Krooninen sairaus

tiivistelmä

Baicalein, yleisesti käytetty Kiinan kasviperäisten lääkeaineiden, on useita farmakologisia vaikutuksia. Kuitenkin hienomekanismin anti-leviämisen ja antimetastaattisia vaikutuksia baicalein päälle sappirakon syöpä (GBC) yhä puutteellisia. Siksi Tämän tutkimuksen tarkoituksena oli arvioida anti-leviämisen ja antimetastaattisia vaikutuksia baicalein ja siihen liittyvä mekanismi (t) GBC. Tässä tutkimuksessa havaitsimme, että hoito baicalein indusoi merkittävästi estävä vaikutus proliferaatioon ja edistää apoptoosia GBC-SD ja SGC996 soluja, kaksi yleisesti käytetty sappirakon syöpä solulinjoja. Lisäksi, hoito baicalein esti etäpesäkkeiden GBC soluja. Lisäksi osoitimme ensimmäistä kertaa, että baicalein esti GBC solujen kasvua ja etäpesäkkeiden kautta alas-säätely ilmentymistason Sinkki sormi proteiinia X-sidottu (ZFX). Lopuksi todettakoon, että tutkimukset viittaavat siihen, että baicalein voi olla mahdollinen phytochemical flavonoidi varten terapeuttisten of GBC ja ZFX voi toimia molekulaarinen merkkiaine tai ennakoivaa kohde GBC.

Citation: Liu TY, Gong W, Tan ZJ, Lu W, Wu XS, Weng H, et al. (2015) Baicalein Estää eteneminen sappirakon syöpäsolujen downregulating ZFX. PLoS ONE 10 (1): e0114851. doi: 10,1371 /journal.pone.0114851

Academic Editor: Seok-Geun Lee, Kyung Hee University, Etelä-Korea

vastaanotettu: 16 tammikuu 2014; Hyväksytty 13 marraskuuta 2014; Julkaistu: 24 tammikuu 2015

Copyright: © 2015 Liu et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään

Rahoitus: Tämä tutkimus tuettiin National Natural Science Foundation of China (nro 81172026, 81272402, 81301816 ja 81172029), National High Technology Research ja kehittämisohjelma (863 Program) (nro 2012AA022606), Foundation for Poikkitieteellinen tutkimus Shanghai Jiao Tong-yliopiston (nro YG2011ZD07) , Shanghai tieteen ja teknologian komissio hallitustenvälinen kansainvälinen yhteistyöhanke (nro 12410705900), Shanghai tieteen ja teknologian komissio lääketieteellinen ohjaava hanke (nro 12401905800), Program Changjiang Scholars, Natural Science Research Foundation Shanghai Jiao Tong-yliopiston School of Medicine (nro 13XJ10037), johtava Talent ohjelma Shanghai, Sailing ohjelma Shanghai tieteen ja teknologian komissio (14YF1403000) ja Erikoistunut Research Foundation for Ph.D. Program of Higher Education-Priority Development Field (No. 20130073130014). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Sappirakon syöpä (GBC) on viidenneksi yleisin syöpä sappiteiden, tunnettu varhainen imusolmuke invaasio ja etäispesäkkeitä [1-3]. Se on yleensä aggressiivinen kasvain, joka leviää varhain ja 90% GBC potilaiden hoidossa on edennyt, käyttökelvottoman vaiheessa [4, 5]. Varhainen sappirakon syöpä on oireeton tai ilmenee vain kuin vatsavaivoja. Jotkut potilaat voivat kehittää oire akuutin tai kroonisen kolekystiitti, joka on helppo sivuuttaa tai neiti. Myöhemmässä aikana potilaat voivat kehittää vatsakipuja, keltaisuutta, ja kulmikas, mutta suurin osa potilaista ei ole kirurginen mahdollisuuksia. Ennuste kehittynyttä sappirakon syöpä on erittäin huono [6-10], ja 5 vuoden pysyvyys on vain noin 5%. Toistaiseksi kirurginen resektio on ainoa hoito, joka tarjoaa toivoa parannuskeinoa [11]. Siksi on erittäin tärkeää tunnistaa luotettavasti biomarkkereita ja lääkkeiden valvontaa varten sekä etenemisen ja sairauden hoitoon.

