Krooninen sairaus

tiivistelmä

muuttaminen syöpäsolun kohti mesenkymaalisten fenotyypin on osoitettu voimistavan kasvaimen aggressiivisuus lisäämällä syöpäsolumetastaasi. Tässä me raportoimme vaikutus triklosaania, joka on laajalti käytetty antibakteerinen aine monissa päivittäin tuotteita, parantamisessa epiteelin-to-mesenkymaalitransitioon (EMT) aggressiiviseen anoikis resistenttien ihmisen H460 keuhko- syöpäsoluja. EMT on pitkään tunnettua lisätä kykyjä solujen lisäämiseksi maahanmuuttoa, invaasio, ja selviytymistä kiertävä järjestelmä. Esillä oleva tutkimus osoittaa, että käsittely syöpäsolujen kanssa triklosaania on fysiologisesti liittyvät pitoisuudet huomattavasti pesäkkeiden määrä syöpäsolujen arvioitiin kasvaimen muodostumisen määrityksellä. Lisäksi, mesenkymaaliset kaltainen morfologia ja lasku solu-soluadheesion havaittiin triklosaania-käsitellyissä soluissa. Tärkeää on, western blot-analyysi osoitti, että triklosaania käsiteltyjä soluja osoitti väheni E-kadheriinin, vaikka tasot EMT markkereita, nimittäin N-kadheriinin, vimentiinistä, etana ja etana todettiin olevan merkittävästi sääteli. Lisäksi EMT aiheuttama triklosaania hoito oli mukana aktivoituminen fokaalisen adheesion kinaasi /ATP riippuvaisen tyrosiinikinaasin (FAK /Akt) ja Ras liittyvät C3 botuliinitoksiinia alustan 1 (Rac1), joka parantaa kykyä solujen siirtyä ja hyökätä . Lopuksi me osoitettu ensimmäistä kertaa, että triklosaania voi voimistaa syöpäsoluja eloonjäämisen irrottaa kunnossa ja peristaltiikan prosessi EMT. Kuten edellä ominaisuudet vaaditaan menestystä etäpesäkkeitä, tässä tutkimuksessa antaa uusia toksikologisia tietoja ja kannustaa tietoisuus triklosaania käyttö syöpäpotilailla.

Citation: Winitthana T, Lawanprasert S, Chanvorachote P (2014) Triklosaani voimistaa epiteelin-To-mesenkymaalitransitioon in Anoikis hylkivät Human Lung Cancer Cells. PLoS ONE 9 (10): e110851. doi: 10,1371 /journal.pone.0110851

Editor: Aamir Ahmad, Wayne State University School of Medicine, Yhdysvallat

vastaanotettu: 21 heinäkuu 2014; Hyväksytty: 24 syyskuu 2014; Julkaistu 16. lokakuuta 2014

Copyright: © 2014 Winitthana et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Data Saatavuus: Tällä kirjoittajat vahvistavat, että kaikki tiedot taustalla olevat havainnot ovat täysin saatavilla rajoituksetta. Kaikki asiaankuuluvat tiedot ovat paperin.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukee Thaimaa Research Fund (PC) (https://www.trf.or.th), Ratchadaphiseksomphot Endowment Fund of Chulalongkorn University ( RES560530132-HR), 90 vuotta Chulalongkorn University Fund (Ratchadapiseksomphot Endowment Fund), ja Chulalongkorn University Graduate Scholarship muistoksi 72. vuotta hänen majesteettinsa kuningas Bhumibol Adulyadej (https://www.grad.chula.ac.th/eng /apurahat). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

tunnettu laajakirjoinen antibakteerinen aine triklosaania (2,4,4 ’-trichloro-2’-hydroksidifenyylieetteriä; TCS) (kuvio 1A) on kaupallisesti käytetty erilaisia ​​tuotteita estää kasvun bakteerit, sienet, ja homeen [1], [2]. TCS on käytetty säätelyn alaisuudessa Food and Drug Administration (kosmetiikassa, deodorantti, käsi saippuat, hammastahna) sekä ympäristönsuojeluviraston (materiaali- säilöntäaine osaksi kodin muovien ja tekstiilien) [2], [3]. Käytetyt pitoisuudet televisiokamerajärjestelmien eri tuotteita voi vaihdella; kuitenkin, sen tason useimmissa henkilökohtaisen hygienian tuotteet vaihtelevat 0,1-2% [1], [3]. Se seikka, että merkittävä määrä TCS ovat havaittavissa plasmassa TCS-altistetaan ihmisen on vaihtelee välillä 0,02 ja 20 ug /ml (0,069 ja 69 uM) johtaa mahdollisimman käsitys, että tämä aine voi mahdollisesti vaikuttaa ihmisen fysiologian [4 ].

