Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

vastavuoroinen vuorovaikutukset epiteelin ja strooman elintärkeä tehtävä eturauhassyövän kehitykseen ja etenemiseen. Tehostettu eritteiden sytokiinien ja kasvutekijöiden syöpä liittyy fibroblastien eturauhastuumoreissa luo suotuisan mikroympäristön syöpäsoluja kasvaa ja etäispesäkkeitä. Meidän edellinen työ osoitti, että progesteroni reseptorin (PR) ilmaistiin erityisesti eturauhasen strooman fibroblasteissa ja sileän lihaksen soluissa. Kuitenkin ekspressiotasot PR ja sen vaikutus kasvaimen mikroympäristössä eturauhastuumoreissa huonosti.

Methods

immunohistokemia määrityksissä käytetään ihmisen eturauhasen kudosnäytteistä. Solujen migraation, invaasion ja proliferaatiomäärityksillä suoritetaan käyttämällä ihmisen eturauhasen soluja. Reaaliaikainen PCR: llä ja ELISA käytetään mittaamaan geenin ilmentymisen molekyylitason tasoilla.

Tulokset

immunohistokemia määritykset osoittivat, että PR-proteiinin tasot laskivat liittyvän syövän strooman verrattuna yhdistetty normaalin eturauhasen strooman. Käyttämällä

in vitro

eturauhasen stroomasolulinja malleja, osoitimme, että elatusainetta kerättiin PR positiivinen stromasoluja esti eturauhasen syöpäsolun muuttoliike ja invaasio, mutta oli pieni tukahduttava vaikutuksia syöpäsolujen leviämistä. PR tukahdutti eritystä strooman peräisin tekijä-1 (SDF-1) ja interleukiini-6 (IL-6) stroomasolut riippumaton PR-ligandien. Esto PR ilmaisun siRNA tai täydentämistä eksogeenisen SDF-1 tai IL-6 loppukäsitellyksi mediaa PR positiivinen stroomasolujen torjua estovaikutukset PR syövän solujen vaeltamiseen ja invaasiota.

Johtopäätökset

vähentynyt ilmentyminen PR liittyvän syövän strooman voi edistää kohonnut SDF-1 ja IL-6: n tasoja eturauhasen kasvaimia ja parantaa eturauhasen syövän etenemiseen.

Citation: Yu Y, Lee JS, Xie N, Li E , Hurtado-Coll A, Fazli L, et al. (2014) Prostate stroomakasvaimet ilmentävät progesteronireseptorille Control Cancer Cell Mobility. PLoS ONE 9 (3): e92714. doi: 10,1371 /journal.pone.0092714

Editor: Allen Gao, UC Davis Kattava Cancer Center, Yhdysvallat

vastaanotettu: 01 joulukuu 2013; Hyväksytty: 24 helmikuu 2014; Julkaistu: 24 maaliskuu 2014

Copyright: © 2014 Yu et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukee Kanadan Institutes of Health Research Operating Grant (MOP- 97934), Rising Star Award ja Discovery Grant eturauhassyöpään Kanadasta XSD ja PNW Eturauhassyöpä SPORE pilotti avustuksen XSD ja MG. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

eturauhasen kasvaimia on useita solupopulaatioiden. Syöpäsolut ympäröi ei-epiteelin solujen ympäristössä, joka koostuu fibroblastien, sileiden lihassolujen ja myofibroblastien. Kertyneet todisteet osoittavat, että vastavuoroinen epiteelin-stroomavuorovaikutuksiin ovat kriittisiä kasvainten kehittymiseen, kasvua ja etäpesäkkeiden [1], [2]. Esimerkiksi eturauhasen hyvänlaatuinen epiteelisolulinja BPH-1 on yleensä ei tuumorigeeninen nude-hiirissä. Kuitenkin, kun se yhdistetään syöpäliitteinen fibroblasteissa (valuuttalisiin) ja oksastettiin munuaiskapselin, BPH-1-soluissa muodostaa kasvaimia [3]. Nämä havainnot osoittavat, että stromasoluja keskeisessä asemassa ovat pahanlaatuisiksi. Kautta erittävät sytokiinejä ja kasvutekijöitä, valuuttalisiin myös tukeva mikroympäristön helpottaa kasvaimen kasvua, invaasio ja metastaasi [4], [5]. Vaikka nämä kriittiset roolit strooman eturauhassyövässä (PCA), terapeuttinen strategia kohdistaminen eturauhasen strooman suomia arvostaa. Tämä kuvastaa vähän tietoa stromassa-epiteelin vuorovaikutuksiin solu- ja molekyylitason tasoilla.