Baicalein on yksi tehokas ainesosat uutetaan

Labiatae

kasvien

scutellaria baicalensis georgi

n kuiva root, jossa on monia farmakologisia vaikutuksia, kuten tulehduksia, antibakteerinen, anti-virus, anti-allergia, anti-hapettumista ja niin edelleen [12-14]. Viime aikoina anti-kasvain vaikutus baicalein on aiheuttanut yhä enemmän huomiota ihmisiä. Solu- ja eläinkokeet ovat osoittaneet, että baicalein oli vahva tuumorin vastainen vaikutus. Esimerkiksi, baicalein aktivoitu AhR ja saamista helpottaa hajoamista sykliini D1, joka aiheuttaa solusyklin pysähtymisen G1-vaiheessa, ja indusoi soluproliferaation inhibointi [15]. Baicalein estää DMBA /TPA aiheuttamaa ihon tumorigenesisin hiirillä moduloimalla leviämisen, apoptoosin, ja tulehdus [16]. Baicalein kumotaan reaktiivisia happiradikaaleja (ROS) -välitteisen mitokondrioiden koe-keuhko- syövän synnyn

in vivo

[17]. Baicalein voi olla tärkeä rooli estävä vaikutus proliferaatioon munasarjasyöpäsoluja [18]. Koska sen laaja kasvaimen vastaisen spektrin riittävän lääkkeen lähde, vähän toksisuutta ja sivuvaikutuksia, baicalein näyttää olevan lupaava molekulaarinen merkkiaine tai terapeuttinen kohde sappirakon syöpä.

Zinc finger-proteiinin, X-linked (ZFX) on transkriptiotekijä, jota koodaa sen geenin nisäkkään X-kromosomi. ZFX on keskeinen rooli valvoa itse uudistaa ja ylläpito sekä alkion kantasolujen ja hematopoeettisten kantasolujen [19-23]. Ilmaisu taso ZFX korreloi aggressiivisuutta ja vakavuuden monissa syövän tyypit, mukaan lukien eturauhassyöpä, rintasyöpä, ihmisen pahanlaatuinen gliooma ja leukemia. Aiemmat tutkimukset osoittivat, että ZFX voi olla ratkaiseva rooli solujen lisääntymisen, solusyklin jakelu, ja apoptoosin monissa syöpäsoluissa [24-29]. Meidän aiemmin tuloksia havaittiin myös, että ZFX voi liittyä sääntelyssä solujen lisääntymisen ja muuttoliike sappirakon syöpä [30]. Siten esillä tutkimus suunniteltiin tutkimaan vaikutuksia ja mekanismeja baicalein vastaan ​​sappirakon syöpäsolujen lisääntymistä, invaasiota ja etäpesäkkeiden

in vitro

ja käytettäessä potilaalle tehdä sappirakon kasvainmuoto

in vivo

. Lisäksi ZFX oli osoitettava loppupään kohteena baicalein, jotka voivat tarjota lupaavaa uutta lähestymistapaa tehokas hoito sappirakon syöpä.

Materiaalit ja menetelmät

Ethics selvitys

Nude hiiret (joiden alkupaino 20-22 g) saatiin Shanghai SLAC Laboratory Animal Co., Ltd (Shanghai, Kiina). Kaikki eläin käsittelyt tehtiin tiukasti noudattaen kansainvälisten eettisten ohjeiden ja National Institutes of Health Guide koskevat hoito ja käyttö Laboratory Animals. Kokeet hyväksynyt Institutional Animal Care ja käyttö komitean Shanghai Jiao Tong-yliopiston.

Solulinjat ja kulttuuri

GBC-SD ja SGC996 solut ostettiin Shanghai Cell Institute Maa Cell Bank . GBC-SD-soluja viljeltiin korkean glukoosin DMEM (Gibco, USA) ja SGC996 soluja viljeltiin RPMI1640 (Gibco, USA). Kaikki kaksi soluja oli täydennetty 10% naudan sikiön seerumia (Gibco, USA), 100 ug /ml streptomysiiniä ja 100 U /ml penisilliiniä (Hyclone, USA), 37 ° C: ssa, alle 5,0% CO2-ilmakehässä.

Lääkkeet ja vasta

baicalein ostettiin Sigma-Aldrich (St. Louis, USA), liuotetaan DMSO: hon niin kantakonsentraatiolla 100 mmol /l, ja säilytetään pimeässä -20 ° C. Kuva. 1 esittää kemiallinen rakennekaava on baicalein. Lopulliset baicalein pitoisuudet käytettiin eri kokeissa valmistettiin laimentamalla kantaliuos korkean glukoosin DMEM tai RPMI 1640-. Vasta-aineet, joita käytetään western blotting olivat seuraavat: kanin anti-kaspaasi-3, anti-Bcl-2, anti-Bax, anti-PARP, anti-p53, anti-cyclinA, anti-cyclinB1, anti-cyclinD1, anti-MMP2 , anti-MMP-9, anti-ZFX ja hiiren anti-β-aktiini. Kaikki vasta-aineet hankittiin yhtiöltä Cell Signaling Technology.

molekyylikaava baicalein on C15H10O5and sen molekyylipaino on 270,24.

