Krooninen sairaus

tiivistelmä

Vasohibin-1 (VASH1) eristettiin endogeeninen angiogeneesin estäjä tuotetaan verisuonten endoteelin. Olemme aiemmin raportoitu, että kasvaimen kasvu ja kasvaimen angiogeneesi oli vahvistunut

VASH1 (- /-)

hiirillä. Täällä tutki VASH1 pelaa mitään roolia syövän etäpesäkkeiden. Kun Lewisin keuhkokarsinooma (LLC) soluja istutettiin jalkatyynyyn tarkkailla spontaani etäpesäkkeiden, merkittävä kasvu keuhkometastaasitestissä yhdessä imusolmukkeet imusolmuke etäpesäke näkyi

VASH1 (- /-)

hiirillä. Histologinen analyysit paljastivat, että alukset polkuanturan kasvain

VASH1 (- /-) B hiiret olivat epäkypsiä, joilla on vähemmän seinämaalaus soluja. Kuitenkin, kun LLC-soluja injektoitiin häntälaskimoon, laajuus keuhkometastaasitestissä pysyi muuttumattomana välillä villityypin hiirissä ja

VASH1 (- /-)

hiirillä. Kun VASH1 endoteelisoluissa viljelmässä oli tippuu alas siRNA, havaitsimme lasku sisältö ZO-1, osa tiukka liittymissä, jotka vähentävät lisännyt sielunvaellus syöpäsolujen poikki endoteelisolujen yksikerroksista. Nämä tulokset osoittavat, että endogeeniset VASH1 kiristää endoteelin este ja tekee tuumoriverisuoniin kestävät syövän etäpesäkkeiden.

Citation: Ito S, Miyashita H, Suzuki Y, Kobayashi M, Satomi S, Sato Y (2013) Enhanced syöpäsolujen leviämiseen hiirillä puutteellinen

Vasohibin-1

Gene. PLoS ONE 8 (9): e73931. doi: 10,1371 /journal.pone.0073931

Editor: Vladimir V. Kalinichenko, Cincinnati Lasten Hospital Medical Center, Yhdysvallat

vastaanotettu: 15 huhtikuu 2013; Hyväksytty: 23 heinäkuu 2013; Julkaistu: 16 syyskuu 2013

Copyright: © 2013 Ito et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat lupanumeroon 22112006 ohjelmasta Grants-in-tuki tieteellisen tutkimuksen innovatiivisia Areas ”Integratiiviset Syöpätutkimuskeskus mikroympäristölle Network”; by lupanumeroon 22300323 ohjelmasta Grants-in-Aid tieteellisen tutkimuksen (B) opetus-, kulttuuri-, urheilu-, tiede-, and Technology of Japan; sekä terveys- ja työ Sciences tutkimus apurahan (kolmas Term Comprehensive Ohjaus Research for Cancer) alkaen terveysministeriön, työ ja hyvinvointi Japanin. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

syöpä on yleisin kuolinsyy maailmanlaajuisesti ja useimmat syöpäpotilaat kuolevat, koska etäpesäke. Prosessi syövän etäpesäkkeiden koostuu peräkkäisiä vaiheita, jotka sisältävät paikallista invaasiota syöpäsolujen ensisijainen vaurio, intravasation, matkustaminen syöpäsolun aggregaattien koko verenkierrosta, pidätti syöpäsolun aggregaattien kaukaisessa valtimoverisuoniverkostoihin, ekstravasaatio, ja regrowth syöpäsoluja metastaattisen vaurion [1], [2].

kasvaimen verisuoniston, yhdyskäytävä syöpäsolujen intravasation, on muodostettu prosessissa, joka tunnetaan angiogeneesiä, yksi tärkeimmistä tunnusmerkeistä syöpien [3 ]. Tämä prosessi angiogeneesin sisältää seuraavat peräkkäiset vaiheet: irtoaminen ympäröivän seinämaalaus solujen ennestään alusten aloittamisen angiogeneesin, soluväliaineen hajoamista endoteelin proteaasit, endoteelisolujen migraation (EC) kärjessä, leviämisen EC klo varsi , putken muodostumiseen ECS, ja uudelleenjaon ja tiukka yhdistyksen seinämaalaus solujen hankittua verisuonten kypsymisestä ja vakauttaminen [4]. Kuitenkin, toisin kuin normaalit verisuonet, kasvaimen verisuonten ovat laajentuneet, monimutkainen, ja vuotavat puutteen vuoksi verisuonten vakautus-, ja tämä epänormaali arkkitehtuuri kasvaimen alukset voivat olla vastuussa intravasation syöpäsolujen [5].

