Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

Forkhead laatikko L1 (FOXL1), pidetään uutena ehdokkaana tuumorisuppressori, hillitsee ja invaasio tietyissä syövissä. Kuitenkin sääntely ja toiminta FOXL1 sappirakon syöpä (GBC) jää epäselväksi.

Methods

FOXL1 ilmentymistä mRNA ja proteiini tasoilla GBC kudoksissa ja solulinjoissa tutkittiin RT-PCR, immunohistokemia ja western blot -määritys. FOXL1 ilmentyminen GBC solulinjoissa sääteli transfektiolla pcDNA-FOXL1. Vaikutukset FOXL1 ilmentymisen vaikutus soluproliferaatioon, apoptoosin, muuttoliike ja invaasio arvioitiin in vitro tai in vivo. Lisäksi välittäjien asemasta maahanmuuttopolitiikasta, invaasio ja apoptoosin tutkittiin käyttäen western blot transfektion jälkeen pcDNA-FOXL1.

Tulokset

FOXL1 oli usein vaimentua vuonna GBC kudoksissa ja solulinjoissa. Sen suurempi ekspressio liittyy parempi ennuste, kun taas sen alempi ilmentyminen korreloi pitkälle TNM-luokitus ja huono erilaistumista. FOXL1 yliekspressio NOZ soluissa merkittävästi tukahduttaa solujen lisääntymistä, muuttoliikettä ja invaasiota in vitro ja tuumorigeenisyystesti nude-hiirissä. FOXL1 yliekspressio häiritsi mitokondrion transmembraaninen potentiaali ja laukaisi mitokondrioiden välittämää apoptoosia NOZ soluissa. Lisäksi, FOXL1 yli-ilmentyminen tukahdutetaan ZEB1 ilmaisun ja indusoi E-kadheriinin ilmentymisen NOZ-soluissa.

Johtopäätös

havainnot ehdottivat, että säädeltyyn FOXL1 on kasvaimien syntyyn liittyvien ja etenemisessä GBC, ja se voi toimia ennustaja kliinisiin tuloksiin tai jopa terapeuttisena kohteena potilaille, joilla GBC.

Citation: Qin Y, Gong W, Zhang M, Wang J, Tang Z, Quan Z (2014) Forkhead Box L1 usein vaimentua sappirakon syöpä ja estää Cell Growth läpi apoptoosin mukaan mitokondrioiden toimintahäiriöitä. PLoS ONE 9 (7): e102084. doi: 10,1371 /journal.pone.0102084

Editor: Alejandro H. Corvalan, Pontificia Universidad Catolica de Chile, lääketieteellisen tiedekunnan, Chile

vastaanotettu: 10 tammikuu 2014; Hyväksytty: 14 Kesäkuu 2014; Julkaistu: 10. heinäkuuta 2014

Copyright: © 2014 Qin et ai. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukivat National Natural Science Foundation of China (nro 81272747 ja nro 81372642). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Sappirakon syöpä (GBC), joka edustaa yleisintä ja aggressiivinen keskuudessa sappitiesairaus syöpäsairauksia on tunnusomaista epäspesifinen esitys, myöhäinen diagnosointi ja puute tehokasta hoitoa. Vaikka viime aikoina saavutetut edistysaskeleet on tehty diagnoosi ja hoito, tuloksia nykyisten hoitomuotojen, kuten leikkauksen, kemoterapiaa ja sädehoitoa (yksinään tai yhdistetty) ovat osoittautuneet synkkä. Se liittyy huonoon ennusteeseen, jossa mediaanielossaolosta kesto 4 kk [1] ja 5 vuoden pysyvyys on alle 10% [2]. Siksi on kiireesti tarpeen kehittää uusi ja tehokas hoito-ohjelman varten GBC potilaille. Kuitenkin rajallinen tietämys kasvaimen kehittymisen sappirakon syövän jarruttavan sen diagnoosin ja hoidon GBC. Parempi ymmärrys molekyylibiologian ja karsinogeeninen mekanismit kehittymistä ja etenemistä GBC voi auttaa luomaan tehokkaampia hoitoja.

Forkhead laatikko (FOX) proteiinit ovat superperheen transkriptiotekijöiden, jotka jakavat erittäin hyvin säilynyt DNA: ta sitova verkkotunnuksen (jäljempänä forkhead laatikko tai siivekäs helix domain) ohjata erilaisia ​​biologisia prosesseja, kuten aineenvaihdunta, erilaistuminen, proliferaatio ja apoptoosi [3]. Koska FOX proteiinit säätelevät näitä elintärkeitä prosesseja kasvun ja kehityksen, voitto tai tappio FOX funktion yllättävää aiheuttaa ihmisen geneettisiin sairauksiin kuten syöpiin. Dysregulaatio useita FOX alaperheistä kuten FOXO, FOXM, FOXP, FOXC ja FOXA on tuumorigeneesiin ja etenemiseen tiettyjen syöpien [4]. Vaikka FOX proteiinit jakavat erittäin konservoitunut DNA-sitova domeeni, niiden säätely ja toiminta vaihtelevat huomattavasti perheille. FOX proteiineilla on erilaisia ​​toimintoja ja toimivat tuumorisuppressoreita tai onkogeenien aikana kasvaimen kehittymisen ja etenemisen eri syöpiä. Esimerkiksi FOXO1 toimii tuumorisuppressori, joka voisi indusoida apoptoosia ja solusyklin pysähtymisen syöpäsoluissa [5]. Toisin kuin FOXO1, FOXM1 osoittaa onkogeenisia toimintaa ja kohdentamalla FOXM1 indusoi apoptoosia syöpäsoluissa [6]. Yhä useammat todisteet on osoittanut vakuuttavasti, että FOX proteiinit voivat edustaa houkuttelevia kohteita terapeuttisen intervention vastaan ​​moniin syöpiin.