3- (4, 5-dimetyylitiatsol-2-yyli ) -2, 5 difenyylitetratsoliumbromidi (MTT)

Drug herkkyys määritettiin käyttämällä MTT-määritystä. Lyhyesti, solut trypsinoitiin ja maljattiin 96-kuoppaisille levyille (Corning, USA) tiheydellä 5 x 10

3 solua kuoppaa kohti. Soluja viljeltiin yön yli ja sitten täydennetään tuoreella alustalla, joka sisälsi erilaisia ​​pitoisuuksia (0, 15, 30, 60, 120, ja 240 umol /L) baicalein 24, 48, ja 72 h. Sen jälkeen 20 ui MTT: tä (Sigma-Aldrich) liuotettuna PBS: ssä 5 mg /ml, lisättiin suoraan kuopista, ja levyjä inkuboitiin 4 tunnin ajan 37 ° C: ssa. Formatsaanikitei- muodostuneet kiteet liuotettiin 100 ul: aan DMSO: ta sen jälkeen, kun supernatantin poisto. Optinen tiheys on nauhoitettu 490 nm: ssä mikrolevylukijalla (Bio-Tek, USA). Tulokset edustavat keskiarvoa 3 itsenäisen kokeen tehnyt usean päivän. Prosenttiosuus solujen elinkykyisyys laskettiin seuraavasti:

Colony muodostavat määrityksessä

Solut logaritmisessa kasvuvaiheessa pilkottiin yhdeksi-solususpensio, jossa on trypsiini-EDTA: a (Gibco, USA) liuos ja sitten 2 ml: lla solususpensiota ympättiin 6-kuoppaisille levyille (Corning, USA) tiheydellä 200 solua /ml. Kiinnittymisen jälkeen soluja käsiteltiin baicalein (0,6,12, ja 24μmol /l) 48 tunnin ajan ja sen jälkeen viljelty 15 päivää. Sen jälkeen solut kiinnitettiin 10% formaliinilla ja värjättiin 0,1% kristallivioletilla (Sigma-Aldrich). Pesun jälkeen levyjä kuivattiin ilmassa, ja digitaalisia kuvia otettiin ja värjättiin yhden kloonien mikroskoopilla (Leica, Saksa). Tulokset edustavat keskiarvoa 3 itsenäisen kokeen tehdä usean päivän aikana.

Solusyklianalyysiä

Soluja käsiteltiin baicalein (0,30,60 ja 120μmol /l) 48 tuntia. Sitten solut kerättiin ja kiinnitettiin kylmällä 70% etanolilla ja varastoitiin -20 ° C: ssa. Sitten solut pestiin ja suspendoitiin uudelleen kylmään PBS: ään ja inkuboitiin 37 ° C: ssa 30 minuutin ajan 10 mg /ml RNaasi ja 1 mg /ml propidiumjodidia (Sigma-Aldrich). DNA-pitoisuus analyysi tehtiin virtaussytometrialla (BD, San Diego, USA). Solujen prosenttiosuus eri solusyklivaiheista määritettiin käyttäen Cell Quest hankinta-ohjelmisto (BD Biosciences).

virtaussytometrinen analyysi apoptoosin

anneksiini V /propidiumjodidi määritys suoritettiin mukaan valmistajan suosituksia (Invitrogen, USA). Lyhyesti, solut maljattiin 6-kuoppaisille levyille (Corning, USA) ja inkuboitiin 48 h baicalein (0,30,60, ja 120μmol /l). Lyhyesti, solut kerättiin ja pestiin kylmällä PBS: llä, sentrifugoitiin, suspendoitiin uudelleen 100 ul: aan sitoutumispuskuria, joka sisälsi 2.5ul FITCconjugatedannexin-V: n ja 1 ui 100 ug /ml PI: n ja inkuboitiin 15 min huoneenlämmössä pimeässä. Kaikkiaan vähintään 10 000 tapahtumaa kerättiin ja analysoitiin virtaussytometrillä (BD, San Diego, USA).

Detection morfologisten apoptoosin Hoechst 33342 värjäys

hoidon jälkeen baicalein (0 , 30,60, ja 120μmol /l) 48 tunnin ajan, GBC-SD-solut pestiin PBS: llä ja kiinnitettiin metanoli: etikkahappo (3: 1) 15 min ajan huoneenlämpötilassa. Kiinnitetyt solut pestiin PBS: llä ja värjättiin 5 ug /ml Hoechst 33342 tahra 10 min. Muutokset ytimet solujen värjäyksen jälkeen Hoechst 33342 havaittiin käyttäen fluoresenssimikroskooppia (Leica, Saksa).

Solun maahanmuutto- ja invaasion

GBC-SD3 × 10

4 solut ja SGC996 1 x 10

5-solut saatetaan pinnoittamatonta kalvoa yläkammiossa (Corning, USA). Solut maljattiin väliaineessa ilman seerumia. Joka sisälsi 10% FBS: ää, pantiin alempaan kammioon toimimaan kemoattraktantti. Kiinnittymisen jälkeen soluja käsiteltiin eri pitoisuuksilla Baicalein (0, 7,5, 15, 30, 60 umol /l) seerumittomassa väliaineessa. Soluja inkuboitiin 24 tunnin ajan; solut, jotka eivät hyökätä huokosten läpi poistettiin käyttäen pumpulipuikolla. Solut vaeltavat läpi 8,0 um: polykarbonaatti kalvoja alapintaan kiinnitettiin 10% metanolilla ja värjättiin 0,1% kristallivioletilla. Siirtyminen solut kvantitoitiin laskemalla värjätään soluja mikroskoopilla (x 200) viidellä satunnaisesti aloilla kullekin hyvin. Kukin koe suoritettiin kolmena rinnakkaisena. Invasion määritykset suoritettiin samalla tavalla kuin siirtyminen määritykset, paitsi että insertit esipäällystetty Matrigel (BD, USA).