Angiogeneesi on tiukasti säännelty tasapaino paikallisen endogeenisen stimulators ja estävät tätä prosessia [6]. Useita angiogeneesin inhibiittoreita on tunnistettu nisäkkään kehossa. Niistä vasohibin-1 (VASH1) on endogeeninen angiogeneesi-inhibiittori tuotetaan verisuonten endoteelin, jossa laaja-alaista anti-angiogeeninen toiminta [7], [8]. Olemme alun perin eristetty VASH1 kuten verisuonten endoteelin kasvutekijän (VEGF) indusoitavissa geenin EC: eissa [7]. Kuitenkin meidän myöhempi analyysi paljasti, että VASH1 ilmentyy edullisesti hankittua vasta muodostuneiden verisuonten takana itämistä etu- jossa angiogeneesi päättyy [9]. Todellakin,

VASH1 KO

hiiret sisältävät useita epäkypsä alusten alueella, jossa angiogeneesi olisi päätettävä taakse itämistä edessä. Sen lisäksi, että anti-angiogeeninen aktiivisuus, viimeaikaisissa analyysi osoitti lisäksi, että VASH1 lisää rasitustoleranssista hankittua ja stabiloi verisuonten [10].

Histologinen analyysit ovat osoittaneet, että ilmentyminen VASH1 näkyy hankittua angiogeneesin aikana alle sekä fysiologisia ja patologisia tiloja kuten syöpiä [7], [11] – [21]. Siten ilmaus VASH1 voi olla biomarkkereiden angiogeneesin. Vaihtoehtoisesti, koskien sen toiminnon, osoitimme, että lisääntynyt kasvaimen kasvu ja tuumoriangiogeneesissa näkyivät kun Lewisin keuhkokarsinooma (LCC) inokuloitiin

VASH1 (- /-) B hiirillä [12]. Todellakin, vähentynyt ilmentyminen VASH1 korreloi huonon ennusteen tiettyjen ihmisen syövissä [21], [22]. Nämä havainnot viittaavat siihen, että endogeeniset VASH1 säätelee aikana kasvaimen angiogeneesiä ja kasvaimen etenemistä. Täällä laajensimme analyysi roolia VASH1 syövän etäpesäkkeiden. Tuloksemme osoittavat, että VASH1 on vastuussa inhibitio syövän etäpesäkkeiden.

Materiaalit ja menetelmät

Solut

Lewisin keuhkokarsinooma (LLC) solut saatiin Cell Resource Center for Biomedical Research, Institute of Development, Aging, ja syöpä, Tohoku University, ja viljeltiin RPMI1640 väliaineessa täydennetty 10% FCS. Ihmisen napalaskimon endoteelisoluja (HUVEC) saatiin Sanko Junyaku Industries (Tokio, Japani) ja viljeltiin tyypin 1 kollageenilla päällystetyille ruokia (Iwaki, Chiba, Japani), joka sisälsi EBM-2 alustassa kasvun lisäravinteet, SingleQuots, ja 2% FCS (Lonza, Basel, Sveitsi). LNM35 solut on kuvattu aikaisemmin [8].

Materiaalit

Seuraavia materiaaleja käytettiin: anti-hiiri-CD31 rotta-vasta-ainetta (Fitzgerald Industries International, Concord, MA); anti-αSMA-vasta-aineen (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO); anti-Lyve-1-vasta-aine (acris, San Diego, CA); anti-ihmisen ZO-1 vasta-aineella (BD Transduction Laboratories); anti-ihmis-ZO-1 polyklonaalinen vasta-aine (Zymed Laboratories, South San Francisco, CA); anti-VE-kadheriinin-aineella (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA); Alexa Fluor 488-konjugoitu anti-hiiri-IgG-vasta-ainetta (Molecular Probes, Eugene, OR); Alexa Fluor 488-konjugoitu anti-rotta-IgG-vasta-ainetta (Molecular Probes); Alexa Fluor 568-konjugoitu anti-vuohi-IgG-vasta-(Molecular Probes); Alexa Fluor 555-konjugoidulla anti-hiiri-IgG-vasta-ainetta (Molecular Probes); anti-β-aktiini-vasta-aineen (Sigma-Aldrich); HRP-konjugoitua anti-hiiri-IgG-vasta-ainetta (Sigma-Aldrich); HRP-konjugoitua anti-vuohi-IgG-vasta-ainetta (Sigma-Aldrich); HRP-konjugoitua anti-kani-IgG-vasta-ainetta (Sigma-Aldrich); Calcein-AM (Sigma-Aldrich); FITC-konjugoitua dekstraania (70 kDa, Sigma-Aldrich); 4 ’, 6-diamino-2-fenyyli dihydrokloridi (DAPI Molecular Probes). Anti-ihmis-VASH1 mAb (4E12) on kuvattu aiemmin [7].

