Krooninen sairaus

tiivistelmä

ituradan mutaatioita

FH

, geeni, joka koodaa trikarboksyylihappo TCA (TCA) kierto entsyymi fumaraatti hydrataasia, liittyy perinnöllinen syövän kutsutaan Perinnöllinen leiomyoma- ja munuaissyöpä (HLRCC). Yksilöiden HLRCC ovat alttiita kehittämiseen erittäin pahanlaatuisten ja tappava munuaissolukarsinooma (RCC). Mekanismit tumorigeneesin ehdotettujen ovat pitkälti keskittyneet biokemiallisia seurauksia menetyksen FH entsyymiaktiivisuus. Vaikka tappio tuumorisuppressorigeenin

von Hippel Lindaun

(

VHL

) arvellaan olevan alkutapahtumaa useimpien RCC, rooli

FH

satunnaisissa munuaisten syöpä ei ole tutkittu. Me raportoimme tässä, että FH-mRNA: n ja proteiinin ilmentyminen vähenee selvästi solun munuaissyövän, yleisin histologinen variantti munuaissyöpää. Lisäksi osoitamme, että alennetaan

FH

johtaa kertyminen hypoksian indusoituvan tekijä- 2α (HIF-2α), transkriptiotekijä tunnetusti munuaisten karsinogeneesiin. Lopuksi osoitamme, että yliekspressio FH munuaissyöpäsoluissa estää solumigraatiota ja hyökkäystä. Nämä tiedot tarjoavat uusia oivalluksia tuumorisuppressorigeenin toiminnot FH satunnaista munuaissyöpä.

Citation: Sudarshan S, Shanmugasundaram K, Naylor SL, Lin S, Livi CB, O’Neill CF, et ai. (2011) Vähentynyt ilmentyminen fumaraatin hydrataasia Clear Cell Munuaisten syöpä välittää HIF-2α keskittymisen ja Edistää Migration and Invasion. PLoS ONE 6 (6): e21037. doi: 10,1371 /journal.pone.0021037

Editor: Marcelo G. Bonini, University of Illinois at Chicago, Yhdysvallat

vastaanotettu: 18 tammikuu 2011; Hyväksytty: 17 toukokuu 2011; Julkaistu: 14 kesäkuu 2011

Copyright: © 2011 Sudarshan et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tuettiin osittain Cancer Therapy and Research Center (CTRC) yliopiston Texas Health Science Center (National Institutes of Health P30 CA054174-17). SS tukee NIH K08 CA138774, Voelcker Fund Young Investigator Award, AUA Foundation /Astellas Rising Star Award, ja erityinen lahja Mr. Charles Butt ja työntekijöiden HEB. SLN tukee CTRC ja NIH U01 CA86402. LZS tukee NIH R01 CA079683. KB tukee Veterans Administration Urakehitys Award (CDA-2) ja NIH R01 NCI CA131272. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Vuonna 2010 yli 57000 miesten ja naisten diagnosoitu munuaissolukarsinooma (RCC) ja 13000 yksilöitä kuolee tähän sairauteen [1]. Vaikka potilaiden elinaikaa paikallinen sairaus on korkea, joilla on pitkälle edennyt sairaus kohtaavat huono ennuste, vaikka äskettäin kohdennettuja tekijöille. Vaikka menetys

von Hippel Lindaun

(

VHL

) tuumorisuppressorigeeniä arvellaan alkutapahtumaa useimpien RCC [2], tiedetään vähän myöhemmin geneettisiä tapahtumia ja niiden vastaavia vaikutuksia kasvaimien syntyyn. Selvittäminen näistä reiteistä on tunnistaa uusia terapeuttisia kohteita sekä helpottaa biologisten merkkiaineiden kehitystyö, joka voi olla sekä ja ennustavia merkitys.

ituradan mutaatioita

FH

liittyy perinnöllinen muoto munuaissyövän tarkoitettujen niin Perinnöllinen leiomyoma- ja munuaissyöpä (HLRCC) [3], [4].