In vitro haavan paranemista määritys

GBC-SD-soluja kasvatettiin 6-kuoppaisille levyille tiheytenä 1,5 x 10

5 /ml ja kasvatettiin konfluenssiin. Haava luotiin kaapimalla konfluentteja yksisolukerrokset pipetillä kärjestä. Solut laajasti huuhdeltiin keskipitkän soluroskan poistamiseksi ennen hoitoon eri pitoisuuksien kanssa (0, 7,5, 15, ja 30μmol /L) baicalein in FBS riistää kunnossa. Solujen annettiin kulkeutua 24 h ja kuvia siirtynyt solujen otettiin käyttämällä käännettyä mikroskooppia (Leica, Saksa).

Käänteinen transkriptio ja kvantitatiivinen reaaliaikainen polymeraasiketjureaktio (qPCR) B

Kvantitatiivinen PCR: ää käytettiin määrittämään mRNA: n ilmentämistä koeryhmissä. Lyhyesti, GBC-soluja käsiteltiin baicalein (15, 30, 60 ja 120 umol /l) 48 tuntia. Kokonais-RNA eristettiin käyttäen RNA helppoa (Invitrogen, USA). Ensimmäisen juosteen cDNA syntetisoitiin 500 ng kokonais-RNA käyttäen PrimeScript käänteistranskriptaasia (TaKaRa, Japani). Kvantitatiivisen tosiaikaisen PCR suoritettiin reaktio 20 ui, mukaan lukien 2 ui cDNA: ta. Alukesekvenssejä olivat seuraavat: MMP-9 (eteenpäin-5′- TGT ACC GCT ATG GTT ACA CTC G-3 ’, reverse-5′-GGC AGG GAC AGT TGC TTC T-3′), MMP2 (eteenpäin-5′ AAC TAC GAT GAT GAC CGC AAG ”reverse-5’-GAC AGA CGG AAG TTC TTG GTG -3 ’), ZFX (eteenpäin-5′- TGT GGA GTG TGG TAA GGG TTT T” reverse-5’-ACT GGT GTG TTT TGC TTT CTT G -3 ’), ja GAPDH (eteenpäin-5′-AAG CTC ATT TCC TGG TAT GACA-3′, reverse-5’-TCT TAC TCC TTG GAG GCC ATGT-3 ’). PCR-olosuhteet olivat seuraavat: 95 ° C 30 sekunnin ajan, jota seuraa 40 sykliä 95 ° C: ssa 5 sekuntia, 60 ° C: ssa 34 sekunnin ajan. Glyseraldehydi-3-fosfaattidehydrogenaasi (GAPDH) käytettiin sisäisenä referenssinä geenin normalisoida ilmentymisen apoptoottisten geenejä. Suhteellinen kvantitointi apoptoosiin liittyvien geenien analysoitiin vertaileva kynnyksen (Ct) menetelmällä. Kunkin näytteen Ct arvo apoptoottisen geenin normalisoitiin käyttämällä kaavaa: ACt = Ct (apoptoottinen geenejä) – Ct (GAPDH). Määrittämään suhteelliset ekspressiotasot seuraavan kaavan käytettiin: ΔΔCt = ACt (käsitelty) – ACt (kontrolli). Arvo käytettiin piirtää ilmentymisen apoptoottisten geenien kaavalla 2-ΔΔCt.

Western blot-analyysi

Soluja käsiteltiin eri pitoisuuksilla baicalein (0, 15, 30, 60 ja 120 umol /l) 48 tunnin ajan ja sitten hajotettiin näytepuskuriin, jota seuraa denaturointi. Proteiinin kokonaismäärän konsentraatio solu-uutteiden määritettiin käyttäen bikinkoniini- happoa määritysjärjestelmä (Beyotime, Kiina) ja BSA: ta standardina. Yhtä suuret määrät (80 ug proteiinia per kaista) koko proteiinit erotettiin SDS-PAGE: lla (8%, 12% geelit), pelkistävissä olosuhteissa. Sitten proteiinit siirrettiin elektroforeettisesti nitroselluloosakalvoille. Membraanit blokattiin 5% rasvatonta maitoa, ja inkuboitiin withanti-kaspaasi-3, anti-Bcl-2, anti-Bax, anti-PARP, anti-p53, anti-cyclinA, anti-cyclinB1, anti-cyclinD1, anti- MMP2, anti-MMP-9, anti-ZFX vasta-aineiden (1: 1000, Cell Signaling Technology) 4 ° C: ssa yön yli. Tätä seurasi inkubointi vuohen anti-kani /anti-hiiri-vasta-ainetta, joka oli konjugoitu piparjuuriperoksidaasiin (1: 5000, Abcam). Yhtä suuri kuormitus kunkin kaistan arvioitiin immunoblottauksella saman kalvot kanssa β-aktiini vasta sen jälkeen, kun irtoaminen aiempien ensisijaisen vasta-aineita. Kuvat on otettu ja optiset tiheydet nauhojen skannattiin ja kvantifioitiin kanssa Gel Doc 2000 (BioRad, USA).

