Krooninen sairaus

tiivistelmä

Anteriorinen Gradient Protein (AGR-2) on raportoitu olevan yli-ilmentynyt monissa epiteelisyövissä ja edistää etäpesäke. Selkeä mekanismi sen havaittu toiminta (t) ei ole aiemmin tunnistettu. Löysimme merkittävää voimistumista AGR-2 ilmentymistä luuston metastaattinen eturauhassyövän solulinjaa, PC3 jälkeen viljelemällä luuytimestä kunnostettu alusta. Merkittävät AGR-2: n ilmentymisen vahvistettiin myös eturauhassyövän kudosnäytteiden potilailla, joilla on luuston vaurioita. Kehittämällä vakaa klooneja PC3-solujen eritasoisia AGR-2 ilmaisun tunnistimme, että kumoamisen AGR-2 vähensi merkittävästi solujen fibronektiiniin tarttumisen, kollageeni I, kollageeni IV, laminiini I ja fibrinogeeni. Menetys soluadheesion liittyi jyrkkä lasku ilmaus α4, α5, aV, β3 ja β4 integriinit. Jättäminen apoptoosiin seuraavat irtoaminen on tunnusmerkki epiteelin syövän etäpesäkkeiden. AGR-2-vaimennettu PC3-solut osoittivat suurempi vastustuskyky tuumorinekroositekijä liittyviä apoptoosi- indusoiva ligandi (TRAIL) indusoi apoptoosia

in vitro

. Tämä havainto tuki myös vähensi merkitsevästi kaspaasi-3 ilmentymisen AGR-2-vaiennetaan PC3-soluissa, joka on avainefektori sekä ulkoisten ja sisäisten kuolema signalointireitteihin. Nämä tiedot viittaavat siihen, että AGR-2 vaikutus eturauhassyövän etäpesäkkeiden säätelyn soluadheesiota ja apoptoosin.

Citation: Chanda D, Lee JH, Sawant A, Hensel JA, Isayeva T, Reilly SD, et al. (2014) Anterior Gradient proteiini-2 on Regulator Cellular Adhesion eturauhassyövässä. PLoS ONE 9 (2): e89940. doi: 10,1371 /journal.pone.0089940

Toimittaja: Lucia R. Languino, Thomas Jefferson University, Yhdysvallat

vastaanotettu 22 lokakuuta, 2013 Hyväksytty: 25 tammikuu 2014; Julkaistu: 27 helmikuu 2014

Copyright: © 2014 Chanda et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: taloudellinen tuella National Institutes of Health myöntää R01 AR560948, R01 CA133737 ja P30 AR046031 on kiitollisena arvostaa. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Dr. Raj Singh on työntekijä Vivo biotieteiden Inc. Ei ole patentteja, kehitteillä tai kaupan tuotteiden julistaa. Tämä ei muuta tekijöiden noudattaminen kaikki PLoS ONE politiikan tietojen jakamista ja materiaaleja.

Johdanto

Eturauhassyöpä on korkein esiintyvyys kaikista syövistä miehillä kehittyneissä maissa ja on kolmanneksi yleisin kuolinsyy takana keuhko- ja paksusuolen ja peräsuolen syöpiä [1]. Eturauhassyövän ja sen etuoikeutettujen etäpesäke luun ja muut elimet säätelee geenien, jotka toimivat yhteistoiminnassa edistämiseksi kunkin vaiheen syövän synnyn ja metastaattisen Cascade [2] – [4]. Vaikka selvä geeni allekirjoitukset koskevat vaiheissa syövän etenemistä on raportoitu rintasyövän, kuten tietoa eturauhassyövän puuttuu edelleen [5]. Tunnistaminen roolia uusien molekyylien diagnostisten ja terapeuttisten merkitys on edelleen merkittävä painopiste nykyisen syöpätutkimukseen. By geeniekspressioanalyysissä, havaitsimme merkittävää lisäämisen AGR-2 on PC3 eturauhassyöpäsolulinja, metastasized luun, seuraava huolto normaalissa luuytimestä kunnostettu alusta. AGR-2 tunnistettiin ensin XAG-2

