Krooninen sairaus

tiivistelmä

Anti-Mesothelin

Pseudomonas

eksotoksiini A-pohjainen rekombinantti immunotoksiineja (rits) aiheuttaa mahdollisen hoitomuotoa haiman adenokarsinooma (PDAC). Tutkia mekanismeja vastus, herkkä PDAC solulinjaa KLM-1 oli ajoittain altistettiin anti-Mesothelin SS1-LR-GGS RIT. Elossa solut olivat resistenttejä erilaisia ​​anti-Mesothelin Rits (IC

50s 1 ug /ml), mukaan lukien uudet deimmunisoidut RG7787. Nämä resistentit KLM-1-R-solut olivat yhtä herkkiä anti-CD71 HB21 (Fv) -PE40 RIT kuin KLM-1, mikä osoittaa, vastus oli spesifinen anti-Mesothelin Rits. Mesothelin geenin ilmentyminen oli osittain alas-säädellä KLM-1-R, mikä johtaa 5 kertaa pienempi pinta-proteiinin tasoja ja vähensi soluunottoa RG7787 verrattuna KLM-1. Bisulfiitti sekvensointi analyysissä havaittiin, että Mesothelin promoottorialue oli huomattavasti metyloitu KLM-1-R (59 ± 3,6%) verrattuna KLM-1 (41 ± 4,8%), mikä osoittaa, hypermetylaation mekanismina Mesothelin downregulation. DNA-metyylitransferaasi-inhibiittorin 5-atsasytidiini palautettu alkuperäinen Mesothelin pinnan ilmentyminen yli puolet KLM-1-R, ja lisääntynyt herkkyys RG7787 (IC

50 = +722,4 ± 232,6 ng /ml), vaikka solut pysyivät merkittävästi vähemmän herkkiä kuin vanhempien KLM-1-soluissa (IC

50 = 4,41 ± 0,38 ng /ml). Mesothelin cDNA käyttöönotto KLM-1-R johti 5-kertainen pinta-proteiinin tasot ja merkittävästi korkeampi RG7887 otto verrattuna KLM-1. Tämän seurauksena alkuperäinen herkkyys RG7787 oli täysin palautettu (IC

50 = 4,49 ± 1,11 ng /ml). Huomattavan suuri RG7787 otto siten, että se pääsee alkuperäistä sytotoksisuuden resistentit solut, vihjaten että solunsisäinen RIT ihmiskauppa on myös rajoittava tekijä. RNA syvä Sekvensointianalyysin KLM-1 ja KLM-1-R solut tukivat kokeellisia havaintoja; verrattuna KLM-1, resistentit solut näytetään olevien geenien erilainen ekspressio liittyy solunsisäinen liikenne ja ilmaisu malli, joka täsmäsi hieman yleisempi hypermetylaation tila. Lopuksi vastustuskykyä Mesothelin Rits KLM-1 on sidottu metylaation liittyvän alas-säätely Mesothelin, kun taas poikkeamat RIT kaupan voisi olla rooli.

Citation: Hollevoet K, muurausmate- Osann E, Müller F, Pastan I (2015) metylointi-Associated Osittainen Down-asetus Mesothelin aiheuttaa vastustuskykyä Mesothelin Immunotoksiinit on Haimasyöpä Cell Line. PLoS ONE 10 (3): e0122462. doi: 10,1371 /journal.pone.0122462

vastaanotettu: 23 joulukuu 2014; Hyväksytty: 17 helmikuu 2015; Julkaistu: 24 maaliskuu 2015

Tämä on avoin pääsy artikkeli, vapaa kaikki tekijänoikeudet, ja saa vapaasti jäljentää, levittää, välittää, modifioitu, rakennettu, tai muuten käyttää kuka tahansa laillista tarkoitusta. Teos on saatavilla Creative Commons CC0 julkisuuteen omistautumista

Data Saatavuus: kaikki asiaankuuluvat tiedot ovat paperi- ja sen tukeminen Information tiedostoja.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukee Intramural tutkimusohjelma National Institutes of Health, National Cancer Institute, Center for Cancer Research, ja jonka Cooperative tutkimuksen ja kehityksen sopimus (# 2791) välillä National Cancer Institute ja Roche Pharmaceuticals. Tämä ei muuta tekijöiden noudattaminen PLoS One politiikkaa jakaa tietoja ja materiaaleja. K.H. tuettiin osittain tieteellisen tutkimuksen rahasto Flanders (FWO, Belgia). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistelua käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Tämä tutkimus oli osittain tuettu Roche Pharmaceuticals. I.P. on keksijä useita patentteja immunotoksiineja jotka on kaikki osoitettu NIH (mukaan lukien US 8357783 ”Ihmisen anti-Mesothelin monoklonaalisia vasta-aineita”, US 20120263674 ”Pseudomonas eksotoksiini A alentunut immunogeenisyys” ja US 20140094417 ”Pseudomonas eksotoksiini A vähemmän immunogeenisiä T-solujen ja /tai B-solu- epitooppien ”). Tämä ei muuta tekijöiden noudattaminen PLoS One politiikkaa jakaa tietoja ja materiaaleja.