(A) kemiallinen rakenne TCS. (B) Monisoluista yhdistäminen anoikis resistenttien H460-soluissa. Mittakaava on 1,000 um. (C-D) hoidon jälkeen TCS (0-10 uM) 24 tunnin ajan, prosenttiosuus solujen elinkykyisyys määritettiin MTT-määrityksellä ja prosenttiosuus apoptoottisten solujen havaittiin Hoechst33342 värjäys, vastaavasti. Arvot ovat keskiarvoja kolmesta riippumatonta triplikaattinäytteet ± SE. *

P

0,05 vs. ei käsitelty kontrolli. (E) Kun ilmoitetaan hoitoon, ydin- solujen morfologia havaittiin Hoechst33342 /PI co-fluoresenssi ja visualisoitiin fluoresenssimikroskoopilla. Mittakaava on 50 pm. (F) Soluja käsiteltiin TCS (0-7,5 uM) 24, 48 tai 72 tuntia. Solujen elinkelpoisuus määritettiin MTT-määrityksellä. Tulokset edustavat avulla kolmen itsenäisen triplikaattinäytteet ± SE. *

P

0,05 vs. ei käsitelty kontrolli kullakin ilmoitettuina ajankohtina. (G-H) Soluja käsiteltiin TCS (0-7,5 uM) 48 tuntia. Solusyklin TCS-käsiteltyjen solujen määritettiin PI värjäys ja virtaussytometria. *

P

0,05 vs. ei käsitelty kontrolli.

Keskittyminen syöpään, ajan tasalla olevaa tietoa on todennut, että TCS on merkityksetön vaikutus syövän synnyn ja suora geenimutaatio [2], [5], [6]. Ottaen kuitenkin huomioon, että TCS on aine, että ihmiset voivat altistua pitkään elämässään, on tärkeää ymmärtää täysin mahdollisia vaikutuksia tämän aineen paitsi karsinogeneesin vaan myös mahdollisia vaikutuksia syöpäsolujen käyttäytymistä. Viimeaikaiset tutkimukset ovat osoittaneet, että siirtyminen solun fenotyypin välillä epiteelin ja mesenkymaalisten nimetty epiteelin-to-mesenkymaalitransitioon (EMT) on kriittinen tekijä, jolla helpotetaan etäpesäke moniin syöpiin [7] – [9]. EMT on saanut merkittävää huomiota syöpään liittyvien tutkimusten ja EMT on tunnustettu tunnusmerkki syövän stemness sekä aggressiivisuus [10]. EMT prosessi on johtanut muutoksiin solun käyttäytymistä, joka useimmissa tapauksissa parantaa kykyä etäispesäkkeitä, mukaan lukien voimisti kulkeutumista solujen ensisijaisen kasvaimen, ja lisääntynyt resistenssi apoptoosia [11] – [13].

Useimmat tutkimusten mukaan osa väestöstä syöpäsoluja, jotka osoittavat anoikis kestävä ominaisuus on suurin osa soluista, joille onnistunut etäpesäke [14] – [18]. Anoikis resistentit solut tunnetaan myös verenkierrossa olevia kasvainsoluja (CTC) [19]. Kliinisessä käytännössä, CTC on pidetty mahdollisena biomarkkeri, joka kuvastaa syövän aggressiivisuus monien syöpien, kuten rinta-, eturauhas-, kolorektaalisen, virtsarakon, mahalaukun, maksan ja keuhkojen syövät [20] – [24]. Läsnäolo ja määrä CTC ääreisverenkierrossa on osoitettu korreloivan hyvin huonon ennusteen syöpäpotilailla [19], [20]. Väestö CTC näytteille heterogeeninen solun fenotyyppejä kuten epiteelin, mesenkymaaliset, ja ne fenotyyppejä siirtymäkauden tilassa epiteelin ja mesenkymaalisten [20], [24] – [27]. Koska prosessi EMT johti mesenkymaaliset fenotyypit kasvaessa etäpesäkkeitä potencies lukien anoikis kestävyys ja invasiivisia kyky solujen [14], [20], [23] tekijöitä tai ärsykkeitä, jotka helpottavat tätä EMT vuonna CTC voi muuttaa fenotyyppien CTC väestön ja vaikuttaa etäpesäke potentiaalit soluihin. Koska CTC löytyy verenkiertoon [19], [24], [28], solut ovat todennäköisesti altistuvat useille kemikaaleille nykyisiä veressä. Perustuen tällaiseen huoleen, useita yhdisteitä on tutkittu ja todettu olevan EMT indusoiva ominaisuus, kuten TGF-β [29], [30], epidermaalinen kasvutekijä [31], [32], selekoksibi [33] gefitinibi [ ,,,0],34] ja kuusiarvoista kromia [35].

Vaikka läsnäolo tiettyjen keskittymien TCS on raportoitu ihmisen levikkejään, koskevat tiedot tällaisen agentin EMT prosessin CTC on yhä suurelta osin tuntematon. Tässä tutkimuksessa pyritään tutkimaan vaikutuksia sekä mahdollisia vaikutuksia tämä yhdiste on aggressiivinen väestöön keuhkosyövän soluja. Parempi käsitykset tästä tutkimuksesta saadut voivat myötävaikuttaa turvallisemman käytön TCS ja tarjoavat uusia arvioinnin lähestymistapoja syöpään liittyvien myrkyllisyys.