FOXL1 proteiini on jäsenenä FOX superperheen joka oli alun perin löydettiin mesenchyme ruoansulatuskanavassa. Toistaiseksi suhde FOXL1 ja ruoansulatuskanavan syöpään mukaan lukien maha, paksusuoli ja haima on tutkittu useissa tutkimuksissa, [7] – [8]. Kuitenkin biologinen toiminta FOXL1 vuonna GBC vielä selvittämättä. Esillä olevassa tutkimuksessa olemme tutkineet merkitys FOXL1 ilmentymisen potilailla, joilla on GBC suhteessa kliinisiä piirteitä ja ennuste. Olemme myös suoritettu toiminnallisia tutkimuksia vaikutusten arvioimiseksi FOXL1 ilmentymisen vaikutus proliferaatioon, apoptoosiin, muuttoliike ja invaasion GBC soluissa in vitro tai in vivo. Lisäksi olemme alustavasti tutkineet ilmentyminen E-kadheriinin ja sinkki sormen E-box sitova homeobox 1 (ZEB1), joka voi osaltaan estäviä vaikutuksia FOXL1 yli-ilmentymisen GBC.

Materiaalit ja menetelmät

Ethics selvitys

kokeista, joissa ihmisen ja eläimet hyväksynyt eettinen komitea Xinhua sairaala, Shanghai Jiaotong yliopiston School of Medicine. Kirjallinen suostumukset saatiin kaikista potilaista.

Potilaille ja kudoksen keräys

35 sairastavien potilaiden GBC (13 miestä ja 22 naista, ikäjakauma 51-71 vuotta, keski-ikä 61,9 ± 5,4 vuotta ) käsiteltiin radikaali cholecystectomy (ilman edeltävää sädehoitoa tai kemoterapiaa) vuosien 2008 ja 2013 Department of kirurgia, Xinhua sairaala, Shanghai Jiaotong yliopiston lääketieteellisessä otettiin tässä tutkimuksessa. Kasvainnäytteet (n = 35) ja viereisen nontumor näytteitä (n = 12) kerättiin välittömästi leikkauksen jälkeen ja upotettiin nestemäiseen typpeen. Mukaan TNM pysähdyspaikan järjestelmä (AJCC, 7

th, 2010), kasvaimet porrastettu (4 vaihe I, 12 vaihe II, 14 vaiheen III, ja 5 vaihe IV). Eriyttäminen arvosana mukaan WHO: n kriteerien oli seuraava: 13 tapausta olivat hyvin eriytetty (WD), 15 kohtalaisen eriytetty (MD) ja 7 huonosti eriytetty (PD). Histologinen diagnoosi kaikkien GBC vahvistettiin kaksi patologia.

immunohistokemia

Jäädytetyt kudosnäytteet upotettu optimaalinen leikkaamiseen lämpötila (MMA) yhdiste. 5-pm paksu kudosleikkeiden kasvainten ja nontumor kudokset leikattiin kudospaloista, ja sitten fiksoitiin kylmässä asetonissa 4 ° C: ssa 20 minuutin ajan. Kudosleikkeet inkuboitiin 3% (v /v) H

2O

2 metanolissa poistamiseksi endogeenisen peroksidaasin aktiivisuus ja salvattiin sitten normaalia vuohen seerumia. Jälkeenpäin osat käsiteltiin immunohistokemiaan käyttäen vasta-aineita FOXL1 (1: 100 laimennus; Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) ja toisen vasta-aineen (1: 500 laimennus; Santa Cruz Bio). Lopuksi, leikkeitä inkuboitiin peroksidaasi-kompleksi ja visualisoitiin 3,3′-diaminobentsidiiniä tetrakloridia (DAB). Kaikki immunovärjättiin leikkeet sokeasti tarkistaa kaksi riippumatonta patologia. Intensiteetti arvioitiin käyttäen 3-asteikko järjestelmä (0, negatiivinen, 1, heikko; 2, kohtalainen, 3, vahva). Prosentuaalinen positiivisuus arvioitiin myös käyttämällä 3-asteikolla järjestelmän (0, 5%, 1, 5% -25%, 2, 25% -50%, 3, 50%). Yleisenä kvantitointi immunohistokemiaan pisteet laskettiin kertomalla pisteet värjäytymisen intensiteettiä ja pisteet positiivisten solujen prosenttiosuuden. FOXL1 ekspressiotasoja rankattiin seuraavasti: – (pisteet 0-1), + (pisteet 2-3), ++ (pisteet 4-6) ja +++ (pisteet 6). Mukaan tulokset FOXL1 Immunovärjäyksen, GBC potilaat luokiteltiin kahteen ryhmään: pieni lauseke (- tai +) ja korkean ilmentymisen (++ tai +++).