Johdanto

laboratorio kehittää rekombinantti immunotoksiineja (Rits) syövän hoitoon. Nykyiset rits kliinisissä tutkimuksissa koostuvat antigeeniä sitovan Fv fuusioituna 38-kDa: n osuus

Pseudomonas

eksotoksiini A (PE) [1]. Sen jälkeen kun reseptorivälitteisen endosytoosin, Rits ovat proteolyyttisesti, ja PE ehdotetaan liikennettä trans-Golgi-verkon ja liikkua taaksepäin polku Endoplasmakalvosto, jossa se käy läpi translokaatio solulimaan [2]. Saapuessaan sytosoliin, PE suunnattu elongaatiotekijä-2 (EF-2). Aikuinen EF-2 tuotetaan posttranslational muuttaminen histidiinin 715, jonka Diphthamide Biosynteesissä proteiinit (DPH) 1-5 ja 7 [3, 4]. Tämä modifioitu histidiini ( ”diphthamide ’) on ADP-ribosyloi PE, joka inaktivoi EF-2 ja pysäyttää proteiinisynteesiä, joka lopulta johtaa ohjelmoidun solukuoleman [2].

aiemmin eristetty ja karakterisoitu useita leukemiasolulinjoilla vastustuskykyinen

Moxetumomab pasudotox

[5-7], anti-CD22 RIT vaiheessa III kliinisessä tutkimuksessa (ClinicalTrials.gov Identifier: NCT01829711). Nämä resistentit solulinjat osoittavat eri poikkeavuuksia DPH ilmaisua, jotka estävät EF-2 ADP-ribosylaatio- ja suojaavat soluja inhibition [5-7]. SS1 (dsFv) -PE38 (SS1P), toinen RIT kliinisissä kokeissa, tavoitteet Mesothelin, 40 kDa solun pinnalla glycophosphatidylinositol (GPI) ankkuroitunut proteiini [8], joka on hyvin ilmaistu useissa maligniteetteja, mukaan lukien mesoteliooma ja haiman adenokarsinooma ( PDAC) [9-11]. SS1P on kliinistä aktiivisuutta yksittäisenä aineena, lähinnä siksi, annosta rajoittava PE immunogeenisuutta potilailla [12, 13]. Vastauksena SS1P on yhdistetty immuunijärjestelmän heikentävien kemoterapia-, jolloin ennennäkemättömän hoitovasteita tulenkestävät kehittynyt mesoteliooma [14], ja matala-immunogeeninen Rits on suunniteltu, jossa monet B- tai T-soluepitooppeja ja proteaasia-herkillä alueilla of PE38 poistetaan. Jälkimmäinen johti katkaistu ja deimmunisoidut 24-kDa toksiiniosasta (PE24), joka on vähemmän reaktiivisuus ihmisen anti-seerumia, on vastustuskykyinen lysosomaalisen hajoamisen, ja näyttää vähentynyt epäspesifinen myrkyllisyys jyrsijöiden

in vivo

[15-18]. Yhteistyössä Rochen Innovation Centerin Penzberg, Saksa, tämä PE24 selkäranka on integroitu uusi anti-Mesothelin RIT, nimeltään RG7787, yhdistämällä se humanisoitua anti-Mesothelin Fab, mikä lisää kokoa ja verenkierron puoliintumisaika [19].

osoittivat äskettäin, että RG7787 on merkittävä aktiivisuus on PDAC ksenograftimallia, joka on perustettu oksastamalla KLM-1-soluja immuunivasteen hiirissä. RG7787 oli myös sytotoksinen vastaan ​​useita muita PDAC solulinjat, vaikka

in vitro

soluntappokyky ollut ehdoton [19]. Olemme aiemmin raportoitu, että epätasapaino pro- ja anti-apoptoottiset proteiinit suojaa syöpäsolujen, mukaan lukien PDAC, PE-indusoidun solukuoleman [20-22]. Jotta saadaan käsitys muihin resistenssin tavoitteena oli selvittää eristää ja karakterisoida soluja KLM-1, jotka olivat resistenttejä anti-Mesothelin Rits.

Materiaalit ja menetelmät

Yhdistelmä immunotoksiineja ja reagenssit

Kliininen-luokan anti-Mesothelin SS1P ja anti-CD25 LMB-2 [anti-Tac (Fv) -PE38] valmistettiin ja toimittanut Advanced BioScience Laboratories, Inc. (Kensington, MD). huSS1 (Fab) -LR-GGS-LO10-PE24 (RG7787) toimitti Roche Innovation Center Penzberg, Saksa alla Cooperative tutkimuksen ja kehityksen sopimus (# 2791). Anti-Mesothelin SS1 (dsFv) -LR-GGS-PE24 (SS1-LR-GGS) ja anti-CD71 immunotoksiinille HB21 (Fv) -PE40 tuotettiin laboratoriossamme, mukaan vakioprotokolla [23]. Sekä SS1-LR-GGS ja RG7787 uudelleen suunniteltu low-immunogeeninen versiot SS1P jotka koostuvat PE24 fragmentin. Tiettyjen muutosten muun muassa poistaa suurimman osan PE domeeni II, jolloin furiinilohkaisu-, ja lisäämällä Gly-Gly-Ser (GGS) -pohjaisen peptidilinkkerin jälkeen furiinilohkaisu-. RG7787 on edelleen optimoitu kliiniseen käyttöön korvaamalla hiiren anti-Mesothelin Fv (SS1), jossa on humanisoitu Fab (huSS1), kasvattaa kokoa ja siten puoliintumisaika verenkierrossa, ja ottamalla käyttöön seitsemän mutaatioiden (R505A, R427A, R490A, R467A, D463A, R456A, ja R538A) on katalyyttinen domeeni III PE vaientaa B-soluepitooppeja [19]. 5-atsasytidiini (AZA) (Sigma) on DNA-metyylitransferaasi inhibiittori, ja liuotettiin RPMI-1640-väliaine.

