Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

haimasyöpäsoluissa tuottaa etäpesäkkeitä, koska ne voivat selviytyä stressiä asettamat uudessa ympäristössä isännän kudosta. Matkia tätä prosessia, haimasyövän soluja, joita ei ole korostettu vakio viljelyolosuhteet injektoidaan nude-hiiriin. Koska he kehittävät ksenografteja, ne olisi ovat kehittäneet riittävästi stressiä vastausta. Luonteenomaiset että vastaus voi tarjota uusia strategioita puuttua haimasyöpä etäpesäkkeitä.

Menetelmät /Principal Havainnot

Ihmisen haimasyövän solulinjoissa Panc-1, Mia-PaCa2, Capan-1, Capan -2 ja BxPC3, käytimme Affymetrix DNA mikrosiruja verrata ilmauksia 22.000 geenien in vitro ja vastaavassa ksenografteissa. Havaitsimme 228 geenien yli-ilmennetään ksenografteissa ja tunnettu seuraus yksi heistä, WSB1, valvonnassa apoptoosin ja solujen lisääntymistä. WSB1 tuottaa 3 vaihtoehtoisesti liitettyjä selostukset koodaavat erilliset proteiini-isoformit. Vuonna ksenograftit ja ihmisen haiman kasvaimissa, globaali ilmentyminen WSB1 mRNA hieman korkeampi taas isoformi 3 on voimakkaasti yliekspressoidaan ja isoformit 1 ja 2 ovat alassäädetty. Hoitoon Mia-PaCa2 solujen stressiä aiheuttavia aineita indusoi samanlaisia ​​muutoksia. Kun taas retrovirus-pakko ilmentymä WSB1 isoformeja 1 ja 2 edistänyt solujen kasvua ja herkistyneet solut gemcitabine- ja doksorubisiinin aiheuttaman apoptoosin, WSB1 isoformi 3 ilmaisu vähensi solujen lisääntymisen ja parannettu kestävyys apoptoosin, joka osoittaa, että stressin aiheuttama modulaatio WSB1 vaihtoehtoisen silmukoinnin paremman suojan apoptoosin haiman syöpäsoluja.

Johtopäätökset /merkitys

tiedot WSB1 sääntelyä tukevat oletusta, että aktivointi stressiä torjuntamekanismeissa auttaa syöpäsolujen perustamisesta etäpesäkkeitä ja ehdottaa merkitystä syövän kehittymistä muita geenejä yli-ilmentynyt ksenografteissa.

Citation: Archange C, Nowak J, Garcia S, MOUTARDIER V, Calvo EL, DAGORN JC, et al. (2008) Teollisuuden WSB1 Gene osallistuu Haimasyöpä Progression. PLoS ONE 3 (6): e2475. doi: 10,1371 /journal.pone.0002475

Editor: Juan Valcarcel, Centre de Regulació Genòmica, Espanja

vastaanotettu 4 maaliskuuta, 2008; Hyväksytty: 18 toukokuu 2008; Julkaistu: 25 kesäkuu 2008

Copyright: © 2008 Archange et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: INSERM, La Ligue, Canceropole PACA, INCA

kilpailevat edut: kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Haimasyöpä on erittäin tappava tauti on huono pitkä -term eloonjäämisaste potilailla, joilla on paikallisesti edennyt ja metastasoituneen vaiheet [1] – [3]. Suurimpia syitä tähän Huonon lopputuloksen ovat meidän kyvyttömyys diagnosoida haimasyövän varhaisessa vaiheessa, koska niillä ei ole erityisiä oireita, sijainti haiman syvälle vatsaonteloon ja varhainen esiintyminen etäpesäkkeitä. Näin ollen suurin osa potilaista, mukaan diagnoosin aikana, alueellisen imusolmuke ja maksan etäpesäke haimasyövän on tapahtunut, rajoittaa tehokkuutta ainoa tunnettu parantavia vaihtoehtoja, jotka on sisällytettävä kirurginen resektio [4] – [6]. Tähän mennessä sädehoito tai kemoterapia eivät ole johtaneet merkittävää parannusta pysyvyyttä [7]. Syitä haimasyövän ei vielä tarkasti tunneta. Monet geenituotteiden näyttää sääntelemätön toimintoja. Lukuisat kasvutekijät ja niiden reseptorien yli-ilmennetään etenemisen aikana haimasyövän [7] – [9], mutta nämä havainnot eivät juurikaan johtaneet mitään parannusta haimasyövän hoidossa.

