja

TINF2

voi myös suojata DFT soluja genomin epästabiilisuuden ja parantaa kasvaimen leviämisen.

Johtopäätökset /merkitys

DFT soluja näyttävät valvoa ja säädellä pituus yksittäisten telomeres: eli lyhyempiä telomeres venytetään jopa sääntelyn telomeraasi liittyvien geenien; pidempi telomeres suojataan lisävenymistä jäsenten shelterin monimutkainen, mikä voi selittää puute paikkatietojen ja kannan vaihtelua DFT telomeerivasta kopiomäärä. Havaittu pitkittäinen kasvu geeniekspression DFT kudosnäytteistä ja telomeraasiaktiivisuus DFT solulinjoissa voi osoittaa valinta vakaampi kasvaimia, joilla on korkeampi proliferaatiopotentiaali.

Citation: Ujvari B, Pearse AM, Taylor R, Pyecroft S , Flanagan C, Gombert S, et ai. (2012) Telomeeri Dynamics ja Homeostasis on tarttuvien Cancer. PLoS ONE 7 (8): e44085. doi: 10,1371 /journal.pone.0044085

Editor: Gabriele Saretzki, Newcastlen yliopisto, Yhdistynyt Kuningaskunta

vastaanotettu: 14 tammikuu 2012; Hyväksytty: 31 heinäkuu 2012; Julkaistu: 29 elokuu 2012

Copyright: © Ujvari et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus rahoittivat Eric Guiler Fund (Save the Tasmanian Devil Appeal): https://www.tassiedevil.com.au/tasdevil.nsf/Grants- -scholarships/F3F98304778C800ECA2576CB007D1E6B, ja Australian Research Council: https://www.arc.gov.au/. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

maailman suurin lihansyöjä pussieläin, Tasmanian paholainen (

Sarcophilus harrisii

) on viime aikoina tullut uhanalaisia ​​takia ainutlaatuinen tarttuvien syöpä, Devil kasvojen Kasvainten Disease (DFTD) [1], [ ,,,0],2], [3]. Ennen syntymistä tauti, paholaiset oli yleinen koko Tasmania. Koska ensimmäinen näköhavainto DFTD vuonna 1996, tauti on levinnyt koko saarivaltio, jolloin väestö vähenee jopa 90% [3]. Tautia esiintyy nyt yli 80% paholaisen maantieteellinen alue, ja väestön nopea väheneminen on johtanut siihen, Tasmanian paholainen on listattu uhanalaisiksi kansainvälisten (Kansainvälinen luonnonsuojeluliitto [4]) sekä kansallisten ja valtion viranomaiset [ ,,,0],5].

DFTD lähetetään yksilöiden välillä puremalla aikana sosiaalinen vuorovaikutus [6] ja tavaraluetteloja brutto pahanlaatuisten kasvainten ympärillä suuontelon, jossa usein etäpesäkkeitä muihin elimiin [7], [8]. Johtuen nälkään, toissijaisten tulehdusten ja elinhäiriöt, paholaiset yleensä periksi tauti 6 kuukauden kuluessa kasvaimen syntymistä [1], [7]. Sytogeneettinen analyysit ovat osoittaneet, että DFTD johtuu roistovaltiot kloonattu solulinja, [9], joka on todennäköisesti peräisin soluista hermostopienan linjan (Schwannin solut) [8], [10]. Vaikka DFTD hallussaan erittäin jäsensi genomi, ja on ominaista kasvainspesifin monimutkainen toiselle siirtäminen ja kromosomi uudelleenjärjestelyt, solulinja on huomattavan (kromosomiin) vakaa [9]. Viime aikoina on kuitenkin neljä, läheistä sukua mutta karyotypically erillisiä DFT kantoja on tunnistettu, mikä viittaa siihen, että kasvain kehittyy [11], [12]. Huolimatta neljä erillistä DFT kantoja, geneettiset tutkimukset käyttäen microsatellite ja immuuni-geenimerkkejä ovat osoittaneet, että Devil kasvojen Kasvaimen (DFT) solut ovat geneettisesti identtisiä [10], [13], [14], [15].

