Krooninen sairaus

tiivistelmä

Tavoitteet

Reić /DKK-3 säätyy alas monenlaisiin ihmisen syöpäsoluja ja sen katsotaan toimivan tuumorisuppressorina. Raportoimme aikaisemmin, että Reić /DKK-3-ilmentävien adenovirusvektori (Ad-Reić) aiheuttama Endoplasmakalvosto (ER) stressi ja syöpää erityisiä apoptoosin ihmisen eturauhasen syöpä. Tässä tutkimuksessa selvitimme terapeuttinen vaikutus Ad-Reić Ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC).

Materiaalit ja menetelmät

Tutkimme antituumorivaikutus Ad-Reić 25. NSCLC solulinjoissa

in vitro

ja A549-soluja

in vivo

. Kaksi näistä solulinjoja keinotekoisesti perustettiin EGFR-tyrosiinikinaasin estäjä (TKI) resistenttejä alalinjoja.

Tulokset

Ad-Reić-hoito esti solujen elinkelpoisuuden 40% tai enemmän 13 ( 52%), 25 solulinjoista infektiokertoimella (MOI) 20 (20 MOI). Nämä solulinjat pidetään erittäin herkät solut. Solujen elävyys ei-pahanlaatuisten kuolemattomaksi solulinja, OUMS-24, ei inhiboinut 200 MOI Ad-Reić. Vaikutukset Ad-Reić on EGFR-TKI resistenttejä alalinjoja olivat vastaavia kuin vanhempien solulinjoissa. Täällä, osoitimme, että Ad-Reić hoito aktivoitua c-Jun N-terminaalinen kinaasi (JNK) in NSCLC solulinjoissa, mikä osoittaa induktio ER stressin kanssa GRP78 /BiP (GRP78) ylössäätöä ja tuloksena apoptoosin. Yksi kasvaimensisäistä injektio Ad-Reić inhiboi merkittävästi kasvaimia kasvun A549-solut

in vivo

. Koska ennustavaa tekijät herkkyyden Ad-Reić hoito NSCLC, tutkimme ilmaus tilan GRP78 ja coxsackievirus ja adenovirus-reseptori (CAR). Olemme havainneet, että yhdistelmä GRP78 ja CAR ilmaisullisella tiloja voidaan käyttää ennakoiva tekijä Ad-Reić herkkyyttä NSCLC soluissa.

Johtopäätös

Ad-Reić aiheuttama JNK aktivaation ja myöhemmät apoptoosin NSCLC soluissa. Tutkimuksemme osoitti, että Ad-Reić on terapeuttista potentiaalia vastaan ​​NSCLC ja että ilmaisu statukset GRP78 ja CAR voi ennustaa potentiaalinen terapeuttinen hyöty Ad-Reić.

Citation: Shien K, Tanaka N, Watanabe M, soh J, Sakaguchi M, Matsuo K, et ai. (2014) Anti-Cancer vaikutukset Reić /DKK-3-koodaavat adenovirusvektori hoitoon ei-pienisoluinen keuhkosyöpä. PLoS ONE 9 (2): e87900. doi: 10,1371 /journal.pone.0087900

Editor: Sumitra Deb, Virginia Commonwealth University, Yhdysvallat

vastaanotettu: 04 joulukuu 2013; Hyväksytty: 30 joulukuu 2013; Julkaistu: 03 helmikuu 2014

Copyright: © 2014 Shien et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: No current rahoituslähteitä tässä tutkimuksessa.

kilpailevat edut: kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Keuhkosyöpä on yleisin kuolinsyy syöpään maailmanlaajuisesti ja metastaattisen muoto on tärkeä tekijä, joka johtaa kuolleisuuteen [1]. On olemassa kaksi suurta histologinen alatyyppi keuhkosyöpään: ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC) ja pienisoluinen keuhkosyöpä. Viimeaikaiset intensiivinen tutkimuksissa on todettu aiheuttava molekyyli muutoksia, jotka ovat suoraan johtaneet uusien terapeuttisten strategioiden ja parantaneet potilaiden ennustetta [2]. Esimerkiksi mutaatiot epidermaalisen kasvutekijän reseptorin geeni (

EGFR

) löytyy noin 30% NSCLCs, erityisesti keuhkojen adenokarsinoomat, ja EGFR-tyrosiinikinaasin estäjät (TKI) ovat erityisen tehokkaita näiden kasvainten [ ,,,0],3], [4]. Viime aikoina, crizotinib on osoitettu olevan tehokas NSCLCs kanssa