Xenopus laevis

, joka stimuloi niiden erilaistumista sementin rauhanen, joka auttaa alkioiden pysyvät kiinni pohjamaa läpi erityksen mucinous aine [6]. Nisäkkään homologi, AGR-2, on proteiini-isomeraasi (PDI), joka sisältää tio-redoxin domain ja vastaavat suolen liman tuotantoon [7]. Joilta puuttuu AGR-2 ovat alttiita kehittämään paksusuolentulehduksen [7]. AGR-2 on kiinnittänyt paljon huomiota viime vuosina sen otaksuttu rooli neoplastisen etenemisen ja etäpesäkkeiden [8] – [15]. AGR-2 on havaittu olevan yli-ilmentynyt eri adenokarsinooman ja on yhteydessä heikkoon säilymiseen sairastavien potilaiden rinta- ja eturauhasen syöpiä [16], [17]. Harvat viimeaikaiset raportit ovat valottavat säätelyelementit AGR-2-toiminto, mutta sen erityinen rooli (t) kasvainten synnyssä ja etenemisessä etäpesäkkeiden puuttuu edelleen [18] – [20]. Eturauhasen syöpä, AGR-2 on raportoitu androgen indusoituvan vain yli-ilmentynyt aikana alkuvaiheessa syövän [13], [21]. Päinvastoin, tuoreessa tutkimuksessa havaittiin myös vähensi AGR-2: n ilmentymisen in high grade kasvaimia, jotka samaan aikaan etäpesäkkeitä [13].

Tässä tutkimuksessa käytetty AGR-2 geenien menetelmän luun metastasoivaa ihmisen eturauhassyövän solulinja PC3 ymmärtää sen biologisen toiminnan eturauhassyövän luuhun etäpesäke. Tulokset osoittivat menetys AGR-2 in PC3-soluissa johti merkittävään vähenemiseen kasvaimen soluadheesiota, menetys ilmaisun α4, α5, aV, β3 ja β4 integriinien ja kehittäminen apoptoosin vastus, mikä viittaa rooli AGR-2 metastasoitunutta Cascade eturauhasen syöpää vaikuttamalla kasvain soluadheesion ja muuttoliike.

Materiaalit ja menetelmät

Solulinjat ja reagenssit

osteolyytti- ihmisen eturauhassyövän solulinjaa, PC3, hankittiin ATCC (Manassas , VA), ja klonaalisen johdannainen PC3-solujen, jotka ilmentävät tulikärpäsen lusiferaasi, oli antelias lahja tri Kenneth J. pientä (University of Michigan, Ann Arbor, Michigan). Molemmat solulinjat pidettiin RPMI-1640-alustassa (Mediatech Inc. Hendron, VA), johon oli lisätty 10% naudan sikiön seerumia (Mediatech Inc.) ja penisilliiniä /streptomysiiniä (Mediatech Inc.). Kokonais-RNA eristettiin käyttämällä Trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA) ja puhdistettiin käyttämällä QIAGEN mini kit (Valencia, CA). cDNA mikrosiruanalyysi suoritti Cancer Genomics Shared Resources klo Winship Cancer Center of Emory University (Atlanta, GA) käyttäen Illumina Beadstation 500 ja tulokset analysoitiin JAVA Puunäkymäikkuna, Spotfire, Gene Cluster 3.0 ja kekseliäisyyttä polku analyysi. iScript cDNA-synteesi kit ostettiin Bio-Rad (Hercules, CA). AGR-2-alukkeita (eteenpäin 5′-TTGGGGTGACCAACTCATCT-3 ’; Reverse 5’GGACAAACTGCTCTGCCAAT-3’) ja RT-PCR-analyysi suunniteltiin käyttäen Primer 3 (versio 4.0) ohjelmisto ja oligonukleotidit hankittiin Integrated DNA Technologies, Inc. (Coralville, IA). cDNA Näytteet analysoitiin Bio-Rad iCycler (Hercules, CA). 3-ulotteinen (3-D) PC3 helmiä kasvua luuytimessä väliaine kertyi seuraavan kasvun PC3 solujen hu-biogeelillä matriisit ja toimittama Vivo Biosciences (Birmingham, AL). Vybrant ® MTT proliferaatiomääritystä Kit ostettiin Molecular Probes, Inc. (Eugene, OR). 3-D Culture Matrix ™ tyvikalvon uute ostettiin Cultrex (3445-00501, Gaithersburg, MD). Cytoselect ™ 48-kuoppaisen soluadheesioanalyysissä kit hankittiin Cell Biolabs, Inc. (CBA-070, San Diego, CA). Kaikki sarjat ja reagensseja käytettiin valmistajan ohjeiden mukaisesti.