Strategiamme tunnistaa uusia potentiaalisia haiman syövän hoidossa perustuu siihen ajatukseen, että kasvaimen etenemistä on aina liitettävä muutokset mikroympäristössä ja että sen menestys riippuu kyvystä syöpäsolujen sopeutua tähän uuteen microenvironment. Itse asiassa on tunnettua, että syövän etenemiseen liittyy useita peräkkäisiä vaiheita. Sisällä primaarikasvaimen solut ensin valitaan sen perusteella nopean kasvun, alhainen vaste apoptoottisia signaaleja ja kyky paeta isännän immuunijärjestelmää. Nämä solut jättää primaarikasvaimen ja vaeltavat läpi organismin. Kuitenkin kaikki ne tuottavat etäpesäkkeitä kaikissa kudoksissa. Tämä prosessi on valikoiva ja riippuu sekä kapasiteetin syöpäsolujen luomaan vuorovaikutus isännän kudokseen ja niiden kapasiteetin hallintaan ympäristötekijöistä, joihin he altistuvat heidän uuteen paikkaan. Fenotyypin kasvainsolun on sovitettu sen alkuperäisestä ympäristöstä, ympäristön elimen, jossa primaarikasvaimen kehitetty. Koska ympäristön antamat kohde-elin on erilainen kuin alkuperäinen, se asettaa hyökkääviä kasvainsolun alla microenvironmental stressin paineessa. Tämän seurauksena, kyky tuumorisolun vastustamaan että stressi voi olla määräävä tekijä onnistumisen etäpesäkkeiden kehitystä. Solu aktivoi sen NMD selviytyäkseen ja onnistuessaan lisääntyä. Tavoitteena oli tunnistaa geenien mukana tässä ohjelmassa, koska estämällä niiden ilmaisun saattaa olla uusi tapa kohdistaa haimasyöpä. Tässä artikkelissa kuvataan paneelin potentiaalisia haimasyövän geenit valitaan käyttämällä vierassiirrännänmallissa strategiaa ja analysoida rakenteen ja toiminnan yksi Heille WSB1 geeni, suhteessa haiman syövän etenemiseen.

Tulokset

paneeli haimasyövän stressigeeniryhmät

malli päätimme perustaa paneelin mahdollisten haiman etenemisen liittyviä geenejä on seuraava: Käytimme 5 ihmisen haimasyövän solulinjoissa erilaisilla geneettiset taustat, Panc-1 , Mia-PaCa2, Capan-1, Capan-2 ja BxPC3. Teimme hypoteesin, että vakio viljelyolosuhteet, nämä solut eivät korostaneet niiden mikroympäristön. Kun injektio nude-hiiret, ne altistuvat stressin eri ympäristössä ksenograftin matkimalla etäpesäke. Vaikka ksenograftimallia kuvastaa vain osittain mitä todella tapahtuu etäpesäkkeitä, se on hyvä keino laittaa solujen ympäristössä aivan erilainen tavanomaisesta ympäristöstään. Tämän seurauksena merkittävä jännityksen syntyy, johon solut on vastustettava. Kussakin solulinjassa, vertasimme ilmauksia 22,000 geenien in vitro ja ksenografteissa, käyttäen Affymetrix mikrosirulla lähestymistapaa. Sen varmistamiseksi, että valitut geenit edustavat suurta osaa ihmisen haiman kasvaimet, vain geenejä, joiden ilmentyminen on muutettu vähintään kaksinkertaiseksi kaikki 5 kasvaimia huomioon. Näissä olosuhteissa voimme valita 228 geenien yli-ilmennetään kasvaimia ja 13, jotka alassäädetty. Täydellinen tiedot ovat saatavilla verkossa osoitteessa https://www.inserm-u624.univ-mrs.fr/affymetrix/. Useat kaikkein yli-ilmentynyt geenit ovat huonosti ominaista jos ei kokonaan tutkimaton. Ensimmäisessä vaiheessa, päätimme keskittyä WSB1 (WD-repeat ja SOCS Pakkaus sisältää-1), koska, kuten on kuvattu tässä alla, se osoitti alkuperäisen ominaisuus tuottavan, vaihtoehtoisen silmukoinnin, 3 variantti selostukset koodaavat erillisiä proteiini-joiden sääntely in ksenografteissa ja kun altistuminen useille rasituksia ei ole koordinoitu.

WSB1 ilmentymistä haiman tuumoriksenografteja

täydellinen proteiini tuottama transkriptio variantti 1, isoformi 1, koostuu 3 verkkotunnuksia (N terminaalisia verkkotunnuksen, proteiini-proteiini-vuorovaikutuksen domeenin, joka sisältää 8 WD-toistoja, ja SOCS laatikko) (kuvio 1). Isoformi 2 puuttuu lähes koko N-terminaalinen domeeni ja ensimmäinen WD-toista. Lopuksi, ennenaikainen lopetuskodoni isoformin 3 generoi katkaistun proteiinin, josta puuttuu C-terminaalinen osa proteiinin, joka vastaa 6 WD-toistoa ja SOCS laatikko.

. Kaaviokuva WSB1 isomuotojen 1, 2 ja 3. B. WSB1 isoformeja ilmaistiin EGFP tai V5 tag fuusioproteiineja ja solunosasijaintia analysoitiin suoralla fluoresenssilla jälkeen immunosolukemiallisella käyttäen EGFP tai V5-vasta-aineiden osalta.