Mouse mallit Metastasis

VASH1 (- /-) B-hiiriä C57BL6J tausta kuvattiin aikaisemmin [9], [12]. Villityypin (WT) C57BL6J hiiriä (8-12 viikkoa, miespuolinen) saatiin Charles-River Japan (Yokohama, Japani). Kaikki eläinkokeet suoritettiin suostumuksella Tohoku University Animal Care komitea.

spontaani etäpesäkkeiden mallia, 5 × 10

5 LLC-soluja istutettiin ihonalaisesti oikeaan takakäpälään hiirillä. Kuusitoista kahdeksantoista päivää inokulaation jälkeen, joilla oli kasvain, jalat resekoitiin syvässä anestesiassa sekä polvitaipeen imusolmukkeet. Kahdeksan päivän kuluttua resektio, hiiret tapettiin; ja niiden keuhkot otettiin talteen, punnittiin ja kiinnitettiin sitten Tellyesniczky ratkaisu. Etäpesäkenystyröiden keuhkojen pinnalla laskettiin tarkkailtavaksi preparointimikroskooppia.

kokeellisen metastaasin malli, 5 x 10

5 LLC solua injektoitiin häntälaskimoon. Kuusitoista päivää injektion jälkeen, hiiret tapettiin, ja keuhkot kerättiin sitten ja kiinnitetään Tellyesniczky n ratkaisu analysoida keuhkometastaasitestissä.

Immunofluoresenssianalyysi kasvainkudosnäytteet

Kasvaimen kudokset upotettiin optimaalinen leikkaamiseen lämpötila (MMA) yhdiste (Sakura Finetech, Tokio, Japani), jotta jäädytetty kudosnäytteiden, ja leikattiin 6 um. Leikkeet kiinnitettiin metanolilla 20 minuutin ajan -20 ° C: ssa, blokattiin 1 tunnin ajan huoneenlämpötilassa PBS: llä, joka sisälsi 1% BSA: ta ja 0,1% Tween-20, ja värjättiin primaaristen vasta-aineiden (anti-CD31 Ab: n, 1:400 laimennus anti-Lyve-1 Ab, 1:200 laimennus, anti-αSMA Ab, 1:200 laimennos) 4 ° C: ssa yön yli, minkä jälkeen Alexa 488- tai Alexa 555-konjugoidun sekundaarisen vasta-aineita (1:400 laimennos) ja DAPI varten 1 tunnin ajan huoneenlämpötilassa. Leikkeitä päällystetty fluoresoivilla kiinnitysväliaine (DAKO, Tokio, Japani), ja kuvat hankittiin fluoresenssimikroskoopilla (BZ-9000, Keyence) ja analysoitiin BZ-II-ohjelmisto (Keyence, Osaka, Japani).

eristys hankittua peräisin Keuhkot ja LLC Kasvaimet

hankittua eristettiin kudoksesta käyttämällä Magnetic Cell Sorting System (MACS, Miltenyi Biotec, Auburn, CA). Lung WT hiirillä ja kasvainkudoksissa WT ja

VASH1 (- /-) B-hiiret jauhettu ja hajotettiin kollagenaasilla II (Worthington, Freehold, NJ). Keuhkojen kudoksiin, veren solut poistettiin PBS perfuusion ennen leikkaaminen. Tuumorikudoksia, yhden sakkaroosi askel-gradienttisentrifugoinnilla kanssa Histopaque 1077 (Sigma-Aldrich) tehtiin sen jälkeen, kun ruoansulatus poistaa verisoluja. Solususpensiot suodatettiin 40 um: n solusiivilän (BD). Sulanut kudokset käsiteltiin ACK hajotuspuskuria (GIBCO), ja CD31 positiivinen hankittua eristettiin MACS CD31-vasta-aineen (Fitzgerald Industries International, Concord, MA).