EML4-ALK

fuusio geenin [5], [6]. Kuitenkin potilaiden määrä näitä muutoksia on rajallinen, ja vähän parannusta ennuste on saatu NSCLCs ilman näitä huumeita herkkä muutoksia. Lisäksi hankitun resistenssin lopulta tapahtuu useimmissa

EGFR

-mutant kasvaimia, jotka oli aiemmin vastannut EGFR-TKI jälkeen keskimäärin 10 kuukautta hoidon [7]. Siten uusi hoitomuoto parantamiseksi tarvitaan kliiniseen tulokseen potilailla, joilla on keuhkosyöpä.

Reić /DKK-3, jäsen Dickkopf (DKK) geeni perhe, on alun perin löydetty kuolemattomien solujen ja on on raportoitu olevan kasvaimen vaimennin; sen ilme on huomattavasti säädellä vähentävästi laajan syöpäsolun tyypit, mukaan lukien keuhkosyöpä [8]. Heatmap kuva lähetti-RNA (mRNA) ilmentyminen

Reić /DKK-3

geenin UCSC Cancer Genome luokkaa, joka on vapaasti saatavilla julkista tietokantaa (https://genome-cancer.ucsc.edu/) (me ladannut tiedot 16. heinäkuuta 2013), osoitti, että

Reić /DKK-3

geenin ilmentyminen väheni useimmissa tutkituissa näytteissä sekä keuhkojen adenokarsinooman ja okasolusyöpää verrattuna normaaliin keuhkokudokset (kuva S1) . Lisäksi voidaan vahvistaa julkisesta tietokannasta, joka ilmaus

Reić /DKK-3

oli myös alhainen monessa NSCLC solulinjoissa (Gene Expression Omnibus arkistossa [http: //www.ncbi.nlm.nih gov /geo, GEO liittyminen GSE4824]). Reić /DKK-3 tiedetään häiritsevän Wnt signaloinnin kautta Wnt-reseptoreihin [9], [10] ja on aiemmin raportoitu pelata selvä rooli apoptoosin induktioon ja etäispesäkkeiden inhiboimiseksi [11], [12]. Apoptoosin syöpäsoluissa johtuu pääasiassa solulimakalvostoon (ER) stressin aiheuttama ylituotanto Reić /DKK-3-soluissa. ER stressi laukaisee aktivointi c-Jun N-terminaalisen kinaasin (JNK), joka on kriittinen tapahtuma indusoiman apoptoosin ylituotanto Reić /DKK-3 käyttäen adenovirusvektori (Ad-Reić) [11], [13] . Aiemmissa tutkimuksissa, huomasimme, että Ad-Reić ollut terapeuttista vaikutusta erilaisten ihmisen syövän, mukaan lukien eturauhanen, kives, keuhkosairaudet, ja rintasyövät [11], [13] – [15]. Ad-Reić infektio ja Reić /DKK-3-proteiinin tiedetään myös säätää ylös anti-kasvain immunosystem [16]. Prekliinisten tietojen kliinisessä tutkimuksessa käyttäen Ad-Reić ihmisen eturauhasen syöpä on ollut käynnissä Japanissa ja USA: ssa (NCT01197209).

Tässä tutkimuksessa tutkimme terapeuttinen vaikutus Ad-Reić on NSCLC-solujen

in vitro

ja

in vivo

. Tutkimme myös liittyviä tekijöitä herkkyyttä solulinjojen Ad-Reić askeleena kohti kehittämiseen tilaustyönä Ad-Reić potilaille, joilla NSCLC.

Materiaalit ja menetelmät

Ethics Statement

tutkimus toteutettiin tiukasti mukaisesti suosituksia opas hoito ja käyttö Laboratory Animals of National Institutes of Health. Protokolla hyväksyttiin Animal Care ja käyttö komitea Okayama University (Luvan numero: OKU-2012-549). Kaikki Leikkaus suoritettiin ketamiini ja ksylatsiinin anestesian, ja yritettiin minimoida kärsimyksen.

