Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

PI3K /AKT-reitin muutoksia liittyy puutteellinen vaste chemoradiation ihmisen kohdunkaulan syövän. Tämä tutkimus suoritettiin testaamiseksi mutaatioita PI3K koulutusjakson ja arvioida vaikutuksia AKT estäjien glukoosin sisäänottoa ja solujen elinkykyä.

Experimental Suunnittelu

mutaatioanalyysiin DNA 140 esikäsittelystä kasvainbiopsioissa ja 8 ihmisen kohdunkaulansyövän solulinjoissa suoritettiin. C33A-solut (

PIK3CAR88Q

ja

PTENR233 *

) käsiteltiin kasvavilla pitoisuuksilla kaksi allosteerisen AKT estäjät (SC-66 ja MK-2206) kanssa tai ilman glukoosianalogi 2-deoksiglukoosi (2 -DG). Solujen elinkelpoisuus ja aktivoinnin tilan AKT /mTOR reitin määritettiin hoitovasteesi. Glukoosin oton arvioitiin inkuboimalla

18F-fluorodeoksiglukoosia (FDG). Solumigraation arvioitiin tyhjästä määrityksessä.

Tulokset

aktivointi

PIK3CA

(E545K, E542K) ja inaktivoimalla

PTEN

(R233 *) mutaatioita tunnistettiin ihmisen kohdunkaulan syövän. SC-66 esti AKT, mTOR ja mTOR substraattien C33A soluissa. SC-66 inhiboi glukoosin sisäänoton kautta vähentää toimitus Glut1 ja GLUT4 solukalvoon. SC-66 (1 ug /ml-56%) ja MK-2206 (30 uM-49%) hoidon laskenut solujen elinkykyä kautta ei-apoptoottisia mekanismi. Vähenemistä solujen elinkelpoisuus paranee, kun AKT estäjiä yhdistettiin 2-DG. Naarmu testi osoitti huomattavaa vähentämistä solujen vaeltamiseen päälle SC-66 hoitoa.

Johtopäätökset

Mutaatioiden kirjo PI3K /AKT-reitin kohdunkaulan syöpä on monimutkainen. AKT-inhibiittorit tehokkaasti estää mTORC1 /2, vähentää glukoosin oton, Glykolyysivaiheen, ja vähentää solujen elinkelpoisuuden

in vitro

. Nämä tulokset viittaavat siihen, että AKT-inhibiittorit voivat parantaa vastaus chemoradiation kohdunkaulan syövän.

Citation: Rashmi R, DeSelm C, Helms C, Bowcock A, Rogers BE, Rader J, et al. (2014) AKT estäjät edistää solukuolemaa Kohdunkaulan syöpä kautta Häiriöt mTOR Merkinanto ja glukoosin imeytymisen. PLoS ONE 9 (4): e92948. doi: 10,1371 /journal.pone.0092948

Editor: Jin Q. Cheng, H.Lee Moffitt Cancer Center Research Institute, Yhdysvallat

vastaanotettu: 22 elokuu 2013; Hyväksytty: 27 helmikuu 2014; Julkaistu: 04 huhtikuu 2014

Copyright: © 2014 Rashmi et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat apuraharahoitusta NIH (USA NIH 5K12HD00145910) Julie K. Schwarz, LKT. CD tukivat Research Medical Student Grant (# RMS113) säteilyyn Society of North America (Julie K. Schwarz mentori). Siteman Cancer Center tukee NCI Cancer Center Support Grant # P30 CA91842. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

maailmanlaajuisesti kohdunkaulan syöpä on kolmanneksi yleisin naisten syöpä, ja se sijoittuu neljänneksi kannalta kuolleisuus [1]. Samanaikainen chemoradiation (lantion alueen sädehoitoa kanssa samanaikaisesta Sisplatiinin kemoterapia) on tavanomaista hoitoa potilaille, joilla on paikallisesti edennyt kohdunkaulan syöpä. Olemme aiemmin osoittaneet, että tulokset hoidon jälkeen [

18F] fluori-deoksi-glukoosi-positroniemissiotomografia (FDG-PET) ennustavat etenemisestä vapaan ja eloonjäämiseen tulosten jälkeen chemoradiation [2] – [4 ]. Tällä hetkellä ei ole olemassa tehokasta hoitoa vaihtoehtoja potilaille, joiden kasvaimet eivät reagoi perinteisiin chemoradiation.

Äskettäin tunnistimme PI3K /AKT-reitin muutoksia kasvaimia potilailla, joilla on positiivinen jälkeinen hoito FDG-PET. Havaitsimme myös korkean p-AKT ilmentymisen esikäsittelyn biopsianäytteissä, ja potilaat, joiden kasvaimet ilmaisivat korkeita p-AKT oli laskenut selviytymisen tuloksia ja lisääntynyt etäpesäkkeitä jälkeen standardi chemoradiation [5]. Geneettiset muutokset johtavat aktivoituminen PI3K /AKT /mTOR-reitin liittyy hoitoon resistenssin erilaisia ​​kiinteitä kasvaimia [6]. Useat PI3K /AKT estäjät on arvioitu kliinisissä tutkimuksissa rintasyövän ja muiden syöpien positiivisella hoitovasteita PI3K /AKT muutoksia [7]. On raportoitu viittaa siihen, että syöpiä

PIK3CA

mutaatiot ovat herkempiä AKT tai PI3K /mTOR-estäjät [8], [9].