Soluviljely

PDAC solulinjaa KLM-1 [24] säilytettiin RPMI-1640 ja toimitti vuonna 2011 Dr. Udo Rudloff (NCI, Bethesda, MD), joka alun perin saatu solulinja päässä RIKEN Cell Bank. Epi- syöpä A431-solulinjaa ylläpidettiin DMEM ja lahjoitti vuonna 1982 Dr. George Todaro (NCI, Bethesda, MD), joka alun perin eristettiin solulinjasta [25]. Media oli täydennetty 10% FBS: ää, 2 mM L-glutamiinia, 1 mM natriumpyruvaattia, 100 U /ml penisilliiniä ja 100 ug /ml streptomysiiniä (Invitrogen). Eristämiseksi resistentit solut, 3 x 10

5 KLM-1-solut ympättiin 6-kuoppaiselle levylle ja inkuboitiin 1 ug /ml SS1-LR-GGS 72 tuntia, joka tappoi yli 90% soluista (S1 Kuva.). Jäljellä soluja lisättiin 5 viikkoa RIT-free-solujen väliaineessa, minkä jälkeen toinen kierros valinta suoritettiin samalla tavalla 1 ug /ml SS1-LR-GGS, jolloin KLM-1-R. Nämä solut laajennettiin RIT-väliaineessa ja säilytettiin kannattavasti jäädytettiin N

2 lisätutkimuksiin. Solulinjaa identiteetit varmennettiin käyttämällä lyhyitä tandem uusintaa (NCI, Frederick, MD). Kaikki solut pidettiin 37 ° C: ssa kostutetussa inkubaattorissa 5% CO

2.

Solujen proliferaatio, solukuolema ja proteiinisynteesin inhibition määritykset

KLM-1 ja KLM-1 R solujen kasvua verrattiin laskemalla elävät solut kanssa Cellometer Vision (Nexcelom). Kuolleet solut suljettiin käyttäen trypaanisini värjäystä, ja kunakin ajankohtana laskettiin kolmena kappaleena. Arvioida hoidon vaikutus, Rits lisättiin noin 16 tuntia kylvämisen jälkeen solut 6- tai 96-kuoppaiselle levylle. Kasvun esto arvioitiin mittaamalla ATP-tasot kanssa Cell Titer-Glo Luminescent solunelinkykyisyysmääritys (Promega). Arvot normalisoitiin valvonnan välillä 1 uM staurosporiinin (Sigma-Aldrich) ja puskurin (Dulbeccon fosfaattipuskuroitu suolaliuos ilman Ca ja Mg (D-PBS), Quality Biological, Inc.), joka sisältää 0,2% ihmisen seerumialbumiinia (Division of Veterinary Resources, NIH , Bethesda, MD) tai keskipitkällä. Kirkas-field kuvat on otettu Zeiss mikroskooppi 10x EY Plan-NeoFluar tavoite käyttämällä AxioCam MRc kameran ja AxioVision 4.7.2 hankinta ohjelmisto. Solukuolemaa arvioitiin käyttämällä anneksiini V-PE Apoptosis Detection Kit I (BD Pharmingen), mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Apoptoottisia soluja pidettiin anneksiini V-positiivisia, määritettynä gating käsittelemättömistä soluista. Inhibition kvantifioitiin mittaamalla [

3H] leusiinilla (Perkin Elmer) sisällyttäminen valmiiksi aiemmin [22]. Arvot esitetään suhteessa kontrolleihin D-PBS 0,2% ihmisen seerumin albumiinia ja 100 ug /ml cycloheximide- (Sigma-Aldrich) käsiteltyihin kontrolleihin.

Reaaliaikainen RT-qPCR

RNA eristetty ja puhdistettu soluista käyttämällä RNeasy-kittiä (Qiagen), käänteinen transkriptio suoritettiin kanssa QuantiTect Reverse Transcription kit (Qiagen), ja vahvistus kanssa QuantiFast SYBR Green PCR-pakkausta (Qiagen). Alukesekvenssit DPH1-5, DPH7, Mesothelin, ja β-aktiini on esitetty S1 taulukossa. Reaaliaikainen RT-qPCR suoritettiin ABI HT 7900 RT-PCR kone, analysoitiin käyttämällä vertailevan C

T-menetelmä (ΔΔ

C

T) menetelmällä SDS manager (Applied Biosystems) ja normalisoitu endogeenisen β-aktiini.