Solulinjat

kuusitoista solulinjoissa Ihmisen keuhkon adenokarsinooma, 3 okasolusyöpä, 3 suurta cell carcinoma , 1 adenosquamous cell carcinoma, 2 EGFR-TKI-resistenttejä alalinjoja päässä HCC827 ja PC-9-soluja (HCC827-GR-high2 ja RPC-9), ihmisen mesoteliooma solulinja MSTO-211H (211H), ja normaalin ihmisen fibroblastisolulinjan line OUMS-24 käytettiin tässä tutkimuksessa (taulukko 1). Yksityiskohtia solulinjoja käytettiin tässä tutkimuksessa on kuvattu menetelmässä S1. HCC827-GR-high2 ja RPC-9 solulinjat perustettiin kuten aiemmin on kuvattu [17], [18]. OUMS-24 perustettiin meidän laitos [19].

adenovirusvektori kuljettavat Reić /DKK-3

Reić /DKK-3 yliekspressoitui käyttämällä adenovirus (Ad-Reić) että olemme aiemmin luotu [11]. Täyspitkä cDNA Reić /DKK-3 liitettiin kosmidivektoriin pAxCAwt ja siirrettiin adenovirusvektori, jonka COS-TPC-menetelmällä (Takara Bio, Shiga, Japani). Adenovirusvektori kantaa LacZ-geeniä (Ad-LacZ) käytettiin myös kontrollina. [11]

solunelinkykyisyysmääritys

Solut maljattiin 96-kuoppaisille levyille tiheytenä 1,5 x 10

3 solua /kuoppa 48 tuntia infektion jälkeen Ad-LacZ tai Ad-Reić at infektiokertoimella (MOI) 20, 100 tai 200 MOI. Solujen elinkelpoisuus arvioitiin 3 päivää myöhemmin käyttämällä MTS määritystä CellTiter 96 Aqueous One Solution Reagent (Promega, Madison, WI).

apoptoosimäärityksessä

tarkastella

in vitro

apoptoosin induktion jälkeen hoidon, me ympättiin soluja 6-kuoppaisille levyille ja inkuboitiin niitä 24 tuntia. Solut käsiteltiin Ad-LacZ tai Ad-Reić 20 MOI seerumittomassa väliaineessa (500 ui) 2 tunnin ajan; elatusaine sitten vaihdettiin tuoreeseen täydelliseen kasvualustaan ​​(2 ml). Vielä 48 tunnin inkuboinnin, Hoechst 33342 väriainetta (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) lisättiin pitoisuutena 2 ug /ml, ja soluja inkuboitiin pimeässä 10 min. Hoechst 33342 on väriaineaine joka mahdollistaa määrittämisen vaihtelut kokonaismäärästä kromatiinin määrän ja asteen kromatiinin kondensaatio [15]. Käyttämällä fluoresenssimikroskopian tunnistimme apoptoottiset solut läsnäolosta erittäin kondensoitu tai hajanaiset ytimiä. Apoptoottisia soluja laskettiin 5 eri alojen mikroskoopin avulla seuraten.

Western blot-analyysi

Yksityiskohtaiset protokolla Western blot analyysi on kuvattu menetelmässä S1. Se suoritettiin tavanomaisissa olosuhteissa käyttäen seuraavia vasta-aineita: kanin anti-humaani Reić /DKK-3-vasta-aine on esitetty laboratoriossamme [11]; kanin anti-humaani GRP78 /BiP (GRP78) (ab21685; Abcam, Cambridge, MA); kanin anti-humaani SAPK /JNK (# 9252) ja kanin anti-humaani-fosfo-SAPK /JNK (Thr183 /Tyr185; # 9251) (Cell Signaling Technology, Beverly, MA); kanin anti-humaani coxsackievirus ja adenovirus-reseptori (CAR) (HPA030411, Atlas-vasta-aineita, Tukholma, Ruotsi); ja hiiren anti-aktiini (MAB1501; Millipore, Billerica, MA). Seuraavat sekundäärisiä vasta-aineita käytettiin: vuohen anti-kani tai anti-hiiri-IgG-konjugoidulla piparjuuriperoksidaasi (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA). Havaita tiettyjä signaaleja membraanit tutkittiin käyttämällä ECL plus Western Blotting Detection Reagents (Amersham Biosciences UK Limited, Buckinghamshire, UK). Lisäksi bändi intensiteetit GRP78, CAR, ja aktiini, edustaa niiden ekspressiotasot, mitattiin käyttäen ImageQuant TL ohjelmistoa (GE Healthcare Bioscience) ja kvantifioidaan GRP78 tai CAR /aktiini-suhde.