Solulinjat ja viljelyolosuhteet

neljä ihmisen GBC solulinjoissa GBC-SD, SGC-996, NOZ ja OCUG-1 käytettiin tässä tutkimuksessa. GBC-SD solulinja hankittiin Cell Bank of Kiinan Academy of Sciences, Shanghai, Kiina; SGC-996 solulinjassa [9] saatiin Kasvain solubiologian tutkimuslaitos Tongji yliopiston, Shanghai, Kiina; NOZ ja OCUG-1 solulinjoja ostettiin Health Science Research Resources Bank, Osaka, Japani. Soluja viljeltiin joko DMEM tai RPMI1640 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), johon oli lisätty 1% penisilliini /streptomysiiniä (Invitrogen) ja 10% (v /v) naudan sikiön seerumia (HyClone, Logan, UT, USA) 37 ° C: ssa kosteutetussa 5% CO

2-inkubaattorissa.

Transfektiot

upregulate ilmentymisen FOXL1, pcDNA-FOXL1 (koodaa FOXL1 cDNA) konstruoitiin ja transfektoitiin GBC soluihin. Tyhjän vektorin pcDNA3.1 (Invitrogen) käytettiin kontrollina. Kloonausstrategiaan ja restriktiokartat Rekombinanttiplasmideista kuvassa S1. Transfektioreagenssi Lipofectamine 2000 aikana käytettiin transfektion mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti (Invitrogen). Saada stabiilit transfektantit, väliaine korvattiin tuoreella täydellistä alustaa, jota oli täydennetty 300 ug /ml genetisiiniä (G418) 48 tunnin jälkeen transfektion. Selektiivinen väliaine päivitetään joka 3-4 päivä, kunnes G418-resistentit kloonit voidaan tunnistaa. FOXL1 ekspressiotasot solulinjoissa tutkittiin RT-PCR: llä ja western blot-määrityksellä.

RNA: n eristys ja RT-PCR-analyysi

Kokonais-RNA uutettiin jäädytetyistä kudosnäytteistä ja GBC solulinjoja käyttämällä Trizol reagenssit kit (Gibco BRL, Gaithersburg, MD, USA). RNA: t muutettiin cDNA käyttämällä Takara RNA PCR Kit (Takara Bio Inc., Dalian, Kiina). Saatu cDNA monistettiin käyttäen seuraavaa menetelmää: 94 ° C (5 min), sitten 30 sykliä 94 ° C: ssa (30 s), 59 ° C (45 s), 72 ° C (45 s). Sekvenssit alukkeiden FOXL1 olivat seuraavat: Sense: cacggtactccacttccagt; Anti-sense: aacacttccctgaacccaca.

Solun elinkelpoisuus ja pesäkkeiden muodostumisen määritykset

Vesiliukoiset tetratsolium (WST) -1 analyysi suoritettiin mittaamaan solujen elinkelpoisuus transfektion jälkeen. 5 x 10

3 transfektoidut solut kuoppaa kohti ympättiin 96-kuoppalevyille ja niitä viljeltiin 24, 48, 72 tai 96 h. Sen jälkeen soluja inkuboitiin sitten WST-1-reagenssia 2 h ajan 37 ° C: ssa. Absorbanssi 450 nm: ssä mitattiin käyttämällä automaattista mikrolevyn lukijaa (Bio-Rad 5 Malli 550, Bio-Rad, Hercules, CA, USA) ja kasvukäyrän laskettiin.

pesäkemuodostusta , 1 x 10

3 transfektoidut solut kuoppaa kohti ympättiin 6-kuoppaisille levyille ja niitä kasvatettiin täydellisessä media 37 ° C: ssa. 14 päivän kuluttua kulttuurin, pesäkkeet värjättiin kristallivioletilla ja pesäkkeiden lukumäärä laskettiin automatisoidulla pesäkelaskuri (Alpha Innotech, San Leandro, CA, USA).