Reaaliaikainen RT-PCR

Kokonais-RNA uutettiin eristetty endoteelisoluista RNeasy-(Qiagen), ja käänteistranskriptio suoritettiin. Reaaliaikainen PCR-analyysi tehtiin käyttämällä CFX96 (BIO-RAD) ja SYBR esiseos Ex Taq (TaKaRa BIO, Otsu, Japani). Sense- ja antisense-alukeparit olivat: hiiren VASH1, 5′-TCAGCACAGAGAGATGAGGA-3 ’ja 5′-TACTGCAGCTCCCTGATGTA-3′; hiiri CD31, 5’-TTCAGCGAGATCCTGAGGGTC-3 ’ja 5′-CGCTTGGGTGTCATTCACGAC-3’, vastaavasti.

geenien Stealth siRNA

HUVEC transfektoitiin synteettisen siRNA in Lipofectamine RNAi max reagenssia ( Invitrogen) mukaisesti valmistajan protokollaa. 12 tuntia transfektion jälkeen solujen elatusaine korvattiin kasvualustaa, ja soluja inkuboitiin vielä 12 tuntia. Sitten soluja käytettiin morfologinen analyysi tai kerätään kokeissa. Erityiset geenien varmistettiin Western blot -analyysillä. Nukleotidisekvenssejä stealth siRNA: iden ihmisen VASH1 ja sen ohjaus olivat 5′-CAA GGA CCG GAA GAA GGA UGU UUC U-3 ’ja 5′-CAA CCA AGG AGA GGA GUA UUG GUC U-3’, vastaavasti.

pelastus kokeessa, HUVEC transfektoitiin siRNA: t 3 ’un-transloitumaton alue (UTR) ihmisen VASH1 ja ekspressiovektori ihmisen VASH1 cDNA, josta puuttuu 3’-UTR. 48 tuntia transfektion jälkeen solut uutettiin Western blottauksella. Nukleotidisekvenssejä stealth siRNA: iden 3 ’UTR ihmisen VASH1 ja sen ohjaus olivat 5′-ATA AGA TGC ACC CAA CTC CCA GAG A-3′ ja 5’-ATA GAA AGG TAC CCA CCA CTC CAG A-3 ’, vastaavasti .

Western blot -analyysi

Western blot-analyysi suoritettiin, kuten aiemmin on kuvattu [7]. Lyhyesti, HUVEC-käsitelty siRNA lyysattiin RIPA-puskurilla (Nacalai Tesque, Tokio, Japani); ja lysaatit erotettiin SDS-PAGE: lla 7,5% erottavan geelin ja siirrettiin sen jälkeen nitroselluloosakalvoille. Membraanit blokattiin 1 tunnin ajan huoneenlämpötilassa PBS: llä, joka sisälsi 1% kuorittua maitoa ja 0,1% Tween-20, ja sitten inkuboitiin tor 1 tunti huoneenlämpötilassa primaarisilla vasta-aineilla (anti-ZO-1 Ab, 1:200 laimennus, anti VE-kadheriinin Ab, 1:200 laimennus, anti-β-aktiini Ab, 1:10000 laimennus, anti-ihmisen VASH1 vasta-ainetta (4E12), 1:500 laimennus). Sitten membraaneja inkuboitiin HRP-konjugoidun sekundaarisen vasta-aineita 1 tunti huoneen lämpötilassa, minkä jälkeen blotit havaittu Immobilon reagenssilla (Millipore, Concord, MA). Kuvat saatiin käyttämällä LAS-4000 luminoiva kuva-analysaattorilla (Fuji Film, Tokio, Japani).

Immunofluoresenssikoe HUVEC: ien

jälkeen siRNA hoidon, HUVEC maljattiin Type-1 kollageenipäällysteisiin lasipeitinlevyille ja inkuboitiin 48 tunnin ajan. Sitten solut kiinnitettiin 4% paraformaldehydillä 10 minuutin ajan, tehtiin läpäiseviksi 0,2% Triton X-100 (Sigma-Aldrich) 15 minuutin ajan, ja blokattiin 1 tunnin ajan huoneenlämpötilassa PBS: llä, joka sisälsi 1% BSA: ta ja 0,1% Tween- 20 (Sigma-Aldrich). Seuraavaksi niitä inkuboitiin yön yli 4 ° C: ssa primaaristen vasta-aineiden (anti-ZO-1 Ab, 1:200 laimennus, anti-VE-kadheriinin Ab, 1:200 laimennus). Sen jälkeen, kun 2 pesua PBS: lla, soluja inkuboitiin 1 tunnin ajan huoneenlämmössä Alexa 488- tai 568-konjugoidun sekundaarisen vasta-aineita (1:400 laimennus). Lasi peitelaseja lopuksi päällystetty fluoresoivilla kiinnitysväliaine, ja kuvat hankittiin käyttämällä fluoresenssimikroskooppia (DMI6000B, Leica).

läpäisevyys endoteelin Yksikerroksinen

siRNA-käsiteltyjen HUVEC (1 × 10

5 solua) maljattiin lattialle ylemmän kammion Type-1 kollageenipäällysteisiin TranswellTM läpäisevä tuet (0,4-um huokosia, 24 kaivot, Corning) valmistella HUVEC yksisolukerroksiin. Kun oli inkuboitu 24 tuntia, FITC-dekstraani (70 kDa, 1 mg /ml 100 ul: ssa EBM-2 väliaine) lisättiin ylempään kammioon; ja FITC-dekstraanin, joka oli läpäissyt yksikerroksista alempaan kammioon kvantifioitiin fluorometrialla (absorptio /emissio 485/538 nm).