Materiaalit ja menetelmät

1. Solut ja reagenssit

NCI-H460 saatiin American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, USA). Syöpä-soluja viljeltiin RPMI-1640-väliaineessa, jota täydensi 10% naudan sikiön seerumia (FBS), 2 mM L-glutamiinia, 100 IU /ml penisilliiniä ja 100 ug /ml streptomysiiniä (Life Technologies, MD, USA) 37 ° C 5% CO

2 kostutetussa inkubaattorissa. Triklosaani saatiin Sigma (St. Louis, MO, USA). TCS laimennettiin steriiliä väliainetta saavuttaa työtä pitoisuuksina 0,1% DMSO lopullinen ratkaisu. Osalta lähteistä reagenssien, Hoechst33342, propidiumjodidi (PI), falloidiinia tetrametyylirodamiini B-isotiosyanaatti, naudan seerumin albumiinia (BSA) ja dimetyylisulfoksidi (DMSO) hankittiin Sigmalta (St. Louis, MO, USA). 3- (4,5-dimetyylitiatsol-2-yyli) -2,5-difenyylitetratsoliumbromidia (MTT) hankittiin Gibco (Life Technologies, MD, USA). Matrigel saatiin BD Biosciences, Inc. (Woburn, MA, USA). BCA iinianalyysikitissä ja SuperSignal länteen pico kemiluminesenssi saatiin Thermo Scientific, Inc. (Rockford, IL, USA). Rabbit monoklonaalisia vasta-aineita E-kadheriinin, N-kadheriinin, vimentiinistä, etana, etana, Akt, fosforyloidun Akt (S473), polttoväli adheesiokinaasi (FAK), fosforyloitu FAK (Y397), β-aktiini, peroksidaasiliitettyä anti-kani-IgG ja peroksidaasiin konjugoitu anti-hiiri-IgG saatiin Cell Signaling (Denvers, MA, USA). Hiiren monoklonaalisia vasta-aineita aktiivisen Rac1-GTP ja Active Rho-GTP saatiin NewEast Biosciences (Malvern, PA, USA). Immobilon Western kemiluminesenssi HRP-substraattia saatiin Millipore, Corp (Billerica, MA, USA) ja Thermo Fisher Scientific Inc. (Rockford, IL, USA).

2. Anoikis resistentit solut

Anoikis resistenttejä soluviljelmässä suoritettiin mukaisen menetelmän Sakuma et ai. [36] ja Khongmanee et ai. [37] pienin muutoksin. Lyhyesti, liitteenä H460 solut trypsinoitiin, kun solut saavuttivat 80-90% yhtymäkohdassa 0,05% trypsiiniä /0,02% EDTA. Sitten soluja viljeltiin ultralow kiinnitys 6-kuoppaiselle levylle (Corning Costar, MA, USA) RPMI-1640-alustassa, kun taas muut kuin on kuvattu liitteenä viljelmää ylläpidettäisiin. Soluja viljeltiin tiheydellä 2 x 10

5 solua /ml 48 tuntia. Suspendoidut solut kerättiin sitten ja valmistellaan yksittäisten solujen suspensio 1 mM EDTA hoitoon. Sitten solut pestiin täydellinen RPMI-1640-väliaine. Solujen elinkelpoisuus mitattiin käyttämällä automatisoituja solulaskijaa. Elävät solut käytettiin lisäkokeita varten.

3. Solunelinkykyisyysmääritys ja soluproleferaatiomäärityksessä

Solut elinkelpoisuus määritettiin MTT: llä. Solut ympättiin tiheydellä 1 x 10

4 solua /kuoppa 96-kuoppaiselle levylle yön yli. Tämän jälkeen niitä käsiteltiin erilaisilla pitoisuuksilla TCS 24 tuntia. Hoidon jälkeen, väliaine korvattiin sitten MTT-liuosta (5,0 mg /ml PBS: ssä) ja inkuboitiin 37 ° C: ssa 4 h. Sitten väliaine korvattiin 100 ul: lla DMSO: liuottamiseksi formatsaanituotteesta ja intensiteetti formatsaanituotteen mitattiin 570 nm: ssä käyttäen mikrolevylukijaa (Anthros, Durham, NC, USA). Solujen elinkelpoisuus ilmaistiin prosentteina laskettuna optinen tiheys käsiteltyjen solujen suhteen hallinnassa soluihin. Samaan aikaan, solun proliferatiivinen vaikutus määritettiin myös käyttäen MTT-määritystä. Solut ympättiin tiheydellä 2 x 10

3 solua /kaivo 96-kuoppalevylle ja inkuboitiin yön yli. Tämän jälkeen solut käsiteltiin erilaisilla pitoisuuksilla TCS 0, 24, 48, ja 72 h. Solujen proliferaatio mitattiin MTT-määrityksellä, kuten on kuvattu solujen elinkelpoisuuden arviointi.