Kasvaimen kasvu määritys vivo

A549-soluja (5 x 10

6 50 ui fosfaattipuskuroitua suolaliuosta [PBS]) sekoitettuna 50 ui matrigeelin (BD Biosciences, San Jose, CA) injektoidaan subkutaani- oikeaan kylkeen aikuisten BALB /c nu /nu-hiiriä (CLEA Japani, Tokio, Japani). Kasvaimen tilavuus laskettiin käyttäen empiirinen kaava V = 1/2 x [(lyhin halkaisija)

2 x (pisin läpimitta)]. Kun kasvaimet olivat saavuttaneet noin 50-100 mm

3, hiiret (n = 15) jaettiin satunnaisesti 3 hoitoryhmään: (a) PBS; (B) Ad-LacZ; ja (c) Ad-Reić. Virukset (1 x 10

9 pfu) 100 ui seerumia annettiin kasvaimen. Lopussa kokeissa, hiiret tapettiin 24 päivän kuluttua viruksen injektion ja kasvaimet kerättiin talteen, mitattiin ja valokuvattiin.

Tilastolliset analyysit

Kaikki tiedot analysoitiin käyttäen STATA ver.12 (STATA Corp., College Station, TX). Fisherin testiä käytettiin tarvittaessa. Jotta vertailu apoptoosin induktio välillä Ad-Reić saaneista ja Ad-LacZ-käsiteltyjen A549-soluja, Cochran-Mantel-Haenszel tilastot haettiin vertailemalla. Toistuva mittaus ANOVA sovellettiin vertailun ksenotransplantaatio NSCLC kasvainten kokoja keskuudessa PBS, Ad-LacZ ja Ad-Reić.

P

0,05 pidettiin merkittävänä. Kaikki testit olivat kaksipuolisia.

Tulokset

vaikutus Ad-Reić on NSCLC solulinjoissa

tutki esto solujen elinkykyä Ad-Reić ja MTS-määritys . 13 (52%) 25 NSCLC solulinjojen, Ad-Reić käsittely 20 MOI esti solujen elinkykyä (40% -60%: n inhibitio), kun Ad-LacZ hoito (taulukko 1, kuvio 1). Nämä solulinjat pidettiin erittäin herkkä Ad-Reić. Sen sijaan, 12-solulinjat (48%) ei ollut inhiboi Ad-Reić hoitoa 20 MOI ja pidettiin resistentit solut. OUMS-24 ei inhiboinut 20 tai 200 MOI Ad-Reić. Huomattavaa on, että Ad-Reić hoitoa 100 ja 200 MOI paransi esto solujen elävyyden (100 MOI: 15% -59% estäminen, 200 MOI: 40% -78%: n esto), verrattuna Ad-LacZ hoito (taulukko 1) . Näin ollen meidän on määritelty 20 MOI alhaisen MOI-arvon ja 200 MOI kuin korkean MOI-arvo. Vertailun, Ad-Reić käsittely suoritettiin myös ihmisen mesoteliooma solulinja 211H, jota on aiemmin raportoitu olevan Ad-Reić herkkä [14]. 211H ei inhiboinut 20 MOI mutta estyi 200 MOI Ad-Reić (taulukko 1). Tunnetut molekyylitason ominaisuudet kustakin solulinjasta on esitetty taulukossa 1. 25 NSCLC solulinjat koostui 8

EGFR

-mutant, 6

KRAS

-mutant, 1

HER4

-mutant, 1

sääntelyviranomaisten

-mutant, 1

PIK3CA

-mutant, 1

EML4-ALK

fuusio, 1

HER2

-amplified, ja 6 solulinjat ilman geenin muutoksia luettelossa. Yhdeksän 17

EGFR

-wild tyyppi solulinjat olivat herkkiä Ad-Reić. HCC827 ja sen kestävä alalinja, HCC827-GR-high2, oli samanlainen herkkyys Ad-Reić. Ei suuntaus molekyyli genotyyppi nähtiin välillä herkkä ja ei-herkkien solulinjoissa. Nämä tulokset viittaavat siihen, että vaikutus Ad-Reić ei riipu molekyylipainojakauma tunnetaan genotyypin.