Oletimme, että PI3K /AKT-estäjät parantaa vastauksena chemoradiation kohdunkaulan kasvaimissa, joissa PI3K /AKT-reitin muutoksia. Testata mutaatioita PI3K /AKT-reitin, analysoimme 140 esikäsittely kohdunkaulan kasvainbiopsioissa ja 8 ihmisen kohdunkaulansyövän solulinjoissa [10]. Otimme kohdunkaulan syövän solulinja C33A, joka on mutatoitunut sekä

PIK3CA

ja

PTEN

(

PIK3CA

R88Q,

PTEN

R233 *) ja ilmaisee korkeita p-AKT lähtötilanteessa, arvioida vaste kaksi allosteeristen AKT-inhibiittorit, SC-66 ja MK-2206.

Materiaalit ja menetelmät

Potilaat

tutkimus Potilaspopulaatiosta 140 potilasta takautuvasti kirjoilla osaksi kasvain pankki tutkimusten aikaan diagnoosi kohdunkaulan syövän (maaliskuu 1998 kautta heinäkuu 2011). Hyväksynnän institutionaalisten Tutkijavoimavarojen suojelutoimisto saatiin tämän tutkimuksen, ja kaikki potilaat allekirjoittivat tietoon perustuvan suostumuksen. Kliinistä seurantaa lukien FDG-PET kuvantaminen suoritettiin kullekin potilaalle hoitokäytännön mukaisesti kuten aikaisemmin on kuvattu [3]. Tuolloin viime seurata, 76 potilaalla ei ollut mitään todisteita taudista, ja 8 potilasta oli elossa tauti; 7 potilasta oli kuollut johtuu muu sairaus; 2 potilasta oli kuollut johtuu hoitoon liittyvän toksisuuden, ja 47 potilasta oli kuollut takia kohdunkaulan syöpä. Mediaani seuranta potilaiden hengissä aikaan Viimeisessä seurannassa oli 41 kuukautta (vaihteluväli 4-161 kuukautta).

Tilastollinen

Survival ja kasvaimen uusiutumisen mitattiin hoidon päättymisen. Kaplan-Meier (tuote-raja) menetelmää käytettiin johtaa arvioita säilyminen [11]. Testit vastaavuuden arvioiden säilyminen potilasryhmien välillä suoritettiin yleistetty Wilcoxonin log-rank-testi. Statview versio 5.0.1 ohjelmiston (SAS Institute Inc., Cary, NC) käytettiin analyysiin.

Mutaatioanalyysi käyttäen MALDI-TOF

kasvainbiopsioissa leikeltiin ja tarkistetaan kasvainsolun sisältöä kuten aiemmin on kuvattu [5]. Kasvaimen DNA valmistettiin käyttämällä standardimenetelmiä, joita Washington University Tissue Procurement Core Facility. Määritykset osajoukon 32 onkogeenisten mutaatioiden (

AKT1

,

AKT2

,

PIK3CA

ja

PTEN

) välillä [10] muotoiltiin kolmeen genotyypityksen kanavanippua, käyttämällä Sequenom n Pitoisuus Designer ohjelmisto, versio 3.1.2.2. (Sequenom Inc, San Diego, CA). Kanavanippujen suunniteltiin käyttämään iPLEX kemiaa. Sequenom MassARRAY järjestelmä (https://www.sequenom.com) työllistää MALDI-TOF (Matrix-laserdesorptio /ionisaatio – Time of Flight) massaspektrometriaa mitata massan ero seuraavien yksipohjaiseksi lisäyksiä laajennus alukkeita. Spectral vastaavat piikit odotettavissa massojen jokaisen laajennetun pohjamaali muuttuvat näytteen genotyyppi puhelut. Käyttämällä tavanomaista iPLEX protokollassa genotyypin ydin Washington Universityssä (St. Louis, MO, USA) jalostettu 15 ng näyte-DNA kohti multiplex kautta MassARRAY järjestelmään. Peak alueet edustavat normaalin ja mutantti pohja lisäykset saatiin kunkin näytteen massaspektri. Mutaatio pidettiin läsnä näytteessä, kun mutantti-huippu oli vastuussa 25% tai enemmän yhdistetyn piikkien pinta-alojen, ja puuttuu, kun mutantti-piikin pinta-ala oli pienempi kuin 25% kokonaismäärästä. Luettelo OncoMap mutaatioita, jotka testattiin myös multipleksoi ovat OM_00970-AKT1-E17K, OM_00032-AKT2-S302G, OM_00033-AKT2-R371H, OM_00241-PIK3CA-R88Q, OM_00242-PIK3CA-N345K, OM_00243-PIK3CA-C420R, OM_00246A-PIK3CA -E545K, OM_00248-PIK3CA-H701P, OM_00249-PIK3CA-H1047L, OM_00250A-PIK3CA-H1047R, OM_00250B-PIK3CA-H1047R, OM_00251-PIK3CA-H1047Y, OM_01017-PIK3CA-E545A, OM_01018B-PIK3CA-N1068fs*4,OM_0102-PIK3CA-Y1021C,OM_00839-PTEN-R173C,OM_00840-PTEN-R173H,OM_00841-PTEN-R233*,OM_00842-PTEN-R335*, OM_01038-PTEN-K267fs * 9 OM_01039-PTEN-V317fs * 3, OM_01069-PTEN-K6fs * 4.