4. Tumavärjäystä määritys

Apoptotic ja nekroottinen solukuolema määritettiin Hoechst33342 ja PI co-värjäystä. Solut ympättiin tiheydellä 1 x 10

4 solua /kuoppa 96-kuoppalevylle ja inkuboitiin yön yli. Soluja käsiteltiin sitten TCS 24 tuntia. Sen jälkeen, kun tiettyjä hoitoja, soluja inkuboitiin 10 ug /ml Hoechst33342 ja 5 ug /ml PI: 30 min 37 ° C: ssa. Apoptoottisten solujen joilla kondensoidaan kromatiinin ja /tai hajanaiset ytimet ja PI-positiivisia necrotic soluja tarkasteltiin ja teki fluoresenssimikroskoopilla (Olympus IX51 kanssa DP70, Olypus America Inc., Center Valley, PA, USA).

5. Solusyklin analyysi

käsittelyn jälkeen soluja TCS 48 tuntia, solut trypsinoitiin ja kiinnitettiin 70%: ssa absoluuttista etanolia -20 ° C: ssa yön yli. sitten solut pestiin kylmällä PBS: llä ja inkuboitiin PI, joka sisälsi 0,1% Triton-X, 1 ug /ml RNaasi, ja 1 mg /ml propidiumjodidia 37 ° C: ssa 30 minuutin ajan. DNA koko solut värjättiin PI ja solukierron profiili analysoitiin virtaussytometrialla (FACSort, Becton Dickinson, Rutherford, NJ, USA).

6. Pesäkemuodostusta

Kun hoidon TCS ankkurista riippumaton kasvu tutkittiin kautta pesäkemuodostusta mukaisesti menetelmän Koleske et al. [38] pienin muutoksin. Lyhyesti, soluja käsiteltiin TCS ei-toksisten pitoisuuksien 24 tuntia ja sitten käsiteltiin 1 mM EDTA valmistamiseksi yksisolususpension. Solut suspendoitiin RPMI-1640, joka sisälsi 10% FBS: ää ja 0,33% agaroosia, sitten 250 ui, joka sisälsi 1 x 10

3-soluja upotettu toisen kerroksen 24-kuoppaisen levyn yli 500 ul: pohjakerroksen, joka sisälsi 10% FBS ja 0,5% agaroosia. Solut syötettiin joka 3 päivä lisäämällä 250 ui täydellistä alustaa. Kun 7 ja 10 päivää, saadut pesäkkeet valokuvattiin x 4 suurennuksella. Colony numero ja pesäkkeen koko määritettiin 10

päivänä kulttuurin.

7. Filopodia karakterisointi

Filopodia karakterisoitiin falloidiinia-rodamiini fluoresenssi, kuten on kuvattu Kowitdamrong et ai. [39]. Soluja käsiteltiin TCS ei-toksisten pitoisuuksien 24 h detach kunnossa ja ympättiin tiheydellä 2 x 10

3 solua /kuoppa 96-kuoppalevyllä 4 tuntia. Sitten solut pestiin PBS: llä, kiinnitettiin 4% paraformaldehydillä PBS: ssä 10 min ajan 37 ° C: ssa, läpäiseviksi 0,1% Triton-X100 PBS: ssä 4 minuuttia, ja blokattiin 0,2% BSA 30 min. Tämän jälkeen soluja inkuboitiin 1:100 phalloidin-rodamiini PBS: ssä 15 minuutin ajan ja pestiin PBS: llä 3 kertaa. Filopodia sitten kuvantaa fluoresenssimikroskoopilla (Olympus IX51 kanssa DP70).

8. Migraatiokokeessa

Migration määritettiin Boyden kammio määrityksessä, kuten aiemmin kuvatulla Kowitdamrong et al. [39]. Soluja esikäsiteltiin TCS at myrkytön pitoisuudet 24 h irrottaa kunnossa. Sitten solut ympättiin tiheydellä 5 x 10

4 solua /kuoppa ylemmän 24-transwell levy Transvvell- suodattimen (8-uM huokoskoko) keskipitkällä, joka sisälsi 0,1% seerumia ja 500 ui täydellistä alustaa oli lisätään alempaan kammioon. 24 tunnin kuluttua, ei-siirretyn solujen yläpuolisen kalvo poistettiin puuvilla-moppi pyyhkimällä. Solut, jotka vaelsivat alapuolelle kalvon värjättiin 10 ug /ml Hoechst33342 30 min. Sitten solut visualisoitiin ja sijoitettiin fluoresenssimikroskoopilla (Olympus IX51 kanssa DP70).