On tunnettua, että syöpään liittyvä strooman lisää eritystä useita sytokiineja, jotka ovat tärkeä osa kasvaimen microenvironment [6]. Stroomasolujen peräisin factor-1 (SDF-1) erittyy strooman fibroblastien ja toimii sitoutumalla reseptoriin, CXCR4: n, kalvon epiteelisolujen laukaista useita signaalin polkuja [7] – [10]. SDF-1 /CXCR4-akseli on osoitettu helpottavan syöpäsolujen invaasio, kasvaimen angiogeneesi [11], [12], stimuloivat soluproliferaatiota [13], [14] ja suojaavat soluja kemoterapeuttisen lääkkeen indusoiman apoptoosin [15] – [ ,,,0],17]. SDF-1-mRNA-tasot ovat lisääntyneet syöpä kudoksiin verrattuna viereisten hyvänlaatuinen kudosten [18] ja ovat korkeimmat metastaattisessa PCa [19]. Lisäksi CXCR4 ilmentyminen on myös kohonnut PCa kudoksissa [19], edelleen monistamalla toimia SDF-1. Interleukiini 6 (IL-6) on myös tärkeä sytokiini, joka voi stimuloida Janus-kinaasien /Signal muuntimet ja Activator Transkriptio 3 väylän syöpäsoluissa [20]. Sekä SDF-1 ja IL-6 voi aktivoida androgeenireseptorin (AR) matalissa androgeeneinä PCA soluissa ja edistää kasvaimen etenemistä kastrointi vastustuskykyisiä vaiheessa [21] – [23]. IL-6 on raportoitu parantaa PCa soluproliferaation ja suojaamaan soluja apoptoosin tuumoriksenografteja [24], [25]. Seerumin IL-6-tasot olivat myös osoitettu olevan huono ennuste markkeri [26], [27].

eturauhasen stroo- solut ilmentävät myös useita steroidireseptorien kuten androgeenin ja estrogeenin reseptorit. Nämä reseptorit on raportoitu olevan tärkeitä stroomasolut suoraan PCa kehitystä moduloimiseksi sytokiinien /kemokiinien [28] – [30]. Me raportoi äskettäin, että molemmat progesteroni reseptorin (PR) isoformit, PRA ja PRB, ilmaistiin erityisesti eturauhasen strooman ja säätelee negatiivisesti stroomasolulinja lisääntymistä [31]. Tässä tutkimuksessa laajensimme pyrkimyksiä mitata PR-proteiinin tasot PCa ja PR sääntely SDF-1 ja IL-6 eturauhasessa stroomasolujen.

Materiaalit ja menetelmät

Human eturauhaskudoksiin ja immunohistokemia

Kaksikymmentäseitsemän koko vuori osia ihmisen eturauhasen kudosnäytteistä saatiin radikaali prostatectomies. Yksityiskohtaiset tiedot kustakin kudosnäytteestä taulukossa 1. Kaikkien potilaiden allekirjoitti tietoisen suostumuksensa protokollaa, joka tarkasteli ja hyväksynyt UBC Clinical Research Ethics Board (Certificate #: H09-01628). Immunohistokemiallinen (IHC) analyysit suoritettiin käyttäen Ventana Discovery XT Autostaineriin (Ventana Medical Systems), jossa vasta-aineita PR (Abcam) ja PRB (Cell Signaling) on ​​raportoinut [31]. Digitaalisia kuvia kudoksen diat skannattiin jonka Bliss skannerin järjestelmä (Bacus Lab Inc). Sisällä reuna-alueilla, 5 strooman kentät ( 1000 ytimiä) valittiin patologi (L. F.) vieressä hyvänlaatuinen epiteelisolujen ja 5 muiden tukikudosten kentät olivat viereisistä syöpä epiteelisolujen. Viisi muuta strooman kentät olivat siirtymisestä vyöhykkeillä. Patologinen tulokset saavutettiin ohjelmiston Digital Image Hub (Leica Biosystem) laskea prosenttiosuuden värjättyä ytimien ja värjäytymisen intensiteettiä. Suhteelliset tasot PR ja PRB laskettiin indeksi HSCORE = Σpi (i + 1), missä i = värjäytymisen intensiteetti, ja pi = prosenttiosuus värjättyjen solujen. HSCOREs käytettiin vertaamaan PR ja PRB tasoa normaalin ja syövän strooman ja oheislaitteiden välillä vyöhykkeiden ja siirtymäalueita.