Soluviljely ja reagenssit

Kohdunkaulan syöpä solulinjoja ylläpidettiin IMDM media (Life Technologies, CA), jossa oli 10% lämmöllä inaktivoitua FBS: ää ja inkuboitiin 37 ° C: ssa, 5% CO

2. SC-66 hankittiin BioVision (Milpitas, CA) ja MK-2206 peräisin Selleck Chemicals (Houston, TX). 2-deoksi glukoosia, proteaasi ja fosfataasi-inhibiittorin cocktailit hankittiin Sigmalta (Saint Louis, MO). Kaikki lääkkeet soluviljelmässä liuotettiin dimetyylisulfoksidiin (DMSO, Sigma). siRNA oligot vastaan ​​

AKT1

,

AKT2

ja

RICTOR

hankittiin Sigmalta (Saint Louis, MO).

Western blotting ja kalvo eristäminen

fosforylaatio AKT ja loppupään tavoitteet AKT ja mTOR polku tai ilman SC-66 (6-10 ug /ml) ja MK-2206 (0-2,5 uM) määritettiin western blotting primaarista vasta-aineita fosforyloidun ja yhteensä muotoja mTOR, p70s6k, 4E-BP1, S6, GSK3-β, FOXO Pakt

Thr308, Pakt

Thr450 ja Pakt

Ser473 (1:1000; Cell Signaling Technology, MA), yhteensä muodot AKT, mTOR ja 4-EBP1 (1:1000, Cell Signaling Technology, MA), yhteensä muotoja p70s6k ja β-Actin HRP Santa Cruz Biotechnology, CA ja yhteensä muotoja PRAS40 ja FOXO Milliporesta (1:5000, Santa Cruz Biotechnology, CA). p-Actin käytettiin sisäisenä kontrollina. Blotit HRP-konjugoidulla anti-kani-(Cell Signaling Technology, Beverly, MA) tai anti-hiiri-polyklonaalisia IgG-vasta-aineita (Santa Cruz Biotechnology, CA) 1 tunnin ajan huoneenlämpötilassa. Havaitsemiseen Pierce West Dura alustan (Pierce Biotechnology) käytettiin mukaisesti valmistajan protokollan ja paljaana röntgenfilmille.

Solun elinkelpoisuus ja anneksiini värjäys

solunelinkykyisyysmääritys C33A soluja käsiteltiin kanssa allosteric AKT-inhibiittorit SC-66 (0.0001 ug /ml-5 mikrog /ml) ja MK-2206 (125 nM-30pM) kanssa tai ilman glukoosianalogi 2-deoksiglukoosi (2-DG) (5-20 mM) käyttämällä annostitraus ja ajanjaksojen. SiRNA kokeissa, C33A-solut transfektoitiin ohimenevästi ja arvioitiin proteiinin ilmentymisen 48 tunnin jälkeen. Solujen elinkelpoisuus testattiin käyttäen Alamar Blue Life Technologies, mukaan valmistajan ohjeiden mukaisesti. Anneksiini /7-AAD värjäys suoritettiin 24 tuntia hoidon jälkeen, kittiä käyttäen BD, Biosciences valmistajan ohjeiden mukaisesti, ja solut analysoitiin virtaussytometrialla.

FDG kertymä määrityksissä

FDG sisäänoton määritys suoritettiin kuten aiemmin on kuvattu [5]. Lyhyesti, solut siirrostettiin ja esikäsiteltiin lohkon (Sytokalasiini B) 30 min, minkä jälkeen AKT-inhibiittoreita vielä 30 min. Tämän jälkeen

18FDG lisättiin glukoosia väliaineessa 1 tunnin ajan. Solut pestiin, kerättiin ja laskettiin gamma-laskurilla.

Immunofluoresenssikoe

kammion dia (8-no) 25,000 soluja ympättiin ja käsitellään SC-66 1 ug /ml 3 h ja kiinnitetään käyttäen 4% p-formaldehydiä Electron Microscopy Sciences (Hatfield, PA) 10 minuutin ajan. Objektilasit blokattiin sitten 5% normaalia vuohen seerumia (Jackson ImmumoResearch, West Grove, PA) kanssa 1 h, jota seurasi laaja PBS pesua. Sitten ensisijainen vasta Glut1 ja GLUT4 (Abcam, Cambridge, MA), joita seurasi sekundaarinen vasta-konjugaatti Alexa Fluor 488 (Life Technologies, Inc., Grand Island, NY). Levyjä lopullisesti asennettuna käyttäen Prolong Gold anti-fade (Life Technologies, Inc. Grand Island, NY).