Pinta-proteiinin ilmentymistä virtaussytometrialla

hiiren anti-ihmisen Mesothelin (MN, Rockland Immunochemicals, Inc.), ja R-PE-anti-humaani CD71 ( Biolegend) käytettiin arvioimaan pinnan proteiinin ilmentymisen. Hiiren IgG-R-PE-isotyyppikontrollilla (BD Biosciences) käytettiin negatiivisena kontrollina Mesothelin värjäystä. Anti-Mesothelin ja isotyyppikontrolli värjättiin sekundäärisen vuohen anti-hiiri-IgG-R-PE: tä (1: 250 laimennos, Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.). Fluoresenssi-intensiteetti analysoitiin virtaussytometrialla FACSCalibur. QuantiBRITE R-PE-helmiä (BD Pharmingen), käytettiin määrittämään useita Mesothelin-sitoutumiskohtien solua kohden.

Shed Mesothelin tasoja solujen väliaineessa

Liukenee Mesothelin tasoilla solulinjassa väliaineessa mitattiin kahtena kanssa Mesothelin Meso Scale Pitoisuus (Morphotek, Inc.) käyttäen elektrokemoluminesenssin teknologiaa Meso Scale Discovery. Solut ympättiin säännöllisesti soluviljelyalustaan ​​12-kuoppalevylle. Kun 20 tuntia, kasvatusliuos kerättiin, tilavuus mitattiin ja solujen määrä kuoppaa kohti laskettiin. Sentrifugoinnin jälkeen väliaine, supernatantit säilytettiin -80 ° C: ssa analyysiin asti. Cell Supernatantti laimennettiin 50-kertaiseksi ja lisättiin kuoppiin 96-kuoppaisella levyllä joka aiemmin oli päällystetty sieppausvasta-aineena. Menettely suoritettiin, kuten aiemmin on kuvattu [26], ja signaalit mitattiin MSD Discovery Workbench (Meso Scale Discovery). Määrä Mesothelin irtoa KLM-1 ja KLM-1-R laskettiin kertomalla saatu Mesothelin keskittymän hyvin tilavuus, ja standardisoitu määrä laskettiin solua kuoppaa kohti.

RG7787 soluunottokokeissa

rits leimattiin Alexa Fluor 647 Labeling Kit (Invitrogen) 3,5 tunnin ajan ja puhdistettiin valmistajan ohjeiden mukaisesti. Kerätyt solut inkuboitiin 30, 75 ja 150 minuutin ajan 37 ° C: ssa kyllästää 2 ug /ml SS1P-Alexa647 tai RG7787-Alexa647 ja käsitellään kuten aikaisemmin on kuvattu [22]. Fluoresenssi-intensiteetti analysoitiin FACSCalibur. Sisäänotto ilmaistu useissa internalized RG7787 molekyylejä, joka laskettiin olettamalla RG7787-Alexa647 GEOMEAN pinnalla ilmentymistä KLM-1, joka on 60 x 10

3 RG7787 molekyylejä (= pinta Mesothelin sitoutumiskohtia kohti KLM-1 solun, kuten arvioitiin virtaussytometrillä ja QuantiBRITE R-PE-helmiä).

metylointi analyysi

arviointi metylaatiostatuksen, joka alue Mesothelin-geenin promoottori päällä tehtiin EpigenDx (Hopkinton, MA). Bisulfiittimodifikaatio toteutettiin käyttäen Zymo Research EZ Metylointi Gold kit. Genomi-DNA: ta (500 ng) käytettiin bisulfiittimodifikaatio, jota seurasi PCR-monistus käyttämällä Hot Star Taq-polymeraasia (Qiagen). Pyrosekvensointi suoritettiin käyttäen PSQ HS 96 pyrosekvensointi System (Qiagen). Analysoidut alue valittiin perustuen saatavilla alukkeita (ADS2475-RS1 ja ADS2475-RS2) at EpigenDx, joka kattoi 147 emäsparin alue ylävirtaan Mesothelin transkription aloituskohdasta (CHR 16: 808890-808742, ENST00000563941). Metylointi kvantifiointi suoritettiin PyroQCpG ohjelmisto, joka laskee jokaisen yksittäisen CpG suhde sen metyloidut ja metyloitumattomien muodossa, jolloin keskimääräinen prosenttiosuus metylaation asteen.

Mesothelin transfektion KLM-1-R

KLM-1-R-solut transfektoitiin Lipofectamine (Invitrogen), jossa ohjaus pcDNA3.1 (+) (Invitrogen) tai pMH107, joka on pcDNA3.1 (+) -vektori, jossa täyspitkän Mesothelin cDNA: n ja genetisiiniä valintamerkkinä [27]. Solut transfektoitiin kolme päivää, valitaan 6 ug /ml Geneticiniä, ja ylläpidetään säännöllisesti RPMI 3 ug /ml genetisiiniä. Yhden solulajittelussa kanssa FACSVantage SE (BD Biosciences) ja myöhemmät myöhemmin laajenemisen tuloksena monoklonaalinen solulinjassa KLM-1-R-

Msln

että korkeasti ja tasaisesti ilmaisi Mesothelin pinnallaan.

toksiinin aiheuttama ADP-ribosylaatio EF-2

Solut lyysattiin RIPA-puskurissa proteaasin estäjien (Roche Applied Science), ja 3 ug solulysaattia inkuboitiin ADP-ribosylaatio-puskurissa [20 mM Tris-HCI (pH 7,4), 1 mM EDTA, ja 50 mM DTT: tä], 5 uM 6-Biotin-17-NAD (Trevigen) ja 10 ng RG7787 eri ajankohtina 25 ° C: ssa. Näytteet altistettiin SDS /PAGE ja sen jälkeen Western blottauksella streptavidiini HRP-konjugaattia (Invitrogen) havaitsemiseksi biotiini ADP-ribosyloi EF-2.