FH

koodaa trikarboksyylihapposyklin entsyymin fumaraatti hydrataasi (kutsutaan myös fumarase), joka katalysoi nesteytystä fumaraatin muodostamiseksi malaatti. Yksilöiden HLRCC ovat alttiita kehittämiseen sileälihaskasvainten ihon ja kohdun lisäksi erittäin pahanlaatuisten ja tappava RCC. Mekanismit tumorigeneesin ehdotettujen ovat pitkälti keskittyneet biokemiallisia seurauksia menetyksen FH entsyymiaktiivisuus. On ehdotettu, että menetys FH johtaa fumaraattimuotoon kertymisen ja edistää pseudohypoxic tila, jossa hypoksiavaste reitit poikkeavasti aktivoituvat huolimatta happiolosuhteissa [5]. Fumaraatti on osoitettu estävän proliinin hydroksylaation hypoksian indusoima tekijä HIF-1α ja HIF-2α, jotka katalysoivat entsyymien perhe kutsutaan HIF-hydroksylaasien (tohtoreita) [5]. Heidän unhydroxylated muodossa, HIFαs välttää tunnustaa E3 ubikitiinipromoottori ligaasilla VHL (jonka kohteena nämä proteiinit proteosomal hajoamisen) ja siten stabiloidaan [6], [7], [8], [9]. Näissä olosuhteissa joko HIF-1α tai HIF-2α pystyvät heterodimerisoitua konstitutiivisesti ilmennetty proteiini HIF-1β, kutsutaan myös ARNT (Tutustuttuamme [10]). Tämä heterocomplex pystyy transkriptionaalisesti aktivoimaan useita geenejä kuten

VEGF

ja muita kasvutekijöitä, jotka voivat olla pro-tuumorigeenisiä kun väärin säädellystä. Pseudohypoxia on myös liitetty yleisin variantti RCC, kirkas cell carcinoma (ccRCC), jossa menetys

VHL

on yhteinen geneettinen tapahtuma [11]. Kuten odotettua, kohonneet HIF-1α ja /tai HIF-2α on merkitty selkeä solussa munuaisten syövistä [12], [13]. Mielenkiintoista, useita rivejä tulokset viittaavat HIF-2α vastakohtana HIF-1α, on kriittinen RCC muodostumista ja /tai etenemistä [14], [15], [16].

Vaikka

VHL

menetys on selvästi kriittinen HIF-2α vakauttaminen, vaihtoehtoiset mekanismit, paitsi ehkäisyssä hajoamista, voi olla rooli ylläpito HIF-2α munuaisten syöpään. Aiempi työ Block

et al.

Perustettu rooli reaktiivisia happiradikaaleja (ROS) tuottamat NADPH -oksidaasien ylläpitää HIF-2α-proteiinin ilmentymisen kautta AKT-riippuvaisen mRNA translaation mekanismi VHL-vajaiden solujen [17] . Lisäksi, mTOR signalointikompleksiin 2 (mTORC2), tunnettu aktivaattori AKT signalointi, on osoitettu edistävän HIF-2α kertyminen

VHL

null munuaissyöpä soluihin [18]. Viime aikoina hoito RCC-solujen kanssa kahden PI3K /mTOR-estäjä esti ilmentymisen HIF-2α [19]. Nämä tulokset tukevat käsitystä, että meneillään HIF-2α synteesi on kriittinen ylläpito tämän onkogeenisten transkriptiotekijän munuaissyöpäsoluissa.

FH

mutaatioita on ensisijaisesti liitetty papillaarisen tyypin II munuaissyöpäsolujen , histologinen variantti, joka osuus on alle 10% kaikista munuaisten syövistä [20].

FH

mutaatioita ei ole havaittu satunnaista kirkas solussa munuaissyöpäsolujen. Kuitenkin viime raportissa on liitetty

FH

kehittämään selkeän solun munuaissyövän potilaalla, jolla ituradan mutaatio

FH

[21]. Tähän mennessä ilmentymistä ja toimintaa

FH

vuonna ccRCC ei ole tutkittu. Siksi tutkimme roolia FH satunnaista kirkas solussa munuaissyöpäsolujen.

Tulokset

Vähentynyt ilmentyminen FH selkein solussa munuaissyöpä

FH ilmaisun ccRCC on vielä tutkittava. Siksi me ensin tutkinut proteiinin ilmentymistä FH paneelissa ihmisen selkeän solun munuaisten kasvaimia ja potilaan vastaaviin normaaleihin munuaisten parenchyma. Immunoblot-analyysi kudoksen lysaatit osoitti huomattavaan vähenemiseen FH-proteiinin tasoja kasvaimissa verrattuna normaaliin viereiseen kudokseen (kuvio 1A). Vahvista Tutkimuksemme suoritimme immunohistokemiallisella värjäyksellä FH potilaiden Hyväksytty kasvain /normaali paria. Nämä tulokset korreloivat meidän immunoblottauksen tulokset että värjäytymisen FH oli vähemmän kasvaimia suhteessa kontrolliin munuaisten kudoksen (kuvio 1 B). Tutkimme seuraavaksi FH-proteiinin tasot paneeli vakiintuneiden ccRCC solulinjojen (786-O, A498, RCC4, ja ACHN). Kaikki viljellyt solulinjat osoittivat alentunut FH proteiinin tasot suhteessa normaaliin munuaisten (kuvio 1 C). Sitten tutkittiin mRNA ekspressiotasot