Metabolinen määrityksissä

laktaatti määritys suoritettiin käyttämällä kittiä (Sigma, Saint Louis , MO) valmistajan ohjeiden avulla elatusaineet kerätään jälkeen proteiinien poisto käyttäen 10 kDa spin pylvässuodattimet. ATP ja NADP /NADPH analyysit suoritettiin käyttäen kaupallisesti saatavilla fluorometrisessä sarjat (Abcam, Cambridge, MA) mukaan valmistajan ohjeiden avulla solulysaateista.

Haavan paranemista määritys

Miljoona C33A solua maljattiin 35 mm: kudosviljelymaljassa ja kasvatettiin täysiksi. Kaksi rinnakkaista naarmuja tehtiin 200 ul pipetin kärki per astia ja scratch leveys mitattiin perustason [12]. Haava leveys mitattiin vähintään kuusi eri pisteitä jokaisesta haavasta. SC-66 (1 ja 2,5 ug /ml) ja MK-2206 (2,5 ja 5 uM) lisättiin 24 tunnin ajan. Leveys naarmut mitattiin Qcapture Pro -ohjelmistoa ja katsella esimerkiksi OLYMPUS 1 x 70 mikroskoopilla. Prosenttia haavan paranemista laskettiin jakamalla tyhjästä leveys lääkkeen lisäyksen jälkeen torjumalla leveys miinus 100%. Esitetyt tulokset ovat keskiarvo ± SEM.

Tulokset

PI3K /AKT /mTOR-reitti on aktiivinen kohdunkaulan syövän solulinjoissa

Paneeli ihmisen kohdunkaulansyövän solulinjoissa testattiin ekspressiolle malli ja aktivoinnin tilan PI3K /AKT /mTOR-reitin molekyylejä. Solulysaatit valmistettiin ilman hoitoa ja perustason western blotit suoritettiin. P70S6K, merkki aktivoimiseksi mTOR-reitin, fosforyloitiin useimmissa solulinjoissa lukuun ottamatta HeLa, C41 ja C33A, jossa se todettiin heikosti fosforyloitu (Fig. 1A). Fosforylaatio 4E-BP1 ja S6 havaittiin olevan alhainen useimmissa solulinjoissa tutkittu. SiHa- ja SW756, ekspressiotasojen ei-fosforyloitua muotojen mTOR, p70s6k, 4E-BP1 ja S6 oli alhainen verrattuna muita solulinjoja. Toisaalta, fosforylaatio mTOR havaittiin olevan samanlainen kaikissa solulinjoissa (Fig. 1A). Lähtötilanteessa ilmaus fosforyloidun muotojen AKT kuten Ser473, Thr308 ja Thr450 määritettiin. C33A ilmaisi kaikki kolme muotoa p-AKT. Voit selvittää tilan ylävirtaan säätelijöitä AKT kuten PI3K ja PTEN, lähtötilanteessa p-PI3K ja p-PTEN tasoja tutkittiin. Fosforyloituu PTEN taso oli samanlainen kaikissa solulinjoissa, paitsi C33A, joissa esiintyy koko PTEN bändi oli minimaalinen. PI3K aktivoitiin useimmissa solulinjoissa tutkittiin tässä. SiHa näytteillä hyvin pieni PI3K aktivointi (Fig. 1 B). Kaikki nämä tulokset viittaavat siihen, että kohdunkaulan syöpä solulinjoja aktivoinut mTOR koulutusjakson perusolosuhteissa ja suuria vaihteluita olemassa p-AKT tasoilla.

(A-B) mTOR koulutusjakson komponenttien ja fosforyloituu muotoja AKT testattiin käyttäen kaupallisesti saatavilla vasta kahdeksan kohdunkaulan syövän solujen lysaatit valmistettiin ilman hoitoa. (C)

PIK3CA

,

AKT

, ja

PTEN

geeni mutaatiostatuksesta tilan 8 ihmisen kohdunkaulansyövän solulinjoissa.

Sequenom mutaatioanalyysiin of PIK3CA, PTEN ja AKT geenien kohdunkaulan syövän

testaamiseksi mutaatioita PI3K /AKT-reitin, toteutimme Sequenom mutaatioanalyysiin onkogeeniselle mutaatioita geeneissä

PIK3CA

,

PTEN

ja

AKT

. Emme havainneet mitään

AKT1

tai

AKT2

mutaatioita kohdunkaulan syövän solulinjoissa. C33A kanna R88Q

PIK3CA

mutaatio. R88Q on aktivoiva mutaatio löytyy ABD verkkotunnus p110α alayksikön

PIK3CA

geeni. Tämä vika liittyy parannettu entsymaattinen aktivointi PI3K proteiinin ja AKT-vaikutusta

in vitro

[13], [14]. Olemme havainneet, että E545K

PIK3CA

mutaatio oli läsnä ME-180 ja CaSki-solujen (Fig. 1 C).

PIK3CA

E545K mutaatio on aktivoiva mutaatio kierteisen alalla p110α alayksikköä PI3K proteiinia. Tämä mutaatio on tunnettua antaa parannetun kinaasiaktiivisuutta ja aktivoivat konstitutiivisesti AKT [15]. Olemme myös löytäneet R173C

PTEN

geenimutaatiokoe CaSki- ja

PTEN

R233 * mutaatio C33A soluissa (Kuva. 1 C).

