Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

Viimeaikaiset todisteet

in vitro

ja

in vivo

tutkimuksissa on osoitettu, että poikkeava aktivoituminen Sonic Hedgehog (SHH) signalointireitin säätelee geenien, jotka edistävät solujen lisääntymistä erilaisissa ihmisen syövän kantasolut (CSCS). Siksi kemoterapia-aineita, jotka estävät aktivoituminen Gli transkriptiotekijöiden ovat nousseet lupaavia uusia terapeuttisia lääkkeitä haimasyöpä. GDC-0449 (Vismodegib), suun kautta annettava molekyyli, joka kuuluu 2-arylpyridine luokan estää SHH signalointireitille estämällä toimintaa Smoothenedin. Tavoitteet Tämän tutkimuksen oli tutkia molekyylitason mekanismeja, joilla GDC-0449 säätelee ihmisen haiman CSC ominaisuudet

in vitro

.

Menetelmät /Principal Havainnot

GDC-0499 esti solujen elävyyden ja indusoi apoptoosin kolme haimasyövän solulinjoissa ja haiman CSCS. Tämä estäjä myös tukahdutetaan solujen elinkykyä, Gli-DNA: ta sitova ja transkription toimintaa, ja indusoi apoptoosia kaspaasi-3 aktivointi ja PARP pilkkominen haiman CSCS. GDC-0449 aiheuttaman apoptoosin CSCS osoittivat lisääntynyttä Fas ilmaisun ja vähentynyt ilmentyminen PDGFRα. Lisäksi Bcl-2 oli alassäädetty taas TRAIL-R1 /DR4 ja TRAIL-R2 /DR5 ekspressio lisääntyi seuraavien hoitoon CSCS kanssa GDC-0449. Tukahduttaminen Molempien Gli1 plus Gli2 mukaan shRNA jäljitteli muutoksia solujen elinkelpoisuuden, pallomainen muodostumista, apoptoosin ja geeniekspressio havaittiin GDC-0449 saaneista haiman CSCS. Täten aktivoitu Gli geenit tukahduttamisen DR: n ja Fas ilmaisuja, ajan säännellä ilmaisuja Bcl-2 ja PDGFRα ja helpottaa solujen eloonjäämistä.

Johtopäätökset /merkitys

Nämä tiedot viittaavat siihen, että GDC-0499 voi käytettävä hallintaan haimasyövän suuntaamalla haiman CSCS.

Citation: Singh BN, Fu J, Srivastava RK, Shankar S (2011) siili Signaling Antagonist GDC-0449 (Vismodegib) Estää haimasyöpä Stem Cell Ominaisuudet : Molecular Mechanisms. PLoS ONE 6 (11): e27306. doi: 10,1371 /journal.pone.0027306

Editor: Arun Rishi, Wayne State University, Yhdysvallat

vastaanotettu: 02 syyskuu 2011; Hyväksytty: 13 lokakuu 2011; Julkaistu: 08 marraskuu 2011

Copyright: © 2011 Singh et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Kirjoittajat ei ole tukea tai rahoitusta raportoida.

kilpailevat edut: kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Haimasyöpä (PC) on erittäin tappava maligniteetti ominaista myöhäinen diagnosointi ja hoito vastus. PC on neljänneksi yleisin syy syövän Yhdysvalloissa, jossa on 5 vuoden pysyvyys on alle 5%. Kirurginen resektio on potentiaalisesti parantava terapeuttinen vaihtoehto PC; kuitenkin, koska ei ole varhaiset oireet, valtaosa potilaista on metastaattinen sairaus, mikä tekee niiden maligniteetti käyttökelvottomaksi [1], [2]. Nykyinen standardi-of-care hoito, gemsitabiini, ulottuu potilaan elinaikaa vain muutama viikko [3]. Tunnistaakseen uusia molekyylikohteista PC voittaa synkkä ennuste on siis tarpeen. Toistuva geneettisten muutosten määritellään geenejä yhdessä häiriöiden kehittävän solun signalointipolkujen on yhdistetty PC kehittymistä ja etenemistä. Viimeaikaiset todisteet

in vitro

ja

in vivo

tutkimukset viittaavat siihen, että Sonic Hedgehog (SHH) signalointireitin [4] on poikkeavasti uudelleen ja tunnustettu yhdeksi välittäjien useimmissa PC; siksi, SHH saarto on mahdollista estää taudin etenemistä ja metastaaseja [5].