Koska niiden syntyminen vuonna 1996 [9] DFT solut ovat läpikäyneet jatkuvaa jako ja eteneminen tuhansissa perkeleitä eikä riittänyt niiden kyky lisääntymään ja vaarantamatta niiden genomista vakautta. Sen sijaan normaalin ihmisen somaattisten solujen näyttää rajallinen kapasiteetti replikaation, joka tunnetaan nimellä ”hayflickin raja” [16]. Eli kun tietty määrä rajapintoja, solujen pakokaasun niiden Replikoitumattoman potentiaali johtuen lyhentää telomeres ja siirtyä tilaan tunnetaan monistus vanhenemista. Hyperproliferatiivisissa sairaudet, kuten tuumorigeneesiä, kun telomere poistuma saavuttaa kriittisen tason, solut kirjoita kasvuvaiheessa pidätys nimitystä ”kriisi” [17], [18], [19]. Jopa säätelevä tai uudelleen käyttöön telomere terminaalitransferaasientsyymiä entsyymi (telomeraasi), syöpäsolut pystyvät ilmenevät ”kriisi” tilassa ja ylläpitää telomeres jotka ovat hieman pidempiä kuin havaittu ”kriisi” [17], [20].

Telomeres ovat ribonukleoproteiini- komplekseja päissä eukaryoottisten kromosomien olennaista säätelyssä solussa elinkaari [18]. Niiden ensisijainen tehtävä on varmistaa oikea kromosomi erottelu mitoosin aikana, ja estää kromosomi fuusio ja samanaikainen solukierron pidätyksen aiheuttama loppuun kromosomien kohdellaan DNA double-säikeen katkoksia [21]. Selkärankaisilla, kuten Pussiahma, telomeres koostuvat vaihteleva määrä tandem-toistojen (TTAGGG nukleotidia) sitoo erikoistunut multiproteiinikompleksissa tunnetaan shelterin [22], [23]. Telomeeripituuden homeostaasin iturataan ja kasvaimen soluihin saavutetaan negatiivinen kierre on shelterin monimutkainen ja telomeerien terminaalitransferaasientsyymiä entsyymi [24]. Telomerase aktivoituu pluripotenttien alkion ja aikuisen kantasoluja, pidättämään progressiivisen telomere poistuman lisäämällä TTAGGG toistaa 3’lohkon kromosomeja [24]. Useimmat ihmisen kasvainsolulinjoja on vakaa telomere asetuksia, jotka saavutetaan negatiiviseen säätelyyn telomerase jonka shelterin monimutkainen [25]. Shelterin monimutkainen koostuu kolmesta shelterin alayksiköstä:

TRF1, TRF2

ja

POT1

, jotka on kytketty toisiinsa kolme ylimääräistä proteiineja

TPP1, RAP1

ja

TINF2

.

TINF2

(

TRF1

-interacting Nukleaaritekijä 2, tai kutsutaan myös

TRF1

-Interacting Nuclear proteiini 2 (

TIN2

)) on keskeinen asema proteiinin kompleksi, antamalla sillan alakomponentit shelterin (katsausta varten katso [26]). On osoitettu, että alhainen ilmentyminen

TINF2

on epävakautta shelterin [27], [28]. Koska keskeinen ja kriittinen rooli

TINF2

”(

TIN2

) in shelterin vakautta päätimme mitata tämän geenin ilmentyminen, proxy on shelterin aktiivisuuden.

kertyminen shelterin pitkin telomeerisesti toista array ehkäisee telomeraasin aiheuttamaa telomere pidentymisen [23]. Ihmisen syövän tutkimukset ovat osoittaneet, että yhteinen säätely ylöspäin telomerase ilmaisun ja geenien shelterin kompleksi voi helpottaa vakauttamaan syöpäsolujen estämällä aktivoituminen DNA-vaurion vasteita, kuten apoptoosin [27]. Noin 85% ihmisen syövissä, telomeraasiaktiivisuuden on osoitettu helpottavan pahanlaatuisiksi ylläpitämällä replikatiivista potentiaalia [29], [30]. Jäljellä 10-15% syövistä, ehkäisy telomere menetys saavutetaan ilman telomeraasiaktiivisuuden kautta rekombinaation välittämän malli kytkentämekanismi tunnetaan vaihtoehtoisia pidentäminen telomeres (ALT) [31]. Niinpä kasvainsolut pystyvät pakenemaan apoptoosin ja siten ylläpitää ääretön replikaatiokykyä.

DFTD solulinja on jatkuvasti jakamalla ja sopeutuminen microenvironment kunkin eri isäntä yli 15 vuotta. Siksi tämä kloonaamalla leviävä tauti tarjoaa ennennäkemättömän mahdollisuuden tutkia syöpäsolun kehittyminen ja eteneminen

in vivo

. Lisääntynyt tieto telomere homeostaasin tässä tarttuvien syöpä voi tarjota uusia oivalluksia miten DFT soluihin saavuttaa ja säilyttää hyperproliferatiivisia mahdollisuudet ja voi auttaa meitä ymmärtämään alkuperän, somaattinen kehitys ja satunnaisia ​​onnistumisen loisten klonaalisen linjaa. Lisäksi sekä

TERT-

ja

TINF2

on ehdotettu mahdollisina terapeuttisina kohteina ihmisen syövässä [32], [33] ja lisätä ymmärrystämme rooli näiden geenien Devil kasvojen Kasvain Disease voi avata uusia mahdollisuuksia sairauksien hoidossa.