FH

kasvainkudoksessa verrattuna potilaan toisiaan normaali munuaisten kudosta yksilöitä Cooperative Human Tissue Network (NCI). Kvantitatiivinen reaaliaikainen RT-PCR osoitti, alennetaan

FH

mRNA-tasot kasvainkudoksessa verrattuna normaaliin kudokseen (kuvio 2). Analyysi mRNA-tasojen paljastaa, että yli 70% tuumorin näytteiden osoittivat alennetaan

FH

mRNA-tasot suhteessa normaaliin täsmäsi munuaisperuskudoksen. Lisäksi 15/32 potilaan näytettä (47%) osoitti yli kaksinkertaiseksi vähentäminen

FH

mRNA-tasot tuumorinäytteissä verrattuna normaaliin säätelyyn. Kaiken kaikkiaan keskimääräinen vähennys

FH

mRNA oli 2,9-kertainen. Tämä ero määritettiin olevan tilastollisesti merkitsevä. Nämä tulokset on alentunut ilmentyminen

FH

mRNA ja proteiini tasoilla ccRCC.

A) proteiini eristettiin selvää solu (CC) kasvainnäytteet (T) lisäksi sovitettu normaali munuaisten parenchyma (N). Proteiinit immunoblotattiin FH proteiinin tasot. GAPDH immunoblottaus on sisällytetty latauskontrollina. B) immunohistokemiallinen värjäys FH suoritettiin potilaan Hyväksytty kasvain /normaali paria. Kuvat saatiin 40 × objektiivilinssi. C) FH proteiinin tasot RCC linjat suhteessa normaaliin munuaisen. Aktiini on sisällytetty latauskontrollina.

mRNA tasot

FH

määritettiin erillisessä joukko kasvainnäytteestä suhteessa potilaan vastaaviin normaaleihin munuaisperuskudoksen reaaliaikaista RT-PCR ( p = 0,004). Ekspressiotasot normalisoitiin 18 s rRNA tasoilla ennen vertaileva analyysi.

FH moduloi HIF-2α tasot

Korkea fumaraatti FH-puutosta RCC osansa vakauttamisessa HIF -2α proteiinin ilmentyminen estämällä proliinihydroksylaasi toiminnan estäen VHL tunnustamista. Näiden tietojen perusteella, me arveltu, että menetys FH pitäisi olla mitään vaikutusta HIF-proteiinin tasot

VHL

null solulinjoissa. Olemme kuitenkin havainneet, että siRNA-välitteinen knockdovvn FH johti lisääntymiseen entisestään HIF-2α-proteiinin tasot kaksi ccRCC linjat, jotka ovat

VHL

null (786-O ja A498) (kuvio 3A). Tueksi Näiden havaintojen ohimenevä yli-ilmentyminen FLAG-merkitty FH (FH-FLAG) vähensi HIF-2α tasot 786-O-solut (kuvio 3B). Yhdessä tämä viittaa siihen, että FH moduloi HIF-2α-proteiinin ilmentymisen puuttuessa VHL.

)

VHL

null 786-O ja A498 solut transfektoitu siRNA on FH ja scramble ohjaus ( sinc). Neljäkymmentä kahdeksan tuntia transfektion jälkeen proteiini lysaatit analysoitiin immunoblottauksella varten ilmoitettu proteiineja. B) 786-O-solut transfektoitiin lyhytaikaisesti kontrollivektorilla (CV) ja vektorilla, joka sisältää FLAG-leimattua FH. Neljäkymmentä kahdeksan tuntia transfektion jälkeen proteiini lysaatit analysoitiin immunoblottauksella varten ilmoitettu proteiineja. FLAG immunoblottaus tarkoittaa onnistunutta siirtogeenin ekspressiota. C) (vasen) 786-O-solut transfektoitiin stabiilisti CV ja FH-FLAG. Valinnan jälkeen puromysiinissä, yksisoluklooneista otettiin talteen ja seulottiin FLAG ilme. HIF-2α tasot mitattiin FH-FLAG ilmentävien kloonien suhteen CV transfektoitujen solujen. Densitometrian bändeistä on määrällisesti näkyy oikealla. Mean suhteelliset arvot +/- keskihajonnan saatiin ImageJ ohjelmiston itsenäisestä kokeesta.

Selventämään lisäksi mekanismi, jonka FH säätelevät HIF-2α-proteiinin ilmentymisen, loimme vakaa solulinjojen yli-ilmentävät FH-FLAG in VHL-puutosta 786-O-solut. Havaitsimme 3-klooneja, jotka pysyvästi ilmensivät FH-FLAG konstruktio. Kaikki 3 kloonit osoittivat alentunut HIF-2α tasot verrattuna kontrollivektorilla transfektoidut solut (kuvio 3C). Alussa tutkittava vaikutukset HIF-2α olivat kopiointia välittämä, mutta emme tunnista vähennyksiä HIF-2α mRNA-tasojen kanssa FH yliekspressio (tuloksia ei ole esitetty).