PTEN

R173C mutaatio liittyy pienentynyt fosfataasiaktiivisuus vastaan ​​PIP

3 [16].

PTEN

R233 * eksonissa 7 indusoi ennenaikaisen lopetuskodonin geeniin, mikä selittää puuttuminen

PTEN

proteiinin ilmentymistä C33A-soluja [17] (Fig. 1 B).

Käyttämällä Sequenom määritystä, me sitten testattiin mutaatioiden

PIK3CA

,

AKT

ja

PTEN

geenien 140 esikäsittely koepaloja kerättiin meidän kasvain pankkiin. Emme havainneet mitään määritettiin mutaatio

AKT

geeni meidän potilasryhmässä. Huomasimme, että kasvaimia 7 ulos 140 potilaalla kanna

PIK3CA

E545K mutaatio ja 1 ulos 140 oli

PIK3CA

E542K mutaatio. Olemme myös havainneet, että 1 kasvaimen kanna

PTEN

R233 * mutaatio. Potilaat, joilla E545K ja E542K mutaatiot

PIK3CA

havaittiin näyttää huonoon ennusteeseen ja lyhyempi taudista vapaan eloonjäämisen jälkeen standardi chemoradiation (lantion alueen sädehoitoa ja samanaikaista sisplatiini kemoterapia) (p = 0,05, Fig. 2).

Kaplan Meierin käyrä ilman taudin etenemistä kohdunkaulan syöpäpotilaiden villin tyypin PIK3CA vs. E545K tai E542K mutantti kasvaimet (p = 0,05).

AKT estäjät SC-66 ja MK-2206 aiheuttaa ei-apoptoottinen solukuolema PIK3CA ja PTEN mutantti C33A solujen

käyttäen C33A solujen mallina PI3K /AKT mutantti kohdunkaulan syöpä, päätimme siitä tuumorisolun selviytyminen oli riippuvainen AKT signalointi. C33A soluja inkuboitiin kasvavia annoksia SC-66 ja MK-2206 ja elinkelpoisuus määritettiin 24 ja 48 tuntia. Solujen elinkelpoisuus väheni alkaen 1 ug /ml SC-66 sen jälkeen, kun 24 ja 48 tuntia, 55% ja 43% vastaavasti. Elinkelpoisuus 5 ug /ml SC-66: n havaittiin olevan 15%, kun 24 h (Fig. 3A). C33A solut olivat myös herkkiä toiselle allosteeristen AKT-estäjällä, MK-2206. Solujen elinkelpoisuus todettu alentavan alkaen pitoisuus 15 uM (58%) ja vähentämällä 2% 48 h (Fig. 3B). Vahvista, joka vaikuttaa solujen elinkelpoisuuteen johtuivat AKT eston sijaan armottoman vaikutuksia SC-66 ja MK-2206, siRNA kokeet suoritettiin. Kuten kuviossa 3C on esitetty, C33A solujen elinkykyisyys laski samassa määrin, kun solut transfektoitiin siRNA: illa jolloin pudotus on

AKT1

,

AKT2

, ja

RICTOR

(kuvio . 3D).

(A-B) C33A-solut ympättiin 48-kuoppaisille levyille ja käsiteltiin kasvavia annoksia SC-66 (0,0001-5 ug /ml) ja MK-2206 (1,25-30 uM ) kolmena kappaleena 24 ja 48 tuntia. Elävyys mitattiin käyttäen Alamar Blue. Prosentuaalinen elinkelpoisuus laskettiin ajoneuvon hoidettuihin kontrolleihin. (C) C33A-solut siirrostettiin 48-kuoppalevyille ja transfektoitiin oligot vastaan ​​

AKT1

,

AKT2

ja

RICTOR

ja käsiteltiin SC-66 (1 ug /ml) ja MK-2206 (20 uM) kolmena kappaleena varten 24. elävyys käyttäen Alamar Blue. Prosentuaalinen elinkelpoisuus laskettiin ajoneuvojen hoidettuihin kontrolleihin ja hallita siRNA transfektoidaan valvontaa, p 0,001 vertailemista varten ohjaus siRNA vs. siRNA varten

AKT1

,

AKT2

ja

RICTOR

, SC-661 ug /ml, MK-2206 20 uM. (D) C33A-solut ympättiin 48-kuoppalevyille ja transfektoitiin oligoilla vastaan ​​

AKT1

,

AKT2

ja

RICTOR

ja lysaatit valmistettiin 48 tunnin kuluttua ja western blotit suoritettiin. (E) C33A-soluja käsiteltiin SC-66 (2,5 ug /ml) ja MK-2206 25 uM 24 tuntia, sitten värjättiin anneksiini /7-AAD ja analysoitiin virtaussytometrialla. Käyrä edustaa% solujen elävyyttä. (F) C33A-soluja käsiteltiin SC-66 (0,0001 ug /ml-0,1 ug /ml) kanssa tai ilman 20 mM 2-DG: ssa 48 tuntia.

