Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

Pahanlaatuinen gliooma joukossa kaikkein vaarallisin syövät. Gliooma näyttää silmiinpistävää cellular heterogeenisyys hierarkian erilaistumisen toteaa. Viimeaikaiset tutkimukset tukevat olemassa syövän kantasolujen gliooma, jotka ovat toiminnallisesti määritelty niiden kyky laajan itseuudistumisen ja muodostumista sekundaarikasvaimia että phenocopy alkuperäisen kasvaimia. Koska c-Myc onkoproteiinin on tunnustettu rooleja normaalissa kantasolujen biologiaan, me arveltu, että c-Myc voi myötävaikuttaa syöpään kantasolun biologian nämä solut on samoja ominaisuuksia normaaleja kantasoluja.

Menetelmät /Principal Havainnot

aiempien menetelmien me ja muut ovat käyttäneet, kasvainsolupopulaatioissa rikastettiin tai köyhdytettyä syövän kantasoluja käyttämällä kantasolujen merkki CD133 (Prominin-1). Olemme tunnettu c-Myc ilmentymistä Hyväksytty kasvainsolupopulaatioissa käyttäen reaaliaikaista PCR, immunoblottauksen, immunofluoresenssilla ja virtaussytometria. Kirjoittajat raportoivat, että c-Myc ilmenee vahvasti gliooma syövän kantasoluja suhteessa kuin kantasoluja gliooma soluja. Kysellä merkitys c-Myc ilmentymisen gliooma syövän kantasoluja, suunnattiin sen ilmentyminen käyttäen lentivirally transdusoitu lyhyt hiusneula-RNA (shRNA). Knockdown c-Myc in gliooma syövän kantasoluja pienentää leviämisen samanaikaisessa solusyklin pysähtymisen G

0 /G

1 vaihe ja lisääntynyttä apoptoosia. Non-kantasolujen glioomasoluihin näkyy rajoitettu riippuvuutta c-Myc lauseke selviytymisen ja leviämistä. Edelleen, gliooma syövän kantasolut vähentynyt c-Myc tasot eivät muodostamaan neuropalloja

in vitro

tai kasvaimia ksenotransplantaatio aivoihin immuunipuutteisilla hiirillä.

Johtopäätökset /merkitys

Nämä havainnot tukevat keskeinen rooli c-Myc säätelyssä leviämisen ja selviytyminen gliooma syövän kantasoluja. Kohdistaminen ydin kantasolujen reittejä voi tarjota parempia hoitomenetelmiä varten pitkälle edenneitä syöpiä.

Citation: Wang J, Wang H, Li Z, Wu Q, lathia JD, McLendon RE, et al. (2008) c-Myc tarvitaan ylläpito Gliooma Cancer Stem Cells. PLoS ONE 3 (11): e3769. doi: 10,1371 /journal.pone.0003769

Editor: Juha Klefström, University of Helsinki, Suomi

vastaanotettu: 11 heinäkuu 2008; Hyväksytty: 02 marraskuu 2008; Julkaistu: 20 marraskuu 2008

Copyright: © 2008 Wang et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Jialiang Wang on vastaanottaja American aivosyövän Association Basic Research Fellowship. Muut rahoitustuki tarjosi Childhood aivosyövän Foundation, Pediatric aivosyövän Foundation Yhdysvalloissa, Accelerate aivosyöpä Cure, Alexander ja Margaret Stewart Trust, aivosyövän Society, Goldhirsh Foundation, Duke Comprehensive Cancer Center Stem Cell Initiative Grant (JR ), NIH myöntää NS047409, NS054276, ja CA116659 (JR). J. R. on Damon Runyon-Lilly Clinical tutkija tukee Damon Runyon Cancer Research Foundation ja Sidney Kimmel Foundation for Cancer Research Scholar. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

kehittyvät syöpä kantasolu malli viittaa siihen, että kasvaimia on järjestetty hierarkiaan, jossa alapopulaatio syövän kantasoluja vastuussa kasvaimen huolto- ja etenemiseen. Syöpä kantasolut ovat erittäin tuumorigeenisemmiksi ja phenocopy alkuperäistä kasvainten jyrsijöiden ksenograftimalleissa. Ehtyminen syövän kantasolujen populaation suuresti heikentää mahdollisuuksia käynnistää ksenograftin kasvaimen muodostumisen irtotavarana kasvainten [1], [2]. Syöpä kantasolujen populaation edistää myös kiinteän kasvaimen angiogeneesi [3], etäpesäke [4], ja kestävyys kemoterapiaa ja sädehoitoa [3], [5], [6], [7], [8], [9]. Vaikka tämä malli on validoitu kasvava luettelo hematopoeettisten ja kiinteitä kasvaimia, molekyyli signalointireittejä orchestrating biologia syövän kantasoluja vielä selvittämättä.