SHH signalointi aloitetaan sitoutuminen lyhytvaikutteisten polypeptidiligandin nimittäin Shh (Sonic Hedgehog, Intian Siili tai Desert Hedgehog) ja sen reseptori, Patched joka siten, vähentää estäviä vaikutuksia Patched on Smoothenedin [6]. Smoothenedin Sitten lokalisoitu ensisijainen cilium solun, organelle niillä on keskeinen rooli SHH signalointi [7]. Siellä Smoothenedin aktivoi solunsisäisiä kaskadin, joka johtaa aktivointi ja tumaansiirtymiseen Gli perheen transkriptiotekijän Gli2 [8]. Gli2 translokoituu tumaan ja indusoi transkriptiota SHH kohdegeenien, kuten Gli1, luotettava markkeri SHH signaloinnin [8], [9]. Gli2 on kriittinen osa SHH signaloinnin ja sen inaktivaatio johtaa inhibitioon SHH-signalointia. Nämä Gli transkriptiotekijät päälle geenien tumaan joka edistää solujen lisääntymistä, solujen selviytymisen, stemness, ja solujen kohtalon määrittämiseen erilaisissa elimissä [5], [10]. SHH polku on morfogeenipolypeptidi toimisi kunnolla lajimuodostuksessa embryogeneesin aikana; kuitenkin, vapautuminen tämän reitin on vastuussa useista ihmisen syövissä [8], [10], [11]. Viimeaikaiset todisteet osoittavat, että SHH signalointireitille tasolla Gli geenien on kriittinen rooli normaalin haiman kehitys ja on yhä enemmän näyttöä, että väärin säädellystä SHH signalointi vaikuttaa jonkin verran haimasyövän [12]. Lisäksi useat raportit osoittavat, että ihmisen haiman syövistä yli express Gli-geenit [13], [14].

transkriptio tekijät Gli perhe on kaksi toimintoa, kuten aktivaattori ja repressorin, jotka on määritetty vain osittain ja voi vastata kombinatorinen ja osuuskunta Gli toimintaa. Gli perhe pelaa kriittinen rooli sovittelun ja tulkinnan SHH signaalit [15]. SHH-ajettu syöpien syntyä erilaisia ​​mutaatioita, jotka vaikuttavat eri komponenttien, mukaan lukien key transkription efektori Gli proteiineja, johtaa erilaisiin ihmisen maligniteettien, mukaan lukien medulloblastooma, rhabdomyosarkooma, melanooma, tyvisolusyöpä, ja rinta-, keuhko-, maksa-, maha-, eturauhas-, ja haimasyöpiin [16], [17], [18], [19], [20]. Konstitutiivisesti, SHH-Gli signalointi on aktiivinen tyvisolusyöpien medulloblastoomien ja syövät ruokatorven, koska mutaatio Patched tai tasoittaa [21], [22]. Melanoomat ja karsinoomat eturauhasen ovat edelleen osoittaneet SHH-Gli signalointi akselilla [23]. Ruoansulatuskanavan syöpien, SHH signalointi tapahtuu aktivointi kautta transkription säätelyn SHH ligandin [24]. Äskettäin on ehdotettu, että SHH signalointi etenee aikana paksusuolen syövän synnyn [25], [26] ja etäpesäkkeitä [27], kun taas normaalissa paksusuolen kudoksessa, SHH signalointi osallistuu erilaistumiseen [28]. Äskettäin geenit on profiloitu, jotka ovat säänneltyjä alavirtaan Gli1 ja Gli2, jotka osallistuvat solujen proliferaation ja solusyklin [29], [30], ja solujen eloonjäämisen (PDGFRα ja Bcl-2) [22]. Gli2 ilmentyy myös monissa tyvisolusyöpien [31], mikä viittaa siihen, että nämä geenit saattavat myös olla mukana kehittämässä PC, joka voisi olla sopusoinnussa sen osittaisen kanteen välittäjänä SHH signaalit [32]. Kuitenkin roolit Gli geenien (Gli1 ja Gli2) in SHH-ajettu solujen eloonjäämisen ja solukuolemaan vasteet säilyvät huonosti määritelty, ja erityisesti niiden rooli solujen lisääntymisen ja eloonjäämisen haiman CSCS on tuntematon ja loppupään kohdegeenien mukana määritys solun kohtalon.

paljon huomiota on viime aikoina keskittynyt roolista syövän kantasoluja (CSCS) /syöpä aloittamisen soluja (CIC) alkamisessa ja etenemisessä kiinteitä pahanlaatuisia kasvaimia. CSCS voivat olla vastuussa kasvaimen puhkeamista, itseuudistumisen /huolto, mutaatio kertymistä, ja etäpesäkkeiden johtuen niiden kyvystä ilmaista antiapoptooppinen ja lääkkeille vastustuskykyisten proteiineja, näin yllä kasvaimen kasvua [33], [34]. SHH signalointireitin on keskeinen säätelijä fysiologisia solun prosesseja, jotka ovat proliferaatiota, erilaistumista, ja apoptoosin [35]. Viimeaikaiset tutkimukset osoittavat, että SHH merkinantojärjestelmän on avainasemassa myös CSC biologian, myös sääntelyn CSCS itseuudistumisen, erilaistuminen; ja Tuumorigeenisuustutkimuksissa, mikä viittaa siihen, SHH signalointi voisi olla lupaava terapeuttinen kohde tietokoneissa [14]. Aktivointi SHH signalointi voi kumota vastus CSCS kemoterapiaa ja voisi johtaa kehittää uusia terapeuttisia lähestymistapoja hoitoon tietokoneita.