Eturauhasen stroomakasvaimet Solulinjat

Ihmisen eturauhasen stroomasolulinja (WPMY-1 ) ja PCa solulinjat LNCaP ja PC-3 hankittiin American Type Culture Collection (Manassas, VA). LNCaP johdettu C4-2B-solut hankittiin Urocore (Oklahoma City, OK, Yhdysvallat). LNCaP, C4-2B ja PC-3-solut ilmentävät havaitsemattomia tasoja PR mRNA ja proteiini. Ihmisen syöpä liittyy fibroblasteja (hCAFs) ystävällisesti Dr. Simon Hayward (Vanderbilt University). He olivat peräisin ihmisen ensisijainen viljellyistä syöpään liittyvät fibroblasteissa [2]. Ihmisen ensisijainen eturauhasen stroomasolut, HPS-19 i oli jalomielinen lahjoitus tohtori David Rowley (Baylor College of Medicine) [4]. Eksogeeninen PRA ja PRB pantiin WPMY-1, hCAF ja HPS-19 i by lentivirus, kuten on kuvattu [31]. Proteiinin ekspressiotasoja sekä solujen lokalisaatio PRA ja PRB vahvistettiin (kuva S1). Kaikki kokeet, joissa käytetään hCAFs olivat 8-10 solujakojen ja HPS-19 i solut olivat 5-6 kohtia kun saadut tarjoajilta.

Quantitative Real-Time PCR

Kokonais-RNA eristettiin käyttäen Trizaol (Invitrogen) mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Kaksi mikrogrammaa kokonais-RNA: ta altistettiin satunnaisalukkeilla käänteistranskriptio käyttäen SuperScritpt 2 käänteistranskriptaasia (Invitrogen). Reaaliaikainen PCR suoritettiin kolmena rinnakkaisena käyttäen Applied Biosystem 7900 HT 5 ng cDNA, 1 uM kumpaakin alukeparia ja SYBR Green PCR Master Mix (Roche). Alukesekvenssejä lueteltiin taulukossa S1. Suhteellinen mRNA-tasot normalisoitiin GAPDH. SiRNA kohdistaminen PR ostettiin Thermo Fisher (Cat N. J-003433-08-0005).

Kokoelma elatusaine

Yhdeksänkymmentä prosenttia konfluentteja hCAFs, WPMY-1 ja HPS-19 i strooman solut pestiin kaksi kertaa PBS-puskurilla, ja kasvatetaan seerumittomassa DMEM: n läsnä ollessa ajoneuvon, P4 tai PR-antagonisti RU486: ssa 48 tuntia. Proteiinipitoisuudet vakioidun alustan (CM) mitattiin Bicinchoninic Acid määrityksellä (Thermo Scientific). Sama määrä CM PR positiivisia ja negatiivisia soluja käytettiin hoitoon PCa soluja solujen vaeltamiseen, invaasiota ja proliferaatiomäärityksillä.

ELISA-määritys

SDF-1 ja IL-6 pitoisuudet CM mitattiin kaupallinen ELISA kit seuraavia valmistajan protokollan (R 0,05 *, P 0,01 ** ja P 0,001 kuin *** .

tulokset

PR-proteiinin tasot laskivat eturauhaskasvaimissa

Olemme keränneet 27 koko kohteen osia ihmisen eturauhasen kudosnäytteistä saaneilta potilailta eturauhasen (taulukko 1) . Potilaat ovat 46-88 vuotta ikää, jossa Gleason tulokset 6-9 ja kasvaimen vaiheet vaihtelevat T2A ja T3b. Käyttämällä IHC määrityksiä sekä yhteensä PR ja PRB isoformit havaittiin ytimet osan eturauhasen strooman soluja (1A-B). Kuitenkin HSCORE PR (yhdistetty laskeminen intensiteetin ja prosenttipiste positiivisten tumien) oli 41% pienempi (p = 0,001) syöpään liittyvä strooman verrattuna pariksi normaaliin strooman eturauhasen reuna-alueet (1C). Lisäksi, HSCORE on PRB syövän liittyy strooman oli noin 44% pienempi kuin normaalissa strooman (P = 0,004) (Fig.1D). Tällä hetkellä ei ole olemassa spesifistä vasta-ainetta havaitsemaan PRA isoformin. Koska molemmat yhteensä PR ja PRB lasku samanlainen astetta, on todennäköistä, että PRA ekspressiotasot noudattavat samaa suuntausta kuin PRB. Ei ollut merkittäviä eroja joko PR tai PRB HSCORE välillä hyvänlaatuinen reuna-alueiden ja siirtymäalueita (1C-D). Ei ollut tilastollisia eroja koko PR tai PRB proteiinin tasot yhdessä Gleason pisteet ja seerumin PSA pitoisuudet Näistä 27 potilasta. Yhdessä nämä tulokset osoittivat, että PR tasot laskivat syöpään liittyvän strooman.