FH menetys aktivoi AKT signalointi

Viimeaikaiset raportit ovat sekaantuneet PI3K /AKT signalointi ylläpitämisessä HIF-2α-proteiinin ilmentymistä

VHL

null solujen läpi translaation mekanismin [17], [18], [19], [22] _ENREF_17. Näiden selvitysten perusteella, tutkimme AKT signalointi FH modulaatio. Olemme havainneet, että siRNA-välitteinen knockdovvn

FH

sekä 786-O ja A498-soluja, mikä johtaa lisääntyneeseen AKT fosforylaatio seriinillä 473 AKT (Kuvio 4A). Vastaavasti, yliekspressio FH alensi fosfo-AKT tasot 786-O-solut (kuvio 4B), joka ilmaisee, että FH tasot korreloivat käänteisesti AKT signalointia. Olemme ensi tutkinut, mitä vaikutuksia PI3K estoa FH-riippuvaisen HIF-2α-proteiinin ilmentymisen. Yhdenmukainen aiempien havaintojen FH knockdown aktivoitu AKT signalointi ja lisääntynyt HIF-2α tasot verrattuna muokkaamaan transfektoituja soluja (sinc) (kuvio 4C). Kuitenkin yhteiskäsittely transfektoitujen solujen kanssa PI3K estäjän LY-294002 esti kasvua HIF-2α liittyy FH taintumisen (kuvio 4C). Yhdessä tämä viittaa siihen, että FH ylläpitää HIF-2α-proteiinin ilmentymisen mekanismien kautta riippuvainen PI3K ja AKT signalointi.

)

VHL

null 786-O ja A498-solut transfektoitiin siRNA on FH ja ryntäily ohjaus (sinc). Neljäkymmentä kahdeksan tuntia transfektion jälkeen proteiini lysaatit analysoitiin immunoblottauksella täydellistä AKT ja Ser473 fosfo-AKT. B) 786-O-solut transfektoitiin lyhytaikaisesti kontrollivektorilla (CV) ja vektorilla, joka sisältää FLAG-leimattua FH. Neljäkymmentä kahdeksan tuntia transfektion jälkeen proteiini lysaatit analysoitiin immunoblottauksella varten ilmoitettu proteiineja. C) 786-O-solut transfektoitiin ilmaistuilla siRNA. Kaksikymmentäneljä tuntia transfektion jälkeen media solujen korvattiin jotka sisälsivät PI3K-estäjä LY-294002 (6,25 uM). Sitten solut otettiin talteen 24 tuntia myöhemmin ja proteiini lysaatit alistettiin immunoblot analyysi osoitti proteiineja.

FH ilmaisu välittää solumigraatioon ja invaasiota

biologiset seuraukset FH yli-ilmentymisen RCC solut seuraavaksi tutkittiin.

FH

null kasvaimet ovat erittäin invasiivisia ja usein etäpesäkkeitä [20], ja HIF-2α on aikaisemmin liitetty tähän soluprosessi [23]. Siksi tutkimme roolia FH solumigraatiota ja hyökkäyksen ccRCC. Huomaamme, että knockdovvn HIF-2α siRNA in 786-O RCC-solujen vähentynyt solujen liikkuvuutta määritettynä haavan paranemista määrityksessä verrattuna muokkaamaan transfektoiduissa soluissa (kuviot 5A ja 5B). Kvantifiointi nämä tulokset on esitetty kuviossa 5C. Vaikka lähes 80% haavan aukon suljettiin kontrollitransfektoidut soluissa 12 tuntia, 50% haavan aukon pysyi HIF-2α knockdown soluissa. Näiden tietojen tutkimme haavojen paranemisen FH yli-ilmentävät 786-O alakloonit verrattuna kontrollivektorilla transfektoituja soluja. Molemmat FH yli-ilmentävät kloonit oli alentanut merkittävästi haavansulkemiseen verrattuna kontrollivektorilla transfektoituja soluja, mikä viittaa siihen, että menetys FH edistää muuttoliikettä RCC (kuvio 6A). Vuonna kontrollivektorille transfektoituja soluja, haava leveys kuilu lähes kokonaan suljettu 10 tuntia. Sen sijaan, FH yli-ilmentävät solut suljettu haavan aukon vain puolet 10 tuntia osoittaa kevennettyä solumigraatiota oli seurausta FH yli-ilmentymisen. Nämä tulokset esitetään graafisesti (kuvio 6B). Edelleen vahvistaa nämä tiedot, tutkimme solumigraatiota käyttäen kammion määrityksessä 10% naudan sikiön seerumia chemotractant. 786-O vektorisäätö solut olivat merkittävästi enemmän muuttavia kuin FH yliekspressoivat klooneja (kuvio 6C). Lopuksi, yliekspressio FH RCC soluissa vähensivät invasiivisen kyvyn määritettynä Matrigel invaasiomääritys (kuvio 6D). Yhdessä nämä tiedot osoittavat, että menetys FH ilmaisun parantaa muuttavien ja invasiivisia kyky RCC soluja.