Vieraslajisiirteen kasvain kokeita

Ihon alle nude-hiirissä suoritettiin arvioimaan vaikutuksia FOXL1 ilmentymisen vaikutus solujen kasvuun ja kasvainten muodostumiseen in vivo. Mies ja Nainen Kateenkorvattomia (nu /nu) karvattomia hiiriä iältään 6-8 viikkoa saatiin Shanghai Laboratory Animal Center of Kiinan Academy Sciences ja majoitettu erityisissä taudinaiheuttajista vapaat (SPF) kunnossa. NOZ-solut transfektoitiin stabiilisti pcDNA-FOXL1 tai pcDNA3.1. Noin 1 x 10

7 FOXL1 yli-ilmentäviä soluja tai kontrolli solut suspendoitiin kokonaistilavuudessa 200 ui 1/1 (v /v) PBS /Matrigel (BD Biosciences, San Diego, CA, USA), ja sitten ihon alle ruiskutetaan kylkiin hiirillä. Noin 4 viikon kuluttua injektion kasvainsolujen, näkyvä ihonalainen kasvain tilavuudet mitattiin viikoittain jarrusatulat ja kasvaimen tilavuudet kussakin ryhmässä laskettiin kaavalla: tilavuus = pituus x leveys

2/2. Kaikki hiiret lopetettiin 6 viikon kuluttua havaintojakson. Ksenograftikasvaimissa kiinnitettiin formaliiniin ja sitten upotettiin parafiiniin. Tuumorin paino mitattiin ja merkittiin muistiin.

virtaussytometrinen analyysi apoptoosin

apoptoosia in vitro määritettiin virtaussytometrialla käyttämällä anneksiini V-FITC Apoptosis Detection Kit (BD Bioscience), mukaisesti valmistajan protokollaa. Lyhyesti, 24, 48 ja 72 h transfektion jälkeen pcDNA-FOXL1 tai pcDNA3.1, solut kerättiin, pestiin PBS: llä ja suspendoitiin uudelleen 1 x Binding Buffer. Sen jälkeen solut värjättiin FITC-anneksiini V: n ja PI-15 minuutin ajan ja analysoitiin virtaussytometrialla.

TUNEL-määrityksessä

apoptoosi kudososat ksenograftikasvaimissa arvioitiin Terminal deoksinukleotidyylitransferaasia dUTP nick end merkinnät (TUNEL) värjäys käyttäen in situ solukuoleman havaitseminen pakki, fluoreskeiini (Roche Diagnostics, Mannheim, Saksa) valmistajan protokollaa. Lyhyesti, ksenografti kasvainnäytteet parafiini käyttäen ksyleeniä ja etanolia. Kudosleikkeet inkuboitiin proteinaasi K: lla liuosta 15 minuutin ajan, jonka jälkeen inkuboitiin TUNEL reaktioseokseen. Sen jälkeen kudosta leikkeitä inkuboitiin muunnin-POD ja vastavärjättiin 4 ’, 6-diamino-2-fenyyli (DAPI). Fluoresenssia nähtiin fluoresenssimikroskopialla käyttäen sopivia viritys- ja emissio-suodattimet.

virtaussytometrinen analyysi mitokondrion kalvon potentiaalia

muutos mitokondrion transmembraanisen potentiaalin määritettiin virtauksen cytomery käyttämällä mitokondrion kalvon potentiaalia herkkiä fluorikromi väriaine JC-1. Lyhyesti, NOZ solut kerättiin 24, 48 ja 72 h transfektion jälkeen pcDNA-FOXL1 tai pcDNA3.1 ja pestään PBS: llä. Soluja inkuboitiin JC-1 (10 ug /ml PBS: ssä) 37 ° C: ssa 10 min. Värjätään solut pestiin kahdesti PBS: llä ja analysoitiin virtaussytometrialla.

Mitokondrioiden ja sytosolin uutteen valmistamiseksi

määrät mitokondrioiden sytokromi c: n ja sytosolin sytokromi c määritettiin käyttäen mitokondrioiden uutetta ja soluliman uutetta vastaavasti. Mitokondrioiden ja solulimafraktioita uutettu viljellyistä soluista Mitochondria /sytosoliin fraktiointi Kit (Abcam, Cambridge, UK) mukaan valmistajan protokollaa. Lyhyesti, sen jälkeen, kun pestiin jääkylmällä PBS: llä, transfektoituja soluja inkuboitiin sytosolin uuttopuskurilla sisältävä seos ditiotreitolia (DTT) ja proteaasi-inhibiittorit jäillä 10 min. Solut homogenoitiin varovasti käyttäen jääkylmää lasihomogenisaattorissa. Solususpensio sentrifugoitiin nopeudella 3000 rpm 4 ° C: ssa 10 min. Supernatantit sentrifugoitiin jälleen 13000 rpm 30 minuutin ajan erottamiseksi ehjä mitokondrioita (pelletit) ja sytosolifraktio (supernatantit). Pelletit suspendoidaan uudelleen 100 ul: lla mitokondriaalisen uuttopuskuria yhdistelmä, joka sisältää DTT: tä ja proteaasi-inhibiittorit ja vorteksoitiin 10 sekunnin ajan. Seos tallennettu mitokondriofraktiosta.

Western blot -määritys

Yhteensä proteiinit uutetaan NOZ soluista 48 tunnin kuluttua transfektion pcDNA-FOXL1 tai pcDNA3.1. Proteiinipitoisuus kvantifioitiin Bradfordin proteiinimäärityksellä. 40 ug proteiinia erotettiin 10-12% SDS-PAGE: lla ja sähköllä PVDF-kalvoille (Millipore, Bedford, MA, USA). Membraani blokattiin 5% rasvatonta kuivamaitoa, ja tutkittiin vastaavan ensisijaisen vasta-aineita (Santa Cruz Bio) yön yli 4 ° C: ssa, jonka jälkeen inkuboitiin piparjuuriperoksidaasiin kytketty sekundaarisia vasta-aineita (Santa Cruz Bio). Piparjuuriperoksidaasi aktiivisuus tehtiin näkyväksi käyttämällä tehostettua kemiluminesenssin (ECL) (Pierce, Rockford, IL, USA) ja altistettiin X-OMAT-Blue elokuva (Kodak, Rochester, NY, USA).