Tunnistaa alavirtaan tavoitteita Gli geenit, jotka säätelevät solujen lisääntymistä ja eloonjäämisen haimasyövän kantasoluja (CSCS), käytimme estäjä SHH signalointia, GDC-0449 (smoothened estäjä), joka on tunnistettu solupohjaisessa pieni molekyyli näytön inhibiittorit Gli perheen-välitteisen transkription [36]. GDC-0449 toimii voimakkaana estäjänä Smoothenedin ja osoittaa suurta selektiivisyyttä SHH-Gli signalointi [36]. Ihmisen haiman CSCS, me osoitti inhibition SHH signalointireitin kohdistamalla Gli transkriptiotekijät. GDC-0449 indusoi merkittävän solukuoleman kolme haimasyövän solulinjoissa (AsPC-1, PANC-1 ja MIA PaCa-2), ja haiman CSCS. Edelleen yksityiskohtaisia ​​analyysejä haiman CSCS, GDC-0449 laski SHH signalointi komponenttien (Gli1, Gli2, Patched-1, Patched-2, SHH ja Smoothenedin) ilmaisu, Gli-DNA: ta sitovan ja Gli-lusiferaasireportterilla toimintaa. Lisäksi, pudotus sekä Gli1 ja Gli2 ilmaisuja käyttäen shRNA resistenssin GDC-0499-indusoidun sytotoksisuuden. Lisäksi GDC-0449 vähensi ilmaus PDGFRα samanaikainen kohonneet Fas, lisääntynyt ilmentyminen TRAIL-R1 /DR4 ja TRAIL-R2 /DR5, laski Bcl-2: n ilmentymisen, ja indusoi kaspaasi-3: n aktiivisuuden ja PARP pilkkominen. GDC-0449 aiheuttamat muutokset geeni-ilmentymisen ja apoptoosin blokattiin Gli1 plus Gli2 shRNA, mikä osoittaa roolin Gli solujen proliferaation ja eloonjäämisen ihmisen haiman CSCS. Nämä tiedot viittaavat siihen, että GDC-0449 estää haiman CSCS lisääntymistä ja selviytymistä estämällä SHH signalointireitille tasolla Gli geenien.

Tulokset

SHH reitin signalointi komponentit ilmaistaan ​​ihmisen haimasyövän solulinjoissa ja haiman CSCS

ensin mitataan ilmentymistä eri osien SHH reitin ihmisen haimasyövän AsPC-1, PANC-1, ja MIA-PaCa-2 solulinjojen ja haiman CSCS RT-PCR (Kuva. 1). Tulokset osoittavat, että komponentit SHH signalointireitin, mukaan lukien ligandin (Shh), signalointi-molekyylien (Patched-1, Patched-2 ja Smoothenedin) ja efektorien (Gli1, ja Gli2) ilmaistaan ​​ihmisen haimasyövän solulinjoissa ja haiman CSCS. Nämä tiedot viittaavat siihen, että SHH-reitti on ehjä haimasyövän solulinjoissa ja CSCS, ja tukee ajatusta, että sitoutuminen Shh ligandin Patched reseptoriin vähentää sen inhiboivia vaikutuksia Smoothenedin, jolloin signaalitransduktion, joka johtaa aktivointiin ja ydin- translokaation gli perheen transkriptiotekijöiden [13], [37].

haiman syöpäsolujen (AsPC-1, PANC-1 ja MIA PaCa-2), ja haiman CSCS kasvatettiin 48 tuntia. Kokonais-RNA eristettiin ja ilmentyminen Shh, Patched-1, Patched-2, smoothened, Gli-1 ja Gli-2 mitattiin qRT-PCR: llä. HK-GAPD käytettiin endogeenisen normalisointia ohjaus. Kaikki määritykset suoritettiin kolmena kappaleena ja laskettiin perusteella ΔΔ

C

t menetelmällä. N-kertainen muutos mRNA-ilmentyminen määritettiin menetelmän 2

-ΔΔCT kanssa GAPDH käyttää kuin endogeeninen kontrolli.

GDC-0449 vähentää solujen elinkykyä ja indusoi apoptoosia ihmisen haiman syöpäsolun linjat ja haiman CSCS

Aiemmat kliiniset tutkimukset ovat osoittaneet, että GDC-0449 on pieni molekyyli estäjä Smoothenedin. Ensin pyrittiin tutkimaan vaikutuksia GDC-0499 solujen elinkelpoisuus ja apoptoosin paneelin kolmen ihmisen haimasyövän solulinjoissa ja haiman CSCS. Estyminen solun eloonjäämistä ja apoptoosin induktio havaittiin 24 tunnin kuluessa altistuksen jälkeen tämän lääkkeen (tietoja ei esitetä), mutta maksimaalisesti huomannut 72 h (kuviot. 2 ja 3). Kaikissa solulinjoissa, GDC-0449: n indusoiman apoptoosin on annoksesta riippuvalla tavalla päästä jopa 65%. Vertailun vuoksi GDC-0449 oli vähemmän tehokas aiheuttamaan apoptoosin CSCS (Fig. 3). Edelleen mekaaniset tutkimukset olemme käyttäneet haiman CSCS.