Tässä tutkimuksessa olemme keskittyneet roolista telomeeripituuden, määrällisesti telomeeri Copy Numbers (vastedes TCN) in liikakasvuun DFT näytteitä. Likiarvoina telomeraasiaktiivisuutta kasvainten kudosnäytteistä selvitimme ilmaus katalyyttisen alayksikön telomeraasin (

TERT-

) ja yksi pääkomponentit shelterin,

TRF1

-intercating Nukleaaritekijä 2 (

TINF2

). Lisäksi ajalliset muutokset telomeraasiaktiivisuutta kvantitoitiin viiden DFT solulinjoissa.

Tulokset

(a) Telomeeri restriktiofragmentin pituuden analysoi

Telomeeri restriktiofragmentti (TRF) pituus oli analysoitiin sekä ensimmäisen metastastatic kasvaimet sekä perna näytteitä neljästä Pussiahma (yhteensä 12 näytettä). Emme voineet antaa telomeeripituuden kaikissa 12 näytettä, kun restriktiodigestiotuotteista tuottanut useita toistuvia TRF-tahroja eri pituisia (jotka vaihtelevat 2 kbps asti 18 kbps) (kuva 1).

Sample nimet kuvaavat keräyshetkellä (10 = 2010). Identtiset luvut edustavat erilaisia ​​kudosnäytteitä kerätään samasta eläimestä, S kuvaa perna ja T esittää DFT näytteitä. MWM sanoista molekyylipainomarkkereita. CTRL 1 tarkoittaa alhaisen molekyylipainon kontrolli-DNA (pituus: 3,2 kbp), CTRL 2 osoittaa suuren molekyylipainon kontrolli-DNA (pituus: 10,2 kbp). Ohjaus näytteet toimitetaan Telo TAGGG TL Assay Kit ja peräisin kuolemattomia solulinjoja.

(b) suhteellinen telomere toista kopiomäärä

Kaikkiaan 65 kudosnäytteitä, kerätään 17 paikkakunnalla poikki Tasmania (Bothwell, Bronte Park, Buckland, Fentonbury, Forestier, Freycinet, Hamilton, MT William, Narawntapu, RAILTON, Ravenswood, Reedy Marsh, Sorell, St. Marys, Weegena, Wisedale ja Länsi Pencil Pine, kuva 2), sisällytettiin suhteellisen telomere toista kopiomäärä analyysi. Perna, keuhkojen ja kasvainten näytteet omasivat merkittävän TCN vaihtelua (Kruskal Wallis testi: T = 17,1, P = 0,0007, DF = 3); kasvaimia (sekä ensimmäisen ja metastaattinen) osoittaa pienin (keskiarvo = 3,21 ± 3,28) ja perna korkein (keskiarvo = 12,52 ± 4,62), kun taas keuhko näytteet osoittivat väli- TCN (keskiarvo = 8,03 ± 2,04, kuva 3). Posthoc Conover-Inman testi (saatavana StatsDirect) ei paljastanut mitään merkittävää eroa TCN välillä keuhkoissa ja pernassa (P = 0,52), välillä keuhkojen ja etäpesäkkeiden (P = 0,08), välillä ensisijainen kasvaimia ja etäpesäkkeitä (P = 0,52). Sama testi ei kuitenkaan paljasta merkittävää eroa TCN välillä keuhko- ja ensisijaisen kasvaimia (P = 0,006), välillä perna ja kasvaimen (P = 0,0001), ja välillä perna ja etäpesäkkeiden (P = 0,01).

Kasvaimen eteneminen vuoteen 2003 mennessä kuvattu katko-, vuoteen 2005 katko–pilkullinen ja vuoteen 2007 pisteviivoilla. Päivämäärät osoittavat etenemistä päivämäärät DFTD. Sijainti lyhenteet: Bo = Bothwell, Br = Bronte Park, Bu = Buckland, Fen = Fentonbury, For = Forestier, Fre = Freycinet, Ham = Hamilton, MTW = Mt William, Na = Narawntapu, Ra = RAILTON, Rav = Ravenswood, Re = Reedy Marsh, S = Sorell, StM = St. Marys, Me = Weegena, Wi = Wisedale, WPP = Länsi Pencil Pine.