Vasta-aineet

Hiiren ja ihmisen monoklonaalisia vasta-aineita, ja polyklonaalisia vasta-aineita AGR-2 hankittiin Abcam Ltd (Cambridge, MA, ja niitä käytetään yhdellä laimentaminen 1:1000 varten Immunoblottien ja 1:500 IHC). Integriini-vasta-sampleri pakkaus ostettiin Cell Signaling (4749S, Danvers, MA, ja niitä käytettiin laimennoksena 1:1000 varten Immunoblottien ja 1:500 IHC). Kaspaasi-3-, katkotun kaspaasi-3 ja beeta-aktiini-vasta-aineet hankittiin Cell Signaling (Danvers, MA, ja niitä käytettiin laimennoksena 1:500 varten immunobloteista). Toissijainen immuno-tunnistus suoritettiin käyttäen vuohen anti-rotta /hiiri /kaniinin IgG ABC sarjat ostettu Vector Laboratories (Burlingame, CA) ja GE Healthcare (Buckinghamshire, UK). Immunofluoresenssitutkimuksia sekundääridetektio, vuohen anti-rotta /hiiri /kaniinin IgG leimattu Alexa-Fluor-594 ostettiin Molecular Probes, Inc. (Eugene, OR, 2 ug /ml).

ihmisestä otettujen kudosnäytteiden

Bone metastaattinen eturauhassyöpä kudosta saatiin ruumiinavaus University of Alabama at Birmingham mukaisesti hyväksyttyjen Institutional Review board (IRB) protokollaa. Formaliinifiksoidusta parafiiniin kudosblokeista saada näistä lähteistä leikeltiin 6 pm. Kaikki kudosnäytteet tarkistetaan ja tyypillistä board-sertifioitu anatomiset patologia.

eristäminen luuydinrekisteri ilmastoiduissa Medium

Male C57BL /6 hiiret uhrattiin ja sekä reisiluun ja sääriluut kerättiin ja luuytimen oli huuhdotaan steriilillä seerumittomalla SIGMA Stemline väliaineessa (St Louis, MO) käyttämällä 28,5 gaugen neulaa asennettu 1 ml: n ruiskuun 50 ml steriiliin putkeen, joka sisälsi 10 ml seerumitonta Stemline väliaineessa. Luuytimen möhkäleitä poistettiin toistuvalla kulkee 16,5 gaugen neulan asennettu 10 ml: n ruiskuun, kunnes saadaan homogeeninen yksittäinen solususpensio on saavutettu. Solut pelletoitiin sentrifugoimalla 1200 rpm: llä, pestiin kolme kertaa käyttäen seerumittomalla alustalla ja suspendoitiin lopuksi uudelleen 50 ml: aan Stemline, joka sisälsi 10% naudan sikiön seerumia ja antibiootteja. Solut laimennetaan edelleen seerumia sisältävässä Stemline väliaineen 100 ml: aan ja jaettiin neljään 150 cm

2 cell-viljelypulloissa (Corning Inc. Corning, NY) huollon kosteassa kammiossa 95% O

2 ja 5% CO

2 tarjontaa. Kahden päivän kuluttua elatusaine kerättiin talteen ja sentrifugoitiin suurella nopeudella päästä eroon solujen ja jätteiden. Supernatantit yhdistettiin ja käytettiin suoraan kulttuurin 3-D, PC3 helmiä.

rakentaminen Rekombinantti shRNA Vector ja kehittäminen Single Cell johdettujen PC3 kloonien AGR-2 Knockdown

Kaksikymmentä yhden emäsparin tavoitteet valittiin ainutlaatuinen alueiden AGR-2 koodaussekvenssi käyttäen Tuschl et al., 1999 siRNA suunnitteluohjeet [22]. Niistä testattu shRNA sekvenssit, yksi, joka osoitti suurimman tehoa käytetään esillä olevassa tutkimuksessa ja ne koostuivat 21-meeri sense (GACAAACACCTTTCTCCTGAT) ja anti-sense-juosteet, joita erottaa 9-bp alueella, ja se sisälsi BamHI tai Hindlll-restriktiokohdat, vastaavasti , suunnattuun kloonaamiseen (Integrated DNA Technologies, Coralville, IA). Oligonukleotidit hybridisoitiin ja suoraan ligoitiin pRNAT.U6 /Neo /GFP-ekspressioplasmidin (Genescript, Piscataway, NJ). Yksi 21-mer-sekvenssit (CCTTGAGACTTGAAACCAGAA) joka epäonnistui hiljentää AGR-2 ilmaisua käytettiin kokeellista ohjaus minimoimaan off-tavoite vaikutus. PC3-soluja viljeltiin 6-kuoppaisille levyille noin 90% konfluenssiin antibiootteja väliaineessa. Sitten solut transfektoitiin AGR-2 shRNA ekspressoivien plasmidien käyttäen Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA) valmistajan ohjeiden mukaisesti. 24 tunnin kuluttua transfektion väliaine korvattiin täydellistä elatusainetta ja toiset 24 tuntia, GFP-positiiviset solut virtauksen lajitellaan ja ylläpidetään ennalta standardoitu 600 ug /ml neomysiiniä (10131, GIBCO, Invitrogen, Carlsbad, CA). Kun neomysiinille resistentit solut kehitetty, solut trypsinoitiin ja uudelleen maljattiin 96-kuoppaisille viljelymaljoihin 1 solu /kuoppa taajuudella, kahtena rinnakkaisena. AGR-2 taintumisen PC3 klooneja (PC3