Western blot

Solut kerättiin, pestiin D- PBS, ja liueta RIPA-puskurissa proteaasinestäjien kanssa (Roche Applied Science). Proteiinikonsentraatiot määritettiin käyttämällä Coomassie Plus -kittiä (Pierce). Yhtä suuret määrät proteiinia, ladattiin NuPAGE 4% -12% Bis-Tris geeleillä (Invitrogen) ja SDS-PAGE: lla ja siirrettiin nitroselluloosamembraaneille (Invitrogen). Seuraavat ensisijainen vasta-aineita käytettiin: hiiren anti-MN (Rockland), kanin anti-EF-2 # ab33208 (Abcam) ja hiiren anti-β-aktiini # 8226 (Abcam). HRP-konjugoitua hiiren toissijainen vasta (Santa Cruz Biotechnology) visualisoitiin ECL tai ECL Plus alustoille (GE Healthcare). EF-2-proteiinin tasot olivat laskettu ja oikaistu β-aktiini Image J [28].

RNA syvä sekvensointi ja tietojen analysointi

Yhteensä RNA eristettiin KLM-1 ja KLM-1 R-soluihin käyttäen Qiagen RNeasy kit, ja kolonniin DNA digestion (Qiagen) suoritettiin valmistajan ohjeiden. Sen jälkeen RNA laadunvalvonta Agilent Bioanalyzer, kokonais-RNA näytteet lähetettiin kirjaston rakentamiseen ja syvä sekvensointi NCI ydin laitos (Bethesda, MD). Raaka sekvenssit laatua valvotaan ja tasataan RefSeq [29]. Raaka laskee normalisoituivat ja ladataan Qlucore OMICS Explorer v_3.0 (35) ero ilmentymisanalyysiä. Soveltamalla Qlucore n varianssi suodatin, luettelo 989 merkittävimmin muuttunut geenejä syntyi jota jakaa ylä- ja alas geenien.

Gene Set Enrichment Analysis

(GSEA) linjaus suoritettiin sisältäpäin Qlucore. Jotta mukautuminen Gene Ontology- (GO), Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomit (Kegg) – ja Reactome-polkuja, ylä- ja alassäädetty geeni lista ladattiin string-db.org [30] ja p-arvot aineistoja merkittäviä muutoksia poimittiin.

tilastollinen

Kokeet tyypillisesti itsenäisesti ainakin kaksi kertaa, ja edustavia tai keskimääräinen tietoja näytetään. Tiedot esitetään keskiarvona ± mittauksen keskivirhe rinnakkaisten kokeiden. Applied tilastot sisältävät Student t-testejä tai yksisuuntainen ANOVA Tukeyn useita vertailutestejä. Tilastollinen analyysi ja kuvassa laatiminen suoritettiin käyttämällä GraphPad PRISM 6 (GraphPad Software, Inc.).

p

-arvo on vähemmän kuin 0,05 katsottiin tilastollisesti merkitsevä, ellei toisin mainita.

Tulokset

KLM-1 jälkeen eristettyjen solujen SS1-LR-GGS inkuboinnin ovat resistenttejä anti-Mesothelin Rits

Kuten kuvattu menetelmät jaksossa, KLM-1-soluja ajoittain altistuvan SS1-LR-GGS ja eloonjääneiden solujen (KLM-1-R) laajennettiin RIT väliaineessa. KLM-1 ja KLM-1-R solut olivat erottamattomat kirkkaan kentän mikroskopia (S2A Fig.) Ja virtaussytometrillä eteenpäin ja sivusironta, osoittaa paikallista solun koko ja rakeisuus (S2B Fig.). Soluproliferaatiota verrattiin ymppäämällä 1 x 10

5-solut päivänä 0, ja laskemalla elinkelpoisten solujen päivittäin 6 päivää. KLM-1-R solut kasvoivat huomattavasti nopeammin kuin KLM-1-soluissa päivästä 2 (

p

0,0001) (S2C Fig.). Arvioidaan vastuksen tasoa, KLM-1 ja KLM-1-R-soluja inkuboitiin 72 tuntia anti-Mesothelin Rits. ATP luelinkykymäärityksillä osoittivat, että KLM-1 solut olivat herkkiä SS1-LR-GGS (IC

50 = 1,73 ± 0,01 ng /ml) ja RG7787 (IC

50 = 4,41 ± 0,38 ng /ml), yhteisymmärryksessä aiempien tulosten kanssa [19]. Sen sijaan, KLM-1-R-solut olivat erittäin resistenttejä sekä Rits (IC