Virhepylväät kuvaavat standardipoikkeamat. Näyte nimet osoittavat keräyshetkellä (06 = 2006, 07 = 2007 10 = 2010). Identtiset luvut edustavat erilaisia ​​kudosnäytteitä kerätään samasta eläimestä. Näytteiden lukumäärä käytetään analyysissa: ensisijainen kasvaimia kerätty 2006: N = 30, 2007: N = 13 ja 2010: N = 8; etäpesäke: N = 4, perna: N = 5, keuhko: N = 5.

(c) Ajallinen (pitkittäinen) maantieteellinen ja kannan vaihtelua TCN

Kruskal-Wallis testi paljasti huomattavan ajallista vaihtelua TCN näytteiden vuonna 2006, 2007 ja 2010 (T = 7,66, P = 0,02, DF = 2) ja posthoc ja Conover-Inman paljasti merkittäviä eroja TCN välillä vuosina 2006 ja 2007 ( P = 0,03) ja 2006 ja 2010 (P = 0,01), mutta ei merkittävää eroa TCN välillä havaittiin vuosina 2007 ja 2010 (P = 0,6). Jälkeinen hoc merkitsee siten ehdottaa ajallinen lisäys TCN (kuva 4).

Virhepylväät kuvaavat standardipoikkeamat. Merkittävät erot telomeeri- kopioida numeroita (TCN) havaittiin välillä vuosien 2006 ja 2007 (P = 0,03) ja 2006 ja 2010 (P = 0,01), mutta ei merkittävää eroa TCN välillä havaittiin vuosina 2007 ja 2010 (P = 0,6). * Tarkoittaa merkittäviä eroja.

Emme kuitenkaan noudata mitään merkittävää eroa TCN joukossa kolme maantieteellisten alueiden (Itä, Keski, North-West) (Kruskal Wallis testi: T = 1,75, P = 0,42, DF = 2), eikä yksi neljästä eri kannat (Kruskal Wallis testi: T = 2,1, P = 0,56, DF = 3).

(d) TERT- ja TINF2 ilmaisun

Devil

TERT-

ja

TINF2

ilmentyminen merkitsevästi säädellään ylöspäin primaarikasvainten verrattuna pernan keskimäärin kertoimella 14,63 P 0,0001 (Std. Error (SE) vaihtelee välillä 4,5 ja 37,8) ja 37,86 P 0,0001 (SE vaihtelee välillä 4,6-272,9), vastaavasti (kuvio 5).

TERT-

ja

TINF2

ilme osoitti huomattavaa vaihtelua kasvaimen näytteitä. Emme kuitenkaan noudata mitään merkittävää yhteyttä välillä TCN ja

TERT

tai

TINF2

ilmaisua kasvain näytteissä (Spearmanin, R = -0.31, P = 0,36, N = 11 R = -0,05, p = 0,88, N = 11, vastaavasti).

lukumäärä käytettyjen näytteiden analyysi: kasvaimet N = 11 ja pernan N = 5. stippled vaakasuorat viivat kuvaavat keskimääräinen suhteellinen geenin ilmentymistä, boxplots osoittavat erilaisia ​​keskivirheen ja baareja kuvaavat 95%: n luottamusväli.

kasvaimia, ilmentymistason

TINF2

oli merkittävästi pienempi kuin

TERT

(kaksipuolisen Mann-Whitneyn U-testi; U = 27, P = 0,03, mediaani

TINF2

= 0,51, mediaani

TERT

= 3.58). Huolimatta ero ilmentymistason havaitsimme merkittävää yhdistyksen välillä

TERT-

ja

TINF2

(Spearmanin R = 0,83, P = 0,0017, N = 11). Olemme myös havainneet huomattavan ajallista vaihtelua

TERT-

ja

TINF2

ekspressiotasot kuin molemmat

TERT-

ja

TINF2

osoitti huomattavasti ekspressiotasot vuonna 2010 verrattuna 2007 (Kaksi puolinen Mann-Whitneyn U-testi, U = 28, P = 0,0173 ja U = 28,5, P = 0,013, vastaavasti;

TERT

mediaani 4,77 ja 2,44, vastaavasti;

TINF2

mediaani 2,84 ja 0,47, vastaavasti, kuvio 6).

Avoimet pylväät kuvaavat TERT ilme, mustat palkit kuvaavat TINF2 ilme. Näytteiden lukumäärä käytetään analyysissa: kasvaimet kerättiin vuonna 2007: N = 5 ja 2010: N = 6. * kuvaa merkittäviä eroja (P = 0,0173 ja p = 0,013, tässä järjestyksessä).

(e ) telomeraasiaktiivisuus määritys

telomeraasiaktiivisuus havaittiin viidessä DFT solulinjan näytteitä. Lisäksi positiivinen ajallinen muutos havaittiin telomeraasiaktiivisuutta (yhteensä tuotetusta tuotteesta) 2003-2011 (Spearmanin, R = -0.9, P = 0,037, N = 5, kuva 7).