Koko mount osia ihmisen eturauhasen koepaloja (n = 27) immunovärjättiin PR-aineella (Abcam) tai PRB vasta-ainetta (Cell Signaling). Edustavia IHC kuvia PR (A) ja PRB (B) hyvänlaatuinen reuna-alueilla, syöpä reuna-alueet ja siirtymäkauden alueet näkyvät. IHC värjäys PR (C) ja PRB (D) proteiini tasoilla pariksi hyvänlaatuista

vs

syövän reuna-alueilla ja pariksi hyvänlaatuisia syrjäisillä

vs

siirtyminen alueet 27 Koko kohteen osia ihmisen eturauhasen koepaloja pisteytettiin Digital Image Hub (Leica Biosystem). HSCORE indeksit esitettiin graafisesti ± SE. Yksisuuntainen ANOVA ja pariksi opiskelijan t-testissä tason laskemiseen merkitys.

stroomakasvaimet PR estää PCa solumigraatioon ja invaasiota

Jotta tutkittaisiin PR toimintojen solutasolla, olemme käyttäneet useita ihmisen eturauhasen stroomasolulinja malleja kuten hCAFs, WPMY-1 ja HPS-19 i. Nämä solut ilmentävät alhaisia ​​PR mRNA mutta havaitsemattomia tasoja PR proteiinia. Otimme eksogeeninen PRA tai PRB isoformin näissä soluissa lentiviraalinen lähestymistapaa raportoitu [31], joka antoi meille mahdollisuuden tutkia tehtävä kunkin PR-isoformin. Vaikka WPMY-1-solut ovat peräisin ensisijaisesti viljellyistä stroomasoluista peräisin eturauhasen hyvänlaatuisen liikakasvun kudoksiin, nämä solut kuolemattomiksi SV40: n suuren-T-antigeenin. Niillä on samanlainen tuumorigeenisia ominaisuudessa hCAFs, kun yhdistetään uudelleen BPH-1-soluissa ja oksastetut alle hiiren munuaisten kapseli (julkaisemattomia tuloksia).

vaikutusten arvioimiseksi PR stroomasoluissa on PCa solujen vaeltamiseen, suoritimme haavan paranemista määrityksiä. CM kerättiin PR-positiivisten ja PR-negatiivinen hCAFs ja WPMY-1-soluissa, kun läsnä on ajoneuvon tai 10 nM P4 käytettiin inkuboitua PC-3-soluja. Haavan paranemista analyysit osoittivat, että CM PR-positiivisten solujen johti merkittävästi vähentynyt solujen vaeltamiseen (2A-B). P4 hoito stromasoluja ollut mitään vaikutuksia siirtymäaste PC-3-solut. 2A-B osoitti edustavat kuvat yhdestä kolmen erillisen kokeen. Olimme myös suorittaa solumigraation määrityksissä edelleen vahvistaa ligandista itsenäistä toimintaa PR kontrolloinnissa syövän solujen vaeltamiseen. PR positiivinen WPMY-1-soluja käsiteltiin kasvavia annoksia P4, ja niiden CM kerättiin ja niitä inkuboitiin PC-3-solujen migraatiota määrityksissä (kuvio 2C). Havaitsimme, että P4 ei ole ollut vaikutusta PC-3 solujen maahanmuuttoluku eikä tehnyt PR antagonisti RU486 (Fig.2D). Nämä tulokset olivat toistettavissa kun korvasi PC-3-solujen luun metastaattinen LNCaP johdettuja C4-2B soluja (Fig.2E-F).