786-O RCC-solut transfektoitiin scramble ohjaus siRNA (sinc) tai siRNA ja HIF-2α. Western blotting tulokset kokosoluekstraktien on osoitettu paneelissa A. B) Haavan paranemista analyysi suoritettiin transfektoiduissa soluissa. Kuvat otettiin jaksoittain otettu ilmoitettuun aikaan piste seuraava ”haava” induktio. Tulokset graafisesti paneelissa C. Tähdellä (*) osoittaa tilastollisesti merkitsevä p 0,05 verrattuna muokkaamaan ohjaus transfektoiduista soluista.

A) Haavan paranemista määritys kuvia sillä ilmoitettuina ajankohtina. B) Haavan leveys välimatkalta ilmoitettuina ajankohtina. C) Chamber solujen migraatiokokeessa on ilmoitettu klooneja. Solut siirrostettiin seerumivapaassa 10% FBS käytetään chemotractant. Siirtyneet solumäärät kloonien 48 tuntia alkuperäisestä kylvö. Tähdellä (*) osoittaa tilastollisesti merkitsevä p 0,05 vertailuryhmään nähden vektori transfektoitujen solujen. D) Matrigel invaasiomääritys 10% FBS mediaa kuin chemotractant. Tähdellä (*) osoittaa tilastollisesti merkitsevä p 0,05 vertailuryhmään nähden vektori transfektoiduissa soluissa.

Keskustelu

Tässä raportissa, osoitamme ensimmäistä kertaa alennetaan FH ilmentymisen mRNA ja proteiini tasoilla selvä solussa munuaissyöpä, yleisin histologinen muunnos, joka muodostaa suurimman osan munuaisten syövistä. Nämä havainnot ovat merkittäviä, sillä aiemmat tutkimukset eivät nimenneet

FH

mutaatioita RCC linjat sekä ensisijaisena RCC yksilöt [24]. Mekanismit, joiden mRNA tasot

FH

vähenevät alle tutkimuksessa. Hypermetylaation voi olla yksi mekanismi, jolla

FH

ilmentyminen tukahdutetaan. Dulaimi

et al.

Ei käynyt ilmi hypermetylaation vuonna CpG saari

FH

promoottori paneelissa papillaarisen RCC [25]. Ei kuitenkaan tutkimuksissa on tutkittu

FH

metylaatiostatuksen in ccRCC. Vaikka hypermetylaation on keino tuumorisuppressorin geenien, vaihtoehtoiset mekanismit voivat selittää alennettu ilmaus

FH

olemme tunnistaneet. Viimeaikainen kiinnostus on keskittynyt roolista mikroRNA (miRNA) geenisäätelyn jossa raportit viittaavat siihen, että geenit osallistuvat oksidatiivisen fosforylaation voidaan annetussa asetuksessa miRNA [26]. On selvää, nämä mahdollisuudet takaa lisätutkimuksia antanut biologisen merkityksen havaintomme.

Olemme aiemmin osoittaneet, että uudelleen villityypin

FH

osaksi

FH

puutteellinen tuumorisolulinja johtaa selvä vähentäminen ydin- HIF-1α tasolla [27]. Lisäksi siRNA-välitteisen knockdovvn FH on osoitettu lisäävän HIF-1α tasot A549 keuhkokarsinooma soluja, jotka ilmentävät VHL [5]. Havainnot näistä tutkimuksista, sekä muut biokemialliset tutkimukset viittaavat siihen, että periaate, mekanismi, jolla tämä tapahtuu, on kautta HIF proteiinin stabiloimiseksi estämällä propyylihydroksylaasia toiminnan seurauksena FH menetys. Nämä havainnot siis olettaa, että vaikutus FH HIF olisi vain ilmeistä läsnäollessa VHL. Kuitenkin meidän havainnot ovat melko uusia, sillä ne osoittavat, että FH voivat moduloida HIF-2α riippumatta VHL. VHL-riippumaton reittejä, jotka välittävät HIF hajoaminen on raportoitu. Erityisesti, Hsp90 ja RACK1 on aiemmin osoitettu moduloivan HIF-1α hajoaminen [28]. Siksi on mahdollista, että samanlainen mekanismi välittää HIF-2α hajoamisen samoin. Huolimatta vakauttaminen estämällä proteiinien hajoaminen, on yhä enemmän näyttöä siitä, että vaihtoehtoinen reitit olla rooli ylläpitää HIF-2α-proteiinin tasot ilman VHL. Estä

et al.