tutkia mekanismi, jonka kautta AKT inhibiittorit indusoivat solukuoleman, suoritimme anneksiini /7-AAD värjäystä. Kun SC-66 (2,5 ug /ml) ja MK-2206 (25 uM) hoito oli hyvin vähän solujen anneksiini vain värjäystä ja osa solujen sekä värjäytyminen oli 35% ja alle 20%, vastaavasti. 7-AAD vain värjäämällä oli lähes 80% vuonna MK-2206 käsitellyt solut (Fig. 3E). Edelleen linkki vaikutuksia SC-66 kautta glukoosin oton eston, yhdistimme SC-66, jossa on 2-deoksi glukoosi (2-PO), kilpaileva estäjä glukoosin oton. 48 tuntia käsittelyn jälkeen SC-66 (0,01 ug /ml) elinkelpoisuus oli 107%, mutta johon on lisätty 2-DG, solujen elinkelpoisuus aleni 72% p 0,001 (Fig. 3F). MK-2206 osoitti synergiavaikutuksen kanssa 2-DG. 24 tunnin kuluttua, elinkelpoisuutta MK-2206 käsitellyistä soluista oli 78%, joka laski 40% lisäämisen jälkeen 20 mM 2-DG (p 0,001, Data A File S1).

SC-66 ja MK-2206 inhiboi mTOR /AKT-reitin tehokkaasti C33A soluissa

tutkia vaikutuksia AKT estoa mTOR ja sen loppupään tavoitteet C33A soluissa, tutkimme fosforylaatiota tilan mTOR koulutusjakson komponenttien Western blot ja käytetyt p70S6K merkkiaineena mTOR aktivointi [18]. SC-66 estää täysin p70S6K fosforylaation 3 tuntia (Kuva. 4A). MK-2206 inhiboi p70S6K aktivointi mutta siellä oli lievää uudelleenaktivointi 4 h. MK-2206 inhiboi mTOR-reitin komponentteja kuten mTOR, 4E-BP1 ja S6 tehokkaasti 2 tuntia. MK-2206 mTOR reitti näyttää olevan ohimeneviä kuin p70s6k oli aktiivisena vielä 4 h (Data D File S3). SC-66 ja MK-2206 esti kaikki kolme fosforyloidun muodot AKT (Thr308, Thr450 ja Ser 473) annoksesta riippuvaisella tavalla viittaa siihen, että MK-2206 vaikuttaa ensisijaisesti mTORC1 (Fig. 4C ja Data F File S3). Tätä tukee havainto, että SC-66 oli tehokkaampi estämään AKT-substraatteja, kuten PRAS 40, GSK3-β ja FOXO1 (Fig. 4B) verrattuna MK-2206, erityisesti PRAS40 joka on mTORC1 monimutkainen [19] (Data E File S3). P70S6K fosforyloitiin 4 h MK-2206 hoito viittaa mTOR-reitin inhibitio oli ohimenevä (Supplemental data).

(A-C) C33A-soluja käsiteltiin kasvavilla pitoisuuksilla SC-66 (6-10 ug /ml) 3 h ja lysaatit valmistettiin western blot.

Rapamysiini, joka on mTOR-estäjä, lievittää palaute estoja ja indusoi AKT Ser473 fosforylaatio käytettäessä mTORC2 riippuvaisella tavalla, joka johtaa uuteen AKT aktivointi [20 ]. Testata tätä käyttämällä estäjät teimme enää solujen inkubaation SC-66 18-24 tuntia. Huomasimme, että p70S6K, markkeri mTOR aktivointi, oli vähentynyt, vaikka 18 ja 24 tunnin hoito. SC-66 hoito laski aktivointi AKT substraattien, Thr308 ja Thr450 by18 ja 24 tuntia. Thr308 tasot eivät nouse verrattuna 3 h näyte mutta silti näkyvissä laskeva 18-24 h (tuloksia ei ole esitetty). Kaikki nämä tulokset viittaavat siihen, että SC-66 esti tehokkaasti sekä mTORC1 /2 ja AKT. MK-2206 todettiin toimivan pääasiassa mTORC1 reitin hieman aktivoituminen koulutusjakson jälkeen 4 tuntia.

SC-66 inhiboi glukoosin otto ja kalvo translokaation glukoositransporttereita

glukoosin oton testattiin suorittamalla

in vitro

FDG otto määrityksissä läsnäollessa ja poissaollessa SC-66 (35 ug /ml). Huomasimme, että SC-66 inhiboi glukoosin oton merkittävästi osoituksena vähentynyt pulsseina minuutissa (Kuva. 5A). Lisäksi olemme määritti SC-66 Glut1 ja GLUT4 translokaatio membraanin. Tämän kalvon sytoplasmaan fraktiointi suoritettiin sen jälkeen käsittelemällä soluja SC-66 (5 ug /ml) 24 tuntia. SC-66 inhiboi Glut1 ja GLUT4 translokaatio sytoplasmasta kalvoon, kuten määritettiin Western blot (kuvio. 5C). Tämä vahvistettiin immunofluoresenssivärjäyksellä (Fig. 5D). Kaikki nämä tulokset viittaavat siihen, että mTOR esto SC-66 johti vähentyneeseen glukoosin sisäänoton kautta Glut1 ja GLUT4 säilyttäminen sisällä solulimassa.