In vivo -tuumoriksenografti tutkimus

Kuusi viikkoa vanhoja koiraspuolisia kateenkorvattomiin nude hiiret (joiden alkupaino 20-22 g) saatiin Shanghai SLAC Laboratory Animal Co., Ltd (Shanghai, Kiina) ja sijoitettu alle patogeenivapaissa olosuhteissa kontrolloidussa lämpötilassa (22 ° C), kosteutta, ja 12 tunnin valo /pimeä sykli. Ruoka ja vesi annettiin ad libitum koko kokeen ajan. SGC996 soluja käytettiin tuumoriksenografteja ja kasvattaa viljelmässä ja sitten irrotetaan trypsinoimalla, pestiin ja suspendoitiin uudelleen seerumittomaan RPMI1640: llä. Kukin kateenkorvattomien nude hiiri injektoitiin ihonalaisesti 1 x 10

6 solujen ina tilavuuden 100 ul oikeaan kylkeen alueelle aloittaa kasvaimen kasvua. Jälkeen SGC996 inokulaation, hiiret jaettiin satunnaisesti kahteen ryhmään (5 hiirtä /ryhmä). Yksi ryhmä käsiteltiin vehikkelillä (10% DMSO: ta ja 90% propyleeniglykolia) intraperitoneaalisesti, ja toinen ryhmä received0.4mg /hiiri baicalein vatsakalvonsisäisesti 9 kertaa. At 21th päivänä eläimet lopetettiin, ja kasvain kudos poistettiin ja punnittiin.

Tilastollinen analyysi

Kaikki arvot ilmaistaan ​​keskiarvona ± SD, ja ne analysoitiin Studentin

t

-testi SPSS versio 13.0 ohjelmisto.

p

-arvo alle 0,05 pidettiin merkittävänä.

Tulokset

vaikutus baicalein elinkelpoisuuteen ja apoptoosin sappirakon syöpä solujen kasvua in vitro ja in vivo

vaikutukset baicalein kasvuun ihmisen GBC-SD ja SGC996, kaksi yleisimmin käytetty solulinjoja sappirakon syöpä,

in vitro

testattiin. Kuten on esitetty kuviossa. 2 (A), hoidon jälkeen 24, 48, ja 72 h, baicalein indusoi annoksesta ja ajasta riippuva väheneminen elinkelpoisuutta sekä GBC-SD ja SGC996 soluja, kuten analysoitiin MTT-määritystä. Kuten on esitetty kuviossa. 2 (B) (C), kyky GBC-SD ja SGC996 solut muodostavat pesäkkeitä, kun läsnä on baicalein havaittiin litteän levyn pesäkemuodostusta. Pesäkkeiden laskenta osoitti, että baicalein oli indusoi annoksesta riippuvan lasku pesäkkeen muodostumisen mahdollisuuden. Havainnot tukevat sitä, että baicalein voinut käyttää merkittävä vaikutus GBC-SD ja SGC996 solujen lisääntymistä. Edelleen vahvistaa vaikutuksen baicalein

in vivo

, testasimme tuumorigeenisyyden sappirakon syöpä soluihin käyttämällä nude-hiirissä -tuumoriksenografti tutkimuksessa. Kuten on esitetty kuviossa. 2 (D), kasvaimen koko ryhmässä baicalein hoito oli pienempi kuin kontrolliryhmässä.

(A) GBC-SD ja SGC996 soluja käsiteltiin vaihtelevilla baicalein, ja solujen lisääntyminen oli määritettiin MTT-määrityksellä päivinä 1, 2, ja 3. Kukin arvo on keskiarvo ± SD (n = 3). (B ja C) Baicalein tukahdutti pesäkkeenmuodostusta GBC-SD ja SGC996 soluja. Soluja käsiteltiin baicalein (6, 12, ja 24 umol /l) ja annettiin muodostaa pesäkkeitä tuoreeseen kasvualustaan ​​ja 14 päivää. Vaikutus pesäkkeet (keskiarvo ± SD, n = 3) in pesäkemuodostusta on esitetty. (D) Baicalein-käsitellyn ksenograftikasvaimissa olivat paljon pienempiä kuin kontrolli kasvaimia. (E) paino kasvaimia kävi ilmi, että ksenograftin kasvaimen kasvua nude-hiirissä oli merkittävästi hitaampaa baicalein saaneilla nude kasvaimia kuin kontrolli kasvaimia. Esitetyt tulokset edustavat vähintään kolmen erillisen kokeen. * P 0,05, ** P 0,01, *** P 0,001.