Solun muuttoliike ja invaasio määritys

Solun maahanmuutto- ja invaasiomääritys suoritettiin käyttäen 24-kuoppaista transwell kammio (Corning Inc., Corning, NY, USA) kanssa 8 um huokosia mukaan valmistajan protokollaa. Transfektoidut solut ympättiin päällystämättömän (migraatiokokeessa) tai Matrigel päällystettyjä (invaasiomääritys) kattohuoneeseen compartement seerumittomalla RPMI1640. RPMI1640 täydennetty 10% naudan sikiön seerumia sijoitettiin alakammioissa kuin kemoatrak-. 24 h inkubaation jälkeen solut yläpuolella suodattimen kalvo poistettiin pumpulipuikolla. Solut, jotka tarttuvat alemman kalvon pinnan kiinnitettiin 4% paraformaldehydillä 30 minuutin ajan ja värjättiin sitten kristallivioletilla 20 minuutin ajan.

Tilastollinen analyysi

Data esitettiin keskiarvo ± SD . Tilastollinen analyysi tehtiin SPSS 11.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, USA). Erot ryhmien välillä arvioitiin käyttämällä Studentin t-testiä tai One-Way ANOVA tai Kaplan-Meier log-rank tai chi-sqaured testi. Tilastollinen merkittävyys määritettiin P 0,05.

Tulokset

FOXL1 ilmaisun GBC ja sen suhteesta kliinis muuttujien

FOXL1 mRNA ja proteiini tutkittiin kasvaimen kudoksissa ja nontumor kudokset RT-PCR: llä, western blot ja immunohistokemia analyysi, vastaavasti. Kuten kuviossa 1A ja B, FOXL1 mRNA ja proteiini-tasot laskivat syöpäkudoksiin verrattuna Hyväksytty nontumor kudoksiin. Lisäksi 2 kasvaimen näytteen puuttuu FOXL1 mRNA ilmaisun ja 3 kasvaimen näytteen puuttuu proteiinin ilmentymistä.

(A) FOXL1 mRNA: n ekspression GBC kudoksissa ja Hyväksytty nontumor kudoksiin. T: GBC kudoksia; N, sovitettu nontumor kudoksiin. (B) FOXL1 proteiinin ilmentymistä GBC kudoksissa ja Hyväksytty nontumor kudoksiin. (C) immunohistokemia analyysi FOXL1 vuonna GBC kudoksissa ja Hyväksytty nontumor kudoksiin. Suurennus on 200 × ja Mittakaavapalkki on 50 pm. a: Positiivinen värjäytyminen FOXL1 vuonna nontumor kudoksissa; b: Positiivinen värjäytyminen FOXL1 hyvin eriytetty (WD) kasvaimet; c: Positiivinen värjäytyminen FOXL1 kohtalaisen eriytetty (MD) kasvaimet; d: Positiivinen värjäytyminen FOXL1 köyhissä eriytetty (PD) kasvaimet; (D) IHC pisteet GBC kudosten ja nontumor kudoksissa (P 0,05). (E) IHC pisteet varhaisen TNM (I ja II) kasvaimet ja myöhäinen TNM (III ja IV) kasvaimet (P 0,05). (F) IHC pisteet WD kasvaimia ja MD + PD kasvaimet (P 0,05). (G) Kaplan-Meier käyrät perustuvat FOXL1 ilmaisun tasoilla immunohistokemia GBC. Potilaat, joilla on korkea ilmentymisen FOXL1 on parempi tulos verrattuna niihin, joilla on alhainen ilmentyminen FOXL1 (P 0,05). (H) mRNA ja proteiini ilmentymistä FOXL1 in GBC-SD, SGC996, NOZ ja OCUG-1 solulinjoissa. (I) Transfektio pcDNA-FOXL1 palautettu ilmaus FOXL1 in NOZ soluissa. * Tarkoittaa merkitsevää eroa.

immunohistokemiallinen analyysi osoitti, että FOXL1 proteiini pääasiassa lokalisoitu ydin- syöpäsolujen ja normaalien epiteelisolujen (kuvio 1 C). FOXL1 proteiini ilmentyy runsaana normaaleissa kudoksissa, mutta on suhteellisesti vähemmän ilmaistu syöpäkudoksissa. Pisteet FOXL1-positiivisten immunovärjääminen GBC kudoksissa oli paljon alhaisempi kuin normaaleissa kudoksissa (P 0,05, kuvio 1 D). FOXL1 ilmentyminen oli merkitsevästi suurempi kasvaimia kanssa varhaisemmassa vaiheessa (I ja II) verrattuna kanssa myöhään (III ja IV) (P 0,05, kuvio 1 E). Ero pisteet FOXL1-positiivisten immunovärjäyksellä mitattiin myös välillä kasvaimen laadut (WD vs PD + MD) ja sen havaittiin olevan merkittävää (P 0,05, kuvio 1 F), korkeammat FOXL1 arvosanat WD ryhmissä. Lisäksi, korkeampi FOXL1 geenin ilmentyminen liittyi parempaan ennusteeseen (P 0,05, kuvio 1G).