AGR-2SH) ja valvonta-solukloonien (PC3

Ohjaus) valittiin testauksen jälkeen AGR-2 ilmaisun kautta western blotting ja immunofluoresenssilla analyysejä.

sTRAIL- indusoima apoptoosi Analyysit

Rekombinantti ihmisen TNF-sukuinen apoptoosia indusoiva ligandi (TRAIL) hankittiin EMD Millipore Corporation, Temecula, CA. PC3

Ohjaus ja PC3

AGR-2SH soluja käsiteltiin 0, 12,5, 25, 50 ja 100 ng /ml pitoisuus TRAIL. Solujen elinkelpoisuus määritettiin jälkeen 12 tunnin ja 72 tunnin by propidiumjodidivärjäys (BD Biosciences) ja MTT proliferaatiomääritystä Kit vastaavasti. Käsitellyt solut kerättiin myös sen jälkeen, kun 0 h, 1 h, 3 h ja 6 h, jonka solu kaavinta, solupelletit pestiin kaksi kertaa jääkylmällä PBS: llä ja altistettiin Western blotting havaitsemiseksi kaspaasi 3 ja aktiivisen pilkottiin kaspaasi-3 peptidejä.

Western-blottaus

Solut trypsinoitiin, pestiin ja suspendoitiin uudelleen proteiinin lyysipuskuria ennen niiden jäädytys-sulatettiin kerran -80 ° C: ssa. Proteiinit denaturoitiin lisäämällä SDS-PAGE-puskuria, joka sisältää β-merkaptoetanolia ja inkuboimalla 95 ° C: ssa 5 min. Genomi-DNA leikattiin ultrasonikoimalla. Proteiinikonsentraatiot mitattiin Lowryn menetelmällä (Biorad, Hercules, CA). Proteiinit erotettiin joko 10 tai 15% polyakryyliamidigeelillä ja siirrettiin nitroselluloosakalvolle. Kaivoa inkuboitiin 1 tunnin ajan, 2% rasvatonta kuivamaitoa, TBST estää ei-spesifisen primaarisen vasta-aineen sitoutumisen. Sitten membraania inkuboitiin yön yli sopivasti laimennettua primaaristen vasta-aineiden TBST-puskurissa. Beeta-aktiini-vasta-ainetta käytettiin lastaus ohjaus. Jälkeen 3 kertaa pese TBST: ssä, membraania inkuboitiin vuohen anti-hiiri /kani IgG: llä konjugoituna piparjuuriperoksidaasiin (1:5000, Agilent Technologies, Santa Clara, CA) 30 minuutin ajan. Kalvo pestiin jälleen TBST ja kehitettiin käyttäen parannetun kemiluminesenssi reagenssia (GE Healthcare Bio-Sciences Corp. Piscataway, NJ) ja kuvattiin on Fuji LAS-3000 kemiluminesenssin kehittäjä.

Immunofluoresenssikoe

molemmat PC3

ohjaus ja PC3

AGR-2SH soluja kasvatettiin viljelmässä, kunnes 50% konfluenssiin vuonna Chambered dioja, pestiin perusteellisesti PBS: ssä ja kiinnitettiin jääkylmässä 3,7% paraformaldehydillä PBS: ssä, joka sisälsi 0,1% Triton-X-100 , 20 min, huoneen lämpötila. Solut pestiin perusteellisesti ja inkuboitiin yön yli 4 ° C: ssa rotan monoklonaalinen ihmisen AGR-2-vasta-aine. Seuraavat PBS pesun, soluja inkuboitiin Alexa-fluori-594 leimattua anti-rotta-IgG: tä (Molecular Probes, Eugene, OR), 30 minuutin ajan, huoneen lämpötilassa. Solut pestiin ja tumat värjättiin DAPI kontrastin. Fluoresoiva leimattuja soluja asennetaan käyttäen Vectashield (Vector Labs, Burlingame, CA) ja tarkastella Leica DMRB fluoresenssimikroskoopilla.

