Krooninen sairaus

tiivistelmä

MikroRNA (miRNA) ovat lyhyitä koodaamattomalla RNA säätimiä, jotka ohjaavat geenien ilmentymisen lähinnä transkription jälkeisen hiljentäminen. Olemme aiemmin tunnistettu

miR-205

in allekirjoituksen ihmisen kohdunkaulansyövän käyttäen syvä sekvensointia lähestymistapaa. Tässä tutkimuksessa olemme vahvistaneet, että

miR-205

ilmentyminen oli usein suurempi ihmisen kohdunkaulansyövän kuin niiden vastaaviin normaaleihin kudosnäytteitä. Toiminnallisesti, osoitamme, että

miR-205

edistää solujen proliferaatio ja migraatio ihmisen kohdunkaulan syöpäsoluja. Edelleen ymmärtää biologisia rooleja

miR-205

teimme

in vivo

silloitus ja Argonaute 2 immunosaostus miRNA ribonukleoproteiini- komplekseja seurasi mikrosiruanalyysillä (CLIP-Chip) tunnistaa sen potentiaalia mRNA tavoitteita. Soveltamalla CLIP-Chip vahvistus- ja menettämisestä toiminnon kokeita tunnistimme joukko selostukset mahdollisina kohteina

miR-205

. Useat tavoitteet toiminnallisesti mukana solujen proliferaatio ja migraatio. Kaksi heistä, Cyr61 ja CTGF, olivat vielä validoitu Western blot analyysi ja kvantifiointi mRNA rikastumista Ago2 immunosaostumissa käyttäen qRT-PCR. Lisäksi sekä

Cyr61

ja

CTGF

oli vaimentua kohdunkaulan syövän kudoksissa. Yhteenvetona havaintomme osoittavat uusia toiminnallisia rooleja ja tavoitteita

miR-205

ihmisen kohdunkaulan syöpä, joka voi tarjota uusia oivalluksia sen roolista kohdunkaulan syövän synnyn ja sen mahdollisia arvoa kliininen diagnoosi.

Citation: Xie H, Zhao Y, Caramuta S, Larsson C, Lui WO (2012)

miR-205

Expression edistää solujen proliferaatio ja migraatio Ihmisen kohdunkaulan syövän solut. PLoS ONE 7 (10): e46990. doi: 10,1371 /journal.pone.0046990

Editor: Siu Tim Cheung, University of Hong Kong, Hongkong

vastaanotettu: 13 huhtikuu 2012; Hyväksytty: 07 syyskuu 2012; Julkaistu: 03 lokakuu 2012

Copyright: © Xie et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat Ruotsin Research Council (523-2009-3517, 521-2010-3518); Åke Olsson säätiö Hematologinen tutkimus; Ruotsin Cancer Foundation; Åke Wiberg säätiö; Kuningas Kustaa V Juhlarahasto; Cancer Society Tukholmassa; Axel ja Signe Lagerman n lahjoitus Foundation; Karolinska Institutet ja Tukholman läänin maakäräjät. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

kohdunkaulan syöpä, kolmanneksi yleisin syöpä naisilla maailmanlaajuisesti [1], on vahvasti liittyy infektioon ja johtuvat muutokset kohdunkaulan solujen erityisillä ihmisen papilloomaviruksen (HPV) alatyyppien [2]. Se, että kohdunkaulan syöpä kehittyy hyvin tunnustettu premaligneja lomakkeita, tarjoaa tärkeän mahdollisuuden varhaistoteamiseen ja ennaltaehkäisyyn. Nykyään tällaiset ensisijainen seulontaan kuuluu Sytologisten analyysit ja HPV tunnistaminen. Nämä tutkimukset eivät voi luotettavasti erottaa vaurioita invasiivisia potentiaalin vauriot, jotka spontaanisti taantua. Siksi kehittäminen vankempi markkereita sairauden etenemisen olisi arvokas täydentää nykyistä seulontamenetelmiä.