Soluja käsiteltiin GDC-0449 (0, 1, 5 ja 10 uM) 48 ja 72 tuntia. Lopussa itämisaika, solujen elinkelpoisuus mitattiin XTT (A) AsPC-1, (B) MIA PaCa-2, (C) PANC-1, ja (D) Haiman CSCS. Data edustaa keskiarvoa ± SD. @ Tai # poikkeavat merkittävästi vastaavista ohjaus (P 0,05).

Soluja käsiteltiin GDC-0449 (0, 1, 5 ja 10 uM) 48 ja 72 tuntia. Lopussa itämisaika, solut kerättiin ja apoptoosi mitattiin. Data edustaa keskiarvoa ± SD. @ Tai # poikkeavat merkittävästi vastaavista ohjaus (P 0,05).

GDC-0449 säätelee alavirtaan tavoitteet SHH koulutusjakson estää Gli-DNA vuorovaikutus, Gli transkriptionaalisen aktiivisuuden ja vähentää Gli tumaansiirtymiseen haiman CSCS

vieressä tutkittiin, mikä vaikutus GDC-0449 ilmenemistä Fas, DR4 /TRAIL-R1, DR5 /TRAIL-R2, PARP, Bcl-2, kaspaasi-3, ja PDGFRα että western blot -analyysillä (Fig. 4). GDC-0449 indusoi ilmentymisen Fas, DR4 ja DR5 ja esti Bcl-2 ja PDGFRα haiman CSCS. Lisäksi, GDC-0449 indusoi pilkkominen kaspaasi-3 ja PARP haiman CSCS, korreloi laajuus solujen eloonjäämistä ja apoptoosin.

Haiman CSCS käsiteltiin GDC-0449 (0, 1, 5 ja 10 uM) 48 tunnin ajan. Ilmentymisen Fas, DR4 /TRAIL-R1, DR5 /TRAIL-R2, PARP pilkkominen, Bcl-2, ja kaspaasi-3: Western blot-analyysi. β-Actin käytettiin latauskontrollina.

vieressä pyrittiin tutkimaan vaikutuksia GDC-0449 on SHH reitti mittaamalla ilmentyminen SHH-reseptorien (Patched-1, Patched-2 ja smoothened ) ja effektorit (Gli1 ja Gli2) by qRT-PCR (Kuva. 5A). GDC-0449 inhiboi ilmentymisen smoothened, Patched-1, ja Patched-2. Samoin, GDC-0449 inhiboi ilmentymistä transkriptiotekijä Gli1 ja Gli2. Nämä tiedot viittaavat siihen, että GDC-0449 voi säädellä CSC ominaisuuksia estämällä eri osien SHH kautta.

. (A), haiman CSCS käsiteltiin GDC-0449 (10 uM) 36 tunnin ajan. Lopussa itämisaika, RNA uutettiin ja ilmentymistä Gli1, Gli2, Patched-1, Patched-2, smoothened ja Shh mitattiin qRT-PCR: llä. Tulokset edustavat keskiarvoa ± SD. @ Merkittävästi erilainen valvontaluetteloihinsa (P 0,05). (B), haiman CSCS käsiteltiin ja GDC-0449 (0, 1, 5 ja 10 uM) 48 tunnin ajan. Valmistettiin tumauutteita ja gelshift koe suoritettiin. Koetin vain, kontrolli (ilman GDC-0449), ja GDC-0449 käsiteltyjen näytteiden (1, 5 ja 10 uM), vastaavasti. Tiedot edustavat kolmen kokeen. (C), Gli-riippuva lusiferaasin aktiivisuus pienenee GDC-0499. Haiman CSCS transdusoitiin lentivi- konstruktilla ilmentävät Gli-riippuvainen lusiferaasireportteri, ja käsiteltiin GDC-0449 (0, 5 ja 10 uM) 48 tunnin ajan. Lysaatit valmistettiin, ja lusiferaasiaktiivisuus mitattiin. Normalisoitu lusiferaasiaktiivisuus on esitetty keskiarvona ± SD. @ Tai # poikkeavat merkittävästi vastaavista ohjaus (P 0,05). (D), GDC-0449 inhiboi ilmentymistä Gli1 ja Gli2 ihmisen haiman CSCS. Solut siirrostettiin fibronektiinillä päällystetyn peitinlaseilla ja käsiteltiin GDC-0449 (10 uM) 48 tunnin ajan. Sen jälkeen solut kiinnitettiin 4% paraformaldehydillä, estetty 10% normaalia vuohen seerumia ja värjättiin Gli1 ja Gli2 primaaristen vasta-aineiden (1:100) 16 tuntia 4 ° C: ssa ja pestiin PBS: llä. Jälkeenpäin soluja inkuboitiin fluoresoivasti leimattua sekundääristä vasta-ainetta (1:200) yhdessä DAPI (1 mg /ml) 1 tunnin ajan huoneenlämpötilassa, ja solut kiinnitetään ja visualisoitiin fluoresenssimikroskoopilla. Paremman visuaalisuus, väri DAPI muutettiin punaisiksi.