endogeenisen FOXL1 mRNA: ta ja proteiinia, olivat havaittavissa GBC-SD, SGC996 ja OCUG-1-solulinjoja , mutta ei NOZ solulinja, joka on näin ollen valittu seuraavissa kokeissa (kuvio 1 H). Transfektion pcDNA-FOXL1 palautti mRNA ja proteiini tasoilla FOXL1 in NOZ solulinjassa (kuvio 1 i).

FOXL1 yliekspressio hillitsee NOZ solulinjan in vitro ja in vivo

in vitro vaikutus FOXL1 ilmentymisen vaikutus proliferaatioon ja kasvun NOZ solujen arvioitiin WST-1-määritystä. Yliekspressio FOXL1 esti merkittävästi proliferaatiota in NOZ-soluissa (P 0,05; kuvio 2A). Ja tämä kasvun estäminen oli aikariippuvainen.

(A) kasvu NOZ solujen inhiboitui merkittävästi transfektion jälkeen pcDNA-FOXL1 (P 0,05). (B) Colony muodostumisen NOZ soluja. Esitetyt tulokset edustavat kolmea koetta. (C) Transfektio pcDNA-FOXL1 merkittävästi vähensi siirtokunnan NOZ soluissa (P 0,05). (D ja E) FOXL1 yliekspressio vähensi ja paino ksenograftin kasvaimen (P 0,05). * Tarkoittaa merkitsevää eroa.

enemmän pitkäaikaisia ​​estovaikutus FOXL1 ilmentymisen vaikutus soluproliferaatioon arvioitiin pesäkemuodostusta. Merkittävä lasku pesäkkeen lukumäärä havaittiin FOXL1 yli-ilmentäviä soluja verrattuna säätökennoja (P 0,05, kuva 2B ja C).

tutkimiseksi edelleen roolin FOXL1 aiheuttavan kasvaimia ja kasvuun GBC in vivo, nude-hiirissä vahvistettiin implantoitu ihon alle FOXL1 yli-ilmentävät ja kontrollisoluja. -Ksenoqraftit muodostuu FOXL1 yli-ilmentävät solut kasvoivat paljon hitaammin kuin muodostama ohjaus soluja. FOXL1 yli-ilmentyminen in vivo indusoi merkittävästi vähentää sekä kasvaimen tilavuus (P 0,05, kuvio 2D) ja kasvaimen paino (P 0,05, kuvio 2E). Nämä havainnot ehdottivat, että FOXL1 estää kasvua GBC sekä in vitro ja in vivo.

FOXL1 yli-ilmentyminen edistää apoptoosia NOZ solulinjassa in vitro ja in vivo

induktio apoptoosin FOXL1 yliekspressio vitro ja in vivo tutkittiin käyttäen anneksiini V /PI-määrityksellä ja TUNEL-määrityksessä vastaavasti. Kuten kuviossa 3A ja B, merkittävän osuuden kasvu apoptoottisten NOZ-solujen (varhainen apoptoosi sekä myöhään apoptoosia) havaittiin transfektion jälkeen pcDNA-FOXL1 (P 0,05). Ja osuus myöhässä apoptoottisten tai nekroottisten solujen lisääntynyt ajan riippuvaisella tavalla (alkoi 24 tuntia ja saavutti huippunsa 72 h).

(A) apoptoosi NOZ-solujen in vitro tutkittiin anneksiini V /PI kaksinkertainen värjäystä. Solut, jotka värjäytyvät negatiiviseksi sekä anneksiini V ja PI ovat elinkelpoisia soluja (alhaalla vasemmalla). Solut, jotka värjäytyvät positiivisia anneksiini V ja negatiivisia PI on käynnissä varhain apoptoosin (alhaalla oikealla). Solut, jotka värjäytyvät positiivisiksi sekä anneksiini V ja PI ovat joko loppuvaiheen apoptoosin, tai joille kuolion (ylhäällä oikealla). Esitetyt tulokset edustavat kolmea koetta. (B) määrä apoptoottisten NOZ soluja (mukaan lukien varhainen apoptoosin, myöhään apoptoosin ja nekroosin) lisääntyi merkitsevästi transfektion jälkeen pcDNA-FOXL1 (P 0,05). (C) apoptoosi NOZ-solujen in vivo määritettiin käyttäen TUNEL-määritystä. Apoptoottiset solut visualisoida intensiivisesti vihreitä fluoresoivia soluja. Lukumäärä apoptoottisten solujen kirjattiin suuritehoisia kentät (400 x). Lokalisointi ytimet tehtiin näkyväksi counterstaining DAPI (sininen). (D) FOXL1 yliekspressio merkittävästi edistänyt apoptoosin NOZ solujen in vivo (P 0,05). * Tarkoittaa merkitsevää eroa.