Histomorfometria ja immunohistokemia

Pehmytkudokset fiksoitiin 10% neutraalissa buffered- formaliiniliuokseen 48 tuntia ennen parafiiniin histologista analyysiä. Bone kudokset kalkki 0,5 mol /l EDTA Ca

2 + – ja Mg

2 + vapaata Dulbeccon PBS (Cellgro) ennen parafiiniin. Kuusi pm pitkittäinen sarja leikattiin reisiluusta ja sääriluu ja värjättiin hematoksyliinillä ja eosiinilla (H Becton Dickinson labware) seerumittomassa väliaineessa kolmena kappaleena. Käynnistää siirtoa 10% FBS käytettiin kemiallis-houkutin alemmassa kammiossa. Soluja inkuboitiin 6 tuntia 37 ° C: ssa ja poistetaan ylemmästä kammiosta pumpulipuikolla. Solujen alapuolella kammion visualisoitiin fluoresenssimikroskoopilla ja laskettiin käyttäen Image J ohjelmisto. Vaikutus AGR-2 hiljentäminen on PC3 solujen vaeltamiseen esitettiin suhteelliset arvot verrattuna kontrolliin (100%).

Tilastollinen analyysi

Tiedot analysoitiin Studentin

t

-testata. Arvot edellyttäen ovat keskiarvo ± SEM ja eroja pidettiin merkittävinä, jos p 0,05.

Tulokset

AGR-2 ilmentyminen lisääntyy metastaattisessa syöpäsolujen läsnäolossa Pakattu luuydinrekisteri microenvironment

Bone etäpesäke on tunnusmerkki eturauhassyövän levittäminen, joka tarjoaa ihanteelliset puitteet tutkia etäpesäkkeiden näiden syöpäsolujen sisällä mikroympäristön ja nimenomaan molekyylitasolla signaaleja, jotka edistävät niiden selviytyminen metastaattisen kapealla. Selvittämiseksi jos vastausten tällaisia ​​signaaleja mikroympäristössä muuttaa AGR-2 ilmentymistä eturauhasen syöpäsolujen PC3-soluja kasvatettiin 3-ulotteinen palloset ja ylläpidetään 3 päivänä luuytimestä kunnostettu alusta. Kokonais-RNA eristettiin näistä soluista ja altistettiin cDNA microarray-analyysi (kuvio 1A), joka vahvistettiin myöhemmin reaaliaikaisella kvantitatiivisella RT-PCR: llä (Gene Expression Omnibus, GEO liittymistä # GSE38714; NCBI seurantajärjestelmä # 16589736). AGR-2 oli yli-ilmentynyt merkitsevästi (p 0,05) verrattuna PC3-soluja viljeltiin säännöllisesti väliaineessa (kuvio 1 B), mikä viittaa siihen, AGR-2 saatetaan tarvita alustava mukauttamista etäpesäkekasvainten solujen uuden mikroympäristössä. AGR-2-ilmentyminen määritettiin myös luun metastaattisen eturauhassyövän kudosnäytteestä. Intense AGR-2: n ilmentymisen havaittiin, mikä viittaa vaatimus AGR-2 perustamaan luumetastaasin (kuvio 1 C).

. cDNA microarray lämpö kartan korkeamman AGR-2: n ilmentymisen (punainen) PC3-soluissa kasvatettu luuytimessä elatusaine verrattuna säännölliseen keskipitkän (vihreä). B. Reaaliaikainen RT-PCR-data osoittaa merkittävän (p 0,05) lisäys AGR-2: n ilmentymisen PC3-soluissa kasvun normaalin luuytimen väliaine (BMCM) verrattuna siihen, kun kasvatetaan säännöllisesti väliaineessa (RM). C. immunohistokemiallinen analyysi, joka osoittaa voimakas AGR-2 immunovärjääminen ihmisen eturauhasen syöpäsolujen metastasized luuhun (alkuperäinen suurennos 400x).

määritys AGR-2 mRNA Expression erilaisissa Eturauhassyöpäsolulinjat

Suhteellinen AGR-2-mRNA: n ilmentyminen määritettiin luun metastaattisen PC3, LNCaP ja C4-2B ihmisen eturauhassyövän solulinjoissa ja aivojen metastaattinen DU145 eturauhassyöpä-solulinjaa RT-PCR: llä. Tulokset osoittavat huomattavasti korkeampi AGR-2 ilmaisun PC3, LNCaP ja C4-2B solulinjoissa verrattuna DU145 solulinjaan, mikä viittaa merkitys AGR-2 eturauhassyövässä luumetastaasipotilailla (kuvio 2A).