9. Invaasiomääritys

invaasiomääritys suoritettiin käyttäen 24-transwell kammioita, kuten aikaisemmin on kuvattu Kowitdamrong et ai. [39]. Siirtoaltaat päällystettiin 50 ui 0,5% matrigeeliä yläpinnalle kammion ja inkuboitiin yön yli 37 ° C: ssa kostutetussa inkubaattorissa. Käsittelyn jälkeen TCS ei-toksisten pitoisuuksien 24 h irrottaa kunnossa, solut ympättiin tiheydellä 5 x 10

4 solua /kuoppa ylempään kammioon alustassa, joka sisälsi 0,1% seerumia ja 500 ui täydellistä alustaa oli lisätään alempaan kammioon. 24 tunnin kuluttua, ei-hyökkäsi solujen yläpuolisen kalvo poistettiin puuvilla-moppi pyyhkimällä. Tunkeutuneet solut basolateraaliseen puolelle kalvo kiinnitettiin kylmällä absoluuttisella etanolilla 10 minuuttia ja värjättiin 10 ug /ml Hoechst33342 30 min. Sitten solut visualisoitiin ja sijoitettiin fluoresenssimikroskoopilla (Olympus IX51 kanssa DP70).

10. Western blot-analyysi

jälkeen erityisiä hoitoja, soluja inkuboitiin hajotuspuskuria, joka sisälsi 20 mM Tris-HCI (pH 7,5), 1,5% Triton X-100, 150 mM natriumkloridia, 10% glyserolia, 1 mM natrium- vanadaatti, 50 mM natriumfluoridi, 1 mM fenyylimetyylisulfonyylifluoridia, ja kaupallinen proteaasi-inhibiittorin seosta (Roche Applied Science, Indianapolis, IN, USA) 2 tuntia jäällä. Solulysaatit otettiin talteen ja proteiinipitoisuus määritettiin käyttäen Bradford-menetelmällä (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA). Yhtä suuret määrät proteiinia kustakin näytteestä denaturoitiin kuumentamalla 95 ° C: ssa 5 min latauspuskuria ja sen jälkeen ladattiin 7,5% SDS-polyakryyliamidigeelielektroforeesilla havaitsemiseksi EMT merkkejä ja E-kadheriinin ekspression tai 10% SDS-polyakryyli- geelielektroforeesi havaitsemiseksi muuttavien liittyvän proteiinin ilmentymisen. Erottamisen jälkeen proteiinit siirrettiin 0,45 uM nitroselluloosakalvoille. Siirretyn membraanit blokattiin 5% rasvatonta kuivamaitoa TBST (25 mM Tris-HCI: ää (pH 7,5), 125 mM NaCl, 0,05% Tween 20) 1 h, ja sitten inkuboitiin tietyn primaarista vasta-ainetta (1: 1000-laimennos) yön yli 4 ° C: ssa. Membraanit pestiin kolme kertaa TBST: llä 5 minuutin ajan ja inkuboitiin piparjuuriperoksidaasiin kytketty isotyyppispesifisessä sekundääriset vasta-aineet (1:2,000 laimennos) 2 tunnin ajan huoneenlämpötilassa. Membraanit pestiin kolme kertaa TBST: llä 5 minuutin ajan ja immuunikompleksien havaittiin lisälaite, jossa on kemiluminesenssisubstraatilla ja kvantitoitiin käyttäen analysoija /PC densitometria-ohjelmisto (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA).

11. Tilastollinen analyysi

Tiedot saatiin kolmesta itsenäisestä kokeesta ja esitetään keskiarvoina ± keskivirhe (SE). Tilastolliset analyysit tehtiin käyttäen yksisuuntaista ANOVA ja post hoc -testi (Turkin testi) merkitsevyystasolla

P

-arvot 0,05. SPSS 17.0 käytettiin kaikissa tilastollisia analyysejä.

Tulokset

1. Vaikutukset TCS on anoikis resistenttejä H460 soluja

Anoikis resistenttejä syöpäsoluja käytettiin mallina opiskeluun CTC [36], [37], [40]. Anoikis resistenttejä keuhkosyövän soluja tuotettiin, kuten on kuvattu Materiaalit ja menetelmät. Todettiin, että erillinen H460-soluja muodostuu spontaanisti monisoluisista aggregaatit viljelyn jälkeen 48 h (kuvio 1 B). Valaista mahdollinen vaikutus TCS CTC keuhkosyöpään solut, solumyrkkyvaikutuksessa yhdisteen soluilla oli ensimmäinen tunnettu. TCS pitoisuuksissa jotka vaihtelevat 0,069 ja 69 uM havaittiin plasmassa TCS-alttiina aiheista [4]. Siksi anoikis resistenttejä soluja inkuboitiin TCS pitoisuuksina 0-10 uM 24 tuntia ja solujen elinkelpoisuus arvioitiin MTT-määrityksellä. Kuvio 1C osoittaa, että TCS hoito laski merkitsevästi solujen eloonjäämistä annoksella 10gM noin 80% soluista Elinkykyisyyden, kun taas solujen käsittelyä TCS on 0-7,5 uM ei aiheuttanut merkittäviä myrkkyvaikutuksia. Hoechst33342 /PI-värjäys määritys vahvisti, että apoptoosin ja nekroosin eivät olleet havaittavissa TCS-käsiteltyjen solujen 0-7,5 uM. Apoptoottisten solujen hajanaista tai kondensoitu tumat havaitaan vain soluissa, käsiteltiin 10 uM TCS (kuviot 1D ja E). Näin ollen pitoisuudet TCS on 0-7,5 uM käytettiin seuraavissa kokeissa.