MikroRNA (miRNA) ovat lyhyitä ei-koodaavat RNA: t (~22-nukleotidia), jotka yleensä ohjaavat geenin ilmentymistä asemalla -transcriptional tasolla mRNA: n hajoamisen ja /tai translaation tukahduttaminen [3]. Nämä pienet molekyylit ovat osoittautuneet tärkeitä rooleja laaja fysiologisten ja patologisten prosessien, kuten syövän kehittymisen ja etenemisen. Me ja muut, ovat aiemmin tunnistettu muuttunut miRNA ilmaisun allekirjoitukset ihmisen kohdunkaulansyövän [4] – [10]. Useat näistä miRNA ovat toistuvasti raportoitu väärin säädellystä kohdunkaulan syövän (

esim

.

miR-143

,

miR 145

,

miR-21

ja

miR-205

). Muutamat ovat myös toiminnallisesti tunnettu ihmisen kohdunkaulan syöpäsoluja. Niistä,

miR-143

,

miR-145

ja

miR-34a

on osoitettu estävän solujen lisääntymistä, ja

miR-146a

ja

miR-21

lisätä solujen kasvuun [8], [10], [11].

miR-23b

hiljattain todettu tukahduttaa ilmaisun urokinaasin plasminogeeniaktivaattorin (uPA) ja aiheuttaa soluvaelluksen ihmisen kohdunkaulansyövän solut [12]. Yhdessä nämä havainnot viittaavat siihen, että säädeltyyn miRNA on toiminnallinen rooli kohdunkaulan syövän kehitykseen ja voivat jäädä soveltaa diagnostisia työkaluja.

Tässä tutkimuksessa selvitimme toiminnallista roolia

miR-205

ihmisen kohdunkaulan syövän. Tämä miRNA oli yksi merkittävimmistä miRNA käyttää kohdunkaulan syövän luokan ennuste on merkittävästi yli-ilmentynyt kohdunkaulan syövän näytteissä verrattuna vastaaviin normaaleihin kollegansa [9]. Lisääntynyt ilmentyminen

miR-205

on havaittu myös kohdun limakalvon adenokarsinooma [13], pään ja kaulan okasolusyöpä solulinjat [14], levyepiteelisyöpä keuhkosyöpä [15] ja munasarjasyöpä [16]. Sitä vastoin vähentää ilmentymistä

miR-205

on raportoitu melanooma [17] ja syövät, ruokatorven [18], munuaisen [19], virtsarakon [20], [21], rintojen [22] ja eturauhasen [23].

edellä esitetyn perusteella tutkimuksissa

miR-205

voi toimia onkogeenin tai kasvainsuppressorigeenin riippuen solujen yhteyksissä. Yhdenmukainen sen kaksoisrooli, useat tutkimukset ovat osoittaneet sen kasvain edistää ja tukahduttava rooleja eri syöpäsolun linjat. Esimerkkejä,

miR-205

on osoitettu tukahduttaa solumigraatio /invaasio epiteelin-to-mesenkymaalitransitioon sekä ihmisen eturauhas- ja rintasyövän solujen [23], [24], sekä kohdistaa

HER3-

tyrosiinikinaasireseptori rintasyöpäsoluissa [22]. Tukeakseen onkogeenisessä toiminnon

miR-205

havaittiin kohdistaa

SHIP2

varten Akt selviytymisen signaloinnin pään ja kaulan okasolusyöpä soluihin [14]. Monimutkaisuuden vuoksi sen toiminnallisuutta, se olisi mielenkiintoista tutkia toiminnalliset roolit

miR-205

kohdunkaulan syövän kehittymisessä.

Ohessa kuvataan toiminnalliset seuraukset

asennuspalveli- 205

sääntelyn ihmisen kohdunkaulan syöpäsoluja. Vuonna vahvistus- ja menettämisestä toiminnon kokeissa osoitamme, että

miR-205

säätelee solujen lisääntymistä ja muuttoliike ihmisen kohdunkaulan syöpäsoluja. Olemme edelleen määritetty joukko otaksutun

miR-205

tavoitteet käyttäen biokemiallinen lähestymistapaa. Useat näistä Ehdokaskohteiden funktionaalisesti liittyy solujen proliferaatio ja migraatio. Kaksi mahdollisten

miR-205

mRNA tavoitteet edelleen validoitu soluviljelmäkokeita. Tutkimuksen tuloksiin sisältyy tärkeä johtoa edelleen oivalluksia toiminnallista roolia

miR-205

ihmisen kohdunkaulan syövän kehitykseen.