. AGR-2-tasot määritettiin RT_PCR analyysin ihmisen eri eturauhassyövän solulinjoissa. Luun metastaattinen PC3-soluissa on korkein AGR-2 mRNA ilmaisu, kun taas aivojen metastaattisen DU145 soluissa on vähiten AGR-2: n ilmentymisen. B. kehittäminen AGR-2 vaiennetaan PC3-soluissa. Western Blot-analyysi osoittaa merkittävää säätelyä alaspäin AGR-2-proteiinin seuraavat vakaa käyttöönoton shRNA konstruktio kohdistaminen AGR-2 in PC3-soluissa. beeta-aktiini käytettiin latauskontrollina. C. Immunofluoresenssianalyysi verrataan AGR-2 ilmentymisen AGR-2 vaiennetaan PC3-soluissa verrattuna ohjaus PC3-solut (Original suurennos 400X).

määritys AGR-2 Expression PC3

Ohjaus ja PC3

AGR-2SH Cell Lines

määrä AGR-2 geenien PC3

Ohjaus ja PC3

AGR-2SH soluissa arvioitiin Western-blottauksella (kuvio 2B) ja immunofluoresenssivärjäyksen (kuvio 2C ). Yli yhdeksänkymmentä prosenttia alas-säätely AGR-2 ilmentyminen saavutettiin PC3

AGR-2SH soluissa kuin PC3

Verrokkisoluja.

Altered kasvuominaisuudet PC3 Cells jälkeen AGR-2 geenien

Kun PC3-solujen eritasoisia AGR-2 ilmaisun analysoitiin

in vitro

, ei ollut merkitsevää eroa leviämisen hinnat välillä PC3

AGR-2SH ja PC3

Ohjaus solulinjoissa (kuvio 3A). Kuitenkin yksikerrosviljelmissä, PC3

Ohjaus solut näyttivät olevan fibroblastien kaltainen ja lujasti kiinni muovi- pinnalle. Solut löyhästi kytketty toisiinsa ja vain kautta pseudopodial laajennuksia. PC3

AGR-2SH solut toisaalta ylläpidetään enemmän epiteelin ilmiasuun pyöristetty tai cuboidal morfologia ja muodostivat mukulakivikadut ulkonäkönsä kun konfluentteja. Toisin kuin PC3

Verrokkisoluja, PC3

AGR-2SH solut näyttivät löyhästi kiinni muovi- pinnalle (kuvio 3B).

. MTT soluproleferaatiomäärityksessä osoittavat samanlaisia ​​kasvuvauhdin PC3

ohjaus ja PC3

AGR2sh soluja. B. PC3

säätökennoja (yllä) esittää fibroblastien kaltainen ulkonäkö valejalka kaltainen laajennus solu-kontakteja. PC3

AGR2sh soluja (alla) osoitti enemmän epiteelisolujen kaltaisia, pyöristetty fenotyyppi. Nämä solut myös löyhästi kiinnitetty viljelymaljoihin verrattuna kontrollisoluihin. Vihreä fluoresenssi oikeaan paneelien näkyy sekä PC3

ohjaus ja PC3

AGR2sh solujen konstitutiivisesti nimenomaista GFP koska läsnäolo GFP ilmentävien kasetti vektoreita käytetään luomaan ohjaus- ja AGR-2-vaiennetaan PC3 solulinjoissa.

AGR-2 edistää solujen Adhesion

Kun PC3

Ohjaus ja PC3

AGR-2SH soluja verrattiin niiden kyvyn suhteen sitoutua eri soluväliaineen (ECM) proteiineja, kuten fibronektiiniä, kollageenia I, kollageenia IV, laminiini ja fibrinogeeni hyödyntäen soluadheesioanalyysissä kit, tulokset osoittivat merkittävä väheneminen kyky PC3

AGR-2SH solujen pysyvät kiinni kaikkien osien ECM testattu. PC3

AGR-2SH tarttumisen fibronektiiniin oli maksimaalisesti vähentynyt (70%) muiden ECM-proteiinien, osoittaa AGR-2 vaikuttaa reitti (t), joka edistää solujen adheesiota (kuvio 4A).