Kun osoittaneet myrkyllinen vaikutus TCS on anoikis resistentit solut, tutkimme seuraavaksi vaikutuksia TCS soluproliferaatioon ja solusyklin. Soluja käsiteltiin myrkytön pitoisuudet TCS varten 0-72 h ja solujen proliferaatio määritettiin kuten on kuvattu Materiaalit ja menetelmät. Leviämisen vaste anoikis resistenttien solujen TCS oli kuvassa 1F. TCS-käsitellyt solut osoittivat merkittävää eroa mitattuna solujen lisääntymisen verrattuna ei-käsiteltyyn kontrolliryhmään soluja. Nämä tulokset vahvistettiin solusyklin analyysillä käyttäen PI ja virtaussytometria. Tulokset osoittivat, että TCS hoito ei aiheuttanut merkittäviä vaikutuksia solukierron (kuviot 1G ja 1H). Yhdessä tulokset ehdottivat, että TCS hallussaan mitään proliferatiivista vaikutusta anoikis resistenttejä H460 soluja normaalissa viljelemällä kunnossa.

2. TCS edistää solujen kasvua kiinnittämisestä riippumattomalla tavalla

Koska kiinnittymisestä riippumatonta kasvua syöpäsolujen on osoitettu lisäävän etäpesäkkeiden, tutkimme seuraavaksi vaikutuksen TCS syövän solujen kasvua sellaisessa kunnossa. Näin tehdessään, anoikis resistenttejä soluja H460 käsiteltiin TCS 24 tuntia ennen niiden alistettiin pesäkemuodostusta. Sitten solut ympättiin agaroosi kerros estää solu-solu-vuorovaikutuksen ja kiinnitys. Colony lukumäärä ja pesäkkeen koko saatiin valokuvaamalla ja laskemalla sen jälkeen, kun soluja viljeltiin 7 ja 10 päivää. Pesäkkeiden muodostuminen on esitetty kuviossa 2A. Colony numero ja pesäkkeiden koko kunkin hoidon laskettiin prosenttiosuutena kontrolliryhmän ja kuvassa 2B on esitetty ja C, vastaavasti. Tulokset osoittivat, että TCS pitoisuuksina 5 ja 7,5 uM huomattavasti pesäkkeiden muodostumista anoikis resistenttien H460-soluissa. Kuitenkin TCS molemmissa pitoisuuksissa vähensi pesäkkeen koko verrattuna, että ei-hoidettuun kontrolliryhmään. Tällaiset havainnot osoittivat, että TCS edistänyt kiinnittymisestä riippumaton selviytymisen solujen, mutta laski kasvuvauhti solujen erillisissä kunnossa. Tuloksemme sisältää edellisen havaintoja, että lisäys kiinnittämisestä riippumaton eloonjääminen on alhainen proliferatiivinen kyky on havaittu syöpäsolujen meneillään EMT [11], [12], [41], [42].

(A) Soluja esikäsiteltiin TCS (0-7,5 uM) 24 tunnin ajan ja altistettiin pehmeän agarin pesäkemuodostusta, kuten on kuvattu ”Materiaalit ja menetelmät”. Edustaja kentät kolmen erillisen kokeen kuvattiin sen jälkeen, kun soluja viljeltiin 7 ja 10 päivää. Mittakaava on 1,000 um. (B-C) Colony numero ja pesäkkeen koko määritettiin kuva-analysaattori on 10

päivänä kulttuurin. Arvot ovat keskiarvoja kolmesta riippumatonta triplikaattinäytteet ± SE. *

P

0,05 vs. ei käsitelty kontrolli.

3. TCS inhiboimaan solu-solu-vuorovaikutuksen

Loss solu-solu-adheesio havaittiin soluissa prosessin aikana EMT kuin tulokset kadheriinin kytkentä [7], [8]. Vaikutuksen tutkimiseksi TCS on solu-solu adheesion anoikis resistenttien H460 soluja, jaoimme solut 24-kuoppaisille matalan kiinnitä levyyn tiheydellä 1,5 x 10

5 solua /kuoppa ja käsiteltiin ne myrkyttömällä pitoisuudet TCS. Solu-solu vuorovaikutus havaittiin muodostumiseen soluaggregaation ja valokuvattiin käyttäen faasikontrastimikroskoopissa. Yhteenlaskettu koko ja määrä määritettiin ja laskettiin suhteessa käsittelemätön kontrolliryhmä. Kuvio 3A osoittaa, että TCS hoito muuttunut merkittävästi yhteenlaskettu käyttäytymistä solujen yksisolususpension. Lisääminen TCS johti huomattavaan vähenemiseen sekä määrän ja koon monen soluaggregaateiksi annoksesta riippuvalla tavalla (kuvio 3B ja C). Nämä tulokset viittaavat siihen, että TCS edistää menetys solu-solu-adheesion anoikis resistenttejä H460-soluja, jotka on hallitseva ominaisuus läpikäyvien solujen EMT.