Tulokset

miR-205

Expression in Human kohdunkaulan syöpä näytteitä

aiemmin määritetty joukko miRNA jotka erottaisivat kohdunkaulansyöpä näytteitä normaalista kollegansa käyttäen sekvensointia perustuvaa miRNA profilointi lähestymistapa [9]. Siinä luokittelija,

miR-205

oli korkeimmat pisteet, mikä viittaa tärkeä tehtävä kohdunkaulan syövän kehitykseen. Vahvista muuttuneen ilmentymisen taso

miR-205

kohdunkaulan syövän, mittasimme

miR-205

ilmentyminen reaaliaikaisella kvantitatiivisella käänteistranskriptio-PCR (qRT-PCR) 27 pareittain kohdunkaulan syövän ja normaalia kudosta. Yhteisymmärryksessä sekvensointilaatuinen pohjainen tuloksiin,

miR-205

havaittiin merkittävästi yli-ilmentyy ihmisen kohdunkaulansyövän verrattuna niiden normaaliin kollegansa

P

0,001; Kuvio 1A). 19 tapauksessa (-70%) ilmentymistä

miR-205

voimakkaasti lisääntynyt kasvain näytteissä verrattuna niiden normaaliin kollegansa; kun taas loput 8 tapausta, syöpä ja normaali näytteet omasivat alhainen mutta vertailukelpoinen ekspressiotasot

miR-205

(kuvio 1 B).

(A)

miR-205

ilmentyminen oli merkitsevästi suurempi kasvaimia kuin normaaleissa näytteissä (

P

0,001, parittainen t-testi). (B) suhteellisesti suurempi ilmentymä

miR-205

löydettiin suurin osa kasvainnäytteestä verrattuna niiden normaaliin kollegansa. (C) korkea ekspressio

miR-205

havaittiin ME-180, C4I ja CaSki-solujen, ja alhainen tai havaita ekspressiotaso havaittiin HeLa, SW756, SiHa ja C33A-solut. Esitetyt tiedot edustavat keskiarvoa kolmen erillisen kokeen kanssa kolmen rinnakkaisen. Virhepylväät edustavat standardipoikkeamaa keskiarvosta.

toiminnallinen seuraukset

miR-205

asetuksen Human kohdunkaulan syövän solut

toiminnallinen seuraukset muuttuneen

miR-205

ilmentyminen tutkittiin kohdunkaulan syövän solulinjoissa korkea tai alhainen endogeenisen

miR-205

. Tätä varten

miR-205

kvantitoitiin ihmisen kohdunkaulan syövän solulinjoissa qRT-PCR. Niistä 7 solulinjat analysoitu,

miR-205

todettiin erittäin ilmaistu ME-180, C4I ja CaSki, kun taas heikkoa ilmentymistä /tuskin havaittavia määriä havaittiin HeLa, SW756, SiHa ja C33A (kuvio 1 C) . Seuraavaksi transfektoitu CaSki-solujen kanssa miRNA-inhibiittorin (Anti-miR-205), ja HeLa sekä SW756-solujen kanssa miRNA matkivat (Pre-miR-205), ja määritetään vaikutus

miR-205

hiljentäminen tai ilmentymisen vaikutus soluproliferaatioon, apoptoosin ja muuttoliike. Negatiivisina kontrolleina käytimme miRNA esiaste tai estäjällä ilman sekvenssihomologia tahansa ihmisen selostukset.

Havaitsimme, että esto

miR-205

ilmentymisen CaSki- soluissa johti merkittävään vähentää solujen kasvu (-15%;

P

0,001), kun taas yliekspressio

miR-205

HeLa ja SW756-soluissa johti merkittävään kasvuun solujen lisääntymistä (-20% ja ~11% vastaavasti;

P

0,05), verrattuna vastaaviin negatiivisiin kontrolleihin (kuvio 2A). Yhdessä sekä vahvistus- ja menettämisestä toiminnon kokeissa johdonmukaisesti tukenut vaikutuksia soluproliferaatioon.

Vaikutukset solujen vaeltamiseen osoitettiin käyttäen TranswellTM ja haavan paranemista muuttoliike määrityksiä. Käyttäen TranswellTM määritystä, osoitimme, että solujen vaeltaminen oli merkittävästi parannettu

miR-205

yliekspressio sekä HeLa ja SW756 solulinjoissa (-20% ja -30%, vastaavasti;

P

100-kertainen,

P

0,01) ja

miR-30a-5p

( 10 kertainen,

P

0,01) anti-Ago2 IP verrattuna anti-IgG IP tai syöttöpainikkeet (kuva S2).

meidän CLIP-Chip analyysi, me ulkopuolelle yksi replikaattiketjun mikrosirut päässä

miR-205

yliekspressio kokeita heikon hybridisaatiosignaaleista. Suodatuksen jälkeen tausta signaaleja, teimme ilman valvontaa hierarkkinen klusterointi viidestä mikrosiruja perustuu niiden mRNA ilmaisun kuvioita. Olemme keskittyneet kuuden klustereita (mukaan lukien 270 selostukset /252 selityksin geenejä), jossa ilmaisu kuviot näkyvät rikastumisen

miR-205

yli-ilmentymisen ja ehtyminen

miR-205

tukahduttaminen kokeita (kuva S3 ja taulukko S1). Suoritimme toiminnallinen merkintä on CLIP-Chip tavoitteet käyttäen GENECODIS ohjelmaa. Useat toiminnalliset ryhmät olivat merkittävästi rikastettu (