väliaine (CM) kerättiin vanhempien hCAFs, WPMY-1 tai niiden solulinjat ilmentävät mock, PRA tai PRB läsnäollessa ajoneuvon tai 10 nM P4. PC-3-soluja siirrostettiin 6-kuoppaisille levyille ja inkuboitiin CM päässä hCAFs (A) tai WPMY-1 (B) solujen kanssa 24 tunnin ajan haavan paranemista määrityksissä. Kuvat ovat 24 tunnin CM hoito oli vangiksi käännettyä mikroskooppia. WPMY-1 ja sen solulinjat ilmentävät mock, PRA tai PRB käsiteltiin 0, 10 nM ja 100 nM: P4 24 tuntia (C ja E) tai vehikkeliä, 10 nM P4 ja /tai 10 uM RU486 varten 24 tuntia (D ja F). CM kerättiin sitten ja inkuboitiin PC-3-soluja (C-D) ja C4-2B (E-F) solumigraation määrityksissä, kuten on kuvattu Materiaalit ja menetelmät osassa. Yksisuuntainen ANOVA ja pariksi opiskelijan t-testissä laskea tilastollista merkittävyyttä asetettu P 0,05 * ja P 0,001 kuin ***.

vaikutusten arvioimiseksi PR stroomasoluissa on PCa soluinvaasiota, haimme Matrigeliä hyökkäystä määrityksiä. CM kerättiin PR-positiivisten ja PR-negatiivinen WPMY-1-soluissa vehikkeliä, 10 nM tai 100 nM P4 (3A). Havaitsimme, että CM kerätty PR positiivinen WPMY-1-soluissa johti 50-75% lasku PC-3 solujen invaasiota. Tämä PR toiminto ei muuttunut P4 tai RU486 (3A-B). Lisäksi samanlaisia ​​tuloksia havaittiin myös silloin, kun C4-2B solun käytettiin Matrigel invaasiota määrityksissä (kuvio 3C-D). Lisäksi olemme myös toisti kokeissa CM kerätään kahden muun eturauhasen stroomasolujen hCAFs ja HPS-19 i. Osoitimme, että CM PR positiivinen hCAFs tai HPS-19 i soluissa johti ~20-30% alenemisvauhti PC-3 solujen invaasiota, mikä PR toiminta oli myös itsenäinen P4 (Fig.3E-F). Yhdessä nämä tulokset osoittivat, että PR hallussaan ehkäisevästä toiminto PCA solujen vaeltamiseen ja invaasiota ligandista riippumattomalla tavalla.

WPMY-1 ja sen johdetut solulinjat ilmentävät mock, PRA tai PRB hoidettiin 0, 10 nM ja 100 nM P4 24 tunnin ajan (A ja C) tai vehikkeliä, 10 nM P4 ja /tai 10 uM RU486 24 tuntia (B ja D). CM kerättiin sitten ja inkuboitiin PC-3 (A-B) ja C4-2B (C-D) solujen soluinvaasiota määrityksissä. hCAFs (E), HPS-19 i (F-solut) ja niistä, jotka ilmentävät mock, PRA tai PRB käsiteltiin 0, 10 nM ja 100 nM ja P4: ssa 24 tuntia. CM kerättiin sitten ja inkuboitiin PC-3 solujen soluinvaasiota määrityksissä. Soluinvaasiota laskettiin kuvatulla Materiaali ja menetelmät -kappaleessa. Yksisuuntainen ANOVA ja pariksi opiskelijan t-testissä laskea tilastollista merkittävyyttä asetettu P 0,05 * ja P 0,001 kuin ***.

roolin tutkimiseksi strooman PR PCa solujen kasvuun

in vitro

teimme soluproliferaatiomäärityksissä (kuva S2). LNCaP-solut ilmentävät mutantti AR joka voidaan stimuloida P4. Hoitoon LNCaP suoraan P4 viljelyväliaineessa aiheutti 3-kertaiseksi induktio solujen lisääntymisen. CM kerättiin PR positiivinen hCAFs puuttuessa P4 oli tilastollisesti merkitsevä, mutta erittäin lieviä estäviä vaikutuksia LNCaP solujen kasvuun. Samoin lievä tukahduttava vaikutus havaittiin myös käytettäessä CM kerättiin PR positiivinen WPMY-1-solujen läsnä ollessa P4.