Jos globaali geenin ilmentymistä, havaitaan, että 213406_at Affymetrix koetin, joka vastaa transkription kaikki kolme isoformeja, on vain lisääntynyt 1,17-2,38-kertainen hiiren ksenografteissa riippuen solulinjan ilmentymistä isoformin 3, havaitsee 201295_s_at Affymetrix koetin, on lisääntynyt 4,63-20,32 kertaiseksi (taulukko 1). Nämä tulokset kontrolloitiin kvantitatiivisen RT-PCR-analyysillä. Kehitimme

Homo sapiens

erityisiä alukkeita analysoimaan itsenäisesti ilmentymiä WSB1 isoformin 3, isoformit 1 + 2 ja isomuotojen 1 + 2 + 3 (maailmanlaajuinen lauseke) (Kuva S1). Olemme havainneet, että maailmanlaajuinen ilmentyminen WSB1 lisättiin 1,75-3,93-kertainen kasvaimia (tuloksia ei ole esitetty). Mielenkiintoista, ilmentyminen isoformin 3 nostettiin 3,7-9 kertainen kun taas isoformien 2 + 3 väheni 5- 20% (kuvio 2), kanssa DNA-siru tietoja. Siksi sen sijaan kasvu WSB1 maailmanlaajuinen ilmentymisen ksenografteissa kasvaimissa verrattuna soluihin ylläpitää in vitro, havaitsimme merkittävää muutosta vaihtoehtoisen silmukoinnin hyväksi isoformin 3 josta tulee pitkälti hallitseva kasvaimissa.

Expression of WSB1 isoformien 1 + 2 ja 3 mRNA: iden arvioitiin qRT-PCR haimasyövän solulinjoissa ja hiirillä ksenosiirrettyjä kasvaimet (A), ihmisen haimasyövän näytteitä (B) ja Mia-PaCa2 solujen käsittelyn jälkeen stressiä aiheuttavien aineiden ( C). Arvot ilmaistaan ​​keskiarvona ± S.D. yhdistettyjen tulosten kaksi erillistä koetta suoritettiin kolmena kappaleena. (*, P 0,05).

Tarkista kliinistä merkitystä näiden havaintojen mittasimme ilmaus WSB1 isoformien kvantitatiivisen RT-PCR 8 ihmisen haiman adenokarsinooma näytteitä. Havaitsimme näissä kasvaimissa erittäin vahva vallitsevana isoformin 3 ilmaisutapoja on alhainen isomuotojen 1 + 2 (kuva 2). Tämä viittaa siihen, että ilmaisun profiilia WSB1 havaittu hiirillä ksenografteissa edustaa mitä tapahtuu ihmisen haimasyövän.

Cellular stressi moduloi WSB1 vaihtoehtoisen silmukoinnin hyväksi isoformin 3

Oletuksena on, että jotkut geenien yli-ilmentynyt kasvaimissa aktivoidaan vastauksena stressin aiheuttama uuden kudoksen mikroympäristö. Meidän kokeellinen malli, ympäristöön haimasyöpäsoluissa on todellakin aivan erilainen, kun niitä viljellään

in vitro

tai kasvaa

nude

hiiri, mitattuna ravinteiden, kasvun matriisi, hormonit, jne. kuitenkin jotkut näistä muutoksista voi olla tärkeää tarpeeksi vaikuttaa geenin ilmentymisen mutta ei siihen pisteeseen asiakkuutta stressiä. Tarkistaa, onko havaitut muutokset WSB1 geenien ilmentyminen ovat todellakin seurausta stressi, me valvoi expressoin on WSB1 mRNA isomuotojen Mia-Paca2 soluja, vastauksena stressiä syntyy erilaisia ​​hoitoja. Nämä hoidot vaikuttavat eri reittejä tulisi myös tarjota tietoa tehtävän WSB1. Ne sisältyvät apoptoosin kanssa staurosporiinia tai Adriamycine® ja gemsitabiinin, jotka estävät DNA-synteesin, DNA vaurioita γ-säteilytys, metabolinen stressi seerumin nälkään ja hypoksian tai anoxia. Kuten kuvassa 2, kaikki hoidot johti hyvin vaatimaton muutos ilmaus WSB1 isomuotojen 1 + 2 ja vahva kasvu isoformin 3 ilme. Siksi WSB1 isoformi 3 lauseke näyttää tehostettava vastauksena stressiä, riippumatta stressi reitin mukana. Vaikka emme voi sulkea pois, että tämä on osittain vaikuttanut läsnäolo strooman tuumoreissa, nämä tulokset viittaavat siihen, että muutokset vaihtoehtoisen silmukoinnin havaittiin WSB1 meidän ksenograftimallia todellakin moduloidaan solun stressistä. Samanlaisia ​​tuloksia saatiin Panc1 soluja (tietoja ei esitetty).