P

0,05), kuten solusykliä, virus- lisääntymiseen, DNA korjaus, apoptoosin, solujen lisääntymisen ja muuttoliike (taulukko 1). Yksityiskohtainen luettelo funktionaalisten merkinnät on esitetty taulukossa S2. Niistä 75 Ehdokaskohteiden lueteltu taulukossa 1, 71 oli myös ennustettu

miR-205

tavoitteita ainakin yhdessä ennustaminen ohjelma (taulukko S3), ja neljästä tavoitteesta (

BOD1

,

SEPT2

,

AAGAB

ja

DCAF13

) ei ennustettu mitään ohjelmia käytettiin tässä tutkimuksessa.

Yksi ehdokas kohdegeenien, löysimme

Cyr61

ja

CTGF

liittyivät sekä solujen lisääntymistä ja muuttoliike (taulukko 1), ja se on johdonmukainen toiminnallinen seurauksia tässä tutkimuksessa havaitut. Edelleen ymmärtää ilmaisun suhdetta

miR-205

ja

Cyr61

tai

CTGF

, määritimme ilmaus

Cyr61

ja

CTGF

28 pareittain kohdunkaulan syövän ja normaaleissa kudoksissa käyttäen qRT-PCR. Tuloksemme paljasti huomattavasti alhaisempi ilmentymistä sekä

Cyr61

ja

CTGF

ihmisen kohdunkaulansyövän näytteitä verrattuna normaalia vastineet (

P

= 0,002 ja

P

0,001, vastaavasti, kuvio 3A-C). Mielenkiintoista, ilmentymiskuviot näiden kahden valitun geeniä korreloi käänteisesti

miR-205

lauseke (

Cyr61

,

Corr

= -0,241,

P

= 0,091;

CTGF

,

Corr

= -0,304,

P

= 0,032; Kuva 3D). Havaitut käänteinen ilmaisu kuvioita yhdessä ennustettu

miR-205

sitoutumiskohtia (taulukko S3, kuva S4), lisänäyttöä varten

Cyr61

ja

CTGF

kuin

miR-205

tavoitteita.

(A) solujen lisääntyminen arvioitiin ihmisen kohdunkaulansyövän solulinjoissa transfektoitu

miR-205

matkivat (Pre-miR-205), estäjä (Anti-miR-205) tai vastaava negatiivinen kontrolli (Anti-miR Neg ohjaus tai Pre-miR neg ohjaus) käyttäen WST-1 määrityksessä. Suhteellinen solujen kasvua normalisoitiin sen valvontaluetteloihinsa käsiteltyjä soluja. (B) Kuvaajat osoittavat suhteellinen solujen vaeltamiseen sekä

miR-205

esto ja yli-ilmentyminen kokeiluja arvioituna TranswellTM migraatiokokeessa. (C) Kuvat ovat solumigraation arvioitiin haavan paranemista määrityksessä. Scratch haavat tehtiin konfluentteja yksikerrosviljelyissä kuluttua 48 h transfektion. Kuvia haavan otettiin 0, 18 ja 24 tunnin kuluttua haavan (vasen paneeli). Prosenttiosuus haavan normalisoitiin haavan alueella 0 h (oikea paneeli). Data esitetään edustavat keskiarvoa kolmesta itsenäisestä kokeesta. Virhepylväät edustavat standardipoikkeamaa keskiarvosta. Kaikki vertailut arvioitiin käyttäen t-testiä. *

P

0,05; **

P

0,01; ***

P

0,001;

ns

= ei merkitsevä.

suhteellisesti vähemmän ilmaus

Cyr61

(A) ja

CTGF

(B) havaittiin useimmissa kasvaimen näytteistä verrattuna niiden normaaliin kollegansa (n = 28). (C) ilmentymistä

Cyr61

ja

CTGF

oli merkitsevästi pienempi kasvaimia kuin normaali näytteet (

P

= 0,002 ja

P

0,05 katsottiin tilastollisesti merkitsevä.