PR tukahduttaa SDF-1 ja IL-6 eturauhasessa stroomasoluissa

Koska PR proteiinin taso on vähentynyt syöpään liittyvien strooman ja CM PR positiivinen stromasoluja estävät PCa soluinvaasiota ja muuttoliike

in vitro

oletamme, että PR voivat toimia tukahduttaa sekretorisen tekijöihin syntetisoida stroomasoluihin ja säädellä eturauhasen epiteelin paracrine tavalla. Jotta testata tätä hypoteesia, me uudelleen tarkastuskäynnin geeni microarray data profilointi PR geenien eturauhasen stroomasoluissa [31]. Jonka ositella kaikki sytokiinien ja kasvutekijöiden, olemme määritelleet SDF-1: n ja IL-6 kuin alkuun sijoittui geenejä, joiden mRNA-tasot olivat inhiboi PR. Vahvista Näiden havaintojen suoritimme reaaliaikainen PCR ja osoittaneet, että PRA esti 70%, kun taas PRB esti 80% SDF-1-mRNA tasolla hCAFs (Fig. 4A-B). Tämä PR toiminta oli ligandi itsenäinen, koska kumpikaan P4 eikä RU486 ollut vaikutusta PR tukahduttaminen SDF-1 mRNA-tasoja. Tärkeää on, tukahdutetaan SDF-1-mRNA-tasojen PR alensivat SDF-1 eritystä eturauhasen stromasoluja mitattuna ELISA (4C). Lisäksi PR estävä vaikutus SDF-1-ekspressiota havaittiin paitsi hCAFs, mutta myös WPMY-1 (Fig.4D-E) ja HPS-19 i-soluja (Fig.4F). Havaitsimme myös samanlainen estovaikutus PR IL-6-mRNA: n ja proteiinin tasot ligandista riippumattomalla tavalla (kuvio 5). On tärkeää huomata, että PR ei aiheuta yleistä estävä vaikutus kaikkiin sytokiinien tai kasvutekijöiden. Useat kasvutekijät kuten bFGF, HGF, VEGF ja KGF ovat joko säädelty tai ei muuta PR ja /tai P4 hoitoon (kuva S3).

hCAFs ja niistä, jotka ilmentävät mock, PRA tai PRB olivat vehikkeliä, 1 (A) tai ajoneuvon, 10 nM P4 ja /tai 10 uM RU486 (B) 24 tuntia. Reaaliaikainen PCR mitattiin mRNA-tasoja SDF-1 suhteessa GAPDH. (C) hCAFs ja niistä, jotka ilmentävät mock, PRA tai PRB sai vehikkeliä tai 10 nM P4 24 tuntia. CM kerättiin ja käytettiin mittaamaan SDF-1-proteiinin tasot ELISAlla. WPMY-1 ja sen solulinjat ilmentävät mock, PRA tai PRB sai vehikkeliä, 1 nM, 10 nM ja 100 nM P4 (D) tai ajoneuvon, 10 nM P4 ja /tai 10 uM RU486 (E) 24 tuntia. Reaaliaikainen PCR mitattiin mRNA-tasoja SDF-1 suhteessa GAPDH. (F) HPS-19 i-solujen ja niistä soluista, jotka ilmentävät mock, PRA tai PRB sai vehikkeliä tai 10 nM P4 24 tuntia. Reaaliaikainen PCR mitattiin mRNA-tasoja SDF-1 suhteessa GAPDH. Yksisuuntainen ANOVA ja sen jälkeen Studentin t-testiä laskea merkitys asetettu P 0,01 * ja P 0,001 kuin ***.

hCAFs ja niistä soluista, jotka ilmentävät mock, PRA tai PRB sai vehikkeliä, 1 (A) tai ajoneuvon, 10 nM P4 ja /tai 10 uM RU486 (B) 24 tuntia. Reaaliaikainen PCR mitattiin mRNA-tasoja IL-6 suhteessa GAPDH. (C) hCAFs ja niistä soluista, jotka ilmentävät mock, PRA tai PRB sai vehikkeliä tai 10 nM P4 24 tuntia. CM kerättiin ja käytettiin mittaamaan IL-6-proteiinin tasot ELISAlla. WPMY-1-soluja ja niistä soluista, jotka ilmentävät mock, PRA tai PRB sai vehikkeliä, 1 nM, 10 nM ja 100 nM P4 (D) tai ajoneuvon, 10 nM P4 ja /tai 10 uM RU486 (E) 24 tuntia. Reaaliaikainen PCR mitattiin mRNA-tasoja IL-6 suhteessa GAPDH. (F) HPS-19 i-solujen ja niistä soluista, jotka ilmentävät mock, PRA tai PRB sai vehikkeliä tai 10 nM P4 24 tuntia. Reaaliaikainen PCR mitattiin mRNA-tasoja IL-6 suhteessa GAPDH. Yksisuuntainen ANOVA ja opiskelijan t-testissä lasketaan merkitys asetettu P 0,01 * ja P 0,001 kuin ***.