TUNEL testi osoitti, että FOXL1 yliekspressio edistää apoptoosia NOZ solujen ksenograftikasvaimissa. Oli vähemmän TUNEL-positiivisten solujen ksenograftikasvaimissa muodostama ohjaus soluja. Sitä vastoin, keskimääräinen lukumäärä TUNEL-positiivisten solujen huomattavasti ksenograftikasvaimissa muodostettu FOXL1 yli-ilmentäviä soluja (P 0,05, kuvio 3C ja D).

FOXL1 yli-ilmentyminen indusoi mitokondrion transmembraanisen depolarisaation ja sytokromi c-välitteisen apoptoosin

mitokondrion kalvon potentiaali (ΔΨm) osoittaa aloittamisesta ja aktivointi joidenkin apoptoottisten porrastetusti. Esillä olevassa tutkimuksessa, ΔΨm tutkittiin JC-1 värjäys. Menetys ΔΨm määritettiin muutos JC-1 fluoresenssi punaisesta vihreäksi. Kuten kuviossa 4A ja B, osuus punaisen fluoresenssin-positiiviset solut vähenivät, kun taas osuus vihreän fluoresenssin-positiivisten solujen lisääntynyt transfektion jälkeen pcDNA-FOXL1 (P 0,05), mikä viittaa siihen, FOXL1 yli-ilmentyminen indusoi ilmeistä vähenemistä mitokondrion kalvon potentiaalia .

(A) menetys mitokondrion kalvon potentiaali (ΔΨm) on merkitty lasku punainen /vihreä fluoresenssi-intensiteetin suhde. X-akseli osoittaa vihreän fluoresenssin intensiteetti; Y-akseli osoittaa punaisen fluoresenssin intensiteettiä. Esitetyt tulokset edustavat kolmea koetta. (B) osuus punaisen fluoresenssin-positiiviset solut vähenivät, kun taas osuus vihreän fluoresenssin-positiivisten solujen lisääntynyt transfektion jälkeen pcDNA-FOXL1 (P 0,05). (C) Western blot-analyysi osoitti tasoa sytosolin sytokromi c lisääntyi merkittävästi, kun taas taso mitokondrion sytokromi c merkittävästi vähentynyt. (D) tasot pilkottiin kaspaasi-9, 3 ja PARP: n ja Bax olivat koholla, kun taas taso bcl-2-oli vähentynyt. * Tarkoittaa merkitsevää eroa.

Mitokondrioiden ja sytosolin sytokromi c tutkittiin western blot -määritys. Taso sytosolin sytokromi c oli merkittävästi koholla, kun taas taso mitokondrion sytokromi c oli merkittävästi vähentynyt 48 h kuluttua transfektion pcDNA-FOXL1, mikä viittaa siihen, että FOXL1 yliekspressio edistetään sytokromin c vapautumista mitokondrioita sytosoliin (kuvio 4C). Sytokromi c oksidaasi alayksikköä IV (Cox IV) ja β-aktiini käytettiin kontrollina mitokondrioiden proteiinia ja soluliman proteiiniin, vastaavasti. Lisäksi olemme huomanneet, pcDNA-FOXL1 indusoi kasvua Bax /Bcl-2-suhde, joka voi laukaisevat sytokromi c välillä mitokondrioita sytosoliin.

vaikutukset FOXL1 ilmentymisen vaikutus kaspaasit aktivaation NOZ-soluissa oli lisäksi tutkittiin Western blot. Olemme havainneet, että lohkaisu kaspaasi-9 ja -3 oli merkittävästi lisääntynyt 48 h transfektion jälkeen pcDNA-FOXL1. Lisäksi, lohkaisu poly (ADP) -ribose polymeraasia (PARP), joka on tunnusomaista apoptoosia lisääntyi myös huomattavasti transfektion jälkeen pcDNA-FOXL1 (kuvio 4D). Nämä havainnot ehdottivat, että FOXL1 yliekspressio aktivoitu kaspaasi cascades in NOZ soluissa.

FOXL1 tukahdutetaan muuttoliike ja invaasion NOZ solujen ja indusoi E-kadheriinin ilmentymisen

Koska yhdistys FOXL1 ilmaisun kliiniseen vaiheeseen ja imusolmuke etäpesäke GBC oli osoitettu edellä, se on odotetusti että FOXL1 voi olla rooli muuttoliikkeen ja hyökkäystä GBC. Siksi me seuraavaksi arvioidaan roolin FOXL1 maahanmuuttoprosessissa ja hyökkäys GBC. Kuten kuviossa 5A-C, transfektion pcDNA-FOXL1 aiheuttama merkittävä lasku määrän muuttavien ja invasiivisen NOZ soluja verrattuna kontrolliryhmiin (P 0,05), mikä viittaa FOXL1 yliekspressio heikensi vaeltavia ja invasiivisia kyvyt NOZ solujen . Lisäksi löysimme E-kadheriinin proteiinin taso oli merkittävästi kohonnut 48 h kuluttua transfektion pcDNA-FOXL1, kun taas taso ZEB1 proteiinin väheni merkittävästi (kuvio 5D).