validointi

Cyr61

ja

CTGF

kuin

miR-205

kohdegeenien

Voit selvittää

Cyr61

ja

CTGF

voisi olla kohteina

miR-205

ihmisen kohdunkaulan syövän solujen, haimme kaksi erilaista lähestymistapoja. Ensin arvioitiin proteiinin ekspressiotasot Cyr61 ja CTGF sekä

miR-205

-overexpressing ja -depleted kohdunkaulan syövän soluihin käyttäen Western blot-analyysi. Kuten kuvassa 4 (A ja B),

miR-205

yli-ilmentyminen HeLa-soluissa johti vähentynyt merkittävästi Cyr61 proteiinin ilmentymisen (-30%,

P

= 0,045) . Esto endogeenisen

miR-205

ilmentymisen CaSki- soluissa lisäsi merkittävästi Cyr61 proteiinin taso (-15%,

P

= 0,016). Sillä CTGF, havaitsimme hieman pienempi tai suurempi (mutta ei tilastollisesti merkitsevä) proteiinin ilmentymistä

miR-205

-overexpressing tai -depleted soluissa, vastaavasti. Todennäköinen selitys on, että CTGF voidaan säädellä useita miRNA tai tekijöitä, ja moduloiva

miR-205

ilmaisu yksinään ei riitä tuottaa merkittäviä muutoksia CTGF ekspressiotaso.

(A) tyypillinen Western blot, joka osoittaa proteiinin ekspressiotasot Cyr61 ja CTGF: llä transfektoiduissa soluissa

miR-205

matkivat,

miR-205

estäjä, tai vastaava hajotus- ja mock transfektion valvontaa. (B) Cyr61 -proteiiniekspressio merkittävästi tukahdutettu

miR-205

-overexpressing (käsitelty Pre-miR-205) solujen ja merkittävästi lisääntynyt

miR-205

-depleting (käsitelty Anti -miR-205) soluja verrattuna niiden negatiivisiin kontrolleihin. CTGF-proteiinin ilmentyminen on hieman tukahdutettu HeLa-soluissa käsiteltiin Pre-miR-205, ja hieman lisääntynyt CaSki soluissa, joita käsiteltiin anti-miR-205, mutta vaikutus ei ollut tilastollisesti merkitsevä. Data esitetään edustavat keskiarvoa vähintään neljän itsenäisen kokeen. qRT-PCR-analyysi

Cyr61

(C) ja

CTGF

(D) mRNA: n Ago2-immunosaostettiin RNA: t

miR-205

-overexpressing tai -depleted soluja verrattuna mock-transfektiosta ohjaus. Suhteellinen ilmentymistaso yksittäisten mRNA: iden normalisoitiin

miR-21

ilmaisu (kuten endogeeninen ohjaus Ago2 IP RNA). Kertainen muutos laskettiin jakamalla normalisoidut ilmentymisen arvot Ago2-immunoprecipiated näytteiden normalisoidut ilmentymisen arvot sen ottoihin näytteitä. Data esitetään edustavat keskiarvoa vähintään kolmen itsenäisen kokeen. Virhepylväät edustavat standardipoikkeamaa keskiarvosta. Kaikki vertailut arvioitiin käyttämällä

t

-testi. *

P

0,05; **

P

0,01; ***

P

0,001;

ns

= ei merkitsevä.

Toisessa lähestymistavassa me määrällisesti

Cyr61

ja

CTGF

mRNA Ago2-immu- mRNA: t molemmissa

miR-205

-overexpressing ja köyhdytettyä soluista käyttäen qRT-PCR, ja verrattiin niiden tasoa valetransfektoidun valvontaa. Tämä koe perustuu siihen oletukseen, että miRNA ja niiden mRNA: n tavoitteet fysikaalisesti liittyvät Ago2 sisältävän proteiini-kompleksin. Siksi odotimme rikastumista kohde- mRNA

miR-205

yli-ilmentäviä soluja tai ehtyminen tavoitteiden solujen

miR-205

esto. Todellakin, havaitsimme merkittävää rikastusta on

Cyr61

(

P

= 0,050) ja

CTGF

(

P

= 0,007) mRNA: iden HeLa-soluissa yliekspressioon on

miR-205

, ja heikentämistä molempien transkriptien CaSki solujen

miR-205

esto (

P

0,001 molempien tavoitteiden, kuvio 4C ja 4D) . Nämä tulokset viittaavat siihen, että sekä

Cyr61

ja

CTGF

ovat tavoitteita

miR-205

ihmisen kohdunkaulan syöpäsoluja.