c-Myc onkoproteiinin on tutkittu laajalti sen instrumentaalinen rooli lisääntymistä ja kasvua normaalien ja neoplastisten solujen. Vapautettiin c-Myc löytyy ihmisen erilaisiin kasvaimia ja liittyy usein edenneen taudin ja huonon ennusteen [10]. Koska c-Myc on hiljattain tunnustettu tärkeäksi säätelijänä kantasolujen biologiaan, se voi toimia linkkinä yhdistää maligniteetti ja ”stemness” [11]. Joko normaali tai transformoituja soluja, c-Myc yksin aktivoi alkion kantasolun transkription moduuli, joka on vahvasti korreloi kasvaimen etäpesäke ja kuolleisuutta [12]. Kohdunulkoinen c-Myc ilmentyminen transformoiduissa ihmisen keratinosyyteissä lisää merkittävästi syövän kantasolujen murto ja parantaa tuumorigeenisyystesti [12]. Johdanto c-Myc muiden transkriptiotekijöiden (kuten Oct3 /4, Sox2, ja Klf4) generoi aiheuttama pluripotenttien kantasolujen (IPS) solujen erilaistuneita soluja [13]. Ilman c-Myc tähän yhdistämiseen poistamatta endogeenistä c-Myc ilmaisua, vähentää huomattavasti tehokkuutta iPS solujen tuotantoa [13], [14], [15], [16]. Vaikka kaikki nämä tiedot viittaavat siihen, rooli c-Myc ylläpitämisessä kantasoluja, muita toimintoja c-Myc säätelyssä kantasolujen biologia on myös kuvattu. Ehdollinen tyrmäyksellä c-Myc hiiren luuytimen ei leviämisen estämiseksi tai itseuudistumisen hematopoieettisten kantasolujen [17]. Pikemminkin se johtaa kertyminen hematopoieettisten kantasolujen luuytimessä viittaa siihen, että c-Myc nimenomaan ohjaa vuorovaikutusta hematopoieettisten kantasolujen ja niiden syvennyksiin. Lisäksi yli-ilmentyminen c-Myc-estrogeenireseptorin fuusioproteiinin ihmisen orvaskeden kantasolujen ajaa erilaistumista sijaan leviämisen [18], [19].

Koska hyväksyttyjen tehtävien c-Myc: in sekä normaaleissa kantasolujen biologiaan ja hermoston maligniteetin, tutkimme rooli c-Myc ihmisen gliooma syövän kantasoluja. Gliooma ovat yleisimpiä ensisijainen luontainen kasvaimen tyyppi keskushermostoon. Laadukas gliooma (World Health Organization laadut III ja IV) ovat kaikkein vaarallisin ihmisen maligniteettien [20]. Vuonna gliooma, c-Myc ilmaisu korreloi luokka maligniteetin [21]. Expression of c- Myc vetämänä glial fibrillary hapan proteiini (GFAP) -promoottorin kehittämisessä hiiren astroglia aiheuttaa kasvaimia, jotka muistuttavat ihmisen glioblastooma [22]. Tässä hiirimallissa, kasvain massa sisältää nopeasti jakava alaryhmästä, jotka ilmentävät c-Myc ja suhteellisesti lepotilassa syöpäsolujen puuttuu c-Myc ilmaisun [22]. Olemme nyt määrittäneet, että gliooma syövän kantasoluja ilmaistuna korkeampi c-Myc suhteessa täsmäsi ei-kantasolujen kasvainsoluja ja aktiivisuus c-Myc tarvitaan proliferaatiota, kasvua ja selviytymistä gliooma syövän kantasoluja. Menetys c-Myc lakkautetaan vierassiirrettä muodostusta gliooma syövän kantasoluja, mikä korostaa avainasemassa c-Myc in gliooma syövän kantasolujen ylläpitoon.

Tulokset

Gliooma syövän kantasolut ilmentävät korkeita c-Myc

tutkimiseksi biologisten toimintojen c-Myc säätelyyn gliooma syövän kantasoluja, ensin määritellään ilmaisu c-Myc näissä soluissa. Lyhytaikainen rikastettu tai köyhdytettyä syövän kantasoluja olivat peräisin ihmisen aivokasvaimen näytteitä käyttäen CD133 valintaa ja luonnehtia olemme aikaisemmin osoittaneet [9]. Kvantitatiivisen tosiaikaisen PCR osoitti, että CD133 + gliooma solut ilmensivät korkeampia c-Myc-mRNA-tasoja kuin täsmäsi CD133- glioomasoluissa (kuvio 1A). Ero mRNA-tasot käännetty korkeampi c-Myc-proteiinin CD133 + gliooma soluja kuin täsmäsi CD133- soluja (kuvio 1 B). Yhdenmukainen ennen raportit [23], [24], syövän kantasoluja fraktiolla myös ilmaissut korkea Olig2, merkki aikuisten hermo multipotentteina esiasteita (kuvio 1 B). Mittaamaan suoraan ilmentymistä c-Myc ihmisen aivokasvaimia, me arvioitiin edelleen c-Myc ilmentymistä virtaussytometrialla sekä CD133 + ja CD133- jakeet glioomasolut akuutisti eristetty ihmisen kirurgisen kudosnäytteistä ilman