Viisi solulinjat ovat peräisin kasvain kerätyistä näytteistä vuosina 2003, 2006, 2007, 2010 ja 2011. Pylväät edustavat keskivirheet toisistaan ​​teknisen toistojen (N = 3).

keskustelu

Kuten monet ihmisen syövistä [34], [35], Devil kasvojen Kasvaimet lyhyet telomeerit.

TERT

geeniekspressiota säädelty 15-kertaisiksi DFT soluissa verrattuna pernasoluihin ja telomeraasiaktiivisuus on läsnä DFT solulinjoissa. Tämä telomeraasiaktiivisuutta estää DFT soluja pääsemästä monistus vanhenemista, ja yhdessä puute kromosomin ulkopuolisessa telomeerisen DNA (Pearse pers. Com) DFT karyotyyppejä, osoittaa kohti telomeraasia ylössäätöä, ei vaihtoehtoista pitkittymiseen telomeres (ALT), ensisijaisena mekanismi DFT kuolemattomia [31].

korkea ilmaus

TINF2

, negatiivinen säätelijä telomeraasiaktiivisuuden [23], DFT soluissa viittaa siihen, että telomere pidentyminen on tarkasti säädeltyä tämä syöpä. DFT solut näyttävät valvoa ja säädellä pituus yksittäisten telomeres eli lyhyempiä telomeres venytetään mukaan telomeraasiaktiivisuutta; pidempi telomeres suojataan lisävenymistä jonka shelterin monimutkainen [27].

Lisääntynyt

TERT-

ja

TINF2

ilmaisu todennäköisesti selittää puute alueellista vaihtelua DFT TCN. Myös TCN ei eroa DFTD kantoja. Kuitenkin ajallinen lisäys

TERT-

ja

TINF2

geenien ilmentyminen ja entsyymin aktiivisuus voi olla yhteydessä kasvuetua ja lisääntynyt syövän etenemisen DFT, koska se on ihmisen syövissä [34], [ ,,,0],36], [37].

lyhyt telomeres ja ylössäätöä telomeraasi todennäköisesti vaikuta toisiaan vastaan. Lyhyen telomeres johtaa lisääntyneeseen geneettinen epävakaus mutta telomeraasin aktivointi helpottaa kasvaimen kasvua joko estämällä edelleen kromosomi epävakauteen tai kiertämällä tarkastuspisteiden jotka tunnistavat huonosti telomeres [37]. Pidemmät telomere pituudet voivat onnistumisen varmistamiseksi ja selviytymistä DFT solujen vakauttaa kromosomi uudelleenjärjestelyt ja estämään genomista epävakauteen.

DFT näytteet omasivat jatkuvasti alemmat TCN verrattuna muihin kudoksiin, mutta huomattava (16-kertainen) keskuudessa-näyte vaihtelu TCN havaittiin. Methodological haasteita, mikä johtui todennäköisimmin keskeytymisen telomeerinen toistoja restriktiopaikkoineen (yhteinen piirre marsupial kromosomien) [38], estänyt meitä korreloivat vaihtelusta kopioluvun vaihtelua telomeeripituuden.

TERT-

ja

TINF2

RNA-tasot eivät liittävät TCN, toteaminen havaittu myös muissa ihmisen syövän solulinjat [39].

Future tutkimus pitäisi tutkia vaikutuksia telomeeripituuden vaihtelua kasvaimen kunto. Onko evoluution optimaalinen noin telomeeripituuden? Älä valikoiva voimat ylläpitää telomeeripituuden tasapainon tai valikoida kasvainsolujen pidemmillä telomeres? Nostavat

TERT

,

TINF2

geenien ilmentyminen, telomeraasiaktiivisuutta ja pidempään telomeres johtaa kehitystä vakaamman DFT muodossa, nopeammasta kasvusta ja proliferaatiopotentiaali?

lähtien ensiesiintyminen 15 vuotta sitten, DFTD on kulkenut tuhansia paholaiset, tappaen lähes 80%: lla eläimistä, eikä niille monistus vanhenemista. DFTD edustaa siis yksi vanhimmista luonnollisesti elävä ja jatkuvasti kuljetettiin solulinjoja luonnossa. Olemme osoittaneet, että dynaaminen vuorovaikutus telomeraasikompleksin ja shelterin kompleksi on olennaista onnistumisen loistaudit, tarttuvat syöpä. Valinta on edistänyt etenemistä DFT solujen lisääntynyt telomere kopio numerot sekä lisääntynyt geenien ilmentyminen ja telomeraasiaktiivisuus, molemmat voivat lopulta johtaa nopeampaan kasvava kasvain. DFTD tarjoaa tehokkaan mallijärjestelmä ymmärtää tuumorigeneesiä paitsi luonto vaan myös ihmisen syövissä. Lisätutkimukset keskittyen ymmärtämään tarkka mekanismi telomeerien huolto- ja sääntelyn DFT soluissa johtaa paremmin ymmärtämään evoluution strategioiden ja mekanismit ja ylläpitää rajaton proliferaatiopotentiaali syöpäsoluja.