Koska Gli välittää vaikutukset Shh, me seuraavaksi tutkinut Gli-DNA vuorovaikutusta elektroforeettisen liikkuvuuden shift (EMSA) ihmisen haiman CSCS. Hoito CSCS kanssa GDC-0449 alensivat Gli DNA: ta sitovan aktiivisuuden annoksesta riippuvaisella tavalla (kuvio. 5B).

vieressä tutkittiin, mikä vaikutus GDC-0449 on Gli transkriptionaalista aktiivisuutta (kuvio. 5C ). Altistuminen CSCS kanssa GDC-0449: ssa 36 tuntia aiheutti eston Gli-riippuvaisen lusiferaasireportteri aktiivisuutta annoksesta riippuvalla tavalla. GDC-0449 esti ilmentymistä Patched-1 ja Patched-2, koska ne ovat alavirtaan tavoitteita Gli. Me seuraavaksi käytetään immunofluoresenssitekniikkaa tutkia vaikutuksia GDC-0449 ydin- ilmentymisen Gli (Fig. 5D). Haiman CSCS käsiteltiin GDC-0449, ja ydin- ilmaus Gli1 ja Gli2 havaittiin. GDC-0449 esti ydin- ilmaus Gli1 ja Gli2. Kaiken kaikkiaan nämä tiedot viittaavat siihen, että GDC-0449 voi estää Gli DNA: ta sitova ja transkriptioaktiviteettia.

Ihmisen haiman CSCS edellyttävät aktiivista Gli toiminto kestävän liittyvien geenien ekspressiota solussa selviytymistä ja proliferaatiota

jotta voidaan tutkia vaikutuksia Gli1 ja Gli2 soluproliferaatioon, apoptoosin ja alas-stream tavoitteet, me esti ilmaus Gli1 ja Gli2 transkriptiotekijöiden mukaan shRNA. Kuten on esitetty kuviossa. 6A, lentivirus- välitteisen ilmentymisen Gli1 ja Gli2 shRNA esti ilmaus Gli1 ja Gli2 proteiinien haiman CSCS. Jos GDC-0449 inhiboi solujen elinkykyä ja indusoi apoptoosia estämällä Gli transkriptiotekijät, inhibition Gli1 ja Gli2 pitäisi estää antiproliferatiivisia ja pro-apoptoottista vaikutusta GDC-0449. Vahvista Gli riippuvia antiproliferatiivisia ja proapoptoottisten vaikutuksia GDC-0449, käytimme haiman CSCS ilmentävät Gli1 + Gli2 shRNA (Fig. 6B). GDC-0449 inhiboi solujen elävyyden ja indusoi apoptoosin CSCS /salattu soluja. Esto Gli1 ja Gli2 yksin shRNA ei kyennyt täysin estämään vaikutuksia GDC-0449 CSC: n elinkelpoisuutta (tietoja ei ole esitetty). Vertailun esto Gli1 plus Gli2 yhteen shRNA tukahdutti vaikutukset GDC-0449 solun elinkelpoisuuden ja apoptoosin CSCS. Nämä tiedot viittaavat siihen, että sekä Gli1 ja Gli2 geenejä tarvitaan anti-proliferatiivisia ja pro-apoptoottista vaikutusta GDC-0449.

(A), Knockout on Gli1 shRNA ja Gli2 shRNA ihmisen haiman CSCS. Haiman CSCS transdusoitiin lentivi- hiukkasia ekspressoivat Scrambled, Gli1 shRNA, Gli2 shRNA tai Gli1 plus Gli2 shRNA (KO). (B), haiman CSCS käsiteltiin GDC-0449 (0, 1, 5 ja 10 uM) 72 tunnin ajan, ja solujen elinkelpoisuus ja apoptoosi mitattiin salattu ja Gli1 plus Gli2 shRNA CSCS. Tiedot edustavat keskiarvoa ± SD, n = 4. @ tai # poikkeavat merkittävästi vastaavista ohjaus (P 0,05). (C), Salattu ja Gli1 plus Gli2 shRNA haiman CSCS käsiteltiin GDC-0449 (0 ja 10 uM) 48 tunnin ajan, ja lysaatit uutettiin ekspression määrittämiseksi DR4: n, DR5, PDGFRα, Fas: n ja Bcl-2: n Western blot-analyysi. p-Actin käytettiin lastaus ohjaus. (D), esto ensisijainen ja toissijainen pallosia by GDC-0449. Haiman CSCS (salattu, ja Gli1 + Gli2 shRNA) ympättiin suspensiossa ja käsiteltiin GDC-0449 (10 uM) ja 7 päivää. Lopussa itämisaika, sferoidit kerättiin, ja liukenevat Accutasella (Innovative Cell Technologies, Inc.). Sekundaariseen sferoidit solut siirrostettiin ja käsiteltiin GDC-0449 (10 uM) ja vielä 7 päivää. Solujen elinkelpoisuus mitattiin trypaanisinistä määrityksessä. Data edustaa keskiarvoa ± SD. @ Tai # poikkeavat merkittävästi vastaavista valvontaa, P 0,05.