in vitro

kulttuuri (kuvio 1 C). Noin puolet CD133 + -soluja korkea c-Myc ilmaisu, kun taas lähes 90% CD133- solut ilmensivät alhaisia ​​c-Myc (kuvio 1 D). Olemme edelleen tutkittiin c-Myc ilmentymistä gliooma syövän kantasoluja käyttäen osia tuotettu akuutisti jäädytetty ihmisen gliooman kirurgisista näytteistä. Koska yhteistyössä värjäyksen CD133 ei ollut yhteensopiva antigeenin hakumenetelmä vaaditaan c-Myc värjäys, teemme yhteistyötä värjättyä c-Myc toisen hermo kantasolujen nestiiniä. Suurempi kuin 90% nestiinifenotyypin positiivisia gliooma soluja myös c-Myc positiivisia (kuvio 1 E). Nämä tiedot viittaavat siihen, että c-Myc ilmentyy voimakkaasti gliooma syövän kantasoluja.

(A) CD133- ja CD133 + -solut eristettiin gliooma kirurgisen biopsianäytteistä siirrostettiin lyhyen aikavälin immuunipuutteisilla hiirillä ja lyhyesti viljeltiin. Kokonais-RNA eristettiin sekä CD133- ja CD133 + -soluja. cDNA valmistettiin käänteistranskriptiolla. Expression c-Myc määritettiin sitten kvantitatiivisella reaaliaikaisella PCR: llä ja normalisoitiin p-aktiini ja HPRT1. Suhteellinen mRNA-tasot c-Myc in CD133- solut annetaan arvo 1. Tulokset on esitetty keskiarvona ± SEM tässä ja kaikissa myöhemmissä kuvaajat (#: p 0,001). (B) kokonaismäärä solulysaatit erotettiin SDS-PAGE: lla. Proteiini tasot c-Myc ja Olig2 määritettiin immunoblottauksella. Aktiini blotattiin kuten latauskontrollina. (C) Gliooma soluja eristettiin suoraan ihmisen kirurgisen biopsianäytteistä, kiinnitettiin 4% paraformaldehydillä seuraavat dissosiaatio, leimattiin anti-CD133-APC: n ja anti-c-Myc-FITC, ja altistettiin FACS-analyysiä. (D) prosenttiosuus ilmentävien solujen korkea c-Myc sisällä joko CD133- osa tai CD133 + fraktio osoitti (#: p 0,001). (E) jaksot juuri jäädytetty ihmisen gliooman kirurginen biopsia näytteet kiinnitettiin ja yhteistyötä värjättiin c-Myc (vihreä) ja nestiinifenotyypin (punainen). Tumat vastavärjättiin Hoechst 33342. Kuvat ovat (630 x) osoitettiin.

c-Myc säätelee solusyklin etenemisen ja leviämisen gliooma syövän kantasoluja

c-Myc näyttelee keskeinen rooli säätelyssä solujen lisääntymistä säätelemällä ekspression solusyklin proteiineja. Kysellä rooli c-Myc, että solusyklin gliooman syövän kantasoluja, suunnattiin c-Myc ekspression infektion lentiviruksen ilmentävät shRNA spesifinen c-Myc. Kaksi eri shRNAs tehokkaasti laskenut c-Myc ilmentymistä sekä CD133- ja CD133 + glioomasoluissa, kuten on esitetty kvantitatiivisella reaaliaikaisella PCR: llä ja immunoblottauksella (kuvio 2A ja 2B). Samanlaisia ​​tuloksia havaittiin toisessa kasvaimen näytteestä (T4597, tuloksia ei ole esitetty). Ehtyminen c-Myc vähensi merkittävästi S-vaiheen solupopulaation kanssa samanaikaisesti kasvu G

0 /G

1 solupopulaation CD133 + soluissa (p 0,001, kuva 3). Sen sijaan, CD133- soluilla pienempää leviämisen, jolla on pienempi S-vaiheessa väestöön kuin täsmäsi CD133 + -soluista (kuvio 3 ja tuloksia ei esitetty), ja solusyklin etenemisen CD133- soluissa ei muuttunut merkittävästi pudotus c-Myc . Asetus solusyklin c-Myc yleisesti välittyvät transkription säätelyn Sykliinien ja sykliiniriippuvaisen estäjät, mukaan lukien Sykliineiksi D

1, D

2, ja E ja p21

WAF1 /CIP1 [26], [27] (https://www.myc-cancer-gene.org). Lieventävät c-Myc ilmentyminen erityisesti vähentää sykliini D

1-proteiinin tasot, mutta ei sykliinien D

2 tai E, ja CD133 + -solujen (kuvio 2B). Lisäksi p21

WAF1 /CIP1 proteiinin tasot yläreguloituja syövän kantasoluja köyhdytetty c-Myc, kun taas p53-tasot vain kohtalaisesti muuttunut (kuvio 2B). Kvantitatiivisen tosiaikaisen PCR osoitti samanlaisen sykliini D

1 ja p21

WAF1 /CIP1 sääntely-mRNA-tasojen c-Myc in CD133 + soluissa, mikä viittaa siihen, c-Myc säädellään nämä kaksi geeniä tasolla transkription. Silmiinpistävä vastakohta, sykliini D