Materiaalit ja menetelmät

(a) näytteet

Tissue kerättiin 17 eri puolilla Tasmania (Bothwell, Bronte Park, Buckland, Fentonbury, Forestier, Freycinet, Hamilton, MT William, Narawntapu, RAILTON, Ravenswood, Reedy Marsh, Sorell, St. Marys, Weegena, Wisedale ja Länsi Pencil Pine, kuvio 1), jonka jäsenet Department of Primary Industries, Parks, Vesi ja ympäristö (DPIPWE) välillä lopetettiin DFTD vaikuttaa paholaisia ​​ja varastoitava Animal Health Laboratories (DPIPWE) . Tutkimus toteutettiin hyväksyntää DPIPWE (Department of Primary Industries, Parks, Vesi ja ympäristö, Tasmania) eläinten eettisen comitte, Animal Ethics No: 101 2010/11. Saimme kudosnäytteitä 48 paholaisia. Meillä oli pääsy perna ja primaarikasvaimen sekä etäpesäkkeiden näytteitä neljästä paholaisia. 51 ensisijainen kasvaimia, viisi etäpesäkkeet, neljä keuhko- ja viisi perna DNA-näytteet käytettiin analyyseissä (kuva 2).

Tutkiakseen maantieteellinen /alueellinen vaihtelu telomeerin kopioluvun näytteet jaettiin kolmeen maantieteelliseen alueet (East = jakelu ennen 2003 Central = jakautuminen 2003-2005 ja Luoteis-= jakautuminen 2005-2007), joka perustuu ajallisen /spatiaalinen etenemistä DFTD poikki Tasmania [40]. Meillä oli tietoa spesifisiä kantoja 45 kasvain näytteet ja käyttää nämä näytteet tutkimaan telomeerivasta kopioluvun vaihtelua DFT kantoja.

ajallista vaihtelua telomeeri- vaihtuvuuden perustui kopiolukuina havaittu kerätyistä näytteistä 2006, 2007 ja 2010 (N = 51). Johtuen Näytekokoelmatodistuksen menettelyjä olimme vain pystyä purkamaan RNA viisi perna ja 11 (5 vuodesta 2007 ja 6 vuonna 2010) primäärikasvain näytteitä, jotka analysoitiin myöhemmin kanssa Quantitative Real-Time PCR.

telomeraasiaktiivisuutta määritykset suoritettiin viisi lyysattiin DFT solulinja saatujen näytteiden DPIPWE. Kasvaimen solulinjat ja pidettiin DPIPWE mukaan kuvaukset Pearse et al 2012 [11]. Viisi solulinjat ovat peräisin kasvain kerätyistä näytteistä vuosina 2003, 2006, 2007, 2010 ja 2011.

(b) DNA: n eristämiseksi, telomeerivasta fragmentti pituus mittauksia ja telomeerivasta kopioluvun kvantitointi

Perimän DNA eristetty kudosnäytteistä fenoli-kloroformiuutolla. Näyte-DNA-määrä ja laatu mitattiin käyttämällä NanoDrop Spektrofotometri (NanoDrop Technologies, Wilmington, DE).

(c) Telomeeri restriktiofragmentin pituus analyysit (TRFL) B

Telomeeri restriktiofragmentti (TRF) pituus kvantitoitiin Southern blot hybridisaatiolla seuraavat protokollaa hahmoteltu Telo TAGGG TL Assay Kit (Roche, Indianapolis, iN) käyttäen vakiokentässä elektroforeesia. Sen jälkeen pilkkomalla genomi-DNA: ta, jossa on seos

Hinf

I ja

Rsa

I restriktioentsyymeillä poistaa sekvenssi-erilaiset DNA: n sentromeerisesti puolelta telomeres, telomeeripituuden analysoitiin agaroosigeeleillä, jotka ajettiin 4 tuntia 5 V /cm. TRF-fragmentit leimattiin digoxigen leimattu koetin, ja TRF kuvat sittemmin kehitetty korkean suorituskyvyn kemiluminesenssin kalvo (Amersham Bioscience, Waukesha, WI).