(A) Soluja käsiteltiin TCS (0-7,5 uM) 12 , 24 tai 48 tuntia irrottaa kunnossa ja solu-solu vuorovaikutus valokuvattiin. Mittakaava on 1,000 um. (B-C) käsittelyn jälkeen TCS (0-7,5 uM) 24 tunnin omakoti- kunnossa, raekoko ja yhteenlaskettu määrä määritettiin kuva-analysaattorin. Tiedot läsnä avulla kolmen itsenäisen triplikaattinäytteet ± SE. *

P

0,05 vs. ei käsitelty kontrolli.

4. TCS lisäämällä ilmaus EMT merkkiaineiden

vieressä tutkineet vaikutusta TCS hoidon EMT markkereita mukaan lukien N-kadheriinin, vimentiinistä, etana, ja etana. Anoikis resistenttejä H460-soluja käsiteltiin myrkytön pitoisuudet TCS: ssa 24 tuntia ja EMT markkereita arvioitiin western-blottauksella. Kuviot 4A ja B osoittavat, että ilmentymistaso E-kadheriinin väheni huomattavasti vastauksena TCS hoitoon pitoisuudesta riippuvaisella tavalla. Lisäksi TCS merkittävästi parannettu lisääntyminen N-kadheriinin, vimentiinistä, etana, ja etana. Ilmaus etana merkittävästi parantaa TCS hoitoa 5 ja 7,5 uM annoksesta riippuvalla tavalla, kun taas ekspressio patruunan vasta huomattavasti indusoitiin käsittelemällä TCS 7,5 uM. Nämä tulokset viittaavat siihen, TCS lisääntynyt EMT fenotyyppejä näissä soluissa.

(A) Anoikis resistenttejä H460-soluja käsiteltiin TCS (0-7,5 uM) 24 tunnin ajan erillisissä kunnossa. Taso N-kadheriinin, E-kadheriinin, vimentiinistä, etana ja etana määritettiin western blottauksella. Blotteja uudelleenseulottiin β-aktiini vahvista yhtä suuri kuormitus. (B) toinen immunoblot-signaalit kvantitoitiin densitometrillä ja keskimääräinen datan itsenäisen kokeet normalisoitu tuloksia. Tiedot läsnä avulla kolmen itsenäisen triplikaattinäytteet ± SE. *

P

0,05 vs. ei käsitelty kontrolli.

5. TCS-välitteisen EMT parantaa solujen maahanmuuton ja invaasion

Tärkeä tunnusmerkki aggressiivinen syöpäsolujen on niiden suuri kyky siirtää ja hyökätä [43], [44]. EMT on tunnustettu olevan tärkeä tekijä helpottaa solun liikkuvuus [12], [45]. Soluja käsiteltiin TCS at myrkytön pitoisuuksia 24 tuntia ja migraation ja invaasion käyttäytymistä solut määritettiin kuvatulla Materiaalit ja menetelmät. Kuvio 5A osoittaa, että TCS-käsitellyt solut osoittivat lisääntynyttä napaisuus ja filopodia. Filopodia TCS-käsitellyt solut värjättiin phalloidin-rodamiini, kuten on esitetty kuviossa 5B. TCS-käsitellyt solut osoittivat filopodia ulokkeita kertyy rajalla solujen annoksesta riippuvalla tavalla. Lisäksi muuttoliike ja invaasiomääritys paljasti, että TCS lisääntynyt solujen muuttoliikkeen ja invaasiota (kuviot 5C ja D). Edellä esitetyt havainnot ehdotti, että EMT induktio upon TCS hoitoa edistetään filopodia muodostumista ja voimistua muuttavien ja invasiivisia kyvyt anoikis resistenttien H460-soluissa.

(A) Soluja käsiteltiin TCS on 0-7,5 uM 24 tuntia ja sitten liitteenä tavanomaisten viljelymaljoista 4 tuntia. Solujen morfologia havaittiin faasikontrastimikroskopialla. Mittakaava on 25 pm. (B) jälkeen osoitetun hoidon filopodia ja elävät solut havaittiin phalloidin-rodamiini tai Hoechst33342 värjäys, vastaavasti. Solut visualisoitiin fluoresenssimikroskoopilla. Filopodia ulokkeet kunkin hoidon oli osoitettu nuolilla. Mittakaava on 5 um. (C) Soluja esikäsiteltiin TCS (0-7,5 uM) 24 tuntia. TranswellTM määritystä käytettiin tutkimaan solujen vaeltamiseen. Muuttavien solut basolateraalisessa puolelle kalvo värjättiin Hoechst33342 ja näkyviksi fluoresenssimikroskopiaan. Mittakaava on 50 pm. Keskimääräinen määrä vaeltavien solujen kussakin kentässä basolateraalisessa puolelle kalvon piirrettiin suhteessa kontrolliryhmään. Arvot ovat keskiarvoja kolmesta riippumatonta triplikaattinäytteet ± SE. *

P

0,05 vs. ei käsitelty kontrolli. (D) hoidon jälkeen TCS (0-7,5 uM) 24 tunnin ajan, soluinvaasiota arvioitiin käyttämällä siirtokuoppaan päällystetty matrigeelin kuvatulla ”Materiaalit ja menetelmät”. Tunkeutuneet solut basolateraalisessa puolelle kalvo värjättiin Hoechst33342 ja näkyviksi fluoresenssimikroskopiaan. Mittakaava on 50 pm. Keskimääräinen määrä hyökkäsi solujen kunkin alan poikki kalvon piirrettiin suhteessa kontrolliryhmään. Arvot ovat keskiarvoja kolmesta riippumatonta triplikaattinäytteet ± SE. *

P

0,05 versus ei-käsiteltyyn kontrolliryhmään.