Vahvista PR välittämä suora esto SDF-1 ja IL- 6-geenin ilmentyminen, me transfektoitiin ohimenevästi eturauhasen stroomasolut siRNA vastaan ​​PR (6A-B). Akuutti PR Knockdown kumosivat dramaattisesti estovaikutukset PR sekä SDF-1: n ja IL-6-mRNA: n tasoja. Lisäksi, PR kohdistuu sen inhiboivia vaikutuksia suoraan SDF-1: n ja IL-6-geenin transkription ja ei vaadi muita proteiinisynteesiä, kuten PR-jäi tukahduttava vaikka läsnä oli sykloheksimidiä hoidon (Fig.6C-D). Olemme myös suorittaa kromatiinin immuunisaostustesti osoittaa, että histoni asetylaatio tasot SDF-1 promoottorialueen dramaattisesti vähennetty PR positiivisia stroomasoluissa. Nämä muutokset olivat toisin histoni asetylaatio tason mukainen GAPDH (Fig.6E). Yhdessä nämä tulokset tukevat että PR näyttelee suora rooli tukahduta promoottoriaktiivisuuksien SDF-1 ja IL-6-geenien ja estää niiden geenin transkriptio.

WPMY-1 soluja, jotka ilmentävät mock, PRA tai PRB transfektoitiin ohimenevästi ohjaus siRNA tai siRNA vastaan ​​PR. SDF-1 (A) ja IL-6 (B) mRNA-tasot suhteessa GAPDH mitattiin reaaliaikaisella PCR: llä. hCAFs ilmentävät mock, PRA tai PRB isoformin käsiteltiin joko ohjaus- tai 20 ug /ml sykloheksimidiä 16 tunnin ajan. Reaaliaikainen PCR-määrityksissä mitattiin mRNA-tasoja SDF-1 (C) ja IL-6 (D) suhteessa GAPDH. (E) WPMY-1-solujen ja niistä soluista, jotka ilmentävät mock, PRA tai PRB sai vehikkeliä tai 10 nM P4 24 tuntia. Kromatiinin immunosaostusmäärityksissä suoritettiin käyttäen asetyyli-histoni 3-vasta-aine. Eluoitu DNA-fragmentit tehtiin mitata rikastuminen asetyyli-histoni 3 tasoa SDF-1 ja GAPDH promoottorialueille. Yksisuuntainen ANOVA ja opiskelijan t-testissä lasketaan merkitys asetettu P 0,01 * ja P 0,001 kuin ***.

Osoittaakseen, että PR-välitteisen tukahduttaminen SDF-1 ja IL-6 lauseke on tärkeä mekanismi, joka vähentää PCa soluinvaasiota ja muuttoliike kapasiteettia, olemme ohimenevästi pudotettiin PR ilmaisun ja tarkkaili muuttoliike ja hyökkäys hinnat PC-3 (7A-C) ja C4-2B (Fig. 7B-D) solut otettiin talteen. Lisäksi, kun yhdistelmä-DNA-SDF-1 tai IL-6-peptidiä lisättiin CM, me havaitsimme, että eksogeeninen SDF-1 tai IL-6 poistetaan PR suppressoiva vaikutus PC-3 solujen invaasiota (Fig.7E). Yhdessä nämä tulokset tukevat, että PR-välitteisen tukahduttaminen PCa solun liikkuvuus on pääasiassa estämällä SDF-1: n ja IL-6-geenin ilmentymistä.

WPMY-1-solut ilmentävät mock, PRA tai PRB transfektoitiin ohimenevästi ohjaus siRNA tai siRNA vastaan ​​PR 24 tuntia. Solut pestiin kahdesti PBS-puskurilla, ja kasvatetaan seerumivapaassa DMEM väliaineessa 48 tunnin ajan. CM kerättiin ja inkuboitiin PC-3 (A ja C) tai C4-2B (B ja D) soluja solumigraation määrityksissä (A ja B) sekä matrigeelin invaasio määritykset (C ja D), kuten on kuvattu Materiaalit ja menetelmät -kappaleessa. (E) CM kerättiin hCAFs läsnä ollessa ajoneuvon tai 10 nM P4 ja sekoitetaan sitten ajoneuvon, 10 ng /ml SDF-1 tai 10 ng /ml IL-6 ja inkuboitiin PC-3-solujen Matrigel invaasio määrityksiä. Yksisuuntainen ANOVA ja pariksi opiskelijan t-testissä tason laskemiseen merkitys asetettu P 0,05 * ja P 0,001 kuin ***.