Osoitti, että kohonnut solujen reaktiivisia happiradikaaleja, välittämä p22-phox pohjainen Nox oksidaaseja ylläpitää HIF-2α-proteiinin tasot RCC soluissa kautta AKT /4E-BP1 mRNA translaation riippuvainen mekanismi [17] , [22]. Vastaavasti fosforylaatiota AKT ja 4E-BP1 voimistuu ihmisen RCC kudoksessa suhteessa normaaliin parenkyymikudokseen [22]. Viime aikoina Toschi

et al.

Havaittu, että AKT aktivoinnin kautta signalointi kautta mTOR signalointikompleksiin 2 (mTORC2), vaadittiin ylläpitämään HIF-2α in VHL null soluissa [18]. AKT aktivointi on yleinen signalointi solmun syövän ja vaihtoehtoiset mekanismit voivat johtaa AKT aktivaation RCC menetetään FH.

Mekanismi, jolla AKT signalointi aktivoidaan FH menetys on alle tutkimuksessa. Olemme aiemmin osoittaneet, että menetys FH munuaisten epiteelisolujen johtaa kohonnut solujen oksidatiivista stressiä [27]. Siten ROS voi olla myötävaikuttamassa kohonnut HIF-2α tasot upon FH knockdown. Vaihtoehtoisesti vaikutukset FH menetys voi olla liity rooliaan TCA sykli. Se on vakiintunut, että FH olemassa myös käytettäessä extramitochondrial, soluliman muodossa. Tällä hetkellä hyvin vähän tiedetään tehtävä tämän muodon FH. Kuitenkin viime aikoina todisteita toimittamat O’Flaherty

et al.

Osoittaa, että menetys extramitochondrial FH voivat edistää HIF vakauttamiseen [29]. Lisäksi, sytosolin FH on osallisena DNA-vaurioiden vaste [30]. Kun DNA-vaurio, sytosolin FH on osoitettu translokoida tumaan. Mekanismi, jolla FH osallistuu DNA-vaurioita vastaus on edelleen epäselvä. Kuitenkin on varmasti mahdollista, että FH ja metaboliitit se vaikuttaa voi säädellä toiminto muiden proteiinien, mahdollisesti tumassa. Mielenkiintoista on, että AKT on myös osoitettu toimivan tumaan [31]. Koska tietomme, sekä nämä viimeaikaiset raportit, kohdistaminen AKT välittämä signalointireittien joko tasolla AKT tai alkupään, saattaa osoittautua terapeuttista hyötyä munuaissyöpään. Tämä on yhdenmukaiset viimeaikaisten tiedot, jotka osoittavat

in vitro

ja

in vivo

tehoa dual PI3K /mTOR-estäjän RCC [19].

Kiinnostavaa on ennakkotapausta korjauksilla TCA cycle entsyymin syöpä. Useita muita geenejä, jotka koodaavat entsyymejä tri- (TCA-kierto) pidetään tuumorisuppressorigeeneille lukien

SDHB

,

SDHC

, ja

SDHD

(sukkinaattidehydrogenaasi alayksikköjen B, C, D) [32], [33], [34].

SDH

alayksikköä mutaatioita on liitetty feokromosytooma ja paragangliooma ja viime aikoina ruuansulatuskanavan stroomakasvain (GIST) [35]. Lisäksi mutaatioita, korjauksilla näiden geenien ilmentymistä on liitetty maligniteetti. Dahia

et al.

Osoitettu alentunut ilmentyminen sukkinaattidehydrogenaasi alayksikön B (SDHB) alaryhmässä feokromosytoomien [36]. Viime aikoina vähentänyt ilmentymistä SDHB tunnistettiin suuri osa GIST ilman mutaatioita

SDHB

tai muiden geenien yleisesti mutatoitunut GIST kuten

KIT

ja

PDGFRA

[35] . Näiden tietojen perusteella, mahdollinen yhdistävä teema voi olla, että puutteet oksidatiivinen fosforylaatio, joko mutaation tai ilmentyminen muuttuu, on rooli kasvaimen synnyssä. Äskettäin Chen

et al.

Ehdotti, että hapenkulutus kautta mitokondrioiden aineenvaihdunta voi säädellä kasvaimen kasvua rajoittamalla hapen saatavuus ei-mitokondrioiden toimintaa, jotka ovat maksuihin kasvaimen kasvua [37].

merkittävää etua on meidän havainto, että FH yliekspressio johtaa vähensi muuttoliikettä ja invaasion RCC soluja. Tuloksemme ovat yhdenmukaiset tuoreessa raportissa Costa

et al.