50s 1 ug /ml) (Fig. 1A) ja SS1P (tietoja ei ole esitetty). Vuonna resistentit solut, oli pieni väheneminen solujen lisääntymisen RIT pitoisuus on yli 100 ng /ml. Kontrollina, testasimme aktiivisuus LMB-2, anti-CD25 RIT [31], joka ei sitoudu KLM-1-soluissa, ja havaittiin ei-erityistä vähennystä 1 ug /ml LMB-2. Tämä osoittaa, että väheneminen 1 ug /ml RG7787 KLM-1-R voisi johtua epäspesifinen (Fig. 1A). Vakiintuneet vastus oli vakaa; ei havaittu mitään muutosta, kun KLM-1-R-solut olivat RIT-free kulttuuri useita kuukausia (tuloksia ei ole esitetty). Koska ATP määritykset voi erottaa solun kasvun pysähtymisen ja solukuolemaa [32], arvioimme vasteen kanssa anneksiini V-PE Apoptosis Detection Kit. Toisin kuin KLM-1 (

p

0,0001), KLM-1-R-solut osoittivat vain vähän tai ei apoptoosia, kun niitä käsitellään 72 tuntia 100 ng /ml (

p

= 0,33 ) tai 1 ug /ml RG7787 (

p

= 0,02), verrattuna käsittelemättömiin soluihin (kuvio. 1 B). Nämä tiedot vahvistavat, että KLM-1-R-solut ovat hyvin resistenttejä soluntappamisaktiivisuutta anti-Mesothelin Rits.

: KLM-1 ja kestävä KLM-1 (KLM-1-R) soluja inkuboitiin 72 tuntia anti-Mesothelin SS1-LR-GGS, RG7787 tai anti-CD25 LMB-2 kontrollina. Kasvun estäminen arvioitiin ATP solunelinkykyisyysmääritys. IC

50-alle 10 ng /ml, KLM-1 on herkkä anti-Mesothelin Rits, joka ei ole KLM-1-R (IC

50s 1 ug /ml). 1 ug /ml LMB-2 väheni solujen elinkykyä, mikä osoittaa, että tämä RIT pitoisuus aiheuttaa epäspesifinen. B: KLM-1 ja KLM-1-R-soluja inkuboitiin 72 tunnin ajan 100 tai 1000 ng /ml RG7787. Apoptoosi arvioitiin kanssa anneksiini V-PE apoptoosin Detection Kit I RG7787 indusoi merkittävän kasvun apoptoottisten KLM-1-soluissa, kun taas KLM-1-R-soluissa osoittaa mitään merkityksellistä apoptoosin lisääntyminen. C: KLM-1 ja KLM-1-R-soluja inkuboitiin 72 tunnin ajan, joissa HB21 (Fv) -PE40. Kasvun estäminen arvioitiin ATP solunelinkykyisyysmääritys. Molemmat solulinjat ovat erittäin herkkiä tämän RIT.

Resistance in KLM-1-R-soluissa on erityinen anti-Mesothelin Rits

Sen arvioimiseksi, onko vastus KLM-1- R koskee myös Rits suunnattu toisia reseptoreiden KLM-1-R soluissa, testasimme HB21 (Fv) -PE40 joka kohdistuu CD71 [33]. CD71 ilmentyy pintaa pitkin samalla korkealla tasolla KLM-1 ja KLM-1-R (tuloksia ei ole esitetty), ja molemmissa solulinjoissa oli samanlainen herkkyys HB21 (Fv) -PE40 jälkeen 72 tunnin inkuboinnin (Fig. 1C). Arvioida herkkyys muiden terapeuttisten, soluja käsiteltiin myös 72 tunnin paklitakselin, joka on mitoosi estäjä, ja gemsitabiinin, nukleosidianalogi. Elinkykymääritykset havaittu eroa herkkyydessä paklitakseliin KLM-1 ja KLM-1-R (IC

50 KLM-1 = 3,0 ± 1,6 ng /ml vs. IC

50 KLM-1-R = 3,7 ± 1,7 ng /ml) (

p

= 0,80). KLM-1-R (IC

50 = 44,2 ± 5,7 ng /ml) oli 3 kertaa vähemmän herkkä gemsitabiinin kuin KLM-1 (IC

50 = 15,2 ± 1,9 ng /ml) (

p

= 0,04), joka on paljon vähäisempää kuin vastus RG7787. Nämä tulokset osoittavat, että vastus KLM-1-R ei ole yleinen eikä spesifisiä anti-Mesothelin Rits.

Mesothelin ilmaisun ja RG7787 otto väheni KLM-1-R

ensimmäinen askel RIT vaikutusmekanismi on sitoutumisen kohdennettuja solun pinnan antigeeni, jota seuraa RIT sisäistämisen. Mesothelin pinta lauseke, kuten arvioitiin virtaussytometrialla, oli 4,9 ± 0,5-kertaisesti alempi KLM-1-R (12 x 10

3 sivustoja solua kohti) verrattuna KLM-1 (60 x 10

3 sivustoja kohden solu) (Fig. 2A). Virtaussytometria näkyy homogeeninen KLM-1-R solupopulaatio, mikä viittaa yhtenäinen lasku Mesothelin pinnalla ilmaisua. Analyysi Mesothelin-negatiivinen A431 soluja ja käyttämällä isotyypin vasta-ohjaus vahvisti, että Mesothelin signaali KLM-1-R soluissa oli erityinen. Kuten odotettua, western blotit osoittivat, että KLM-1 solut sisälsivät suuren vyöhykkeen kypsä Mesothelin 37-kDa ja heikompi esiaste vyöhyke 72 kDa. Resistentti solut oli pieniä määriä kypsiä Mesothelin, mutta edeltäjä ei havaittu, mikä johtuu todennäköisesti sen vähäisessä määrin (Fig. 2B). Ylimääräinen variseminen Mesothelin KLM-1-R voisi selittää alhainen Mesothelin pinnan tasolle. Käyttämällä Meso Scale Pitoisuus, huomasimme, että irtoa Mesothelin oli 4,8 ± 0,03 kertaa pienempi median KLM-1-R (40,7 ± 5,3 pg /10