A) C33A soluja käsiteltiin SC-66 (35 ug /ml) tai lohkon (sytokalasiini B) 30 minuuttia ennen inkubointia

18F-fluorideoksiglukoosi kuvatulla menetelmät jaksossa. Käyrä edustaa cpm-arvot, p 0,01 vertailemista varten FDG yksinään (solut vain) versus FDG + SC-66. B) C33A-soluja käsiteltiin SC-66 (0-5 ug /ml) 3 ja 24 tuntia ja Glut1 tasot analysoitiin western-blotilla. C) C33A-soluja käsiteltiin SC-66 (0, 1 ja 5 ug /ml) 24 tuntia. Kalvo ja sytosolin jakeet valmistettiin käyttämällä kittiä (MemPER) alkaen Peirce Biotechnology. Nämä subsellulaarisista fraktiot sekoitetaan sitten näytteen ja inkuboitiin 65 ° C: ssa 20 minuuttia ennen lastattu geelit Western blot varten Glut1 ja GLUT4. D) Immunofluoresenssi suoritettiin C33A soluissa, sen jälkeen käsittelemällä niitä SC-66 (1 ug /ml) 3 tuntia kammiossa dia.

AKT-estäjällä SC-66 estää Glykolyysivaiheen

Sen määrittämiseksi, AKT inhibitio johti alentuneeseen Glykolyysivaiheen, mittasimme ATP ja NADPH tasoilla jälkeen SC-66 hoitoa. Olemme havainneet, että ATP-tasot laskivat merkitsevästi jälkeen SC-66 hoitoa, ja NADPH kohoamiseen, mikä viittaa siihen, että vaihtoehtoisia väyliä glukoosiaineenvaihdunnan, kuten Pentoosi fosfaatti shuntti, voi olla aktiivinen C33A soluihin AKT signalointi tukahdutetaan (Fig. 6A ja 6B). Yhteensä laktaattitasot Myös laskivat C33A soluissa hoidon jälkeen SC-66 (Fig. 6C ja 6D). Kaikki nämä tulokset osoittavat, että esto AKT estää glykolyysin C33A soluissa. Arvioida loppupään vaikutuksia kasvainten solujen aineenvaihduntaa, tarkkailtiin aktivoinnin tilan substraatin AKT: n, ATP-sitraattilyaasi (ACL) sen jälkeen, kun SC-66 hoitoa. C33A soluja inkuboitiin kasvavia annoksia SC-66 ja western blotit tehtiin. SC-66 inhiboi ACL fosforylaation 5 ja 24 tuntia, mikä viittaa siihen, että esto AKT voi myös vaikuttaa muiden näkökohtien kasvain solujen aineenvaihduntaa, kuten lipidisynteesiin (Fig. 6E).

(A-B) C33A soluja ympättiin T 25 cm

2 kudosviljelykolveissa, käsiteltiin SC-66 ja solunsisäisten NADPH tasoja ja ATP määritettiin. Käyrä edustaa ATP ja NADPH uM tasolla perustuu standardikäyrän, p 0,01 vertailemista varten ohjaus verrattuna SC-66 10 ug /ml 1 ja 3 h ja p 0,001 valvontaa vs. 30 ug /ml ATP-tasot; p 0,01 vertailemista varten ohjaus verrattuna SC-66 5 ug /ml 3 h ja p 0,01 ohjaus versus 10 ug /ml 3 h NADPH tasoilla. (C-D) C33A solut ympättiin T 25 cm

2 kudosviljelykolveissa, käsiteltiin SC-66 ja erittyy laktaattitasot mitattiin nM käyttäen standardikäyrää, p 0,001 vertailemista varten ohjaus vs. SC -66 5 and10 ug /ml. (E) C33A-soluja käsiteltiin kasvavilla pitoisuuksilla SC-66 (0-5 ug /ml) 5 h ja 24 h, ja lysaatit valmistettiin Western blot.

SC-66 vähentää siirtymää of C33A soluissa in vitro

on raportoitu osoittavat roolin AKT metastasoituneessa prosessissa kuten solun muuttoliike ja invaasiota [21]. Vaikutusten tutkimiseksi SC-66 ja MK-2206 on solumigraatio käsittelimme soluja 1 ug /ml SC-66 ja 2,5 uM MK-2206: ssa 24 tuntia ja suoritetaan naarmu määritystä. Huomasimme, että SC-66 inhiboi solujen migraatiota noin 50% verrattuna kontrolliin kun taas MK-2206 ei ollut mitään vaikutusta (kuvio. 7).

C33A-soluja käsiteltiin A) SC-66 (1 ja 2,5 ug /ml), ja B) MK-2206 (2,5 ja 5 uM) 24 tuntia. Prosenttia haavan paranemista laskettiin kuvatulla -osiossa on p 0,0001 vertailemista varten ohjaus vs. 1 ug SC-66 ja p 0,0001 ohjaus vs. 2,5 ug SC-66.