solunosasijaintia WSB1 isoformien 1, 2 ja 3

analysoimiseksi solunosasijaintia WSB1 isoformien 1, 2 ja 3 olemme subkloonattiin 3 cDNA osaksi pEGFP-N1 vektorin saamiseksi WSB1 isoformeja kuin EGFP-WSB1 fuusioproteiineja. Nämä plasmidit transfektoitiin HeLa-soluja ja 24 tunnin kuluttua, isoformit 1, 2 ja 3 esiintyi sytoplasmisen pisteinä. Mitään eroja piste kokoa tai määrää välillä havaittiin kolme isoformia. EGFP-WSB1 fuusioproteiinit voivat hankkia poikkeava paikkatietojen konformaatioita estää niiden päästä normaaliin sijainti proteiinin ja mahdollisesti indusoimalla aggregaatin muodostuminen, joka voisi selittää havaintomme. Kontrollina, me jatkokloonanneet WSB1 isoformit osaksi pcDNA4 tuottaa kolme WSB1-V5-merkittyjen proteiinien. Transfektoitiin HeLa-soluja ja anti-V5-vasta-aineita käyttää havaitsemaan 24 tuntia myöhemmin isoformien immunosytokemialla. Mielenkiintoista on, että solunsisäisen jakautuman V5-merkityn isoformeja oli hyvin samankaltainen kuin mikä todettiin EGFP-WSB1 isoformit (kuvio 1).

WSB1 tehostaa solujen proliferaatiota

tiedetään vähän WSB1 toiminto. WSB1, joka tunnetaan myös nimellä SWIP1, ensin tunnistetaan Vasiliauskas et al. [10] hakemalla ihmisen sekvenssit on samanlainen kuin kanan geenin swip1. WSB1 osakkeita 88% aminohappojen identtisyys kanan swip1. Kirjoittajat osoittivat, että swip1 säädeltiin sonic siilin somiitit ja raajasilmuihin kehittyvissä kanan. Viime aikoina, Dentice et ai. [11] esitti todisteita siitä, että WSB1 on osa E3 ubikitiinipromoottori ligaasilla kilpirauhashormonin aktivoivaa jodityroniini deiodinase-2. On tärkeää huomata, että kaikki aikaisemmat kokeet on suoritettu kana, jossa vain kaksi isoformia, joka vastaa ihmisen isoformit 1 ja 2 on tunnistettu. Näin ollen, toiminto tämän geenin ihmisen syövässä, erityisesti sen isoformin 3, on täysin tuntematon. Ensin tutkittiin miten WSB1 soluproliferaatioon. Tätä varten me inhiboi WSB1 ilmentymisen transfektoimalla Mia-Paca2 kanssa siRNA, joka kohdistuu 3-isoformeja. Kuten kuviossa 3 on esitetty, 48 h transfektion jälkeen, tämä siRNA tehokkaasti vähentää WSB1 maailmanlaajuinen ilmentymistä 85% (80%, isoformien 1 + 2 ja 89% isoformin 3). Solujen kasvu mitattiin 24 tunnin välein, alkaen 48 tunnin kuluttua siRNA transfektion, suoralla solujen laskenta ja MTT: llä. Molemmissa tapauksissa tulokset osoittavat, että solut, jotka on transfektoitu WSB1 siRNA kasvoivat hitaammin kuin solut, jotka oli transfektoitu ohjaus siRNA (kuvio 3). Samanlaisia ​​tuloksia saatiin Panc1 soluja (tietoja ei esitetty). BrdU kokeet vahvistivat nämä tulokset. Kuitenkin, että erotus voi johtua lisäys solujen kuoleman sijaan on vähentynyt leviämisen WSB1 siRNA-transfektoiduissa soluissa. Tämän hypoteesin testaamiseksi olemme arvioidaan apoptoosin mittaamalla kaspaasi-3-aktiivisuus soluissa, jotka on transfektoitu näillä siRNA. Kaspaasi-3-aktiivisuus oli sama transfektoiduissa soluissa WSB1 siRNA tai ohjaus siRNA. Lisäksi, kun apoptoosi indusoitiin hoitojen staurosporiinia tai doksorubisiinin, jotka on transfektoitu WSB1 siRNA oli alempi kaspaasi-3-aktiivisuus kuin verrokkisoluissa (kuvio 3). Yhdessä nämä tulokset viittaavat vahvasti siihen, että WSB1 ilmentyminen parantaa solujen kasvua lisäämällä solujen lisääntyminen sen sijaan, että vähentämällä solukuolemaa.

. Mia-PaCa2 solut transfektoitiin vastaan ​​suunnattu siRNA WSB1 mRNA: ta ja ekspressiota WSB1 isoformien 1 + 2 + 3, 1 + 2, ja 3-mRNA: iden analysoitiin qRT-PCR: llä. B. Mia-PaCa2 solut transfektoitiin WSB1 siRNA ja kasvua analysoitiin suoralla solujen laskenta (B), MTT-analyysi (C) tai BrdU (D) kuten on esitetty materiaalit ja menetelmät osassa. E. Mia-PaCa2 solut transfektoitiin WSB1 siRNA ja kaspaasi 3 aktiivisuus mitattiin käsittelemättömän ja hoidon jälkeen staurosporiinia tai doksorubisiinin. Arvot ilmaistaan ​​keskiarvona ± S.D. yhdistettyjen tulosten kaksi erillistä koetta suoritettiin kolmena kappaleena. (*, P 0,05).