5 solut) verrattuna KLM-1 (149,0 ± 23,4 pg /10

5 solua). Alustassa ilman soluja (negatiivinen kontrolli), ei Mesothelin havaittu. Nämä tiedot ovat yhdenmukaisia ​​ero pinnan tasoa ja osoittavat, että alhainen Mesothelin KLM-1-R ei ole lisääntyneen irtoaminen. Sen määrittämiseksi, pieneni Mesothelin johtui vähemmän mRNA, suoritimme RT-PCR ja totesi, että Mesothelin RNA oli 7,3 ± 4,3-kertaisesti alempi KLM-1-R (C

T = 24,1 ± 0,09) verrattuna KLM-1 (C

T = 21.54 ± 0,73). Sen arvioimiseksi, onko jäljellä Mesothelin on KLM-1-R pinta voi sitoa ja sisäistää anti-Mesothelin Rits, arvioimme solun sisäistämisen RG7787-Alexa647. Otto KLM-1-R kasvanut ajan myötä, mutta oli merkittävästi alhaisempi kuin KLM-1 kunakin ajankohtana (4- 5-kertainen,

p

0,01). Sen jälkeen 150 minuutin inkuboinnin, esimerkiksi KLM-1 sisäistää noin 40 x 10

3 RG7787 molekyylejä, verrattuna vain 8 x 10

3 in KLM-1-R (Fig. 2C). Nämä tiedot osoittavat, että KLM-1-R-soluissa on osittainen alassäätöä in Mesothelin ja siksi sisäistää huomattavasti vähemmän RG7787, joka tarjoaa potentiaalia selitys havaittu vastus.

V: Pinta Mesothelin tasot 5 kertaa pienempi resistenttien KLM-1 (KLM-1-R) verrattuna KLM-1. Mesothelin ilmentyminen KLM-1, KLM-1-R ja Mesothelin-negatiivisia A431-soluja (negatiivinen kontrolli) arvioitiin käyttäen virtaussytometriaa. Täytetty histogrammit ovat toissijaisia ​​vasta-valvontaa. B: Koko Mesothelin proteiini taso on vähentynyt KLM-1-R. Esiaste (72 kDa) ja lohkaistaan ​​kypsän Mesothelin (37 kDa) oli läsnä KLM-1. KLM-1-R, pilkotun osa havaittiin matalalla tasolla. Proteiini tasot seulottiin hoitamattomilla KLM-1 ja KLM-1-R solulysaatista Western blot. p-aktiini toimii latauskontrollina. C: Kunakin ajankohtana, soluunottoa RG7787-Alexa647 in KLM-1 on merkittävästi suurempi kuin KLM-1-R, ja merkittävästi alhaisempi kuin KLM-1-R-

Msln

(transfektoitu Mesothelin ). Sisäänotto arvioitiin 30, 75 ja 150 min. Keskimäärin GEOMEAN fluoresenssivoimakkuudet muunnetaan määrän RG7787 molekyylejä.

AZA osittain palauttaa Mesothelin pinnan ilmentymistä KLM-1-R rajoitettu vaikutus herkkyys RG7787

Mesothelin ilmentyminen voidaan hiljentää DNA metylaatio CpG sivustoja sen promoottori alueella [34-37]. AZA, DNA metyylitransferaasin estäjä, voivat kääntää tällaiset hypermetylaation. Annoimme soluja 500 nM AZA päivässä 3 viikon ajan, ja totesi, että Mesothelin ekspressio lisääntyi KLM-1-R (KLM-1-R-AZA) noin 3-kertaiseksi, jopa 34 x 10

3 sivustoja kohden solu, joka on vielä pienempi kuin 60 x 10

3 sivustoja solua kohti KLM-1 (Fig. 3A). AZA parantaa herkkyyttä RG7787 KLM-1 ja KLM-1-R, vaikka jälkimmäinen pysyi erittäin vastustuskykyinen jälkeen 72 tunnin inkuboinnin (IC

50 = +722,4 ± 232,6 ng /ml) (Fig. 3B). Nämä tiedot viittaavat Mesothelin alas-asetuksen hypermetylaation.