Keskustelu

havainnot lisääntynyt tai vähentynyt ilmentyminen

miR-205

eri kasvaintyypeissä viittaa siihen, että

miR-205

voi olla eri toimintoja, syövän kehittymisessä riippuen solutyypistä mukana. Tämän mukaisesti käsite, aiemmat tutkimukset ovat osoittaneet sen tuumorisuppressiogeeneksi toiminta sekä rinta- ja eturauhassyövän solut [22] – [24], ja sen kasvaimen edistämisen toiminta pään ja kaulan okasolusyöpä soluihin [14]. Tässä työssä olemme edelleen tutkitaan sen toiminnallinen seurauksista ja tavoitteet ihmisen kohdunkaulan syöpäsoluja.

miR-205

Säätelee Cell Proliferation ja Migration Human kohdunkaulan syövän solut

Täällä , ensin varmistettiin qRT-PCR, että

miR-205

on yliekspressoituvat merkittävästi kohdunkaulan syövän näytteissä verrattuna niiden normaaliin kollegansa. Tulos on yhtäpitävä aiempien sekvensoimalla perustuu havaintojen [9], ja jossa mikrosiru ilmoittamat tiedot Wang et al. [8]. Koska havaittu lisääntyneen ilmentymisen

miR-205

kohdunkaulan syövän kudoksissa, me tutki tarkemmin toiminnalliset seuraukset

miR-205

sääntelyn ihmisen kohdunkaulan syöpäsoluja. Molemmissa

miR-205

-overexpressing (HeLa ja SW756), havaitsimme merkittäviä vaikutuksia soluproliferaatioon ja muuttoliike. Sen jälkeen

miR-205

eston CaSki- soluissa, leviämisen väheni huomattavasti, mutta vaikutus solujen vaeltamiseen se julkistettiin vasta vuonna haavan paranemista määritys muttei TranswellTM migraatiokokeessa. Yksi mahdollinen syy tähän ristiriita on, että solujen vaeltaminen riippuu eri tekijöistä vastaavissa määrityksissä. Solu muuttoliike, joka tapahtuu haavan paranemista riippuu soluväliainekonstruktissa vuorovaikutus. Kuitenkin Transwell määrityksessä solut valmistetaan ensin yksittäiset solut suspension, joka häiritsee solu-solu- ja solu-matriisi vuorovaikutuksia. Lisäksi soluvaelluksen Transwell määrityksessä voi riippua kemotaktinen kaltevuus, joka ei ole käytettävissä haavan paranemista määrityksessä.

Vaikutukset solujen proliferaatio ja migraatio samanlaisia ​​kuin tässä ihmisen kohdunkaulansyövän on myös raportoitu muissa solutyypeissä. Esimerkiksi

miR-205

yliekspressio lisäsi soluproliferaatiota hiiren maitorauhasen epiteelisolujen esisolut [25] ja soluvaelluksen ihmisen keratinosyyteissä [26]. Sitä vastoin lisääntynyt ilmentyminen

miR-205

havaittiin tukahduttaa soluproliferaatiota melanooma [17] ja rintasyövän solujen [27], samoin kuin solujen vaeltamiseen eri syöpäsolulinjojen, mukaan lukien SK- LU-1 pienisoluinen keuhkosyöpä [28], U87 glioblastooma [28] ja A498 munuaissyöpä [19]. Yhdessä nämä havainnot tukevat edelleen kaksitoiminen

miR-205

tuumorisuppressorina tai onkogeenin.

Cyr61

ja

CTGF

kuin Novel kohderyhmä

miR-205

Koska sen toiminnallisen monimutkaisuuden, haimme biokemiallinen lähestymistapa (CLIP-Chip) tunnistamiseksi

miR-205-

tavoite vuorovaikutusta

in vivo

. Tätä lähestymistapaa käyttäen tunnistimme joukko

miR-205

tavoitteet sekä vahvistus- ja menettämisestä toiminnon kokeita. Näistä useat ovat toiminnallisesti liittyvät soluproliferaatioon ja muuttoliike; joka on yhdenmukainen toiminnalliset seuraukset havaittu tässä tutkimuksessa. Kaksi kohdegeenien,

Cyr61

ja

CTGF

, oli vielä validoitu proteiinin ja /tai RNA-tasot. Kuitenkin niiden tarkka vuorovaikutus sivuston (t) on edelleen määräytyy lusiferaasireportterilla määrityksiä. Tässä tutkimuksessa emme suorita Cyr61 ja CTGF eston kohdunkaulan syövän solujen, on mahdollista, että muut suora tavoite (s) osallistuu

miR-205

välittämää vaikutuksia solun proliferaatio ja migraatio. Silti nämä geenit oli huomattavasti pienempi ilmentyminen kohdunkaulan syövän näytteissä kuin normaalia kollegansa, mikä viittaa siihen, että ne voivat olla tärkeässä asemassa kohdunkaulan syövän syntymistä.