Sen arvioimiseksi, onko baicalein vaikuttaa solusyklin etenemisen, virtaussytometria analyysi suoritettiin. Tulokset osoittivat merkittävän vähenemisen määrä solujen proliferatiivinen G0 /G1 vaiheeseen ja merkittävä lisääntyminen solujen S-vaiheessa, sen jälkeen, kun 48 tunnin hoidon baicalein (Fig. 3 (A)). CyclinA, G1 /S siirtymisen edistämiseen proteiinia, oli annoksesta riippuvaa kasvoi baicalein hoitoa. Se saattaa olla syynä S vaiheen pysähtymisen aiheuttamaa baicalein. CyclinB1 ja cyclinD1 jotka edustavat S /G2 ja M /G1 siirtymävaihetta vastaavasti, olivat annoksesta riippuvaa laskua baicalein hoitoon (Fig. 3 (B) ja S5 kuvassa.). Nämä tulokset osoittavat, että baicalein pidätystä solukierrossa S-vaiheessa.

(A) Soluja käsiteltiin 30, 60, tai 120 umol /l baicalein 48 tuntia ja DNA-pitoisuus analysoitiin virtaussytometrialla. Prosenttiosuus soluja G1, S ja G2 /M-vaiheisiin solusyklin on esitetty. Nämä tulokset olivat 1 edustava koe 3 riippumatonta tutkimuksissa. (B) ilmentäminen sykliini B ja sykliini D GBC-SD-solujen ja sykliini A ja sykliini D SGC996 solut muuttuneet merkittävästi hoidon jälkeen baicalein kuin verrokkiryhmän. Esitetyt tulokset edustavat vähintään kolmen erillisen kokeen. * P 0,05, ** P 0,01, *** P 0,001.

edelleen vahvistaa nämä tulokset, arvioimme vaikutuksia baicalein on apoptoosin GBC-SD ja SGC996 solut käyttämällä anneksiini V-FITC ja propidiumjodidivärjäys. Arvioimana virtaussytometrialla ja kuvassa. 4 (B), selvä annosriippuvainen nousu sekä varhaisen ja loppuvaiheissa apoptoosin oli ilmeinen GBC-SD ja SGC996 solujen jälkeen baicalein hoidon verrattuna kontrolli soluihin.

(A) Apoptotic morfologisia muutoksia tällaisten epänormaali ydin- morfologia, väheneminen solujen lukumäärän kanssa apoptoottisten kehon muodostumista ja solujen kutistuminen, indusoi baicalein (30,60 ja 120 umol /l) hoitoa 48 tuntia, havaittiin Hoechst 33342-värjäyksen GBC-SD ja SGC996 solulinjoja . (B) Soluja inkuboitiin baicalein (30,60 ja 120 umol /l) 48 tunnin ajan, mitä seurasi värjäys anneksiini-V /PI. Solujen apoptoosin arvioi virtaussytometrialla. (C) Baicalein indusoi apoptoosin aktivaatiosta liittyvien proteiinien GBC-SD ja SGC996 soluja. Käsittelyn jälkeen baicalein (0, 15, 30, 60, ja 120μmol /l) 48 tunnin ajan, solulysaatit valmistettiin ja Western blot -analyysi suoritettiin vastaan ​​Bcl-2, Bax, pro-kaspaasi-3, P53 ja PARP. p-Actin käytettiin latauskontrollina. Esitetyt tulokset edustavat vähintään kolmen erillisen kokeen. * P 0,05, ** P 0,01, *** P 0,001.

morfologiset muutokset apoptoottisia soluja paljasti Hoechst 33342 värjäystä, kuten on esitetty kuviossa. 4 (A). Käsittelemättömän GBC-SD ja SGC996 solujen tumat värjättiin heikko homogeeninen sininen, kun taas ryhmässä, jota käsiteltiin baicalein, kirkas kromatiinin kondensaatio ja ydin- pirstoutumista havaittiin.

vaikutus baicalein on apoptoosiin liittyviä tekijöitä

mitkä proteiinit olivat pääasiassa mukana baicalein aiheuttama apoptoottisen prosessin, analysoimme useita apoptoosin liittyvät tekijät western blot. Kuten kuviossa. 4 (C), prokaspaasia 3 ja P53 olivat alas-säädellä baicalein hoitoa. Halkaistut PARP lisääntyi merkittävästi. Proteiini taso Bax oli säädelty, kun taas proteiinin taso Bcl-2 oli merkittävästi vähentynyt.