, Joka osoitti, että

fh

Knockdown kuolemattomiksi tehdyissä hiiren alkion fibroblasteja (iMEFS) lisännyt liikkuvuutta verrattuna trandusoidun iMEFS [38 ]. Lisäksi kasvu liikkuvuudessa oli HIF-1α riippuvainen. Rooli HIF-2α opinnoissaan ei voitu määrittää, koska he eivät pystyneet havaitsemaan HIF-2α ilmentymisen fh puutteellinen iMEFS. Meidän tutkimukset keskittyivät HIF-2α annettava ennen tutkimuksia, sotkea sen tehtävä munuaisen syövän synnyn. Koska HIF-2α knockdovvn RCC soluissa estää maahanmuuttoa, meidän tiedot osoittavat, että vaikutukset FH yli-ilmentymisen siirtolaisuudesta ja invaasio ovat osittain välittyvät vaikutukset HIF-2α. HIF-2α on aikaisemmin liitetty invasiivisen käyttäytymisen RCC soluja. Lisäksi invasiivisia edistävät ominaisuudet HIF-2α on tutkittu 786-O-solut, sama solujen Tässä tutkimuksessa käytettiin. Hughes

et al.

Osoittivat, että HIF-2α knockdovvn in 786-O-solujen vähensi ilmaus useiden integriinien jotka voivat välittää solun liikkuvuus ja invaasiota [39]. Petrella

et al.

Tutki roolia VHL menetyksen soluinvaasiota [40]. He havaitsivat, että uudelleen villityypin

VHL

osaksi VHL-puutteellisia 786-O-solujen vähensi HIF-2α tasoja ja solujen invaasiota. Sitä vastoin uudelleen ilmentäminen HIF-2α in

VHL

rekonstruoitu 786-O-solujen palauttaa invasiivisia potentiaalia. Nämä tiedot osoittavat rooli HIF-2α RCC muuttoliikettä ja invaasiota. Lisäksi, HIF-2α yliekspression havaittiin parantaa kasvua RCC ksenograftien kun taas yli-ilmentymisen HIF-1α havaittiin estävän ksenografti kasvua [41]. Vastaavasti erillinen tutkimukset osoittavat, että HIF-2α, mutta ei HIF-1α, edistää kasvua

VHL

null tuumoriksenografteja [16], [42]. Näin ollen tietomme lisätä yhä enemmän todisteita, jotka osoittavat kasvaimen edistävät vaikutukset HIF-2α ilmentyminen RCC.

Huolimatta viimeaikaisista hyväksymisestä useiden aineiden pitkälle munuaissyövän, useimmat potilaat, joiden munuaisten syöpä lopulta periksi heidän sairautensa. Siksi tunnistaminen romaani signalointireittien on kriittinen kehittää tehokkaita hoitomuotoja. Nyt on yhä enemmän todisteita siitä, että munuaisten syöpä on yksi kasvaimia, jotka edustavat kehittyvien paradigman syöpäbiologiassa aineenvaihdunnan linkkejä maligniteetti. Meidän havainnot FH viittaavat metabolisen uudelleenohjelmointi selvästi solussa munuaisten syöpä, joka edistää ilmentyminen kasvaimia aiheuttavasta tekijöistä, kuten HIF-2α kautta useita mekanismeja. Purkamiseen mekanismeja, joiden kasvain aineenvaihdunta on muuttunut, ja alavirran solu seuraukset tulisi tarjota syvällisesti munuaisten syövän biologian sekä uusia terapeuttisia strategioita.

Materiaalit ja menetelmät

Solut

A498, 786-O, ja ACHN-solut saatiin American Type Culture Collection ja pidettiin DMEM: ssä, jota oli täydennetty 10% lämmöllä inaktivoitua naudan sikiön seerumia, 37 ° C: ssa kosteutetussa 5% CO

2-ilmakehässä. RCC4 solut ystävällisesti P. Ratcliffe (Oxford).

Kemikaalit

LY294002 ostettiin Sigma.

Constructs

FH-FLAG konstruktio on kuvattu aikaisemmin [27].

immunoblottauksella

Kaikki immunoblot-analyysit suoritettiin kuten aiemmin on kuvattu [27] kokosolulysaateista valmistetaan käyttämällä radioimmunosaostuskokeella-puskuria (50 mM Tris- HCI: ää, 150 mM NaCl, 1% Triton X-100, 1% natriumdeoksikolaatti ja 0,1% natriumdodekyylisulfaattia), johon oli lisätty proteaasi-inhibiittoriseosta (Roche). Vasta-aineet saatiin seuraavista kaupallisista lähteistä: GeneTex (FH-immunoblottaus), Santa Cruz Biotechnology (FH-immunohistokemia), Novus (GAPDH, HIF-2α), Sigma (Tubulin, β-aktiini), Cell Signaling (yhteensä AKT ja Ser473 fosfo AKT).