inhibiitionopeudet 25 NSCLC solulinjojen transfektoitu Ad-Reić verrattuna Ad-LacZ näkyvät mustina baari 20 MOI ja valkoisen palkin 200 MOI. Kolmetoista solulinjoja yli 40%: n esto korko 20 MOI määritellään erittäin herkkä ja 12 solulinjoissa pienempi esto 20 MOI määritellään kestävä. Kaikki resistenttejä solulinjoja osoittaa yli 40%: n esto kurssi 200 MOI. Solulinjat luokitellaan 3 ryhmään perustuu GRP ja CAR ekspressiotaso seuraavasti; A-luokan (matala GRP /korkea CAR), B-luokan (matala GRP /matala CAR tai korkea GRP /korkea CAR), C-luokan (korkea GRP /matala CAR). Kaikki 8 erittäin herkkä solulinjat sisällytetty luokkaan A, ja kaikki 5 resistenttejä solulinjoja sisällytettiin luokkaan C. Sq; okasolusyöpä, AD; adenokarsinooma, LC; suuri karsinooma, ADSQ; adenosquamous karsinooma, MM; pahanlaatuinen mesoteliooma, NHF; normaaleja ihmisen fibroblasti.

Hoechst 33342 värjäys suoritettiin A549-soluja tutkia apoptoosin. Apoptoottisia soluja havaittiin Ad-Reić-käsiteltyjen A549-solut (kuvio 2a). Keskimääräinen nopeus apoptoosin oli 22%, ja se oli merkittävästi (p 0,001 Cochran-Mantel-Haenszel testi) kasvoi verrattuna ohjaus Ad-LacZ hoitoa.

(a) Apoptoosin jälkeen

in vitro

Ad-Reić kohtelun tutkittiin A549-soluja käyttämällä Hoechst 33342 värjäystä. Ylempi paneeli osoittaa selvästi apoptoottisten solujen jälkeen Ad-Reić hoitoon. Alempi paneeli esittää apoptoottisten nopeudella A549-soluja jälkeen ilmoitettu hoidon. Kaikkiaan 5 eri alojen tutkittiin mikroskoopilla määrittää apoptoottisten korko. Merkittävä ero havaittiin (* p 0,001) välillä Ad-LacZ ja Ad-Reić hoitoa. (Bar: 100 m) (b) Western blot analyysi osallistuvien proteiinien signaalitransduktion laukaisi Ad-Reić. Solut kerättiin 48 tuntia transfektion jälkeen Ad-LacZ tai Ad-Reić 20 MOI. (C) H460-soluja, jotka ovat resistenttejä adenovirustransduktiota, kerättiin 48 h transfektion jälkeen Ad-LacZ tai Ad-Reić 20, 100, ja 200 MOI.

vaikutus rekombinantti Reić /DKK-3 proteiinin NSCLC solulinjoissa tutkittiin 7 satunnaisesti valitun solulinjoja (NCI-H522, NCI-H611, NCI-H1299, NCI-H1819, NCI-H2009, PC-9, ja A549). MTS-määritys osoitti, että Reić /DKK-3-proteiinin ei vaikuttanut solujen elinkelpoisuus tutkittiin solulinjoissa, kun sitä annetaan konsentraatioalueella 1-200 ng /ml (tuloksia ei ole esitetty).

ilmentäminen GRP78 ja CAR vastauksena Ad-Reić terapia

Koska ennustavaa tekijää Ad-Reić herkkyyttä NSCLC, tutkimme ilmauksia GRP78 ja CAR; Näiden ilmaisu tilat korreloivat inhibitiota solujen elinkelpoisuuden Ad-Reić 13 solulinjoissa. Aiemmassa tutkimuksessa on todettu, että yli-ilmentyminen GRP78 esti ER-stressi, joka voi olla vastakkain korreloida vaikutus Ad-Reić. CAR ilmentyminen on tiukasti liittyy tehoa adenovirusinfektion, joka voi olla positiivinen korrelaatio vaikutus Ad-Reić. Western-blottaus suoritettiin, ja ilmentymistaso kvantitoitiin kuten on esitetty taulukossa 1 ja kuviossa 1. mediaani (alue), jossa GRP78 ja CAR ilmaisut olivat 0,24 (0,075-0,98) ja 0,60 (0,080-2,1), vastaavasti. Näiden tietojen perusteella, solut GRP78 ekspressiotaso yli 0,25 määriteltiin korkea CRP78 ilmaisu, kun taas ne, joilla on GRP78 alle 0,24 määriteltiin Low GRP78 ilme. Mitä CAR, 15 solulinjat merkittävästi korkeatasoisen CAR ilmentymisen (yli 0,50) määriteltiin korkea CAR ilmaisu, kun taas 10 solulinjat, joilla on huomattavasti alhainen CAR ilmentymisen (alle 0,20) määriteltiin Low CAR ilme. GRP78 ilmentyminen oli alhainen 8 13 Ad-Reić-herkkien solujen (62%) ja 4 12 Ad-Reić-resistenttien solujen (33%). CAR ilme oli korkea 12 13 Ad-Reić-herkkien solujen (92%) ja 3 12 Ad-Reić-resistenttien solujen (25%).