vaikutus baicalein on etäpesäke sappirakko karsinoomasoluja

Koska sappirakon syöpä solumigraatioon ja invaasiota liittyy etäpesäkkeitä, käytimme solujen eri määrityksiä arvioimaan vaikutuksia baicalein on metastaattista potentiaalia sappirakon karsinoomasoluja. Jotta voidaan tutkia vaikutus baicalein on syöpäsolujen liikkuvuutta, teimme migraatiokokeessa käyttäen GBC-SD ja SGC996 soluja. Kuten on esitetty kuviossa. 5 (A), solumigraatiota estyi baicalein hoitoon. Lisäksi teimme haavan määrityksessä edelleen vahvistaa esto vaikutus baicalein solun muuttoliikettä. Kuten on esitetty kuviossa. 5 (C), baicalein näkyvästi esti GBC-SD solumigraatio annoksesta riippuvalla tavalla. Edelleen tutkitaan, invasiivisen aktiivisuuden vaikuttivat vastauksena baicalein selvitimme invasiivisen aktiivisuuden avulla Matrigel päällystetty kalvo. Tulokset osoittivat, että baicalein dramaattisesti vähentänyt hyökkäsi solujen ja tämä inhibitio esiintyi pitoisuudesta riippuvalla tavalla (Fig. 5 (B)). Lisäksi leviämisen ja metastaasin kyvyt ovat edelleen voimistua käsitellyissä soluissa sekä siRNA vastaan ​​ZFX ja baicalein (S4 kuvassa.).

Soluja käsiteltiin 7,5, 15, 30 ja 60μmol /L baicalein 12 tuntia ennen migraatioon (A) tai invaasio (B) määritys. (C) yksisolukerrokset haavoittui raaputtamalla 200 ul pipetin kärki. Miehitys alue GBC-SD yksisolukerros hoidettiin baicalein oli annoksesta riippuvainen väheni 24 tunnin kuluttua alusta. Baicalein vaikuttaa ilmentymisen matriisin metallopeptidases (MMP). (D) mRNA: n MMP-2 ja MMP-9 havaittiin qPCR jälkeen käsiteltiin baicalein 48 tuntia. (E) proteiini MMP-2 ja MMP-9: ää havaittiin Western blot jälkeen käsiteltiin baicalein 48 tuntia. Esitetyt tulokset edustavat vähintään kolmen erillisen kokeen. * P 0,05, ** P 0,01, *** P 0,001.

MMP tiedetään olevan ratkaiseva hajottavien soluväliaineen komponentteja sekä edistää kasvainten solujen invaasio

in vitro

ja

in vivo

. Käsittelyn jälkeen eri pitoisuus baicalein 48 h GBC-SD ja SGC996 soluja, kvantitatiivisen tosiaikaisen PCR: llä ja western blot-analyysi osoitti, että mRNA: n ja proteiinin ilmentymistä MMP-9: n ja MMP-2 merkittävästi vähentynyt verrattuna kontrolliryhmään annoksesta riippuvalla tavalla (Fig. 5 (D B)) väheni baicalein käsittely GBC-SD ja SGC996 soluihin ja translokaation ZFX tumaan tukahdutettiin baicalein hoito (S2 Kuva.). Vaikutus baicalein on ZFX ilmentyminen oli erityinen, koska ilmentymistason NF-KB ja STAT3 ei vaikuttanut tämän molekyylin (S1 Kuva.).

(A ja B) ZFX ilmentyminen GBC-SD ja SGC996 indusoiman baicalein. Soluja käsiteltiin 0, 15, 30, 60 ja 120 umol /l baicalein 48 tuntia, sitten proteiini ja mRNA: n ilmentymisen taso ZFX määritettiin Western blot (A) ja qPCR (B). (C ja D) transfektoitiin ZFX-GFP-plasmidi GFP-plasmidi, vastaavasti. 72 tuntia transfektion jälkeen solut käsiteltiin 0, 7,5, 15, 30 ja 60 umol /l baicalein 72h. ZFX-GFP merkittävästi esti proliferaation inhibitiota GBC-SD-soluihin baicalein käyttämällä MTT-määritystä (C). ZFX-GFP merkittävästi esti apoptoosin induktion ja GBC-SD-solujen baicalein arvion mukaan virtaussytometrillä (D). (E ja F) 72 tuntia transfektion jälkeen solut käsiteltiin 60 umol /l baicalein 24 tuntia. ZFX-GFP merkittävästi esti kulkeutumista estävällä ja invaasion vaikutus GBC-SD solujen baicalein. Solun Migraatio arvioitiin haavan paranemista määrityksellä (E) ja solujen invaasiota arvioitiin transwell määrityksellä (F). (G) ZFX-GFP esti ilmentymisen PARP inhibition MMP2, MMP9 ja säädelty suhde Bcl2 /Bax vastauksena baicalein. 72 tuntia transfektion jälkeen solut käsiteltiin 60 umol /l baicalein varten 48h.The proteiinin tasot PARP, MMP-2, MMP-9, Bcl2, Bax ja ZFX määritettiin Western blot. Esitetyt tulokset edustavat vähintään kolmen erillisen kokeen. * P 0,05, ** P 0,01, *** P 0,001.

yli-ilmentäminen ZFX helpottunut elinkelpoisuuden, apoptoosia ja etäpesäkkeiden vaikutus baicalein in GBC-SD solujen