(d) kvantitatiivinen PCR suhteellisten telomere kopioluvun

Suhteellinen telomere toista kopiomäärä analysoitiin kvantitatiivinen PCR (Q-PCR), kuten on kuvannut Cawthon [41]. Telomere spesifisiä alukkeita adoptoitiin Cawthon [41], tel1: 5’GGTTTTTGAGGGTGAGGGTGAGGGTGAGGGTGAGGGT -3 ’; Puhelin2, 5’-TCCCGACTATCCCTATCCCTATCCCTATCCCTATCCCTA -3 ’.

RPLP0

(kutsutaan myös

36B4

) geeni valittiin yhden kopion geenistä mukaisia ​​menetelmiä Cawthon [41], ja yksi kopio esiintyminen geenin Tasmanian Devil genomi [42] vahvistettiin etsimällä genomin vaihtoehtoisia kopioita geenistä. Mitään vaihtoehtoista

RPLP0

kopioita tai pseudogeenien löytynyt.

RPLP0

geenin alukkeet suunniteltiin perustuen Tasmanian Devil genomin [42], käyttämällä Primer3Plus verkkosivuilla (https://www.bioinformatics.nl/cgi-bin/primer3plus/primer3plus.cgi),

RPLP0_F

: 5’CTTCCCGTTCACCAAAGAAG -3 ’ja

RPLP0_R

: 5’TGTTCTGGACTGGCAAAGTG -3 ”. Q-PCR-reaktiot suoritettiin RotorGene6000 (Qiagen, Germantown, MD) 15 ul: n kokonaistilavuudessa, joka sisälsi 7,5 ui Qiagen 2xQuantifast SYBR Green PCR master mix (Qiagen, Germantown, MD), 0,5 uM eteenpäin ja taaksepäin-alukkeita (jäljempänä optimaalinen alukekonsentraatiot) ja 1 ui gDNA (1 ng /ul pitoisuus). Q-PCR-olosuhteita sen mukaan, mikä valmistajan protokollan: 95 ° C 5 min denaturoinnin jälkeen 40 sykliä 95 ° C 15 s ja 60 ° C: ssa 30 s (hehkutus lämpötila). Fluoresenssisignaali oli hankittu hehkutus lämpötilassa. Standard dikäyrät sarjaliikennearkkitehtuureihin 01:05 (

RPLP0

) ja 01:10 (Telomeeri) laimennoksia yhdistetty näyte, joka sisältää yhtä suuret määrät DNA: perna ja kasvainkudoksen otteita. Kaikki laimennokset suoritetaan kolmena kappaleena. Standard käyrät oli R

2 0,985 (

RPLP0

reaktio: R

2 = 0,985 ja Telomeeri reaktio R

2 = 0,997) ja sisälsivät vähintään neljä (Telomeeri reaktio) tai viisi (

RPLP0

reaktio) laimennokset laimennussarja lineaarisella dynaaminen alue on vähintään 3 suuruusluokkaa ja oli PCR tehokkuutta välillä 1,3 ja 1,1 (vastaavasti). Kaikki näytteet ajettiin neljänä ja kaikki Cq arvot tuntemattomia kuuluu lineaarisen määrällisesti alueella asianmukaisen standardin käyriä. Ohjelman Rest [43], käytettiin laskettaessa normalisoitua kertamuutos kohdegeenin verrattuna viite-geenin. Tämä ohjelma paketti korjaa myös eri reaktion tehokkuutta. Tilastollinen merkitys (P 0,05) määritettiin Pari Wise Kiinteä uudelleenjako Satunnaistamisessa Test © kuten kuvataan Pfaffl

et al.

[43].

(e) RNA ja määrällisesti telomeraasin ilmaisun kvantitatiivisella RT-PCR: llä

RNA uutettiin kudosnäytteistä käyttämällä yhdistelmää Trizol (Sigma, St. Louis, MO) ja Qiagen RNeasy mini -kittiä (Qiagen, Germantown, MD). RNA laatu ja määrä kvantitoitiin Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent, Santa Clara, CA). Genominen DNA poistettiin RNA-näytteet, joita DNAasi I AMPD1 Kit (Sigma, St. Louis, MO), ja cDNA syntetisoitiin kanssa QuantiTect Reverse Transcription Kit (Qiagen, Germantown, MD). Telomerase alukkeilla ulottuu eksonin rajoja suunniteltiin katalyyttinen proteiini alayksikköä paholaisen

TERT

geeni käyttäen Primer3Plus verkkosivuilla (https://www.bioinformatics.nl/cgi-bin/primer3plus/primer3plus.cgi)

TERT

-F: 5’TGCTGTAGTCCAGAAGAATGC -3 ’, ja

TERT

R: 5’TGCAGGGAAGAGGTTTCTTG -3 ”.