Seuraavaksi luokitellaan solun rivit kolme luokkaa perustuvat GRP78 ja CAR ilmaisun tilat; solut Low GRP78 /Korkea CAR ilmaisu luokiteltiin luokkaan A, joilla on alhainen GRP78 /Matala CAR tai Korkea GRP78 /korkea CAR ilmaisu luokiteltiin luokkaan B, ja ne, joilla korkea GRP78 /Low CAR ilmaisu luokiteltiin luokkaan C. korkeat herkkiä soluja hinnat olivat 100% A-luokan (8 ulos 8, 95% luottamusväli [CI]: 63-100), 42% Luokka B (5 pois 12, 95% CI: 15-72), ja 0% C-luokkaan (0 out of 5, 95% CI: 0-52) (taulukko 2). Luokat liittyivät merkittävästi herkkyyttä Ad-Reić hoitoa (p 0,01).

JNK ja GRP78 ilmentyminen NSCLC solulinjoissa käsitelty Ad-Reić

western blotting analyysi osoitti merkittävää ilmentymistä Reić /DKK-3-proteiinin 14 NSCLC solulinjoissa käsitelty Ad-Reić. 9 solulinjat infektoitiin 20 MOI, Ad-Reić hoito johti fosforylaation JNK ja ylös-säätely GRP78 (kuvio 2b). Muissa 8 solulinjat, jotka olivat suhteellisen resistenttejä Ad-Reić, aktivointi JNK ja GRP78 havaittiin korkeampi MOI-arvoja (100 ja 200 MOI) (kuvio 2c).

vaikutus Ad-Reić on NSCLC kasvaimia ksenotransplantaatiomenettelyssä malli

Tutkimme vaikutus Ad-Reić kasvuun A549

in vivo

. Viikon kuluttua transplantaation, kun kasvaimen tilavuus saavutti 50-100 mm

3, 1 x 10

9 plakkia muodostavaa yksikköä Ad-Reić tai Ad-LacZ 100 ul: ssa PBS: ää tai 100 ui pelkkää PBS: ää oli injektoitiin kasvaimen. Kasvaimet kasvoivat progressiivisesti PBS ja Ad-LacZ hoitoryhmissä aikana myöhemmin 24 päivän tarkkailujakson aikana. Sen sijaan kasvaimen kasvua Ad-Reić hoitoryhmässä oli merkitsevästi (p 0,001 toistuvasti mittauksen ANOVA) tukahdutetaan tarkkailujakson aikana (kuvio 3a, b).

(a) keskimääräinen tilavuus ihonalainen ksenograftikasvaimissa laskettiin 5 hiirtä kussakin ryhmässä. Merkittävä ero havaittiin tulosten välinen Ad-Reić ja Ad-LacZ hoito (* p 0,001 toistuvasti mittaus ANOVA). (B) Ulkonäkö kasvainten aikaan uhrata hoidon jälkeen PBS, Ad-LacZ ja Ad-Reić.

Keskustelu

Tässä tutkimuksessa olemme huomanneet, että Ad-Reić oli suoraan tehokas yli puolet NSCLC solulinjoja tutkittiin, riippumaton sen tunnettujen kuljettajan muutoksiin kuten

EGFR

ja

KRAS

mutaatioita. Eläimen ksenograftimallissa osoitti myös terapeuttinen vaikutus Ad-Reić. Anti-kasvain vaikutus Ad-Reić riippuu ER-stressi-välitteisen JNK aktivaation ladataan ylituotanto Reić /DKK-3-proteiinin, jolloin apoptoosin [14], [20]. Aktivointi JNK, joka on olennainen askel induktio ER stressiä ja apoptoosia Ad-Reić, havaittiin 20 MOI NSCLC solulinjoissa. Toisaalta, kasvaimen vastainen vaikutus rekombinantti Reić /DKK-3-proteiinia ei havaittu, kuten muun tyyppisiä syöpiä, jotka olivat aiemmin tutkittu. Alunperin Reić /DKK-3 tunnistettiin eritysproteiinia ja oletettiin kohdistamaan fysiologisen toiminnon, mutta sen solun pinnan reseptorin ja sen rooli eritysproteiinia ei ole tunnistettu.