vieressä tutki vaikutuksia estämällä Gli ilmaisun loppupään tavoite SHH reitin Western blot-analyysi (Fig. 6C). GDC-0449 (10 uM) indusoitua ilmentymistä Fas, DR4 ja DR5, pilkottiin PARP, ja esti Bcl-2 ja PDGFRα CSC /salattu soluja. On mielenkiintoista huomata, että ilmentyminen PDGFRα laski seuraavat GDC-0449-hoidon samanaikaisesti kasvu Fas. Vertailun vuoksi GDC-0449 ei ollut merkittäviä vaikutuksia ilmentymistä näiden loppupään tavoitteiden SHH signalointireitin in CSCS /Gli1 + Gli2 shRNA soluja.

vieressä tutkittiin, mikä vaikutus GDC-0449 on ensisijaisen ja toissijaisen pallomainen muodostumiseen (Fig. 6D). GDC-0449 esti muodostumista ensisijaisen ja toissijaisen rakeita CSC /salattu soluja. Vertailun vuoksi, transduktio Gli1 plus Gli2 shRNA in CSCS tukahdutti estäviä vaikutuksia GDC-0449 on ensimmäisen ja toisen pallomainen muodostumista. Nämä tiedot viittaavat siihen, että GDC-0449 voi estää haiman CSC ominaisuudet.

Keskustelu

Tutkimuksemme osoittaa, ensimmäistä kertaa, että tasoittaa riippuva terapeuttista ainetta GDC-0449 säätelee solujen eloonjäämisen ihmisen haiman CSCS. Erityisesti GDC-0449 inhiboi solujen elävyyden ja indusoi apoptoosin kolme haimasyövän solulinjoissa ja haiman CSCS. Haiman CSCS, GDC-0449 tukahdutti myös solujen elinkykyä, Gli-DNA: ta sitovan ja Gli-transkription toimintaa, indusoi apoptoosin kautta kaspaasi-3 aktivointi ja PARP pilkkominen. Analyysi molekulaarisia mekanismeja GDC-0449-indusoituvaa solukuolemaa CSCS osoittivat lisääntynyttä Fas ilmentyminen ja vähentynyt ilmentyminen PDGFRα, joka säätelee myös Fas. Lisäksi Bcl-2 oli alassäädetty taas DR4 ja DR5 ilmaisuja korotettiin käsittelyn jälkeen GDC-0449. Tukahduttaminen Molempien Gli1 plus Gli2 mukaan shRNA jäljitteli muutoksia solujen elinkelpoisuuden, pallomainen muodostumista, apoptoosin ja kuolema liittyvät geenin ilmentymisen havaittiin GDC-0449 saaneista haiman CSCS. Täten aktivoitu Gli geenit tukahduttamisen DR: n ja Fas ilmaisuja taas ylös säätelevä Bcl-2 ja PDGFRα ilmaisuja estävän Fas. Tuloksemme korostavat kriittinen rooli SHH signalointi ihmisen haiman CSCS ja mahdollisuus suunnata Gli1 ja Gli2 aktivaattori toimintoja käyttämällä GDC-0449 haimasyövän kantasoluja.

SHH signalointi tapahtumia ovat sekaantuneet kasvainsoluproliferaation ja eloonjääminen, sekä on molekyyli tunnusmerkki ihmisen erilaisten kasvainten yksiköt, jotka kuuluvat ruokatorven okasolusyöpä, tyvisolusyöpä [38], osajoukot medulloblastooman [39], eturauhassyöpä [40], paksusuolen syöpä [41], aivokasvaimet [42 ], rabdomyosarkooma [43], ja rintasyövän [44]. Useita rivejä todisteet tukevat ajatusta, että SHH signalointi on edellytys lisääntynyt elinkelpoisuuden haiman CSCS siten, että esto-aktiivista SHH signalointia terapeuttisen inhibiittorin molekyylit, kuten GANT-61 (kohdistaminen efektoreja Gli1 ja Gli2) ja syklopamiinilla (kohdistaminen SHH-reseptoria tasoitetaan) solukuolema [45]. Olemme osoittaneet, että ihmisen haimasyövän solulinjoissa ja CSCS jatkuvasti näihin eri osien SHH reitin mukaan lukien efektoreja (Gli1 ja Gli2), ja reseptorit (Patched-1, Patched-2, ja Smoothenedin), ja mikä tärkeintä ligandi: SHH, mikä viittaa siihen, , SHH reitti on yksi ”ydin” signalointireitin tai autokriinistä tilassa SHH signalointia näissä soluissa. Aktivointi SHH signalointiryöpyn johdonmukaisesti indusoi Gli perheen transkriptiotekijöitä (Gli1 ja Gli2), joten molemmat Gli-geenien mRNA [46], joka ilmaistaan ​​haimasyövän solulinjoissa ja CSCS, jossa potentiaali osallistuminen SHH signalointi ihmisen haiman syövän synnyn.