1 ja p21

WAF1 /CIP1 oli minimaalisesti muuttunut kaatamalla c-Myc joko mRNA tai proteiini tasojen CD133- soluissa. Erityisesti pohjapinta sykliini D

1 tasot olivat korkeampia CD133 + soluja kuin Hyväksytty CD133- soluja, kun taas sykliini D

2 ja sykliini E tasot olivat korkeampia CD133- soluissa, mikä viittaa siihen, että sykliini D

1, mutta ei sykliinien D

2 tai E, on ratkaisevaa G

1 /S siirtymisen CD133 + glioomasoluihin. Yhdessä nämä tulokset viittaavat siihen, että c-Myc säätelee solusyklin etenemistä gliooma syövän kantasoluja, ainakin osittain, ohjauskeinoilla ilmaus sykliini D

1 ja p21

WAF1 /CIP1.

( A) Early kanavan ( P5) T3359 glioblastoma CD133- tai CD133 + -soluja tartunnan lentivirus suuntaaminen ilmentymistä joko ei-kohdistuksen shRNA (NT) tai c-Myc erityisiä shRNAs (sh-1 ja sh-2). MRNA-tasot c-Myc, p21

WAF1 /CIP1, sykliini D

1 (cycD1) ja sykliini D

2 (cycD2) määritettiin kvantitatiivisella reaaliaikaisella PCR: llä 3 päivää infektion jälkeen. (B) Proteiinin tasot c-Myc, p53, sykliini D

1, sykliini D

2, sykliini E ja p21

WAF1 /CIP1 määritettiin immunoblottauksella.

(A, B) Early kanavan ( P5) T3359 glioblastoma CD133- tai CD133 + -soluja tartunnan lentivirus suuntaaminen ilmentymistä joko ei-kohdistuksen shRNA (NT) tai c-Myc erityisiä shRNAs (sh-1 ja sh-2). Kolme päivää infektion jälkeen solut kiinnitettiin 75% etanolilla ja leimattiin 10 ug /ml propidiumjodidia. Solusyklin jakautuminen määritettiin virtaussytometrialla. (A) Tiedot muodostettiin kolmen erillisen kokeen. *, P 0,05; #, P 0,001 yksisuuntainen ANOVA vertailu kontrolliryhmien vastaavaksi c-Myc pudotus ryhmiä. (B) Representitive FACS olet piirtänyt. M1-sub G

0 vaiheessa; M2-G

0 /G

1 vaihe; M3-S-vaiheessa; M4-G2 /M vaiheessa.

Aiemmat raportit osoittivat, että aivokasvaimen kantasoluja eristettiin ihmisen kirurgisen koepalanäytteistä olivat aktiivisesti proliferatiivinen

in vitro

[28], [29], mutta numerot Hyväksytty CD133- kasvainsolujen juuri kasvanut viikon kuluttua kulttuurin. Meidän tuloksemme, että suhteellisen korkea ilmentyminen c-Myc: in gliooma syövän kantasoluja on tärkeää niiden solusyklin säätelyssä viittaa siihen, että näiden solujen kasvua voidaan myös vaatia, c-Myc aktiivisuuden. Kuten käy kasvukäyrän määrityksiä kokonaismäärä ohjaus CD133 + -solujen lisääntynyt noin kuusi tai seitsemän kertaisesti yli viisi päivää, kun taas CD133 + solut köyhdytetty c-Myc ei lisätä tai vähentynyt määrä (kuva 4). Toisaalta, kasvu CD133- väestöstä vain kohtalaisen vaimentaa c-Myc pudotus (kuvio 4). Nämä tulokset viittaavat siihen, että c-Myc edullisesti edistää jatkuvaa kasvua kasvaimen aloittamista soluja.

(A) T3359, (B) T3832, ja (C) T4597 CD133- ja CD133 + -solut eristettiin ja infektoitiin, kuten on kuvattu. Sitten solut maljattiin 96-kuoppalevyille kolmena kappaleena 5000 solua kuoppaa kohti ja CD133- soluja tai 1000 solua per kuoppa ja CD133: a + soluja. Yhteensä elävien solujen lukumäärä määritettiin sitten CellTiter-Glo Luminescent solunelinkykyisyysmääritys (Promega) päivittäin. *, P 0,05; #, P 0,001 yksisuuntainen ANOVA vertailu kontrolliryhmien vastaavaksi c-Myc pudotus ryhmien samana päivänä.