Tissue näytteen kvantitatiivisen tosiaikaisen PCR

Biospecimens RNA-analyysiä varten saatiin Cooperative Human Tissue Network of NCI /NIH. Kokonais-RNA käänteistranskriboitiin käyttäen High-Capacity cDNA Archive Kit (Applied Biosystems). Sitten cDNA käytettiin templaattina kanssa Applied Biosystems ”määritykset-on-demand 20 × määritys sekoitus alukkeita ja Taqman. Neljäkymmentä amplifikaatiosykleissä tehtiin Applied Biosystems Prism 7900 järjestyksessä ilmaisin. Kertainen muutos arvojen kasvain ja normaali näytteet laskettiin käyttäen Δ

C

t menetelmällä normalisoinnin 18S rRNA tasolle. Koska tilastollinen testi käytimme Mann-Whitney pariksi epäparametrinen testi verrata FH ilmentyminen kasvainkudoksessa verrattuna normaaliin viereiseen kudokseen (toteutetaan GeneSpring, Agilent).

Immunoblottausmääritys ja immunohistokemia humaanituumorityyppien yksilöiden

Tuumorinäytteet ja normaali vastaava kudos sairastavien potilaiden RCC saatiin Department of Urology yliopiston Texas Health Science Center at San Antonio. Kasvaimet tätä tutkimusta varten histologisesti luokiteltu selkeä cell munuaissyöpä jonka virtsaelinten patologi. Kokoelma ja käsittely ihmisnäytteillä suoritettiin protokollan mukaisesti hyväksymän Institutional Review Board, University of Texas Health Science Center at San Antonio. Perustuen protokolla, näytteet tuotettuina deidentified muoti potilailta, joille suoritetaan kirurginen resektio munuaisten syöpään. Koska näytteet saatiin ja analysoitiin anonyymisti tavalla, potilaan suostumus ei ollut tarpeen.

Haavan paranemista määritys

Solujen annettiin kasvaa lähes konfluenssiin 60 mm ruokia. Yhtenäinen tyhjästä jälkeen tehtiin alas keskelle levyyn 200 mikrolitran mikropipetin kärki, minkä jälkeen pestiin kahdesti PBS: llä. Sama merkitty alalla tyhjästä haava valokuvattiin käyttäen Olympus valo mikroskooppi (4 × tavoite) osoitetuissa aikapisteissä. Leveys tyhjästä haava mitattiin kolmella eri alueilla Q-Capture pro ohjelmisto. Määrällisten tietojen edustavat keskiarvoa +/- S.D. vähintään kaksi erillistä koetta.

migraatiokokeessa

786-O alakloonit soluja (1 x 10

4) ympättiin 8 huokoskoko Thin-CERT 24 kuoppaisille levyille (Greiner Bio-One) seerumivapaassa mediassa. Seitsemänsataaviisikymmentä mikrolitraa 10% FBS: ia, lisättiin alaosaan, kuten chemotractant. 48 tunnin kuluttua solut päälle kalvon poistettiin pumpulipuikolla. Siirrettyjä soluja alareunassa puolella pestiin PBS: llä, kiinnitettiin 70% etanolilla ja värjättiin käyttäen 0,1% Kristalliviolettiliuos visualisoida siirtynyt soluja. Siirtyneet solut on kiinnitetty alempaan membraanin laskettiin valomikroskoopilla 10-kertaisella suurennuksella. Counts edustavat solujen keskimääräinen lukumäärä kymmenen mikroskooppikentäs-.

Invasion määrityksessä

Cell hyökkäystä määritettiin invaasiomääritys (kalvo, joka on päällystetty kerroksella Matrigel soluväliaineen proteiinit) mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Solut siirrostettiin seerumittomassa elatusaineessa ylempään kammioon ja tunkeutuu pohjaa kohti kammion, joka sisältää 10% FBS: ia, kun chemotractant. Kalvot käsiteltiin samalla tavalla kuin migraatiokokeessa.

RNA-interferenssi

FH ja HIF-2α knockdovvn, solut transfektoitiin yhdistettiin siRNA reagenssilla (Thermo Fisher) kanssa Amaxa Nucleofector järjestelmä mukaan valmistajan protokollaa. Solut kerättiin 48-72 tuntia transfektion jälkeen. Ei-kohdistaminen scramble siRNA altaan käytettiin negatiivisena kontrollina (Thermo Fisher).

Kiitokset

Kiitämme Cynthia Galindo ja Dawn Garcia tekniseen tukeen. Kiitämme Computational Biology Initiative (UTHSCSA /UTSA) pääsyn tarjoamiseksi ja koulutuksen analyysiin käytetty ohjelmisto.