migraatiota of Cancer Cells

siRNA-käsiteltyjen HUVEC-soluja (5 x 10

4-solut) maljattiin lattialla ylemmän kammion Type-1 kollageenipäällysteisiin Transwell läpäisevä tuet (8 um huokosia, 24 kaivot, Corning) ja inkuboitiin 24 tunnin ajan valmistautua yksikerroksiset HUVEC. Sitten LNM35 ihmisen keuhkosyöpä solut värjättiin kalseiini lisättiin yläkammioiden (1 x 10

4 solua /100 ui EBM-2 väliaine, 0% FCS), jossa alakammioissa sisälsi 600 ui RPMI 1640 väliainetta, jossa 10% FCS: ää. Kuusi tuntia myöhemmin solujen lukumäärä, jotka olivat transmigrated alemmalle puolelle kalvojen laskettiin tarkkailtavaksi fluoresenssimikroskoopilla.

Tilastollinen analyysi

tilastollinen merkitsevyys ryhmien välisiä eroja arvioitiin käyttämällä paritonta ANOVA, ja

P

arvot laskettiin suorittamalla parittomia Studentin

t

testiä.

tulokset

Lisäys spontaani etäpesäke

VASH1 (- /-) B Hiiret

arvioimiseksi mahdollista roolia VASH1 syövän etäpesäkkeiden, me ympätty LLC soluja ihon alle oikeaan takajalan polkuanturaan WT ja

VASH1 (- /-)

hiirillä. Kuusitoista kahdeksantoista päivän kuluttua istutuksesta kasvain jalat resekoitiin; ja sen koko ja paino kasvainten määritettiin. Kasvaimia

VASH1 (- /-) B hiirillä kasvoi isompi (Fig. 1A ja B). Kasvaimia

VASH1 (- /-) B hiiret osoittivat lisääntynyttä verisuonten alue (Fig. 1 C ja D). Olemme eristetty normaalin hankittua WT-hiirissä tai kasvaimeen liittyvän hankittua WT ja

VASH1 (- /-) B-hiirissä, ja verrattiin ilmaus VASH1. Ilmentymistä VASH1 EC: eissa kasvaimen alusten oli merkittävästi suurempi kuin näiden normaalin lepotilassa alusten WT-hiirissä, kun taas ekspressio VASH1 puuttui

VASH1 (- /-) B-hiirillä (kuvio 2).

LLC-solut ympättiin oikean takajalan polkuanturaan WT ja

VASH1 (- /-)

hiirillä. V: Gross ilmestyminen päivänä 16.-18 siirrostuksen jälkeen. B: Paino kasvainta kantavien jalat. * P 0,05. C: Kasvaimen leikkeet immunovärjättiin CD31, ja verisuonten pinta-ala määritettiin kuten on kuvattu Materiaalit ja menetelmät. Keinot ja SDS näkyvät (N = 7). * P 0,05. D: tuumorisektioiden immunovärjättiin CD31, ja verisuonten määrä määritettiin kuten on kuvattu materiaalit ja menetelmät. Keinot ja SDS annetaan (N = 7). NS: ei ole merkittävä.

: n ilmentyminen CD31 ilmentymisen magneettisesti lajitellut solut normaaleista keuhkoista tai kasvainkudoksissa ja virrata fraktio analysoitiin RT-PCR: llä. B: n ilmentyminen hiiren VASH1 keuhkoissa päässä

VASH1 (- /-) B-hiirissä, ja tavanomaisessa keuhkoihin ja tuumorikudosten WT-hiirissä määritettiin RT-PCR: llä. C: n ilmentyminen hiiren VASH1 ilmentymisen normaaleissa keuhkoissa ja kasvaimen kudoksia WT-hiirissä kvantitoitiin reaaliaikainen RT-PCR: llä ja verrattiin (N = 3). ** P 0,01.

Kahdeksan päivän kuluttua kasvaimen resektion kantavien jalat, uhrasimme hiirillä ja määritettiin, missä määrin keuhkojen etäpesäkkeiden. Gross ulkonäkö ja osat keuhkoja paljasti huomattavan määrän lisääntyminen etäispesäkekasval-

VASH1 (- /-) B-hiirissä (Fig. 3A ja B). Tämä kasvu etäpesäke

VASH1 (- /-) B hiiriä tarkemmin määrällisesti punnitsemalla keuhkot ja laskemalla etäpesäkenystyröiden niihin (Fig. 3C ja D).