Erityinen merkitys isoformin 3

Expression of WSB1 isomuodon 3 indusoituu ihmisen haimasyövän soluja sekä in vitro altistuksen jälkeen stressiä ja in vivo, kun nämä solut kasvavat hiirissä. Se on myös suurelta osin hallitseva ihmisen haiman kasvaimia, mikä viittaa siihen, että 3-isoformit on eri tehtävät. Luonnehtia näitä toimintoja muodostimme stabiilit solulinjat ilmentävät jokaisen isoformin WSB1 erikseen WSB1-EGFP fuusioproteiineja, transdusoimalla Mia-PaCa2 solujen retrovirus, joka koodaa WSB1 isoformit 1, 2 tai 3 ilmentäminen fuusioproteiinien näkyi Western blot (kuvio S2). Mittasimme solujen kasvua suoraan laskemalla kunkin 24 tunnin aikana 4 päivää ja totesi, että solut, jotka ilmentävät isoformi 1 tai 2 kasvoi nopeammin kuin kontrolli soluja, jotka ilmentävät EGFP yksin. Kuitenkin yllätykseksemme, solut, jotka ilmentävät isoformi 3 kasvoivat hitaammin kuin solut, jotka ilmentävät isoformeja 1 tai 2, tai kontrolli-soluja (kuvio 3). Kuten aiemmin, me sulkea pois, että tämä johtui lisääntyneestä solukuolemaan koska kaspaasi-3-aktiivisuus oli sama 3 solulinjoissa (tuloksia ei esitetty). Lisäksi solusyklin analyysi vahvisti nämä havainnot. Itse asiassa huomasimme, S /G1 faasin suhde korkeampi soluissa, jotka ilmentävät isoformeja 1 tai 2 kuin kontrollisoluissa, ja hitaammin soluissa, jotka ilmentävät isoformin 3 (kuvio 4). Siksi WSB1 isomuotoja 1 tai 2 ja isoformin 3 on vastakkaiset vaikutukset soluproliferaatioon, isoformi 3 estämällä haiman solujen kasvuun taas isoformit 1 ja 2 stimuloida niiden leviäminen.

. Mia-PaCa2 solut transdusoitiin retrovirus ilmentävät WSB1 isoformit 1, 2 tai 3, kuten EGFP fuusioproteiini tai EGFP yksinään kontrollina ja valitaan puromysiinin. Solukasvu mitattiin laskemalla suoraan pinnoituksen jälkeen 10

5-soluissa 48-kuoppaisilla levyillä aikana päivittäin 4 päivää. B. Kun synkronointi 24 h seerumin nälkään, soluja inkuboitiin seerumia sisältävässä väliaineessa 24 h, värjättiin propidiumjodidilla ja solukierron analysoitiin virtaussytometrillä. C. S /G1 suhteen. Arvot ilmaistaan ​​keskiarvona ± S.D. yhdistettyjen tulosten kaksi erillistä koetta suoritettiin kolmena rinnakkaisena (A) tai trice kolmena kappaleena (B ja C) (*, p 0,05).

WSB1 isoformin 3 vähentää alttiutta stressistä johtuvaa solukuolemaa

Koska ilmentyminen isoformin 3 indusoi stressiä, tutkimme, onko se voi vaikuttaa herkkyyttä solujen korostaa solukuolema. Olemme esittäneet Mia-Paca2 solut, jotka ilmentävät isoformit 1, 2 tai 3 käsittelemällä 100 tai 150 uM doksorubisiinin tiedetään indusoivan apoptoosia, ja mitataan solujen elinkelpoisuus 6 h kuluttua. Havaitsimme molempien lääkeainepitoisuudet lisääntynyt solukuolema soluissa, jotka ilmentävät isoformeja 1 tai 2, kontrollisoluihin verrattuna. Päinvastoin, solut, jotka ilmentävät isoformi 3 olivat merkittävästi vastustuskykyisempi kuin kontrolleilla (kuvio 5). Voit tarkistaa nämä havainnot, soluja käsiteltiin 48 tunnin ajan 150 ja 350 uM gemsitabiini ja solujen elinkelpoisuus arvioitiin. Profiili on samanlainen kuin doksorubisiini-käsiteltyjä soluja saatiin, solut, jotka ilmentävät isoformit 1 ja 2 ovat herkempiä lääkeaineelle kuin kontrollisolut, toisin kuin solut, jotka ilmentävät isoformin 3 (kuvio 5). Nämä lääkkeet tappaa jakamalla mutta ei pidätetty soluja, mutta erot kuluttua 6 tunnin hoidon ovat liian tärkeitä täysin selittää sillä, että hitaammin kasvavat solut kuolevat hitaammin. Nämä tulokset osoittavat, että yli-ilmentyminen WSB1 isomuodon 3 ja alas-säätely isoformit 1 ja 2 vastauksena solustressiä tuloksia lisääntyneen resistenssin apoptoosia.