Lisäksi alavirran efektorin proteiineja, jotka ovat vastuussa solun liikkuvuus määritettiin käyttäen western blotting. Solut käsiteltiin osoitetulla pitoisuuksilla TCS: ssa 24 tuntia ja niille suoritettiin Western blot-analyysi. Ilmentymistasojen vaeltavien-sukuiset proteiinit mukaan lukien aktivoitu FAK (fosforyloitu FAK, Tyr 397), FAK, aktivoitu Akt (fosforyloitu Akt, Ser 473), Akt, aktivoitu Rac1 (Rac1-GTP), ja aktivoitu RhoA (RhoA-GTP) olivat tutkittu. Kuviot 6A ja B osoittavat, että TCS hoito lisäsi merkittävästi taso fosforyloidun FAK, aktivoitu Akt, ja aktiivinen Rac1-GTP. Kuitenkin, TCS hallussaan ole merkittävää vaikutusta aktivoituna RhoA tasolla. Nämä tulokset viittaavat siihen, että TCS-indusoitu EMT edisti motiliteettia anoikis resistenttejä H460-solujen aktivoitumisen kautta FAK /Akt-signalointireitin, sekä Rac1 aktivointi.

(A) Anoikis resistenttejä H460-soluja käsiteltiin TCS 0 -7,5 uM 24 h irrottaa kunnossa ja sitten kiinnitetty tavanomaisten viljelymaljoista 4 tuntia. Taso pFAK (Tyr 397), FAK, Pakt (Ser 473), Akt, aktivoitu Rac1 (Rac1-GTP) ja aktivoitu RhoA (RhoA-GTP) määritettiin Western blot. Blotteja uudelleenseulottiin β-aktiini vahvista yhtä suuri kuormitus. (B) toinen immunoblot-signaalit kvantitoitiin densitometrillä ja keskimääräinen datan itsenäisen kokeet normalisoitu tuloksia. Arvot ovat keskiarvoja kolmesta kolmena riippumatonta näytettä ± SE. *

P

0,05 vs. ei käsitelty kontrolli.

Keskustelu

Keuhkosyöpä on kerännyt eniten huomiota syöpätutkimuksessa alan koska tämäntyyppinen syövät pidetään koska merkittävä syy syöpään liittyvää kuolleisuutta [46]. Todellakin, korkea etäpesäkkeitä nopeudella tällaisessa syöpä tekee eniten hengenvaarallinen ja useimmissa tapauksissa etäpesäke havaitaan aikaan ensimmäinen diagnoosi [47]. Koska kyky syöpäsolujen etäispesäkkeitä voidaan täydennetty prosessin EMT [9], [12], [48], tässä tutkimuksessa raportointi positiivinen sääntelyn vaikutus TCS on EMT ihmisen syöpäsolujen korostetaan mahdollisia uusia myrkyllisyys aiheuttamia tätä yhdistettä.

TCS on käytetty laajasti yli 30 vuotta terveydenhuollon tuotteita sekä lääketieteellisissä laitteissa. TCS on helposti ja täysin imeytyy oraalisen annon jälkeen. TCS on todettu virtsasta, plasmasta, ja äidinmaidossa ihmisten kanssa erilaisia ​​tasoja riippuen yksilön päivittäinen saanti, sen pitoisuus tuotteita sekä reitti ja antotiheys [2], [3]. Alhainen ja suuria pitoisuuksia TCS ihmisen plasmassa on raportoitu 0,02 ja 20 ug /ml (0,069 ja 69 uM) vastaavasti [4]. Aiemmat tutkimukset raportoitu mahdollisista vaikutuksista televisiokamerajärjestelmien induktioon maksasoluadenooman ja -karsinooman muodostumat koe-eläinmallissa [2]. Äskettäin, Ma et ai. (2013) havaitsivat, että TCS vähentäneet maailmanlaajuista DNA: n metylaatio (GDM) HepG2-soluissa ja ne ehdotti vähentäminen on mahdollinen mekanismi TCS edistää kasvaimen jyrsijöillä [49]. Koska maailmanlaajuinen DNA hypometylaatio liittyy poikkeava geenien ilmentyminen, menetys painamista, kromosomi epävakautta ja poikkeavuuksia, sen on osoitettu olevan keskeisessä asemassa valvoa EMT ja syövän etäpesäkkeiden [50].