määritellään 20 MOI kuin alhainen MOI-arvon ja 200 MOI kuin korkean MOI-arvo, koska normaalissa ihmisen fibroblastisolulinjassa OUMS-24 ei inhiboinut 20 tai 200 MOI Ad-Reić, kun taas pahanlaatuisia solulinjoja estetty, kun MOI-arvo nostettiin 100 ja 200 MOI solulinjoissa, joissa Ad-Reić oli tehoton 20 MOI. NSCLC, Ad-Reić oli tehokas alhaisella MOI-arvo yli puoli solulinjat, jotka testattiin. Ottaen huomioon, minkä seurauksena 211H estyi vain korkealla MOI-arvo, Ad-Reić saattavat olla tehokkaampia NSCLC kuin mesoteliooma.

Patient valinta perustuu molekyylitason ominaisuudet syöpäsolujen on tärkeä teema maksimoimiseksi terapeuttinen hyöty ja minimoida haitallisia vaikutuksia. Tätä tarkoitusta varten olemme keskittyneet GRP78 ilmaisun ja CAR ekspressiotasoja. GRP78 on jäsen Hsp70 perhe, joka toimii ER stressi-signalointi säädin [21]. Aiemmassa tutkimuksessa on osoitettu, että yli-ilmentyminen GRP78 resistenssin monenlaisia ​​kemoterapeuttisten aineiden erilaisten solujen [22]. Osoitimme myös, että hankittu resistenssi klooni PC-3-solujen Ad-Reić perustettu toistuvan altistumisen Ad-Reić osoitti korkean ilmentymistason GRP78, verrattuna vanhempien PC-3-solujen [13]. Teoriassa Ad-Reić pitäisi olla tehokas kasvainsoluja määritelty A- ja ole yhtä tehokkaita niille määritellään luokan C. Vaikka herkkien solujen B-luokan tunnistettiin, kaikki 8 solut A-luokan vastasi Ad-Reić hoitoa. Nämä tulokset viittaavat siihen, että ilmaus statukset GRP78 ja CAR kasvaimissa voisi olla hyödyllinen biomarkkereita räätälöityjä Ad-Reić hoito NSCLC kun lisävahvistusta tarvitaan suuri skaalattu tutkimus käyttäen erilaisia ​​solulinjoja.

hiljattain aihe keuhkosyövän hoidossa, EGFR-TKI on osoitettu olevan tehokas hoito

EGFR

-mutant NSCLCs. Kuitenkin kehittynyt resistenssi EGFR-TKI jälkeen TKI hoito on ongelma, joka on voitettava. Nykyisessä tutkimuksessa tuloksemme osoittivat, että vaikutus Ad-Reić vastaan ​​hankittu EGFR-TKI-resistenttien solujen oli sama kuin vastaan ​​vanhempien soluja, mikä viittaa siihen, että Ad-Reić voi olla hyödyllistä hankinnan jälkeen vastustuskyvyn EGFR-TKI.

Vaikka adenovirusvektorit kuljettavat asianmukaista tuumorisuppressorigeeneille, kuten Reić /DKK-3, on suuret mahdollisuudet syövän geeniterapia, niillä ei ole kohdistaa spesifisyyttä ja siten se voi tarttua myös normaaleja soluja läheisyydessä syöpäsolujen . Kirjoittajat raportoitu, että infektio ihmisen normaalien fibroblastien (NHF) Ad-Reić ei aiheuttanut apoptoosin NHF itsestään, vaan aiheuttama tuotannon interleukiini (IL) -7. Kun Ad-Reić-tartunnan NHF sekoitettiin käsittelemättömien syöpäsolujen ja seos istutetaan hiiriin, kasvun syöpäsolujen merkittävästi tukahdutti, mikä viittaa siihen, epäsuora kasvainta estävä vaikutus Ad-Reić välittävät IL-7 [20] . Nämä havainnot osoittavat, että mis kohdistettujen infektio syövän stroomasoluilla Ad-Reić aktivoi immuunijärjestelmää kautta IL-7. Lisäksi kirjoittajat raportoitu, että Reić /DKK-3-proteiinin pelaajan sytokiinin kaltainen rooli monosyytti erilaistumista dendritic-cell-kaltaisia ​​ominaisuuksia