Loss c-Myc indusoi apoptoosia gliooma syövän kantasoluja

c-Myc säätelee paitsi soluproliferaatiota vaan myös solujen eloonjäämistä. Vuonna yhteensopivuutta rooli selviytymisen, olemme huomanneet kertymistä kuolleiden solujen CD133 + murto köyhdytettyä c-Myc ilmaisun aikana kasvukäyrän kokeet, ei ollut läsnä kontrolleissa (tuloksia ei ole esitetty). Toisaalta, merkkejä solukuoleman rajoitettu sovitettu CD133- soluissa, riippumatta c-Myc tila viittaa siihen, että menetys c-Myc voi erityisesti indusoivat apoptoosia CD133 + -solujen. Rooli c-Myc apoptoosin säätelyyn edelleen kiistanalainen. Aiemmat raportit ovat osoittaneet, että c-Myc edistää apoptoosin syöpäsolulinjoissa ja erilaisissa normaaleissa solutyypeissä, kun taas downregulation c-Myc johtaa myös apoptoosin tietyissä olosuhteissa [30], [31], [32], [33]. Erottaa anti-apoptoottisen tai pro-apoptoottisen roolin c-Myc: in gliooma syövän kantasoluja, me määrällisesti apoptoottisten solupopulaatioiden seuraavat pudotus c-Myc. Anneksiini V: värjäys paljasti, että ehtyminen c-Myc aiheutti apoptoosia CD133 + gliooma soluja, kun taas ohjaus CD133 + solut sisälsivät minimaalisen apoptoottisten populaation (kuvio 5A, C). Sen sijaan CD133- väestöstä oli vain tausta-värjäys anneksiini V riippumatta c-Myc tasoilla. Yhdenmukaisesti näiden tietojen perusteella, yhdistettynä kaspaasi 3/7 aktiivisuus koholla CD133 + soluissa c-Myc pudotus, mutta ei täsmäsi CD133- soluissa (kuvio 5B, D). Yhdessä nämä tiedot viittaavat siihen, että c-Myc on eloonjäämistekijä gliooma syövän kantasoluja.

(A, B) T3359 ja (C, D) T4597 CD133- ja CD133 + -solut eristettiin ja infektoitiin, kuten on kuvattu . (A, C) kuusi päivää infektion jälkeen solut käsiteltiin trypsiinillä ja kvantitoitiin apoptoosin käyttämällä anneksiini V-FITC Apoptosis Detection Kit (Calbiochem). Prosenttiosuus FITC-positiivisten solujen määritettiin FACS-analyysillä, ja kuolleet solut jätettiin propidiumjodidilla värjäys. (B, D) Nämä solut maljattiin myös 96-kuoppalevyille 5000 solua kuoppaa kohti CD133- solujen ja 1000 solua per kuoppa ja CD133 + -solujen infektion jälkeen ja valinnan. Kuusi päivää infektion jälkeen, yhdistetyt toiminnot kaspaasi 3 ja kaspaasi 7 määritettiin kaspaasi 3/7 Luminescence Assay Kit (Promega), ja normalisoitiin elinkykyisten solujen määrä määritetään CellTiter-Glo määrityksissä, kuten on kuvattu kuviossa 4. * , p 0,05 yksisuuntainen ANOVA vertailu kontrolliryhmien vastaavaksi c-Myc pudotus ryhmiä.

Loss c-Myc heikentää neuropallo muodostumista gliooma syövän kantasoluja

jakaminen tiettyjä keskeisiä ominaisuuksia normaaleja kantasoluja, syövän kantasolut kykenevät itseuudistumisen, joka mahdollistaa jatkuva ylläpito tämän alaryhmän ja laajentaminen koko kasvain. Serial neuropallo muodostuminen määrityksessä on käytetty korvikkeena on kyky uusiutua hermoston kantasolujen [34], ja se on äskettäin työskentelee aivokasvain kantasolujen [9], [28]. Primaarisissa neuropallo muodostumisen määritykset, noin 15% ohjaus CD133 + solut muodostivat neuropalloja, kun taas hyvin harvoja aloja muodostettiin solujen köyhdytetyn c-Myc (kuvio 6A). Neuropallojen kehitetty 100% kaivoja kontrolliryhmässä, kun maljattiin tiheydellä 100 solua /kuoppa, ja 80-85%: kuopissa, kun maljattiin 10 solua /kuoppa (kuvio 6B). Sen sijaan, neuropallojen muodostettiin solujen köyhdytetyn c-Myc ilmentymisen vain 10% (shRNA-1) tai 30% (shRNA-2), kaivot, kun maljattiin tiheydellä 100 solua /kuoppa, kun taas mitään palloja havaittiin, kun nämä solut maljattiin 10 solua /kuoppa. Huomattavaa on, että neuropalloja muodostuu soluja vähensi c-Myc ilmentyminen oli selvästi pienempi kuin pallojen muodostama ohjaus solut (kuvio 6C) ja pelkästään täytti minimikriteeriä pisteytettävien meidän kokeita. Puute neuropallojen muodostaman gliooma syövän kantasoluja köyhdytetty c-Myc ehdottaa heikentynyt itseuudistumisen. Kuitenkin arvioitaessa toissijainen neuropallo muodostuminen poissuljettua sillä harvat palloset syntyy Knockdown ryhmien ensisijainen määrityksessä ja neuropallojen oli rajoitettu elinkelpoisuus. Nämä tutkimukset siksi voi varmasti määrittää, c-Myc ilmentymistä tarvitaan itseuudistumisen gliooman syövän kantasoluja. On kuitenkin odotettavissa, että itseuudistumisen gliooman syövän kantasoluja estyy knockdown c-Myc, joka perustuu havaintojemme että gliooma syövän kantasolut eivät yleistyisi ja jalostettu apoptoosin kun knockdown c-Myc.