(A) määrä vaeltavia ja invasiivisia solut värjättiin kristallivioletilla heijastuu niiden muuttavien ja invasiivisen kapasiteettia. Lukumäärät muuttavien tai invasiivisen NOZ solua näkökentässä laskettiin mikroskopialla jälkeen kristalliviolettia värjäyksen (× 100). (B ja C) Transfektio pcDNA-FOXL1 esti merkittävästi maahanmuutto- ja invaasion NOZ solujen (P 0,05). (D) ZEB1 ilmentyminen tukahdutetaan ja E-kadheriinin ilmentyminen indusoitiin FOXL1 yli-ilmentyminen. * Tarkoittaa merkitsevää eroa.

Keskustelu

roolit Forkhead perheenjäsenten kuten FOXOs, FOXMs ja FOXPs syövät on laajalti tutkittu. On kuitenkin olemassa muutamia tutkimuksia sääntelystä ja toiminta FOXL1 syövissä. Esillä olevassa tutkimuksessa, rooli FOXL1 kasvuun, apoptoosin, muuttoliike ja hyökkäys GBC solun alustavasti tutkittu. Löysimme tasot FOXL1 mRNA ja proteiini oli merkittävästi vähentynyt GBC kudoksissa verrattuna Hyväksytty nontumor kudoksiin. Lisäksi GBC, lasku ilmaus FOXL1 havaittiin myös muiden tutkijoiden haimatuumorien [10], [11]. Lisäksi FOXL1 ilmentyminen korreloi negatiivisesti kehittynyt TNM ja huono erilaistumista GBC. Lisäksi korkeampi FOXL1 ilmentyminen liittyi parempaan ennusteeseen potilailla, joille tehdään leikkaus GBC. Nämä havainnot ehdottivat, että downexpression of FOXL1 voi olla osallisena kasvainten synnyssä ja etenemisessä GBC ja FOXL1 voi olla hyödyllinen ennustaja ennuste niille leikkauspotilaiden. Samanlaisia ​​tuloksia havaittiin myös myelooman ja haimasyövän [8], [12]. Kuitenkin mekanismit downexpression of FOXL1 ilmaisun näiden syöpien ei ole vielä selvitetty. Useat mekanismit, kuten kromosomaalinen deleetio [13], kromosomi translokaatiot [14], [15], promoottori metylaatio [16], muutos alkupään sääntelyviranomaiset [17], [18] ja translaation jälkeiset modifikaatiot [4] on osoitettu edistää sääntelyn purkamiseen Fox tekijöistä. Perustuen esillä olevat tulokset, on vaikea sanoa, mikä järjestelmä oli vastuussa downregulation FOXL1 in GBC. Lisätutkimuksia geneettiseen ja epigeneettiset mekanismit vapautettu FOXL1 geeniekspression pitäisi suorittaa asian selvittämiseksi.

korrelaatio suurempi FOXL1 ilmaisutapoja alkuvaiheen ja paremmin ennuste ehdotti sen mahdollisen tukahduttava rooli GBC solujen kasvua ja etenemistä. Siksi toteutimme joukon toiminnallisia tutkimuksia vaikutuksen arvioimiseksi FOXL1 kasvuun, apoptoosin, muuttoliike ja hyökkäys GBC solulinjan.

yli-ilmentyminen FOXL1 esti merkittävästi kasvua NOZ solujen in vitro ja in vivo, ja tämän kasvun inhibitio voi johtua apoptoosin induktio FOXL1 yli-ilmentyminen. Apoptoosi on biologinen prosessi, johon liittyy geneettisesti ohjelmoitu tapahtumasarja johtaa solun kuolemaan. Tämän prosessin aikana useita keskeisiä tapahtumia esiintyy mitokondrioita, esimerkiksi vapauttamaan sytokromi C mitokondrioita sytoplasmaan ja mitokondrion transmembraanisen potentiaali (ΔΨm) [19], [20]. ΔΨm on tärkeä parametri mitokondrioiden toimintaa ja sitä on käytetty indikaattorina eläviä soluja. Bcl-2-perheen, joka koostuu pro- apoptoottisen ja anti-apoptoottiset jäsenet säätelee mitokondrioiden reitin apoptoosin ohjaamalla läpäiseväksi ulomman mitokondrion kalvon ja avaamisen jännitteestä riippuva anioni kanava (VDAC). Pro-apoptoottinen proteiini, kuten Bax nopeuttaa avaaminen VDAC, kun taas anti-apoptoottisen proteiinin Bcl-x (L) sulkee VDAC sitoutumalla siihen suoraan. Lisäys Bax /Bcl-2 suhde voi johtaa häiriöitä ΔΨm ja avaamisesta VDAC. Myöhemmin mitokondrioiden sytokromi c voi translokoituvat sytosoliin kautta VDAC ja käynnistämään apoptoosin [21].