Cyr61 ja CTGF proteiinit ovat jäseniä kysteiinirikkaan 61 /sidekudoksen kasvua tekijä /nefroblastooma (CCN) perheen kasvua säätävät. Nämä proteiinit pelata erilaisia ​​rooleja monissa solun toiminnoissa, kuten kehitys-, solujen lisääntymistä, tarttuvuus, muuttoliike, angiogeneesi ja kasvaimen kehittymisen [29]. CCNs ovat poikkeavasti ilmaistaan ​​monenlaisia ​​kasvaintyypeissä [29]. Mielenkiintoista, sekä Cyr61 ja CTGF voivat toimia tuumorisuppressoreilla tai onkogeenien riippuen solujen yhteydessä (katso esimerkit alla); joka on samanlainen kuin kaksitoiminen

miR-205

.

vastaavuuden tiedoksi havaintojemme vapauttaminen Cyr61 ja CTGF on myös osoitettu useissa muissa tutkimuksissa. Esimerkiksi

Cyr61

ilmentyminen säätyy alas kohdunkaulan syövän [30], keuhkosyöpä [31] – [33], kohdun limakalvon syöpä [34] ja maksasyövän [35]; kuitenkin, sen ylössäätöä on raportoitu useita kasvain tyypit, mukaan lukien osteosarkooma [36], gliooma [37], [38], ja rintasyövän [39], [40]. Samanlaisia ​​Cyr61, aiemmat tutkimukset ovat osoittaneet ristiriitaisia ​​ekspressiokuvioita CTGF eri kasvaintyypeissä. Esimerkiksi vähentynyt CTGF ilmentyminen on raportoitu keuhkosyövän [31], rintasyöpä [40], Wilmsin kasvain [41] ja munasarjasyöpä [42]; kun taas lisääntynyt ekspressio havaittiin papillaarinen kilpirauhassyövän [43], peräsuolen syöpä [44], pään ja kaulan okasolusyöpä [45], [46] ja glioblastooma [47].

Mielenkiintoista,

miR -205

, Cyr61 ja CTGF ovat mukana yhteinen toiminnallinen prosesseihin ja polkuja. Samanlainen toiminnallinen seuraukset

miR-205

tässä tutkimuksessa havaittu, Cyr61 on osoitettu tukahduttaa solujen kasvua keuhkosyövän [32] ja maksasolusyövän [35]. Toisaalta, vaimentaminen Cyr61 tukahduttaa solujen lisääntymistä ja muuttoliike gliooman [37] ja haiman syöpäsoluja [48]. Menetys

miR-205

ilmaisu johtaa induktioon epiteelin-to-mesenkymaalitransitioon (EMT) [23], [24], kun taas hiljentäminen on Cyr61 ilmaisun estää EMT [48]. Ehtyminen

miR-205

ja Cyr61 ilmaisun estää Akt signalointi keratinosyyteissä, suun okasolusyöpä soluihin [14] ja glioomasoluihin [37]. Kuten Cyr61 ja

miR-205

, CTGF on myös osoitettu pelata sekä onkogeeniset ja vaimennin rooleja monenlaisia ​​syöpäsolutyyppien [45], [47], [49] – [51], ja se on myös mukana molemmissa EMT [52], [53] ja Akt-reitin [54] – [56]. Huolimatta lukuisista edellä mainittujen tutkimusten, roolit Cyr61 ja CTGF ihmisen kohdunkaulansyövän jää epäselväksi. On kiinnostavaa määrittää toiminnalliset roolit näiden tekijöiden kohdunkaulan syövän ja arvioida niiden vuorovaikutusta

miR-205

eri syöpätyyppejä.