(A) T3359 CD133 + -soluja infektoitiin lentiviruksen ja valittu kuvattu. Sitten solut maljattiin tiheytenä 100 tai 10 solua per kuoppa 24-kuoppalevyille, kun läsnä on 1 ug /ml puromysiiniä. Kahdeksaan kuoppaan maljattiin kullekin ryhmälle. Numerot neuropallojen kussakin kuopassa määritettiin seitsemän päivää. Kuulat, jotka sisälsivät yli 20 solua, pisteytettiin. (B) Prosenttia kaivojen ilman neuropallojen muodostunut kvantifioitiin. #, P 0,001 yksisuuntainen ANOVA vertailu kontrolliryhmien vastaavaksi c-Myc pudotus ryhmiä. (C) edustaja valokuvia neuropallojen muodostuu soluja, jotka ilmentävät ei-kohdistuksen shRNA tai c-Myc erityinen shRNA (baaria = 50 pm). (D, E) Samanlaisia ​​tuloksia osoitettiin T4302 CD133 + solut.

Knockdown c-Myc estää Tuumorigeenisuustutkimuksissa gliooma syövän kantasoluja

Perustuu vaatimus c- myc toimintaa solusyklin etenemistä, kasvu ja selviytyminen, ja CD133 + glioomasoluilla kulttuuri, tutkimme rooli c-myc ilmentymistä niiden Tuumorigeenisuustutkimuksissa. CD133 + gliooma solut infektoitiin ei-kohdistuksen ohjaus lentiviruk- tai lentivirusta ilmentävät c-Myc shRNA. Seuraavat puromysiiniselektion, 5000 solua kunkin ryhmän injektoitiin aivojen paljaan hiiren neljänä kappaleena. 100% of hiirillä kontrollisolujen kehittyi nopeasti neurologisia oireita ja näytetään suuria kasvaimia on histopatologia koostuu pleomorphic soluista sisältää korkean ydinvoiman sytoplasman suhteet, näkyvä nucleoli minimaalisella solulimassa, reipas mitoosi toimintaa ja keskeinen maantieteellinen kuolion, joka takaa korkean asteen glial maligniteetti ( kuvio 7). Sitä vastoin ei ole hiiriä, joihin injektoitiin soluja köyhdytettyä c-Myc ilmaisu kehitetään merkkejä ja sen jälkeen 100 päivää, ei havaittu todisteita neoplastisten solujen (kuvio 7). Siten, c-Myc näyttää olevan välttämätöntä, syövän kantasoluja muodostaa kasvaimia.

(A) T3359 CD133 + solut infektoitiin ja valittu, kuten on kuvattu. Valinnan jälkeen solut injektoitiin aivot kateenkorvattomiin BALB /c-nu /nu-hiirissä (5000 solua per hiiri). Neljä hiirtä injektoitiin kussakin ryhmässä. Hiiret kontrolliryhmässä lopetettiin heti kehityksen neurologisia oireita. Kaikki hiirillä c-Myc Knockdown glioomasoluihin ei kehittänyt neurologisia oireita ja tapettiin 100 päivän kuluttua ilman merkkejä kasvaimen. Kaplan-Meier eloonjäämiskäyrien näytetään. (B) edustaja valokuvia hematoksyliinillä ja eosiinivärjäykset kallonsisäinen ksenograftikasvaimissa (10 x). (C) ksenograftikudoksesta kontrolliryhmässä koostuu pleomorphic soluista sisältää korkean ydinvoiman sytoplasman suhteet, näkyvä nucleoli minimaalisella solulimassa, reipas mitoosi toimintaa ja keskeinen maantieteellinen kuolion (tähti, 600 x). (D) Ohjaus gliooma ksenografti näytteillä painopistealueista eriytetään kasvainsolujen suhteellisesti enemmän eosinofiilinen sytoplasma ja solujen eksentrinen soluliman profiilit viittaavia gemistocytic ulkonäkö (nuolet, 400 x). (E) Vieraslajisiirteen kasvain kontrolliryhmässä esiintyy tunkeutumista tuumorisolujen ympäröivään aivokudokseen pitkin marginaali. Mitoosiin (nuolenkärki) soluttautua kasvaimen soluilla ydinvoiman sytoplasmiseksi suhteet ja pitkänomainen fibrillar solulimassa (nuoli) (600 x). (F) Hiiren aivot ruiskutettiin T3359 soluja, jotka ilmentävät c-Myc shRNA ei havaittu kasvaimen neulan pistoskohdan (nuolet, 200 x).