Mia-PaCa2 solut transdusoitiin retrovirus ilmentävien WSB1 isoformit 1 , 2 tai 3, kuten EGFP-fuusioproteiinia tai EGFP-ohjaus ja valitaan puromysiinin. Soluja käsiteltiin gemsitabiinin (100 ja 150 uM) 48 tunnin ajan tai doksorubisiinin (150 ja 350 uM) 6 tuntia. Solujen elinkelpoisuus mitattiin MTT. Arvot ilmaistaan ​​keskiarvona ± S.D. yhdistettyjen tulosten kaksi erillistä koetta suoritettiin kolmena kappaleena. (*, P 0,05).

Keskustelu

hypoteesi tukee tätä työtä on, että haiman kasvainprogression ja etäpesäkkeiden tapahtuu vain, kun kiertävä syöpäsolut voivat menestyksellisesti vastustaa jännitykset syntyvät uudet microenvironment antamat isännän kudokseen. Jos karannut syöpäsolut ei toimitettu stressiä uusissa ympäristöissä, etäpesäke kehittyisi kaikissa kudoksissa. Itse asiassa, kliininen havainto on, että primaarisyöpien kehittää tietyn elimen aina kehittää etäpesäkkeitä samalla muihin elimiin, luultavasti niitä, joissa nämä syöpäsolut pystyvät vastustamaan stressin aiheuttama ympäristön olosuhteissa. Näin ollen hoitostrategioita jotka häiritsevät mekanismeja suojella syöpäsolujen stressi saattaa hidastaa tai estää metastaattinen prosessi. Ensimmäinen askel kohti tällaisten strategioiden on tunnistaa geenit, jotka antavat resistenssin uudelle microenvironment aikana kasvainten kehittymiseen. Tämä voidaan saavuttaa vertaamalla DNA-array-geenin ilmentymistä soluissa, jotka kasvavat eri microenvironmental olosuhteissa, valitse geenien yli-ilmentyy olosuhteissa kasvaimen kasvun. Matkia stressiä, joka tapahtuu metastaasin muodostumista potilailla, käytimme koejärjestelyistä perustuu ksenografti haiman kasvain malli. Vertasimme geeniekspressioprofiilien ihmisen haimasyövän solulinjoissa kasvaa in vitro tavanomaisissa viljelyolosuhteissa (mikroympäristön A) ja kasvaimen käsittelyn aikana kehittämistä injektion jälkeen nude-hiiriin (mikroympäristön B). Monet geenit osoittivat yli-ilmentyminen uuden mikroympäristössä ja jos jotkut niistä voivat olla yli-ilmentyy vasteena signaaleja, kuten solu-solu tai solu-soluväliaine yhteyttä, toiset voivat olla osallisena vastustuskyvyn stressiä. Me valittiin parhaat hakijat geenit voimakkaasti yli-ilmennetään siinä ksenografteissa tuottamat kaikki 5 solulinjoissa. Joukossa kandidaattigeenit, päätimme luonnehtia yksityiskohtaisesti WSB1 koska se esitteli edelleen kiinnostusta tuottavan vaihtoehtoisen silmukoinnin kolme erillistä isoformia, joiden sääntely altistuessaan stressi ei ole koordinoitu. Vaikka yli-ilmentäminen isoformien 1 + 2 + 3 on kohtalainen, 1,75-3,93 kertaiseksi riippuen solutyypistä, isoformi 3 on voimakkaasti yli-ilmentynyt (3,7-9-kertainen). Päinvastoin, ilmaus isoformien 1 + 2 on laskenut 5-20%: in ksenografteissa. Mielenkiintoista, isoformi 3 on myös pitkälti hallitseva ihmisen haiman kasvaimissa, mikä tukee työhypoteesia.

Vaikka U133A GeneChip- on suunniteltu kohdistamaan ihmisen sekvensseihin, emme voi sulkea pois mahdollisen ristihybridisaation joidenkin antureilla hiiren sekvenssit. Siksi suunniteltu

Homo sapiens

erityisiä alukkeina qPCR. qPCR suoritettiin hiiren alkion fibroblastien cDNA samoissa olosuhteissa kuin ihmisen haiman cDNA eikä ollut mitään DNA: n monistuksen jälkeen 45 sykliä, vaikka pystyimme monistamaan koko isoformin 3 samasta hiiren alkion fibroblasteista cDNA PCR alukkeilla matching täydellisesti-sekvenssit ovat yhteisiä sekä lajeja (Forward 5′-CCATGAGCCAGCTTTCCC-3 ’; Reverse 5′-TCACACCAATATTGCTGCCAC-3’). Sen vuoksi päättelimme, että qPCR alukkeet ovat ihmisen erityisiä ja että tehostettu ilmentyminen isoformin 3 esiintyy ihmisen epiteelisoluissa eikä hiiren stroomassa.