Aberrant aktivointi SHH signalointi on osallisena monissa ihmisen syövissä. Tunnistamaan uusia terapeuttisia kohteita, esto SHH signalointi on yritetty useita ihmisen syövistä [11], [41], [45]. Äskettäin Gli ja Smo antagonisteja on käytetty kumota SHH signalointi ihmisen syövissä (40). Luonnolliset ja synteettiset tasoitetaan antagonistit kuten syklopamiinihoidon [24] ja IPI-926 [11], vastaavasti ovat estivät proliferaatiota, eloonjäämistä ja kasvaimen vastaisia ​​toimintoja, jolloin kumota SHH signalointi. Kuitenkin kliinisissä tutkimuksissa eri tasoilla resistenssin on havaittu. Farmakologiset aineet, mukaan lukien syklopamiinihoidon (11), GDC-0499 ja GANT-61 [41] on estetty, selviytymisen ja antitumor toiminnot kokeellisissa malleissa ihmisen syövissä. Gli-geenit ovat mahdollisia jäseniä SHH koulutusjakson, jotka toimivat alavirran välittäjinä SHH signalointi ja niillä on sääntelyn vaikutuksia solukierron ja apoptoosin. Siten yksi potentiaalinen druggable tavoite piilee Gli perheen transkriptiotekijöitä, jotka ovat viimeinen välittäjiä transkription sääntelyn SHH signalointireitin. Esillä olevassa tutkimuksessa, altistuminen GDC-0449 indusoi merkittävää sytotoksisuutta ja apoptoosin ihmisen haimasyövän soluja ja CSCS.

GDC-0449 hoito alentaa tehokkaasti Gli-DNA: ta sitovan ja Gli-transkriptionaalista aktiivisuutta ihmisen haiman CSCS. Nämä tulokset ehdottavat, että GDC-0449 voi aiheuttaa posttranskriptionaalisella muutoksia Gli-geenin, mikä voisi osoittaa kohti, nousu fosforylaation, jotka joko estävät DNA: ta sitovan tai horjuttaa Gli-DNA-kompleksi. Translaation jälkeiset muutokset Gli-geenin on tärkeä mekanismi, joka säätelee kyky eri transkriptiotekijöiden estävän erillisiä geenin sarjaa, osallistuvat säätelyyn solukuoleman inhibitio [41], yhdenmukaisia ​​aiempien havaintojen haimasyöpäsoluissa muokattu ilmentämään Gli1 [13 ]. Erityisen kiinnostavia, tasoittaa riippuva GDC-0449 hoidossa haiman CSCS selvästi esti ilmauksia SHH reseptorien (Patched-1, Patched-2 ja Smoothenedin) sekä -efektiboksejamme (Gli1 ja Gli2), mikä osoittaa potentiaalista terapeuttista hakemuksen hoitoon haimasyövän . Aikaisemmin raportoitiin, että GDC-0449 tunnistettiin estäjä Gli1 transkriptionaalisen aktiivisuuden, ja myös kumottu Gli2-välitteisen transkription [36]. Myöhemmin olemme havainneet, että vähennys Gli2 ilmaus edeltäneen of Gli1 haiman CSCS. Edelleen, hiirillä ovat osoittaneet, että Gli2 on ensisijainen välittäjiä SHH signalointi ja on tunnettu transkriptionaalisesti säätelevät Gli1 ilmentymistä [25]. Koska SHH signalointireitille on jo aktivoitu ihmisen haiman CSCS, tutkimukset käyttäen shRNA knockdovvn Gli1 ja Gli2 yksin ja samanaikaisesti tehtiin. GDC-0449 inhiboi merkittävästi solujen elinkelpoisuuden ja indusoi apoptoosin shRNA Gli1 ja Gli2 yksinään (tuloksia ei ole esitetty). Mielenkiintoista, merkittävää suojaa GDC-0449 aiheuttamaa sytotoksisuutta ja apoptoosin kirjattiin shRNA knockdovvn Sekä Gli1 ja Gli2. Nämä tulokset edelleen tukevat ajatusta, että GDC-0449 saattaa olla Gli riippuvia ja riippumattaman vaikutustapa (Fig. 7) ja osoittavat lisäksi, että on tärkeää toiminnallisen Gli geenien ylläpitämiseksi solujen eloonjäämisen ihmisen haiman CSCS.

aktivoitu Gli1 ja Gli2, alavirtaan SHH-Patched-smoothened, säätelevät tavoitteet SHH signalointi kuten Bcl-2, PDGFRα, Fas, ja DR:. GDC-0449 (kohdistaminen Smoothenedin) estää epäsuora toimintoja Gli aktivaattoreita, mikä johtaa solun kuolemaan.