Keskustelu

Syöpä varsi solu hypoteesi on aiheuttanut merkittäviä ristiriitoja, mutta läsnäolo heterogeenisuus kasvainsolujen joidenkin syöpien on hyvin tunnustettu. Kasvainsoluja, jotka näyttävät kantasolujen-ominaisuuksiltaan ja aloittaa ksenograftikasvaimissa on puhdistettu yhä enemmän syöpiä, mukaan lukien leukemia [35], [36], aivojen [28], [29], rintojen [37], peräsuolen [38 ], [39], haiman [40], ja pään ja kaulan alueen syövät [41]. Nämä syövän kantasoluja funktionaalisesti määritelty kautta määritykset itseuudistumisen ja sarja ksenotransplantaatio määrityksiä jyrsijöiden. Kokeet osoittavat, että Tuumorigeenisuustutkimuksissa syövän kantasoluja on vähintään useita suuruuksia suurempi kuin suurin kasvaimia. Esimerkiksi gliooma syövän kantasoluja rikastetaan valinnalla CD133 pinta-antigeenin muotoa potilaalle tehdä ksenograftikasvaimissa 500 solua kateenkorvattomissa nude-hiirissä, kun taas 2 x 10

6 CD133- soluja voi [9]. Mukaisesti voimakas tuumorigeenisyyteen aivokasvaimen kantasoluja, osoitimme tässä, että CD133 + gliooma syövän kantasoluja ilmentyy voimakkaasti c-Myc onkoproteiinin. FACS-analyysi osoitti, että vähintään puolet CD133 + solujen akuutisti erottaa ihmisen kirurgisen koepalanäytteistä oli korkea c-Myc, kun taas suurin osa ( 85%) CD133- soluja c-Myc-matala (kuvio 1 D). Samanlaisia ​​koekspressoimalla c- Myc ja kantasolujen markkeri, nestiinifenotyypin, tunnistettiin suoraan ihmisen kirurgisen Ohutsuolikoepala kohdat (kuvio 1 E). Erityisesti, gliooma syövän kantasoluja ilmentävät c-Myc shRNA vielä säilyttänyt jäämät c-Myc-proteiinia (kuvio 2B, kaistat 5 ja 6), jotka olivat suuremmat kuin c-Myc-pitoisuudet CD133- soluissa, jotka ilmentävät ei-kohdistuksen shRNA (kuvio 2B, kaista 1). Tästä huolimatta alenemisesta c-Myc pystyneet tukemaan leviämisen, kasvua, selviytymistä, ja kasvaimen kehittymisen gliooman syövän kantasoluja. Tuore hiirimallissa T-solujen lymfooma käyttämällä ehdollisesti ilmaistaan ​​c-Myc viittaavat myös siihen, että tietyt raja-arvon C-Myc tarvitaan ylläpitämään kasvaimen fenotyypin [42]. Yhdessä meidän tulokset korostavat välttämätön edellytys korkean c-Myc ilmentymistä gliooma syövän kantasoluja.

Syöpä kantasolut on ehdotettu hitaasti pyöräily solut, kuten heidän somaattisten kantasolujen kollegansa [43]. Nopea laajeneminen kasvainten riippuu tällöin nopeasti jakamalla progenitorisolujen. Hidas solusyklin voi tarjota syövän kantasoluja suojamekanismi vastaan ​​tiettyjä terapeuttisia lähestymistapoja, jotka kohdistuvat nopeasti jakautuvat solut. Esimerkiksi ihmisen akuutti myelooinen leukemia, lepotilassa leukemia kantasolut ovat resistenttejä chemo-lääkkeitä, jotka riippuvat solusyklin [44]. Kuitenkin ominaisuudet syövän kantasolut voivat olla välttämättä yhtenäinen eri syöpätyyppejä, ja biologia syövän kantasolut voivat muuttua koko eri vaiheissa kasvain kehityksen. Vuonna aivokasvaimia, Singh ja työtoverit ensimmäinen osoitti, että ainoastaan ​​CD133 + syövän kantasolujen populaatio lisääntyvät nopeasti

in vitro

kun akuutisti eristää ihmisen kirurgisen koepalanäytteistä [28], [29]. Nämä tulokset olivat samankaltaisia ​​kuin erittäin proliferatiivisen syövän kantasoluja, jotka oli tunnettu RAS aiheuttama zebrafish alkion rabdomyosarkoomasolut [45]. Esillä olevassa tutkimuksessa, että annettu CD133 + glioomasoluihin sisälsi suurempi osuus S-vaiheen solujen ja kasvoivat nopeammin

in vitro

kuin täsmäsi CD133- solut (kuviot 3 ja 4). Olemme myös havainneet, että kasvua ja lisäkasvua gliooma syövän kantasoluja vakavasti heikentynyt, kun pudotus c-Myc, mutta tärkeämpää on, että solusyklin eteneminen CD133- glioomasolut olivat suhteellisen epäherkkiä menetys c-Myc. Transkription ohjelmat säätelee c-Myc edelleen heikosti määritelty ja riippuvainen solujen valtion [26], [46], mutta sisältää induktio sykliini D

1 [47] ja tukahduttaminen p21

WAF1 /CIP1 cyclin- riippuvaisen kinaasin estäjä [48], [49]. Tasaisen, ilmaus solusyklin sääntelyviranomaisten alavirtaan c-Myc, mukaan lukien p21

WAF1 /CIP1 ja sykliini D

1, muutettiin vuonna gliooma syövän kantasolut seuraavat c-Myc knockdovvn, mutta ei CD133- soluissa. Nämä tiedot paljastaa erityinen asema c-Myc ja sen loppupään kohdegeenien säätelyssä lisääntymistä ja kasvua CD133 + gliooma syövän kantasoluja.