V: AZA johtaa 2,8-kertainen Mesothelin pinnan ilmentymistä kestävä KLM-1 (KLM-1-R). Virtaussytometria histogrammi KLM-1, KLM-1-R, ja KLM-1-R-AZA. Täytetty histogrammit edustavat sekundäärinen vasta-aine valvontaa. B: Kolme viikkoa inkubaation AZA, DNA metyylitransferaasin estäjä, lisää herkkyyttä RG7787. KLM-1, KLM-1-R, ja AZA-käsiteltyjä soluja (KLM-1-AZA ja KLM-1-R-AZA) käsiteltiin 72 tunnin ajan kanssa RG7787. Kasvun estäminen arvioitiin ATP solunelinkykyisyysmääritys. Katkoviivat esittävät AZA käsiteltyjä soluja. C: CpG: t alueella ylävirtaan Mesothelin transkription aloituskohdasta ovat metyloitu KLM-1-R kuin KLM-1. Kolme viikkoa inkubaation AZA pienenee metylaation KLM-1-R-soluissa. Analysoidut alue sijaitsee CHR 16: 808890-808742 ja ulottuu 147 emäsparia ja seitsemän CpG: t. D: Mesothelin transfektion KLM-1-R johtaa merkittävään yli-ilmentyminen Mesothelin verrattuna KLM-1 (5-kertainen) ja KLM-1-R (23-kertainen). Virtaussytometria pinta Mesothelin tasoilla KLM-1, KLM-1-R ja Mesothelin-transfektoiduissa resistenttien solujen (KLM-1-R-

Msln

). E: Mesothelin yli-ilmentymisen KLM-1-R palauttaa herkkyys RG7787. KLM-1 ja KLM-1-R-

Msln

soluja inkuboitiin 72 tunnin ajan kanssa RG7787. Kasvun estäminen arvioitiin ATP solunelinkykyisyysmääritys.

CpG: t in Mesothelin promoottorialueella hypermetyloitunut KLM-1-R

Sen varmistamiseksi, että Mesothelin geeni on todellakin edellyttää hypermetylaation KLM-1-R, suoritimme valmistelevan analyysin metylaatiostatuksen seitsemän CpG: t on Mesothelin promoottorialue (CHR 16: 808890-808742, S3 kuvassa.) käyttäen bisulfiitin sekvensointia. Tämä 147 bp: n päällä alue valittiin perustuen alukkeita saatavilla EpigenDx. Tulokset osoittivat, että nämä CpG: t oli merkitsevästi suurempi metylaation KLM-1-R (59 ± 3,6%) verrattuna KLM-1 (41 ± 4,8%) (

p

0,05) (Fig. 3C) . Atsatiopriini- toi metylaatiotasot KLM-1-R takaisin niille KLM-1 (p 0,05). Nämä tulokset tukevat edelleen, että Mesothelin downregulation in KLM-1-R liittyy hypermetylaatiota Mesothelin geenin.

yli-ilmentyminen Mesothelin KLM-1-R palauttaa herkkyys RG7787

Palauta Mesothelin ilmentyminen KLM-1-R, toimme täyspitkä Mesothelin cDNA (KLM-1-R-

Msln

). Pinta Mesothelin ilmentyminen KLM-1-R-

Msln

oli 22,6 ± 5,3 kertaa suurempi kuin KLM-1-R, ja ylitti alkuperäisen ilmentymistä KLM-1 5,3 ± 1,3-kertaisesti, johtaen noin 300 x 10

3 sivustoja solua kohden (Fig. 3d). Tämän seurauksena, edistää RG7787-Alexa647 KLM-1-R-

Msln

kunakin ajankohtana oli merkittävästi suurempi kuin KLM-1 (5- 10-kertaiseksi,

p

0,05) ja KLM-1-R (24- 46-kertainen,

p

0,001) (Kuva. 2C). Jälkeen 72 tunnin inkuboinnin RG7787 oli samanlainen IC

50 KLM-1-R-

Msln

(4,49 ± 1,11 ng /ml) kuin KLM-1 (4,41 ± 0,38 ng /ml) (

p

= 0,80). Kuitenkin KLM-1-R-

Msln

oli herkempi kuin KLM-1 suuremmilla RG7787 pitoisuuksina, solujen elinkelpoisuuden pienenee nollaan 100 ng /ml (kuvio. 3E). Käyttöönotto ohjaus pcDNA3.1 (+), ei ollut vaikutusta Mesothelin tasot tai resistenssin RG7787 (tietoja ei esitetty). Nämä tiedot vahvistavat, että vastus KLM-1-R liittyy vähenemiseen Mesothelin. Jotta saavuttaa samanlainen herkkyystason RG7787 nähdään KLM-1, KLM-1-R vaatii huomattavasti korkeampi Mesothelin tasoilla kuin KLM-1. Tämä havainto vihjaa, että vastus voi myös olla sidottu tehoton kaupan RG7787 sytosoliin, tai että inhibition vaikutetaan KLM-1-R.

Proteiinisynteesiä esto RG7787 on rajoitettu KLM-1- R, EF-2 ADP-ribosylaatio-osassa on ehjä

proteiinisynteesin inhibitio aloitetaan sen jälkeen, kun toksiini traffics solun pinnan sytosoliin ja inaktivoi EF-2: ADP-ribosylaation. KLM-1-soluja inkuboitiin RG7787 16 tunnin ajan, ja KLM-1-R-soluissa 16 ja 48 tuntia, jonka jälkeen proteiinisynteesiä tutkittiin mittaamalla [

3H] leusiinin sisällyttäminen (Fig. 4A). 16 tunnin kuluttua, RG7787 indusoi annoksesta riippuvaisen laskun proteiinisynteesiä in KLM-1, mutta ei KLM-1-R.