in vitro

ja että tunkeutumisen CD11c- ja CD8-positiivisten (dendriittisen ja tappaja-T-solujen markkereita, vastaavasti) solujen havaittiin sisällä käsitelty kasvaimet

in vivo

. Kokeessa käyttäen ortotooppisten eturauhassyövän malli ennalta vahvistettujen keuhkometastaasitestissä, metastaasien lukumäärän keuhkokasvaimet merkittävästi vähentynyt injektion jälkeen Ad-Reić on primaarikasvaimen sivuston lisäksi kasvun eston ortotooppisten eturauhasen kasvaimia, mikä viittaa siihen, että syöpälääkkeen immuuni ylössäätöä Ad-Reić hoito primaarikasvaimen sivustot laukaisi antituumorivaikutuksia jopa kaukaisia ​​kasvaimen sivustolla [16]. Nämä seikat viittaavat vahvasti siihen, että Reić /DKK-3 esittää epäsuoran kasvaimen vastaisen vaikutuksen kautta anti-kasvain immuunijärjestelmä, joka on tärkeä tekijä metastaattisen taudin. Koska Ad-Reić on sekä suoria että epäsuoria vaikutuksia syövän hoidossa, se voi tulla voimakas terapeuttinen vaihtoehto kuin ”yhden luoti, kahden aseet” syöpälääkkeen erityisesti NSCLCs, joka usein etäispesäkkeitä muihin elimiin.

suhteen kliinisessä käytössä, koska tiedot viittaavat siihen, että CAR ja GRP78 ilmaisun tiloja kasvainsoluissa ennustaa reagointikykyä Ad-Reić hoito, Ad-Reić hoito olisi välillä suorittaa potilaille, jotka luokitellaan korkean riskiryhmän alussa vaihe hoidon pieniannoksisen Ad-Reić. Potilaille, joiden kasvainsolujen paljastaa väli- tai tehottomia ja pieniannoksisen Ad-Reić, se olisi loppuvaiheessa niiden hoitoa suurella annoksella Ad-Reić. Näille potilaille, kustannustehokkuus hoitoon ja kliinisten tulosten tulee harkita huolellisesti. Mitä hallinnon strategia, paikallishallinto ehkä suotavaa sijaan systeemistä antamista minimoimaan haitallisia vaikutuksia kliinisissä tilanteissa. Olemme aiemmin vahvistettu hiirimallissa että Ad-Reić voitaisiin laajalti elimissä jälkeen kasvaimensisäisiä paikallishallintoa, ja paikallinen hallinto oli tehokas, ei vain suoraan vaan myös välillisesti immuunijärjestelmää vaikutus [16], [23]. Lisäksi intrapleural paikallishallinto voisi olla toinen hallinnon strategia joilla on vakava Pleuraeffuusiot. On raportoitu, että intrapleural anto adenoviruksen välittämä geeniterapia on hyödyllinen lähestymistapa sukupolven anti-kasvain immuunivasteita pahanlaatuinen mesoteliooma ja metastaattisen keuhkopussin nestekertymä useissa kliinisissä tutkimuksissa [24], [25].

Yhteenvetona olemme osoittaneet, että Ad-Reić aiheuttama JNK aktivaation ja myöhemmät apoptoosin NSCLC soluissa riippumatta tunnettujen molekyylien muutoksia tai herkkyys EGFR-TKI. Tämä tutkimus viittaa siihen, että Ad-Reić on terapeuttista potentiaalia NSCLC, ja ilmaisu statukset GRP78 ja CAR voi olla ennustaja Ad-Reić terapia.

tukeminen Information

Kuva S1.

heatmap kuva mRNA ilmentymisen

Reić /DKK-3

geeni. MRNA ekspressiotaso

Reić /DKK-3

geeni saatiin UCSC Cancer Genome luokkaa, joka on vapaasti saatavilla julkista tietokantaa (https://genome-cancer.ucsc.edu/) (me ladannut data 16. heinäkuuta 2013), osoitti, että

Reić /DKK-3

-geenin ilmentyminen oli vähennetty useimmissa tutkituissa näytteissä sekä (a) keuhkojen adenokarsinoomat ja (b) okasolukarsinoomia, verrattuna normaaliin keuhkojen kudoksiin.

doi: 10,1371 /journal.pone.0087900.s001

(PDF) B Menetelmä S1.

tukeminen tietoa solulinjojen ja Western blot-analyysi.

doi: 10,1371 /journal.pone.0087900.s002

(DOC) B