Apoptoosi voidaan indusoida poikkeava ilmentymä tiettyjen onkogeenien, kuten c-Myc ja E2F1, jotka voivat toimia ”fail-safe” mekanismi poistamaan mahdollisia solutransformaatioon [33], [50]. Indusoiman apoptoosin c-Myc voidaan välittää aktivaation kautta ARF-MDM2-p53-reitin, tai aktivoimalla syöttämällä reseptoreita, kuten CD95 /Fas [33]. Kuitenkin sääntelyn purkaminen c-Myc on yleinen ihmisen kasvaimissa ja on indikaattori huonon ennusteen koska kasvaimet ovat hyvin varustettu erilaisilla anti-apoptoosin mekanismeja, jotka voivat neutraloida apoptoottinen paineen käyttöön c-Myc. Tuumorigeneesiä c-Myc siirtogeenisen hiiren mallia nopeutuu jos yhdessä muiden anti-apoptoosin geneettisiin muutoksiin, kuten yliekspressio Bcl-2 [51], tai Bmi1 [52], tai häiritsevät ARF-MDM2-p53-reitin [53]. Edelleen, se on suoraan osoitettu, että jatkuva c-Myc aktiivisuutta tarvitaan kasvaimen ylläpidon erilaisia ​​ehdollisen siirtogeenisen hiiren mallia. Nämä mallit osoittavat, että inaktivointi c-Myc lähes väistämättä johtaa kasvaimen taantumiseen riippumatta kasvaintyypistä samanaikaisen kasvun estäminen, erilaistumista ja apoptoosia (tarkistetaan [54]). Joissakin tapauksissa, kuten osteosarkooma [55] ja ihon kasvaimissa [56], lyhyt inaktivaatio c-Myc on riittävä indusoimaan jatkuvaa kasvaimen regression. Kuitenkin riippuvuus c-Myc voi olla kasvain-tyypistä. Tietyissä ehdollinen siirtogeenisiä malleja, aktivoituminen c-Myc jälkeen ohimenevä häiriö palauttaa kasvaimen kasvua [57], joihin voi liittyä aktivoitumisen lepotilassa syövän kantasoluja. Vaihtoehtoisesti, kasvaimet voivat uusiutumisen osuudessa eläimiä, vaikkei c-Myc aktiivisuuden, mikä viittaa siihen, että syövän kantasoluja on saattanut kertyä muita mutaatioita korvaamiseksi menetystä c-Myc [58], [59], [60]. Jatkuva kasvainregressio voi liittyä täydellinen häviäminen syövän kantasoluja seuraavat inaktivaatio c-Myc, kun taas syöpä kantasolut voivat selviytyä ja /tai paeta c-Myc riippuvuus toistuva kasvaimia. Meidän tutkimuksen tulokset osoittivat, merkittävästi apoptoosin induktion jälkeen, c-Myc pudotus syövän kantasolujen populaation (kuvio 4), ja syövän kantasoluja köyhdytettyä c-Myc ilmentymisen onnistuneet kehittämään ortotooppisten ksenograftikasvaimissa nude-hiirissä (kuvio 6). Erityisen kiinnostavia, selviytyminen ei-kantasolujen glioomasoluihin ei ollut riippuvainen jatkuvaa ilmentymistä c-Myc. Useissa viimeaikaisissa tutkimuksissa muissa syöpään malleissa, kohdistaminen c-Myc ilmaisu heikentynyt solujen lisääntymistä ja indusoi vanhenemista [61], [62], [63]. Nämä mallit voivat edustaa tuloksista menetys c-Myc enemmän homogeeninen syövän solupopulaatioiden, erityisesti geneettisesti mallit ajaa yli-ilmentyminen c-Myc. Tutkimuksemme on merkittäviä vaikutuksia niin kohdistaminen c-Myc on ainutlaatuisia etuja ominaisia ​​solun osiin malleissa edustavien solujen heterogeenisyys. Vaikka kohdistaminen c-Myc riitti estämään kasvaimen kasvua meidän tutkimuksissa dikotomista vaikutukset c-Myc-esto, joka olemme havainneet voivat tukea tarvetta samanaikaisesti kohdistaa ei-kantasolu kasvainpopulaatiot edellytys kliinisen tehon. Siten, c-Myc kuin molekyylikohteessa on lähestyttävä hienostuneisuutta sillä suurin osa kasvainsolujen voi osoittaa rajallinen terapeuttisen vaikutuksen mutta kriittinen kasvain väestö – syövän kantasoluja – voi estyä tai tapetaan parantaa yleistä kasvaimen valvontaa ja vähentää vastustuskykyä muita hoitoja.