. Tartuntaominaisuudet PC3

ohjaus ja PC3

AGR2sh solut arvioitiin seuraavia kasvun viljelymaljoilla päällystää erilaisilla ECM proteiineihin. Ensimmäinen, solut ympättiin kahtena kappaleena päälle päällystettyjen substraattien ja annettiin kiinnittyä. Seuraavaksi sitoutumattomat solut pestiin pois ja tarttuneet solut kiinnitettiin ja värjättiin. Lopuksi väriä uutettiin ja kvantitoitiin kolorimetrisesti. Vähennetään merkittävästi soluadheesiota fibronektiiniin (*** p 0,001), kollageeni I (** p 0,01), kollageeni IV (*** p 0,001), laminiini (* p 0,05) ja fibrinogeeni (* p 0,05) havaittiin tapauksessa PC3

AGR2sh soluissa kuin PC3

ohjaus soluja. BSA-päällystettyihin kuoppiin käytettiin reagenssin ohjaus (p 0,1). Tässä esitetyt tiedot ovat keskiarvo ± SEM. B. Merkittävät alas-säätely α4, α5, aV, β3 ja β4 integriinien havaittiin PC3

AGR2sh soluja verrattuna PC3

ohjaus soluja. Mitään eroa β1 integriinin tasot havaittiin kahden solutyypeissä. Beeta-aktiini käytettiin lastaus ohjaus. Useita proteiininauhat läsnä blotit sisältävät integriiniä esiaste ja kypsät proteiinit sekä katkaistun tuotteiden odotetaan molekyylimassa mukaan valmistajan tiedot (Cell Signaling Technology, Cat # 4749S).

Menetys integriinin ekspressioon PC3 Solut Puuttuvat AGR-2

integriini heterodimeerejä eri yhdistelmissä tiedetään välittävän soluadheesion ECM ja niillä on tärkeä rooli kasvaimen kasvua ja etäpesäkkeiden [23]. Sen määrittämiseksi, modulaatioina AGR-2 tasossa kasvaimen kasvun aikana ja etäpesäkkeiden liittyy muuttuneisiin integriinin tasoja ja toiminta, päätimme ilmaus paneelin integriinien (α4, α5, aV, β1, β3, β4, β5 integriinit) PC3

AGR-2SH ja PC3

Verrokkisoluja Western-blottauksella. Vähensi merkitsevästi ilmaus α4, α5, aV, β3 ja β4 integriinien havaittiin PC3

AGR-2SH soluissa. Vertailukelpoinen määriä β1-integriinin tasot havaittiin molemmissa solulinjoissa taas mitään β5 integriinin havaittu kummassakaan solulinjassa. Tämä data viittaa vahvasti rooli AGR-2 säätelyssä soluadheesiota kautta integriinin ilmentymisen. (Kuvio 4B).

Alennettu tuumorisolun Migration in AGR-2-vaiennetaan PC3 Cells

Voit selvittää pienentää soluadheesiota ja integriini ilmaisun AGR-2-vaiennetaan PC3-solut vaikuttavat PC3 solu muuttoliike, sekä ”haavan” määritys sekä Boyden kammio migraatiokokeessa suoritettiin. Tulokset osoittavat merkittävästi vähentynyt (p 0,01) kasvaimen solujen vaeltamiseen in AGR-2-vaimennettu PC3-soluissa verrattuna ohjata PC3-soluja. Molemmat määritykset ehdottaa myös soluadheesion kautta integriinin ilmentyminen on ratkaisevaa kasvaimen solujen vaeltamiseen (kuvio 5 A B).

Korkea AGR-2 ilmentävien PC3

säätökennoja ja matalan AGR-2 ilmentävien PC3

AGR-2SH soluja kasvatettiin 6 hyvin viljelymaljalle jopa 90% konfluenssiin. Ne seerumia yön yli ja annettiin siirtyä seuraaviin luomisen haava käyttäen 200 ui pipetin kärki ja lisäämällä tuoretta täydellistä alustaa. Valokuvat otettiin 0 tunnin ja 22 tunnin määrittämiseen haavan sulkemisen kahden solulinjoista. B. Boyden Chamber määritys: PC3

säätökennoja ja PC3

AGR-2SH solut maljattiin soluviljelmissä insertit seerumittomassa väliaineessa ja solujen kulkeutumista stimuloitiin lisäämällä 10% FBS kuten kemoatrak- sisään alaosaan. 6 tunnin kuluttua inkubaation, solut poistettiin ylhäältä insertin vanupuikolla ja solujen alapuolella insertin valokuvattiin ja laskettiin. Vaikutus AGR-2 hiljentäminen on PC3 solujen vaeltamiseen on esitetään tässä suhteelliset arvot verrattuna kontrolliin (100%).