Kahdeksan päivän kuluttua jalka resektio, hiiret tapettiin, ja keuhkometastaasien arvioitiin. V: Gross ulkonäkö. B: hematoksyliinillä ja eosiinilla (H 0,05. D: Numero etäpesäkenystyröiden keuhkoissa WT ja

VASH1 (- /-) B hiirille annetaan (N = 7). ** P 0,01.

lisääntynyt koko primaarituumorin voi olla yksi syy täydennetty etäpesäke

VASH1 (- /-) B hiiret (Fig. 1 B). Kuitenkin paino kasvain jalan oli alle 2-kertainen (Fig. 1 B), kun taas määrä metastaattisen kyhmy oli yli 3-kertaiseksi

VASH1 (- /-) B hiiret (Fig. 3d) . Tämä suhteellinen kasvu keuhkojen etäpesäkenystyröiden voi osoittaa kiihtyvyyden metastaattisen prosessien itse

VASH1 (- /-)

hiirillä. Todellakin, vahvistimme merkittävä kasvu keuhkojen etäpesäkenystyröiden in

VASH1 (- /-) B hiirten sama paino kasvainta kantavien jalat (kuva S1).

Seuraava sovellettu toista hiirtä malli etäpesäkkeiden ruiskuttamalla LLC solut suoraan häntälaskimon kautta. Tämä liike, niin sanottu kokeellisen metastaasin malli, ohitetaan alkuperäisen intravasation askel. Mitä havaittiin oli, että laajuus keuhkometastaasitestissä oli muuttumaton välillä WT ja

VASH1 (- /-) B-hiirillä tässä mallissa (Fig. 4A, B, C ja D).

Kahdeksan päivää injektion jälkeen LLC-solujen häntälaskimon kautta, hiiret lopetettiin; ja keuhkojen etäpesäkkeiden arvioitiin sitten. V: Gross ulkonäkö. B: H 0,01. C: imusuonien alueella kasvain on esitetty (N = 4). * P 0,05. D: Oikeanpuoleinen imusolmukkeet LNS otettiin talteen ja valokuvattiin. Bar = 10 mm. E: paino imusolmukkeet LNS näkyy (N = 5). ** P 0,01.

Immature Kasvain Aluksia

VASH1 (- /-) B Hiiret

Normaali verisuonten kypsiä ympäröivät seinämaalaus soluja, mutta kasvain verisuonet ovat yleensä kehittymättömät, ovat puutteellisia seinämaalaus solun kattavuutta. Täällä tutkimme solukoostumuksesta kasvaimen alusten immunovärjäämällä niitä vasta-aine CD31, merkkiaine hankittua, ja vasta-aine αSMA, markkeri seinämaalaus soluja. Kuten odotettua, monet kasvain alukset eivät kuulu seinämaalaus soluja WT hiirillä (Kuva. 6A; ylemmät paneelit). Kuitenkin laajuus kattavuus seinämaalaus solut merkitsevästi vähemmän kasvain alukset

VASH1 (- /-) B hiiret (Fig. 6A alempi paneelit ja B).

V: Kasvain osastoja jaloissa WT ja

VASH1 (- /-) B-hiiriä immunovärjättiin CD31 ja αSMA. Bar = 100 pm. B: suhde αSMA-positiivisten alusten koko alusta on esitetty (N = 7). * P 0,05.

Tämä havainto vastaa hyvin meidän edelliseen [12], ja tämä ero seinämaalaus solupeittoa saattaa olla yksi syy kasvuun syöpäsolun intravasation näissä

VASH1 (- /-)

hiirillä. Kuitenkin, koska kasvain alukset WT hiirillä olivat huomattavasti kehittymätön, joten saattaisi olla lisäsyy tehostetun etäpesäke

VASH1 (- /-) B hiirillä.

puutteellinen muodostuminen tiiviiden liitosten endoteelin Yksikerrokset Puuttuvat VASH1

siis onko olemassa mitään muutoksia omaisuutta ECS itseään, kun niillä ei ollut VASH1 ilme. Me tippuu alas ilmentymistä VASH1 vuonna HUVEC käyttämällä siRNA, ja sitten tutkittiin läpäisevyys poikki endoteelin yksikerroksista. Oli merkittävä kasvu läpäisevyys koko yksikerroksista HUVEC: ien puuttuu VASH1 (Fig. 7A). Olemme edelleen tutki transmigraatioon syöpäsolujen poikki endoteelin yksikerroksista. Oli merkittävä kasvu transmigraatioon syöpäsolujen koko yksisolukerroksen VASH1-puutteellisten HUVEC-soluja (Fig. 7B).