TRF1

-interacting Nukleaaritekijä 2 (

TINF2

) alukkeet suunniteltiin poikki eksonit 6 ja 7

TINF2

-F: 5’TTGCCCTGACTCAGTATTGC -3 ’, ja

TINF2

R: 5′-GGATCCTGGAAAACTTGCTC -3 ’. Kaksi geeniä,

GAPDH

(

qGAPDH

) ja

GUSB

(

qGUSB

) käytettiin Normaliser geenien jälkeen, kuvauksen Murchisonin et al. [ ,,,0],10], [14]:

qGAPDHf

: 5′- GACTCAACCACGTATTCGGCTC -3’and

qGAPDHr

: 5’ATATGATTCCACCCATGGCAAGTTCAA -3 ’;

qGUSBf

: 5′- CTGCTGCCTATTATTTCAAGAC -3’and

qGUSBr

: 5′-CAAGATCCAATTCAGGCTTAG -3 ”. Q-PCR-reaktiot suoritettiin RotorGene6000 (Qiagen, Germantown, MD) 15 ul: n kokonaistilavuudessa, joka sisälsi 7,5 ui Qiagen 2xQuantifast SYBR Green PCR master mix (Qiagen, Germantown, MD), 0,5 uM eteenpäin ja taaksepäin-alukkeita (jäljempänä optimaalinen alukekonsentraatiot) ja 1 ui cDNA: ta (5 ng /ul pitoisuus). Käänteiskopioijaentsyymiä negatiivinen ja cDNA negatiiviset näytteet ajettiin rinnalla cDNA näytteitä valvonta havaitsemiseksi genomista DNA saastuminen ja alukedimeerin kokoonpanoissa. Q-PCR-olosuhteita sen mukaan, mikä valmistajan protokollan: 95 ° C 5 min denaturoinnin jälkeen 40 sykliä 95 ° C 15 s ja 60 ° C: ssa 30 s (hehkutus lämpötilassa, AT). Fluoresenssi signaali hankittiin AT. Arvioimaan spesifisen monistamisen lopullinen sulamiskäyräanalyysi (AT enintään 99 ° C), lisättiin jatkuvasti fluoresenssimittauksissa. Standard dikäyrät käyttämällä sarja- 01:05 laimennoksia yhdistetty näyte, joka sisältää yhtä suuret osat cDNA näytteistä tuotettu perna ja kasvainkudoksen RNA otteita. Kaikki laimennokset suoritetaan kolmena kappaleena. Standard käyrät oli R

2 0,99 (

GUSB

reaktio: R

2 = 0,998,

TERT

reaktio: R

2 = 0,990 ja

TINF2

reaktio: R

2 = 0,993) ja sisälsivät vähintään neljä (

TERT

reaktio) tai viisi (

GUSB

ja

TINF2

reaktioita) laimennokset laimennussarja lineaarisella dynaaminen alue on vähintään 3 suuruusluokkaa ja oli PCR tehokkuutta välillä 0,98 ja 1,4 (

GUSB

: 1,1,

TERT

: 1,4 ja

TINF2

: 0,98). Kaikki näytteet ajettiin neljänä ja kaikki Cq arvot tuntemattomia kuuluu lineaarisen määrällisesti alueella asianmukaisen standardin käyriä. Ohjelman Rest [43], käytettiin laskettaessa normalisoitua kertamuutos kohdegeenin verrattuna viite-geenin. Tämä ohjelma paketti korjaa myös eri reaktion tehokkuutta. Tilastollinen merkitys (P 0,05) määritettiin Pari Wise Kiinteä uudelleenjako Satunnaistamisessa Test © kuten kuvataan Pfaffl

et al.

[43].

(f) Telomerase määritys

Telomeraasiaktiivisuus mitattiin käyttämällä TRAPEZE-RT telomeraasin detektioreagenssipakkaus (Millipore, Bedford, MA). Solut lyysattiin 200 ui CHAPS-puskuria, ja proteiinipitoisuus määritettiin kvantitatiivisesti käyttämällä Pierce BCA Protein Assay Kit (Thermo Scientific, Rockford, IL). Alikvootit solulysaattia (250 ng proteiinia /kuoppa) tutkittiin kolmena kappaleena. Standardit, inaktivoitu näytteitä, ja ei-mallin reaktiot olivat mukana myös määrityksessä laadunvalvontaa. Reaaliaikainen monistukset suoritettiin RotorGene6000 monivärinen reaaliaikainen PCR-tunnistus järjestelmä (Qiagen, Germantown, MD). Standardikäyrä muodostetaan TSR8 ohjaus mallin seuraten valmistajan ohjeita.