vahvistaa, että WSB1 on todellakin stressin aiheuttama geeni, me toimitettu haiman soluja useisiin jännitykset ja totesi, että ilmentyminen WSB1 isoformin 3 on aina voimakkaasti aktivoitunut taas ilmaus isomuotojen 1 + 2 oli ennallaan tai vähentynyt. Tämä solustressiä säätelee WSB1 ilmentymistä moduloimalla sen liittämiseen on todella mielenkiintoinen, mutta ei alkuperäinen, koska tällainen asetus on jo kuvattu muita geenejä. Esimerkiksi, modulaatiot vaihtoehtoisen silmukoinnin esiintyä Arabidopsis SR-proteiinin homologeja, atSR30 ja atSR45a, vasteena ympäristön stressiin [12]. Lisäksi, UV-ja γ säteilyn sekä sisplatiinihoitoon aiheuttaa vaihtoehtoisen silmukoinnin ja hdm2 [13] ja altistuminen ensisijainen lymfosyyttien stressi indusoi ulkonäkö TSG101 silmukointivariantit [14]. Lopuksi neuronien asetyylikoliiniesteraasia siirtyy isoformista AChE-S normaalisti harvinainen isoformi AChE-R vastauksena useisiin korostaa [15]. Tärkeää on, että stressin aiheuttama modulaatio vaihtoehtoisen silmukoinnin ilmentymisen WSB1 isoformeja on hyvin samanlainen kuin mitä me havaittu ksenograftin kasvaimen etenemistä.

On huomattava, että ihmisen WSB1 isoformi 3 sekvenssi on pysyvästi poistettava vuodesta tietokantojen ollessa nonsense-välitteisen mRNA hajoaminen (NMD) ehdokas. NMD on mRNA valvonta polku, joka takaa nopean hajoamisen mRNA: iden, jotka sisältävät ennenaikaisen translaation lopetus- kodonia, mikä estää kerääntymisen katkaistun ja mahdollisesti haitallisten proteiinit [16]. Tässä tutkimuksessa osoitamme kertyminen isoformi 3 mRNA jälkeen stressi induktion, vierassiirrekokeissa ja ihmisen haiman kasvaimissa toisin olisi odotettavissa on NMD yhteydessä. Näin ollen, vaikka sen sekvenssi voi liittyä NMD, on selvää, että WSB1 isoformi 3-mRNA: ta ei hajoa nopeasti, ja ei näytä olevan todellista kohde NMD. Olemme myös sulkea pois RT-PCR-monistus ja sekvensointi koko isoformin 3 mRNA siihen, että pre-mRNA on havaittu sijasta isoformin 3-mRNA: n (tietoja ei esitetty).

fysiologiset vaikutukset haiman syöpäsoluja stressin aiheuttamiin muutoksiin osuudet WSB1 isoformien suhteen kasvuvauhdin ja kestävyys apoptoosin, ovat tärkeitä. Expression of WSB1 isoformeja 1 tai 2 osoitettiin nopeuttaa solusyklin taas ilmaus isoformin 3, päinvastoin, hidasti se alas. Kun kaikki isoformit samanaikaisesti suunnattu jonka siRNA Mia-PaCa2 tai Panc1 solun kasvu väheni merkittävästi, mikä oli odotettua, koska isoformit 1 ja 2 on runsaasti ei-korosti soluja, jotka osoittavat normaalia kasvua. Näin ollen, stressin olosuhteissa kasvua rajoittaa sekä vähentynyt ilmentyminen isoformien 1 ja 2 ja yli-ilmentyminen isoformin 3. Toisaalta, ilmaus isoformia 1 tai 2 lisää herkkyyttä solujen pro-apototic ärsykkeiden taas ekspressio isoformi 3 lisää niiden kestävyys. Jälleen stressin aiheuttama esto isoformien 1 ja 2 ilmaisun ja yli-ilmentyminen isoformin 3 sekä auttaa soluja selviytyä eri ympäristössä. Molekyylitason mekanismeja, joilla nämä proteiinit voivat vaikuttaa solujen kasvuun ja kestävyys apoptoosin vastakkaisiin suuntiin vielä määritettävä, vaikka menetys isoformin 3 C-terminaalista osaa isoformin 1 olisi luultavasti selittää osan siitä. Silti, huolimatta merkittäviä rakenteellisia eroja, 3 WSB1 isoformit samalla jaetaan sytoplasmassa, kuten on esitetty kuviossa 1.

Yhteenvetona, me raportoimme, että muutos WSB1 isoformin ilmentyminen havaitaan ihmisen haimasyövän soluja toimitettu ja stressi on samanlainen kuin muutos havaittiin, kun nämä solut ovat ksenosiirrettyjä nude-hiirissä tai ihmisen haiman kasvaimia. Jos tämä muutos johtaa vähentynyt kasvu solujen, se myös lisää merkittävästi niiden vastustuskyky apoptoosin. Nämä tulokset tukevat hypoteesia, että aktivointi stressiä torjuntamekanismeissa auttaa syöpäsoluja perustamisesta etäpesäkkeitä, ettei samaa WSB1 isomuodon suhde on havaittu haiman adenokarsinooman. Onko stressin aiheuttamiin muutoksiin WSB1 isoformin ilmentyminen on välttämätöntä kasvainten kehittymiseen, mikä tekisi siitä potentiaalinen terapeuttinen kohde, kuitenkin vielä tutkittava.