Lisäksi yliekspressio ZFX (S3 kuvassa.) Johti osittain esto baicalein indusoitua proliferaatiota ja apoptoosia GBC-SD-solut (Fig. 6 (C) (D)). Näin ollen estämällä muuttoliikkeen (Fig. 6E) ja invaasion (Fig. 6F) kyvyt solujen baicalein oli merkittävästi kumota yliekspressio ZFX. Toisaalta, yliekspressio ZFX suuresti estyy baicalein indusoimaa aktivoitumista PARP ja lisääntynyt suhde Bcl2 /Bax. Lisäksi yliekspressio ZFX johti myös esto baicalein inhiboivan vaikutuksen MMP-2 ja MMP-9 (Fig. 6 (G)). Siten tiedot osoittivat, että ZFX proteiini saattaa osallistua baicalein aiheuttaman solujen apoptoosin ja anti-etäpesäkkeiden sappirakon syöpä soluissa.

Keskustelu

Tutkimuksemme tarjoaa joitakin uusia tietoja baicalein käytetty syövän hoidossa. Syövän vastaisen vaikutuksen baicalein on vahvistettu monissa muissa syövissä, mutta anti-leviämisen ja metastasoitunut vaikutus ja siihen liittyvä mekanismi (t) GBC soluissa ei ole selvä. Tässä olemme osoittaneet biokemialliset ja molekyylitason mekanismeja apoptoosin ja antimetastaattisia induktio baicalein.

Ensinnäkin, huomasimme, että baicalein voi olla tärkeä rooli GBC solujen lisääntymisen, solusyklin ja apoptoosin

vuonna vitro

ja

in vivo

. Hoito baicalein johti merkittävään vähenemiseen elinkelpoisuuden viljeltyjen GBC-SD ja SGC996 soluissa ja pesäkkeiden lukumäärä, että nämä solut muodostivat. Tietääksemme tämä on ensimmäinen tutkimus, jossa arvioidaan mahdollista roolia baicalein on

in vivo

ksenografti- eläinmallissa. Merkittävästi vähentää kasvaimen massaa jälkeen havaittiin 3 viikon hoidon.

in vivo

vaikutus baicalein on GBC kasvaimiin tukevat vahvasti baicalein mahdollisen uuden lääkkeen anti-GBC hoitoa.

Vaikutus baicalein solusyklin pysähtymisen ja apoptoosin induktion in GBC soluja arvioitiin myös. Anti-kasvain vaikutuksia baicalein uskottiin käyttää vaikuttamalla pysähtymisen solusyklin tai olemalla vuorovaikutuksessa solukierron-sukuiset proteiinit [31]. Tutkimuksessamme baicalein myös indusoi S-vaiheessa solusyklin pysähtymiseen ja esto sykliini B1, sykliini D1, edistäminen sykliini A GBC-SD ja SGC996 soluja. Koska apoptoosin pidetään tärkeänä mekanismi estäminen syövän, suoritimme hoechst33342 värjäystä määritys, anneksiini V /PI-kokeessa, ja havaitseminen apoptoosin liittyvän proteiinin ilmentymisen tutkimaan edelleen mekanismi baicalein aiheuttaman apoptoosin. Baicalein merkittävästi indusoi apoptoosia sekä GBC-SD ja SGC996 soluja, kuten on osoitettu muutokset ydin- morfologia, lisääntyminen prosentteina anneksiini V-värjäys soluissa, mikä vahvistettiin edelleen lisääntynyt ilmentyminen katkaisun pro-kaspaasi-3, pilkkominen PARP, Bax ja vähentää ilmentymistä Bcl-2 ja P53. Monet näistä geeneistä liittyvät mitokondrioiden apoptoottisen reitin. Pilkkominen pro-kaspaasi-3, lohkaisu PARP ja lopulta hajoamiseen DNA. Bax ja Bcl-2-proteiinien, jotka säätelevät olennaisen muutoksen mitokondrion kalvon läpäisevyyden apoptoosin [32]. Näiden tietojen perusteella voidaan päätellä, että baicalein indusoi GBC apoptoosia aktivoimalla luontainen mitokondrioiden kautta.

Lisäksi solujen lisääntymistä, muuttoliike ja invasiivisia kapasiteetti solut ovat myös kaksi tärkeimmistä ominaisuuksista pahanlaatuisten solujen käyttäytymistä. Valaista vaikutuksen baicalein solun liikkuvuuteen, solujen vaeltaminen ja invasiivisuus määritettiin haavan paranemista migraatiokokeessa ja siirtokuoppaan määritys, vastaavasti. Näiden tietojen huomasimme, että baicalein hillitsevän muuttoliike ja hyökkäyksen kykyä GBC-SD ja SGC996 soluja. MMP ovat erittäin säännelty superperheen sinkki riippuvaisten endopeptidaasit jotka syy-yhteydessä kehittymistä ja etenemistä kasvaimia [33].