Keskustelu

tässä tutkimuksessa, suoritimme mutaatioanalyysiin 140 esikäsittelyn kasvainbiopsioissa ja 8 ihmisen kohdunkaulan syöpä solulinjoja seuloa mutaatioiden PI3K /AKT-reitin. Tämä on ensimmäinen tutkimus, tietojemme mukaan kattavasti analysoida mutaatioita PI3K /AKT-reitin ihmisen kohdunkaulan syövän. Havaitsimme useita mutaatioita PI3K /AKT-reitin ihmisen kohdunkaulansyövän yksilöihin, mukaan lukien aktivoivat mutaatiot

PIK3CA

(E545K, E542K) ja inaktivoivat mutaatiot

PTEN

(R233 *). Mutaatioanalyysiin kohdunkaulan syövän solulinjoista paljasti muita vikoja. C33A soluissa on sekä R233 *

PTEN

mutaatio ja R88Q

PIK3CA

mutaatio [22].

Tämä tutkimus suunniteltiin myös testaamaan hypoteesia, jonka mukaan kohdunkaulan syöpäsolut muuttuneeseen AKT aktivointi olisi herkkiä AKT estäjiä. SC-66 ja MK-2206 tehokkaasti indusoi solukuoleman C33A soluihin ei-apoptoottisia mekanismi. SC-66: n havaittiin olevan voimakas mTORC1 /2-estäjällä. SC-66 tehokkaasti inhiboi p70s6k ja 4E-BP1 mTORC1 substraattien lisäksi estämällä Ser473 ja Thr308 fosforylaation AKT: n, ja aktivointi AKT substraattien, kuten PRAS40, GSK3-β ja FOXO. SC-66 näkyvät synergiavaikutuksen kanssa 2-PO, ja SC-66 esti jatkojalostustuotteisiin tapahtumia, kuten translokaatio glukoositransporttereita kalvoon mikä johti vähentyneeseen glukoosin oton. Lisäksi esto AKT vähennetään Glykolyysivaiheen osoituksena väheni ATP ja laktaattitasot, ja lisääntynyt aktiivisuus vaihtoehtoisten metaboliareitit johtaa lisääntyneeseen solun NADPH. Nämä tulokset viittaavat siihen, että AKT estäjät vähentävät kohdunkaulan syövän kannattavuutta häiritsemällä solun glukoosiaineenvaihdunnan. Oletamme, että kohdunkaulan syöpiä PI3K /AKT-reitin muutokset ovat riippuvaisia ​​korkea glukoosin oton ja Glykolyysivaiheen hengissä. On huomattava, että aktivointi Akt mukaan

PTEN

menetys ja /tai

PIK3CA

mutaatioita ohittaisi tarpeen aktivaation kasvutekijän reseptorien (eli IGF-1 R) aloittaa PI3K /Akt /mTOR signalointiryöpyn. Tällä tavalla, kohdunkaulan syövän solut kykenevät upregulaatioon glukoosin tuonti ja aineenvaihduntaa jopa ilman asianmukaisen ulkoisen signaaleja.

Aiemmin on osoitettu, että inhibitio mTORC2 johtaa nopeaan eston AKT Ser473 fosforylaatio, joka nopeuttaa epävakautta prosessi Thr308 sivuston fosforylaation [23]. Tämän mukaisesti olemme myös havaittu, että SC-66 välittämä kaventumiseen fosforylaatioon Ser473 ja Thr308 in C33A soluissa. Aiemmin työ muilta ehdotti, että defosforylointia AKT at Thr308 sivuston johtaa syvällisempää eston AKT toimintoa kuin mitä nähdään defosforylointia AKT at Ser473 yksin [23]. Thr308 on jäännös avain T-silmukan AKT proteiinia ja pitää osoittavat paremmin AKT-kinaasiaktiivisuutta. On ristiriitainen tietoja Ser473 fosforylaatioon ja AKT-kinaasiaktiivisuutta [24], [25]. Tuloksemme osoittavat, että SC-66 estää kaikki kolme fosforyloidun muotoja AKT.

On raportoitu, että mTORC2 tarvitaan kehitystä tiettyjen syöpien kanssa

PTEN

menetystä [26]. C33A solut ovat

PTEN

vialliset, ja huomasimme, että SC-66 on voimakas mTORC2 estäjä.

PTEN

R233 * mutaatio löytyy C33A solut voidaan johtaa suurempaan kertymiseen solun PIP

3 johtavat parempaan PI3K signalointi ja PDK-1-välitteisen AKT Thr308 fosforylaatio [25], [27], [ ,,,0],28]. Me spekuloida, että SC-66 kykenee sen estävä vaikutus AKT Thr308 fosforylaatio epäsuorasti toimimalla PDK-1-estäjä. SC-66 ei ehkä ole yhtä tehokkaita kuin estäjänä PDK-1, koska se on mTOR ja AKT, ja tämä selittää hieman Thr308 jälkeen todetut enää inkuboinnin. Lisäksi havaitsimme, että SC-66 on voimakas solukuoleman induktori 24 h, mikä aktivoituminen AKT voi olla ongelma

in vivo

.