Materiaalit ja menetelmät

Solulinjat ja solujen viljelyolosuhteet

ihmisen haimasyövän johdettu Mia-PaCa2, BxPC3, Panc-1, Capan-1 ja Capan-2, ja Phoenix amfotrooppinen viruksen pakkaus solulinjoja viljeltiin suosittelema American Type Culture Collection.

ihonalainen kasvain induktio nude-hiirissä

Jousitus haiman solulinjojen, (10

7/200 ui PBS) injektoitiin ihon alle kylkeen mies atyymisissä 7-8 viikkoa vanha nude-hiirissä, ja kasvainten annettiin kehittyä 30 päivää. Kaikki tutkimukset suoritettiin mukaisesti Euroopan unionin määräyksiä eläinkokeista.

Ihmisen haiman kasvain näytteet

haimakudoksesta saatiin potilailta, jotka tehtiin haiman resektio laitoksella Kirurgian Hopital Nord, Marseille, Ranska. Institutional Review Board hyväksyntä saatiin Comité d’Ethique de l’Institut Paoli Calmettes (Marseille, Ranska). Kirjallinen suostumus saatiin potilailta mukaisesti Helsingin julistuksen.

RNA: n eristys

Yhteensä-RNA eristettiin Trizol (Gibco-BRL) menettely.

Microarray

koe suoritettiin U133 2.0 Plus GeneChip- (Affymetrix, Santa Clara, CA), kuten aiemmin on kuvattu [17], ja analysoitiin Microarray Suite 5.0 ohjelmistoa (Affymetrix).

Hoidot

joissakin kokeissa, Mia-Paca2 soluja käsiteltiin aikana 24 h 10 uM doksorubisiinia (Sigma), 0,5 uM Staurosporiini (Sigma) tai 350 uM Gemsitabiini (eli Lilly) tai annetaan 24 h seerumideprivaatiolle, tai että y-säteilytys (5Grays).

hypoksia /Hapettomuus

happipitoisuudet muutettiin käyttämällä hypoksian yrityshautomo kammio (luettelo # 27310; Stem Cell Technologies) ja asianmukaiset kaasuseokset (Linde kaasu, Ranska ), seuraten valmistajan ohjeita. Solut toimitettiin 5 h anoxia (5% CO

2, 95% N

2) tai 6-18 h hypoksia (5% CO

2, 94,8% N

2 ja 0,2% O

2).

kvantitatiivinen RT-PCR-analyysi

ensimmäisen juosteen cDNA syntetisoitiin käyttäen Expand käänteistranskriptaasia (Roche, Meylan, Ranska). Kvantitatiivinen PCR suoritettiin käyttäen Roche Light Cycler järjestelmä ja reagenssit, seuraava valmistajan ohjeiden. Käytetyt alukkeet ja olosuhteet hehkutus olivat 5′-AGTGTCAGACTGATCTGG-3 ’ja 5′-ACAGTAGACGGATTCTTCAA-3′, 58 ° C: ssa 7 sekuntia; 5’-GATCATACTGAAGTGGTCAG-3 ’ja 5′-GCCCAAATTCCATCAGAATG-3′, 56 ° C: ssa 14 sekunnin ajan; ja 5’-GATCGTGGTTAGTTTGGG-3 ’ja 5′-TGGGTCACCAACTTGAG-3’, 57 ° C: ssa 6 s; maailmanlaajuisen ilmentymä wsb1, isoformit 1 + 2 ja isoformin 3 vastaavasti. (Ks Täydennyskuvio S1) Kukin näyte analysoitiin kahtena kappaleena ja koe toistettiin kahdesti. Tulokset analysoitiin RelQuant (Roche) ja ilmaistiin suhteena Tata laatikko sitova proteiini (TBP) tai verrokkiarvoista (käsittelemättömät solut).

transfektoinneilla

Solut transfektoitiin käyttäen FuGENE HD ( Roche Diagnostics) seuraten valmistajan ohjeita pEGFP-N1-plasmidia (Clontech), joka sisälsi ihmisen täyspitkän WSB1 cDNA, isoformia 1, 2 tai 3 (tässä järjestyksessä NM_015626, NM_134265, NM_134264), tai ei-insertti. 3-isoformit myös subkloonattiin pcDNA4-V5-plasmidi (Invitrogen).

WSB1 fluoresenssin

hiiren anti-V5-vasta-ainetta (InVitrogen), jota käytettiin havaitsemaan V5-merkityt WSB1 proteiineja ja paljasti vuohen Chromeo 488-konjugoidun anti-hiiri-vasta-ainetta (ActiveMotif). Solut, jotka ilmentävät EGFP-WSB1 fuusioproteiinit vain kiinteä. Solut asennettu pidentää Gold (Invitrogen) ja analysoitiin Nikon I90 mikroskooppi (40 x /APO suunnitelma /NA1.40).

retrovirusvektorin ja retrovirus- geeninsiirto

3