arvioimiseksi antiproliferatiivista vaikutusta GDC-0449 yksityiskohtaisemmin, olemme seuraavassa korreloi ilmaus solusyklin ja apoptoosiin liittyvien geenien kanssa SHH signalointi haiman CSCS. Useita kantasoluja ja syöpäsolujen, SHH toimii eloonjäämistekijä [9], [47]. SHH on raportoitu ohjaamaan lisääntymistä useiden solutyyppien erilaisten molekyylitason mekanismeja, kuten lisääntyminen PDGFRα ja Bcl-2-ilmaisuja, laskevan DR: n ja Fas ilmaisuja, ja inhibitio PARP lohkominen ja kaspaasi-3-aktivaation koolonsyöpäsolulinjoissa yli-ilmentävät Gli-geenit [41], tai yli-dominanttinegatiivivaikutus FADD soluissa, jotka ilmentävät SHH tai konstitutiivisesti aktiivinen Smoothenedin [41]. Tutkimuksessamme GDC-0449 aiheuttama kasvoi selvästi ilmaus Fas ja molemmat DR: (TRAIL-R1 /DR4 ja TRAIL-R1 /DR5), mikä viittaa mahdollisen osallistumisen näiden DR: in lääkkeen aiheuttama apoptoosin. Viimeaikaiset raportit osoitti puuttuessa Gli sitoutumiskohdat promoottorialueen DR4 ja DR5. Sääntely DR ilmentymisen Gli ei tällä hetkellä tiedetä, ja se voi olla kautta epäsuora mekanismi. Kuitenkin GDC-0449 aiheuttama up säätää sekä DR: haiman CSCS, mikä viittaa transkription säätely DR: jota ei toistaiseksi tunneta mekanismia. Olemme myös päättäneet panokset apoptoottisen solukuoleman väyliä (mitokondrioissa välittämää luontainen ja kuolema reseptorin signalointia välittämän ulkoista), joka perustuu tunnettujen sääntelyä PDGFRα ylävirtaan Fas [2], [48], ja Bcl-2, jotka voivat olla suora transkription kohteena sekä Gli1 ja Gli2 keskeinen anti-apoptoottisen proteiinin SHH-riippuvaisten solujen eloonjäänti [49]. Olemme osoittaneet, että GDC-0449 hoito vähentää pro-selviytymisen proteiini Bcl-2: n ilmentymisen haiman CSCS. Näin ollen tietomme osoittavat, että aktivaatio SHH reitin voi säädellä geenien sekä solunulkoisen ja solu-sisäisen reitin apoptoosin.

Yhdessä tämä tutkimus osoittaa, että endogeeninen SHH signalointi säätelee kyky uusiutua ihmisen haiman CSCS kohdistamalla alavirtaan tavoitteet Gli. Lopuksi GDC-0449 voidaan käyttää hoidettaessa ihmisen haimasyövän, koska se voi kohdistaa haimasyöpä CSCS.

Methods

Vasta-aineet ja reagenssit

Vasta-aineet SHH, tasoitetaan, Fas, TRAIL-R1 /DR4, TRAIL-R2 /DR5, ja β-aktiini ostettiin Santa Cruz Biotechnology Inc. (Santa Cruz, CA). Vasta-aineita Gli1, Gli2, Patched-1, Patched-2, PDGFRα ja kaspaasi-3 saatiin Cell Signaling Technology (Danvers, MA). Enhanced kemiluminesenssin (ECL) Western blot detektioreagensseja olivat Amersham Life Sciences Inc. (Arlington Heights, IL). GDC-0449 (Vismodegib; C19H14Cl2N2O3S) hankittiin Tocris (Ellisville, MO). Kaikki muut käytetyt kemikaalit olivat analyyttistä laatua ja ostettiin Fisher Scientific (Suwanee, GA) ja Sigma-Aldrich (St. Louis, MO).

Soluviljely

Haimasyöpä solulinjoissa ( AsPC-1, PANC-1 ja MIA PaCa-2) saatiin American Type Culture Collection (Manassas, VA), ja niitä viljeltiin RPMI 1640, johon oli lisätty 10% naudan sikiön seerumia (FBS) ja 1% antibiootti-antimykoottia 37 ° C: ssa kosteutetussa ilmakehässä 95% ilmaa ja 5% CO

2. Ihmisen haiman CSCS (CD133

+ /CD44

+ /CD24

+ /ESA

+) saatiin Celprogen Inc. (San Pedro, CA). Ne eristettiin primaarikasvaimista ja on kuvattu aiemmin [33]. CSCS viljeltiin DMEM: ssä, jota oli täydennetty 1% N2 Supplement (Invitrogen), 2% B27 Supplement (Invitrogen), 20 ng /ml ihmisen verihiutaleiden kasvutekijä (Sigma-Aldrich), 100 ng /ml epidermaalista kasvutekijää (Invitrogen) ja 1 % antibiootti-antimykoottia (Invitrogen) 37 ° C: ssa kostutetussa ilmakehässä, jossa oli 95% ilmaa ja 5% CO

2. Haiman CSCS rutiininomaisesti varmistettiin morfologia ja kasvuominaisuuksiin.

Lentivirusvektorikonstruktit hiukkasten tuotanto ja Gli1 shRNA ja Gli2 shRNA transduktio

Gli1 shRNA (5′-GCCTGAATCTGTGTATGAA-3 ’; 5′-GTTTGAATCTGAATGCTAT-3 ”5’-AGCTAGAGTCCAGAGGTTC-3 ’; 5′-CCGGAGTGCAGTCAAGTTG-3′ ja 5’-GGCTGGACCAGCTACATCA-3 ’) ja Gli2 shRNA (5’CCGAGAAGCAAGAAGCCAA-3′; 5’-CACAGCATGCTCTACTACT-3 ’; 5’- TCGCTAGTGGCCTACATCA