: n määrä FITC-dekstraanin, että läpi yksikerroksiset HUVEC käsitelty ohjaus siRNA tai VASH1 siRNA verrattiin (N = 3). ** P 0,01. B: määrä syöpäsolut transmigrated kautta yksikerroksista HUVEC: ien hoidettu ohjaus siRNA tai VASH1 siRNA verrattiin. (N = 3). * P 0,05.

tekijä, joka määrittelee läpäisevyys ja transmigraatio syöpäsolujen koko endoteelisolujen yksikerroksista olisi muodostumista solu-solu-liittymissä. Siksi tutkimme komponentit solu-solu risteyksiin immunovärjäämällä vasta-ainetta ZO-1 markkerina tiiviiden liitosten ja vasta-ainetta VE-kadheriinin markkerina noudattamisen liittymissä. Oli väheneminen ZO-1, mutta ei VE-kadheriinin, positiivinen immuunivärjäyty- yksikerroksisten HUVEC: ien puutteelliset VASH1 (Fig. 8A). Tämä muutos ZO-1-pitoisuus varmistettiin lisäksi Western blottauksella (kuvio. 8B). Olemme lisäksi käytetään siRNA: t 3 ’UTR ihmisen VASH1 ja ekspressiovektori ihmisen VASH1 cDNA, josta puuttuu 3’-UTR pelastamiseen kokeessa. Näin ollen, siRNA olisi pudotus endogeenisen VASH1 ilmaisua, mutta se ei häiritse ilmentymisen eksogeenisen VASH1 ekspressiovektorin. Kuten on esitetty kuviossa. 8C tippuu alas ja VASH1 tässä siRNA vähensi myös ilmaus ZO-1 ja kotransfektoimalla VASH1 cDNA puuttuu 3 ’UTR palautti ilmaus VASH1 ja estäneet laski ZO-1 ilme.

Seitsemänkymmentä-kahden tunnin kuluttua siRNA hoidon immunovärjäyty- varten ZO-1 ja VE-kadheriinin, komponentit tiiviiden liitosten ja kiinnittyminen risteykset, vastaavasti HUVEC käsitelty ohjaus siRNA tai VASH1 siRNA suoritettiin. Bar = 50 pm. B: proteiinipitoisuus ZO-1, VE-kadheriinin, VASH1, ja β-aktiini in HUVEC käsitelty kontrolli-siRNA tai VASH1 siRNA analysoitiin Western-blottauksella. C: HUVEC-solut transfektoitiin VASH1 ekspressiovektorilla, ja stealth siRNA. Solut uutettiin 48 tuntia myöhemmin, ja Western blot -analyysi suoritettiin.

Keskustelu

Tässä me tutkimme roolia endogeenisen VASH1 syövän etäpesäkkeiden suhteen vuorovaikutusta syöpäsoluja ja verisuonistoon. Meillä työskentelee 2 hiiri malleja syövän etäpesäkkeiden, joka arvioi koko prosessit etäpesäkkeiden kuin spontaani etäpesäkkeiden malli ja muut, prosessi ekstravasaation ja myöhemmät tapahtumat kuin häntälaskimoinjektio malli. Nykyinen analyysit paljastivat parannetun etäpesäke

VASH1 (- /-) B hiiret spontaanisti etäpesäkkeitä mallia mutta ei häntälaskimoinjektio malli. Vuonna spontaani etäpesäkkeiden malli, syöpäsolut transmigrate kautta sekavaa vastaperustetun tuumoriverisuoniin. Kuitenkin, kun syöpäsolut injektoitiin suonensisäisesti kokeellisen metastaasin malli, prosessi intravasation oli ohitettu. Tämä saattaa olla yksi syy, että emme löytäneet mitään eroa kokeellisessa etäpesäkkeitä mallia. Me arveltu, että endogeeniset VASH1 osallistui puolustautua syöpäsolun intravasation ensisijainen vaurio. Ehdotamme myös, että kireys endoteelin este on tärkeämpää syöpäsolujen lähtevät ensisijainen sivustosta.

Havaitsimme kasvu kasvaimen lymfangiogeneesiä ja alueellisten LN etäpesäkkeiden

VASH1 (- /-)

hiirillä. Olemme aiemmin osoittaneet, että eksogeeninen VASH1 esti kasvaimen lymfangiogeneesiä ja LN etäpesäke [8]. Tärkeää on, meidän nykyinen tulokset edelleen pohdittava, että endogeeniset VASH1 hallussaan estävä vaikutus kasvaimen angiogeneesiin ja LN etäpesäke. Kuten VASH1 etusijassa tuotetaan verisuonten hankittua [12], tämä estävä vaikutus VASH1 on lymfangiogeneesiä pääasiassa välittävät parakriinisesti.