Keskustelu

Tutkimuksemme osoittavat että PR-proteiinin tasot ovat vähentyneet liittyvän syövän strooman ja että PR kohdistaa estävää vaikutusta PCA solun liikkuvuutta ilmentymisen moduloimiseksi kaksi tärkeää sytokiinien, SDF-1: n ja IL-6. Nämä havainnot viittaavat siihen, että pienempi PR ilmaisun syöpäliittynyt strooman muuttaa tasapainoisen eturauhasen microenvironment, jotka voivat vaikuttaa PCa soluinvaasiota ja etäpesäkkeiden.

Havainto, että vähentynyt PR ilmentyminen syövässä liittyy strooman on samankaltainen kuin on raportoitu kanssa muut steroidi reseptoreihin, kuten AR ja ER-β [34] – [36], mikä viittaa yleisperiaate, että menetys steroidireseptorit voidaan tarvita eturauhasen strooman uudelleen aktivoitu ja rakentaa tukeva mikroympäristön PCA. Suosia Tämän hypoteesin strooman AR osoitettiin tukahduttaa PCa solujen lisääntymistä ja invaasiota [37]. ER-β agonistia tehostettu apoptoosin eturauhasen strooman ja epiteelin soluja aromataasin knock-out hiirillä [38]. Vaikka PR ja AR jakaa suuren homologia DNA sitovat alueet, geeni microarray tutkimukset ovat osoittaneet eri geenistä profiileja säätelee näiden kahden reseptorin [31], [39]. Lisäksi PR ilmaistaan ​​kaksi suurta isoformia identtisillä DNA sitovia domeeneja. Kuitenkin ne säätelevät eri transcriptome. Yksi selitys voisi olla, että PR kykenee sen transkriptioaktiviteettia läpi proteiinin vuorovaikutus muiden transkriptiotekijöitä [40], [41].

Mekanismi, jolla PR ekspressiotasoja pienenevät PCA soluissa ei tunneta. Sekä intensiteetti PR värjäyksen ja prosenttipiste PR positiiviset ytimet ovat pienemmät PCA kudoksissa. Koska kaikki eturauhasen stroomasolut ilmaista PR, on epäselvää, onko PR negatiivinen stroomasolujen väestö tulee hallitseva, vai onko PR-positiivisten solujen menettää ilmaisun aikana syövän etenemiseen. Meidän edellinen työ osoitti, että PR positiiviset stromasoluja lisääntynyt paljon hitaammin kuin PR negatiivisia soluja [31]. Kuitenkin se voisi myös olla mahdollista, että syöpäsolut voisi käyttää paracrine vaikutuksia aktivoida uudelleen eturauhasen strooman solujen suppressoimaan niiden PR ilme. Nämä mahdollisuudet eivät sulje pois toisiaan ja voivat elää rinnakkain aikana syövän kehitystä.

IHC analyysejä levitettiin koko vuori osissa eturauhasen koepaloja sijaan kudos microarray (TMA), mittaamaan strooman proteiinimarkkereita. Heterogeenisuus eturauhasen strooman vaatii useita alueita potilasta kohden slide on analysoitava patologi. Tämä on tärkeä standardi, joka ei voi olla tyytyväinen jos käytetään TMA. Johtuen pienestä koosta kudoksen hylsyjä TMA, on teknisesti vaikea vangita edustava pariksi hyvänlaatuinen ja syöpä liittyy strooman ja suorittaa patologinen vertailu analyysejä.

Ligandivälitteinen itsenäisen toiminnan PR geenien transkriptio raportoitu useissa tutkimuksissa [42], [43]. Sekä ligandoidun ja unliganded PR voidaan sijoittaa solun tumassa, mutta eri osa-ydin- osastoja [44], [45]. Translaation jälkeisiä modifikaatioita, kuten fosforylaation tai sumoylation myös osaltaan PR aktivoinnin puuttuessa progestiinin [46]. Mielenkiintoista on, että se on äskettäin raportoitu, että AR säätelee c-myc ekspressiota ligandia itsenäisesti, joka edistää kastraatio resistenttejä etenemisen PCa [47]. Nämä havainnot yhdessä viittaavat siihen, että voi olla laajempia geenien, joiden ilmentymistä säätelee steroidireseptorit riippumattomien ligandeihin.