kehittäminen TRAIL Resistance PC3

AGR-2SH Cells

Aiemmat kokeet osoitti AGR-2-vaiennetaan PC3-solut osoittivat alentunut soluadheesiota, integriinin ilmentyminen ja muuttoliike. Normaali epiteelisolujen apoptoosia seuraavat irtoaminen tyvikalvon (anoikis), kun taas anoikis vastus on yksi tunnusmerkkejä pahanlaatuisten syöpäsolujen. Sen määrittämiseksi, AGR-2 hiljentäminen on osaltaan alttiutta anoikis sekä PC3

Ohjaus ja PC3

AGR-2SH soluja viljeltiin

in vitro

72 tuntia, kun läsnä on 0, 12,5, 25, 50 ja 100 ng /ml rekombinantin ihmisen liukoisen (s) TRAIL-proteiinia. Tulos kokeilu analysoitiin solunelinkykyisyysmääritys käyttäen MTS soluproleferaatiomäärityksessä sarja sarjan TRAIL hoitoa. Vaikka solukuolemaa havaittiin molemmissa PC3

Verrokkisoluja ja PC3

AGR-2SH soluja, PC3

AGR-2SH solujen selvisi TRAIL haaste huomattavasti parempi kuin PC3

Verrokkisoluja (kuvio 6A), mikä viittaa menetys AGR-2 saattaa liittyä kehittymistä anoikis resistenssin pahanlaatuisten syöpäsolujen. Solujen elinkelpoisuus seuraava sTRAIL haaste määritettiin myös värjäämällä solut propidiumjodidilla (PI). PC3

Ohjaus ja PC3

AGR-2SH soluja viljeltiin

in vitro

12 tunnin läsnä ollessa 0 ng /ml ja 100 ng /ml pitoisuus sTRAIL seuraa PI värjäys. Vaihekontrasti, loisteputki ja overlayed kuvat otettiin käyttäen Leica DMI 4000B mikroskoopilla ja analysoitiin Image J ohjelmisto. Sekä elävät ja kuolleet solut laskettiin ja elinkelvottomien solujen (PI positiivinen) olivat edustettuina prosenttiosuutena kokonaismäärästä soluja. Tulokset osoittivat merkittävästi korkeampia PI-positiivisia soluja (p 0,05) PC3

Verrokkisoluja verrattuna PC3

AGR-2SH soluja (kuvio 6 B p 0,02 Fisherin eksakti testi) välillä AGR -2 ja kaspaasi-3: viittaa taipumusta yhteistyössä esiintyminen näiden kahden molekyylin [26].

. PC3

ohjaus ja PC3

AGR2sh soluja käsiteltiin

in vitro

eri pitoisuuksilla sTRAIL. Solujen elinkelpoisuus testattiin 72 tunnin kuluttua käyttäen solunelinkykyisyysmääritys kit. Merkittävästi suurempia solukuolemaa (p 0,001) havaittiin PC3

säätökennoja verrattuna PC3

AGR2sh soluja. B. Solujen elinkelpoisuus seuraava sTRAIL haaste myös määrittelevät PC3

ohjaus ja PC3

AGR2sh soluja PI värjäys ja katselu alla fluoresenssimikroskoopissa (alkuperäinen suurennos 200X). C. Useita valokuvia otettiin kustakin solulinjasta seuraavat sTRAIL hoidon ja PI värjäystä. Sekä elävät ja kuolleet solut käsin laskettiin käyttäen Image J ohjelmisto ja graafisesti piirretty. D. Western blot-analyysi osoittaa kaspaasi-3 ja halkaistut kaspaasi-3 tasoa indusoimattomassa ja TRAIL aiheuttama ohjaus ja AGR-2-vaiennetaan PC3-soluissa.

Keskustelu

Eturauhassyöpä metastasizes luun ja tuottaa osteoblastic /osteolyyttisiä vaurioita, jotka aiheuttavat vakavia luukipu, alttius murtuma ja selkäydinkompressio [27]. Bone metastaattinen syöpä on parantumaton ja johtaa huomattavaa sairastuvuutta ja kuolleisuutta näillä potilailla. Adhesion kuorituista, verenkierrossa syöpäsoluja luuytimessä ECM proteiinit on merkittävä askel tarvitaan perustamiseen luumetastaasin [28]. Meidän microarray tutkimuksessa merkittävää säätelyä AGR-2 mRNA: n ilmentymisen seuraava huolto luuytimessä väliaine ehdottaa roolin AGR-2 helpottamisessa kasvun eturauhassyövän luuytimessä mikroympäristössä.