Oheislaitteet imusuonten normaalisti puuttuu seinämaalaus soluja. Täten kasvua imusuonten voivat suoraan myötävaikuttaa intravasation syöpäsolujen imusuonten ja LN etäpesäke. Kuitenkin verisuonet ovat rakenteellisesti erilaisia. Siksi tarkasteltiin solukoostumuksesta kasvaimen verisuonten, ja vahvisti aiemmat havainto, että kasvaimen verisuonten

VASH1 (- /-) B hiiret ovat kehittymättömät, jossa on vähemmän seinämaalaus soluihin [12]. Se on dokumentoitu, että puutteellinen kattavuus kasvaimen verisuonten seinämaalaus solujen liittyy lisääntynyt esiintyvyys etäpesäke ihmisen kolorektaalisyövän soluissa [23]. On tärkeää kiinnitti solupeittoa suojelemiseksi kasvaimen verisuonten syöpäsolun intravasation varmistettiin edelleen sarja kokeita, joissa on useita eläinmalleissa [24] – [27]. Niinpä katsotaan, että epäkypsien kasvaimen verisuonten

VASH1 (- /-) B hiirillä saattaa olla yksi syy augmentation syövän etäpesäkkeiden. Toistaiseksi emme voineet havaita mitään vaikutuksia VASH1 on seinämaalaus soluissa [7]. Siten säätelevistä mekanismeista VASH1 välittämää ylläpito verisuonten kypsyyttä vielä selvittämättä.

Kuten VASH1 syntetisoivat ja vaikuttaa hankittua toimimalla Autokriinisenä tekijä [7], [10], VASH1 saattaa muuttaa omaisuutta hankittua itselleen lisäksi vuorovaikutuksessa seinämaalaus soluihin. Todellakin, knockdovvn VASH1 tehostetun läpäisevyyttä ja transmigraatioon syöpäsolujen poikki homotyyppisessä endoteelin yksikerroksista. Nämä tulokset edistänyt meidät tutkimaan homotyyppisessä solu-soluadheesion limakalvon endoteelin. Olemme todellakin havaittu, että knockdovvn VASH1 EC: eissa johti vähentynyt pitoisuus ZO-1, osa tiukka liittymissä, mutta ei vaikuttanut VE-kadheriinin, komponentti noudattamista risteyksissä. Lisäksi ulkoisesti transfektoitu VASH1 voisi palauttaa lasku ZO-1 aiheuttama VASH1 siRNA.

tiiviin liitoksen on kaikkein ajankohtainen rakenne, joka ohjaa läpäisevyys epiteelin ja endoteelin kerroksia. Tiukka risteyksen endoteelikerros toimivat esteenä, jonka kautta neste, molekyylit ja solut eivät voi siirtää [28], [29]. Siten tiiviin liitoksen tulisi olla este, joka syöpäsolujen täytyy voittaa niiden intravasation. Itse asiassa väheni tiiviin liitoksen kasvaimen alusten mukana hankinta metastaattisen fenotyypin melanooman [30], ja huono ennuste maksasolukarsinoomassa [31]. Siksi katsomme, että lasku ”kireys” on tiiviin liitoksen voisi olla toinen syy augmentation syövän etäpesäkkeiden. Mekanismia, miten VASH1 säätelee endoteelin tiiviin liitoksen muodostuminen on vielä selvittämättä.

Yhteenvetona pääteltiin endogeeninen VASH1 voidaan tarvita vastus endoteelin vastaan ​​intravasation syöpäsolujen tarvitaan etäpesäkkeiden. VASH1 voi toimia varmistaakseen tiukan sitoutumisen välillä endoteelisolujen ja yhdistyksen endoteelin kanssa seinämaalaus solujen verisuonten kypsymisestä, ja nämä fenotyypit muistuttavat ”sormiluu endoteelisolujen” [32], [33]. Vaikka täsmälliset mekanismit, joiden VASH1 töitä on vielä selvittämättä, nämä toiminnot VASH1 voidaan soveltaa inhibition syövän etäpesäkkeiden.

tukeminen Information

Kuva S1.

Kuusitoista kahdeksantoista päivän kuluttua siirrostuksen syöpäsolujen, kasvain jalat resekoitiin.

doi: 10,1371 /journal.pone.0073931.s001

(DOCX) B

Tiedoksi

kiitos Ms. Yuriko Fujinoya hänen erinomaisesta teknisestä avusta.