Yhteenvetona raportoimme toiminnallisia vaikutuksia kasvain fenotyyppejä ja uudet tavoitteet

miR-205

ihmisen kohdunkaulan syöpäsoluja. Osoitamme, että

miR-205

näyttelee onkogeenisessä merkitys ihmisen kohdunkaulan syövän edistämällä solujen lisääntymisen ja muuttoliike. Lisäksi tunnistimme joukko uusia

miR-205

tavoitteet yhdistämällä biokemiallisten ja mikrosirujen lähestymistapaa. Niistä

Cyr61

ja

CTGF

olivat edelleen tarkastettiin proteiinia ja /tai RNA-tasot. Mikä tärkeintä, nämä kaksi geeniä vaimentua ihmisen kohdunkaulansyövän näytteitä. Tulosten perusteella näyttää, että

miR-205

ja sen tavoitteet (

esim

Cyr61 ja CTGF) voi olla tärkeä rooli patogeneesissä kohdunkaulan syöpä, ja että

miR-205

(ja sen tavoitteet) voivat toimittaa mahdollisia diagnostisia arvoja kohdunkaulan patologian.

Materiaalit ja menetelmät

Tissue Näytteet ja eettinen lausunto

Kolmekymmentä paria snap-jäädytetty kohdunkaulan kasvain ja Hyväksytty normaaleissa kudoksissa viereisistä alueista 30 potilasta antamat Gynecologic Oncology Group Tissue Bank (Columbus, Ohio). Kasvain ja normaali kudosnäytteiden oli todennettu kasvain tai ei-kasvain histopatologinen tutkimus hematoksyliinillä ja eosiinilla värjättyjen parafiinileikkeillä. Kaksikymmentä yhdeksän paria näytteet huomioitu aiemmin pieni RNA profiloinnilta syvä sekvensointitekniikan [9]. Tutkimuksen hyväksyi Karolinska Institutet eettisen komitean. Ei kirjallinen suostumus oli tarpeen, koska kaikki kliiniset materiaaleja deidentified. Etiikkaa komitea hallitus Karoliinisen instituutin nimenomaan luopuneet tarvetta suostumusta.

Kohdunkaulan syöpä Solulinjat

Seitsemän ihmisen kohdunkaulansyövän solulinjoja käytettiin: CaSki-, HeLa, SW756, ME-180, SiHa, C4I ja C33A. CaSki- ja ME-180-solut perin perustetaan metastaasien kohdunkaulan syöpään, ja muut solulinjat johdetut kohdunkaulakasvaimista [57] – [61]. Nämä rivit ystävällisesti Dr. Keng-Ling Wallin (Karolinska University Hospital, Ruotsi), ja oli hankittu American Type Tissue Culture (ATCC). CaSki ja ME-180-soluja kasvatettiin RPMI 1640: ssä, kun taas HeLa, SW756, SiHa, C4I ja C33A-soluja viljeltiin DMEM-alustassa. Kaikki solut oli täydennetty 10% FBS: ää ja 1% penisilliini /streptomysiiniä (Invitrogen, Carlsbad, CA) ja viljeltiin 37 ° C: ssa ja 5% CO

2: ssa kostutetussa inkubaattorissa.

TaqMan Quantitative Käänteinen transkriptio -PCR (qRT-PCR) B

Expression kypsä miRNA ja mRNA: t kvantifioitiin qRT-PCR käyttäen Applied Biosystems 7500 Fast Reaaliaikainen PCR-järjestelmä (Applied Biosystems). RNA uutettiin käyttäen Mirvana miRNA eristyspakkausta (Applied Biosystems /Ambion, Austin, TX), soveltamalla pieniä RNA rikastamiseen kudosnäytteistä ja kokonais-RNA erillään solulinjoista. RNA mitattiin käyttäen NanoDrop ND-1000 spektrofotometrillä (NanoDrop Technologies, Wilmington, DE).

kypsä miRNA, cDNA syntetisoitiin 25 ng pienten RNA-rikastettu RNA kudosnäytteitä, 120 ng kokonais-RNA: ta solulinjoja tai 15 ng Ago2-immunosaostettiin RNA: ita käyttäen Taqman MicroRNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems). Predesigned TaqMan MicroRNA Analyysit

miR-205

(ID 000509),

miR-21

(ID 000397) ja

miR-30a-5p

(ID 000417) hankittiin Applied Biosystems. Kaikki reaktiot suoritettiin kolminkertaisesti kolmeen riippumatonta otteeseen ja suhteelliset ekspressiotasot normalisoituivat geometrinen keskiarvo

RNU6B

(ID 001093) ja

RNU43

(ID 001095), ja raportoidaan 2

-ΔCT.

mRNA kvantifiointiin, cDNA syntetisoitiin 200 ng suurten RNA jae (

eli

RNA osa jäljellä sen jälkeen pieniä RNA rikastamiseen) varten kudosnäytteiden tai 50 ng Ago2-Immunopresipitoidun RNA: t käyttävät High Capacity cDNA Reverse Transcription kit (Applied Biosystems).