Krooninen sairaus

tiivistelmä

Septins ovat perheen GTP-sitovaa solun tukirangan proteiinit ilmaistuna monissa kiinteitä kasvaimia. Septin 9 (

SEPT9

) erityisesti havaittiin yli-ilmennetään erilaisia ​​karsinoomia. Tässä tutkimme ilmaus SEPT9 isoformin 1 proteiinia (SEPT9_i1) ihmisen eturauhassyövän yksilöitä. Me käytetään immunohistokemiallisella värjäyksellä tutkia ilmentymistä SEPT9_i1 proteiinia. Värjäys taso analysoitiin yhdessä kliinisiä piirteitä ja patologinen Gleason arvosana ja pisteet. Viisikymmentä ihmisen eturauhassyövän yksilöt (42 ensisijainen kasvaimia ja 8 etäpesäkeleesioita) värjättiin SEPT9_i1 vasta-aine ja analysoida. SEPT9_i1 ekspressoitiin eturauhassyövän soluissa, mutta puuttuu normaaleissa epiteelisoluissa. Värjäytymisen intensiteetti korreloi suhteessa hoitoa edeltävälle eturauhasen antigeenin (PSA) veren ja Gleason (

P

0,05). SEPT9_i1 oli hyvin ilmaistu kaikissa etäpesäkeleesioita. Merkittävä Assocation välillä SEPT9_i1 ilmaisun ja korkean Gleason pistemäärä monimuuttuja lineaarisen regressioanalyysin todettiin. Olemme päätellä, että SEPT9_i1 ilmentyy korkealaatuisesta eturauhasen kasvaimia viittaa sillä on merkittävä rooli eturauhasen kasvainten synnyssä ja että se voisi toimia molekulaarinen merkkiaine eturauhasen syövän etenemiseen.

Citation: Gilad R, Meir K, Stein I, saksa L, Pikarsky E, Mabjeesh NJ (2015) korkea SEPT9_i1 Protein Expression liittyy High-Grade eturauhasen syöpiä. PLoS ONE 10 (4): e0124251. doi: 10,1371 /journal.pone.0124251

Academic Editor: Zoran Culig, Innsbruck Medical University, Itävalta

vastaanotettu: 07 marraskuu 2014; Hyväksytty: 11 maaliskuu 2015; Julkaistu: 21 huhtikuu 2015

Copyright: © 2015 Gilad et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään

Data Saatavuus: kaikki asiaankuuluvat tiedot ovat paperi.

Rahoitus: Tätä työtä tukivat Dr. Miriam ja Sheldon G. Adelson Medical Research Foundation (AMRF). Rahoittaja ei ollut roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Eturauhassyöpä on vertaansa keuhkosyöpä esiintyvyys maailmanlaajuisesti ja on toiseksi yleisin syöpä, ja yksi johtavista syistä syövän kuolleisuus Länsi-miehet [1]. Ensisijainen riskitekijät eturauhasen syöpä ovat ikä ja suvussa. Eturauhassyöpä yleistyy iän vaikuttaa vuotiaista miehistä 50 tai enemmän [2]. Eturauhasen adenokarsinooma metastasizes lähinnä luut ja harvemmin imusolmukkeisiin, ja saattaa paikallisesti etukäteen hyökätä naapurimaiden elimiin. Nykyiset hoidot ovat hormonihoito, immunoterapia ja kemoterapiaa, mutta ei ole olemassa parantavaa hoitoa metastaattisen eturauhassyövän [3, 4]. Siksi uusia strategioita eturauhassyövän hoitoon ja tunnistamiseen ja uusien molekyylikohteista kuten interleukiini-6 ovat välttämättömiä [5].

Septins ovat perheen GTP-sitovaa ja hehkulamppuja muodostavat proteiinit, ensimmäinen kuvattu

Saccharomyces cerevisiae

on näytön geenit, jotka säätelevät orastava prosessi [6]. Sen jälkeen, septins on havaittu monissa muissa eukaryooteissa, jotka vaihtelevat sienet ihmiseen [7-9], jossa merkittävä puuttuminen kasveissa [10]. Monet septin isoformit poikkeuksellisen ilmaistaan ​​karsinoomia [11], ja muuttunut tasot septin ilmaisun vahvasti korreloivat tuumorigeenisia fenotyypit kuten lisääntynyt solukasvu, liikkuvuuteen, invasiivisuus ja kestävyys mikrotubulusten häiritsevistä reagenssit [12, 13].

Meillä oli aiemmin tunnistettu SEPT9_i1, tuote transkriptio SEPT9_v1 joka koodaa isoformi 1 suurimpien N-pään pidennys, positiivisena säätelijänä hypoksia koulutusjakson [14]. SEPT9_i1 vuorovaikutuksessa hypoksia-indusoituva tekijä 1α (HIF-1α), happi-säännelty alayksikköä HIF-1, joka on keskeinen säätelijä hypoksia vastereitissä [15]. Vuorovaikutus on spesifinen HIF-1α, mutta ei HIF-2α, ja se lisää HIF-1α proteiinin stabiilisuuteen sekä HIF-1 transkriptionaalisen aktiivisuuden, joka parantaa proliferaatiota, kasvaimen kasvua ja angiogeneesiä. HIF-1 on transkriptiotekijä, joka säätelee vastauksista ja solujen sopeutuminen hypoksia ajo transkriptio monia geenejä, jotka ovat tärkeitä sopeutumisen ja selviytymisen hypoksiaolosuhteissa [14]. Näistä geenit ovat glykolyyttisiä entsyymejä, glukoosia ELÄINKULJETTAJAT Glut-1 ja Glut-3, endoteliini-1, endoteelikasvutekijä, hiilihappoanhydraasin IX, ja erytropoietiini [16]. Immunohistokemiallinen analyysit paljastivat, että HIF-1α yli-ilmennetään monissa ihmisen syövissä [17]. Lisäksi lisääntynyt HIF-1-aktiivisuus on usein liittyy lisääntynyt kasvaimen aggressiivisuus, terapia vastus, ja kuolleisuutta [18].

Aiemmat tutkimukset eri eturauhasen solulinjoissa ja ksenografteissa osoitti SEPT9_v1 mRNA ilmentyy voimakkaasti ihmisen eturauhasessa syöpänäytteissä verrattuna normaaliin eturauhasen kudosta [15]. Tässä tutkimuksessa määritimme ilmentymistä SEPT9_i1 proteiinin ensisijainen ihmisen eturauhassyöpäkudoksille käyttäen immunohistokemia ja korreloi sen ilmaisutapoja ennusteeseen viittaavia ominaisuuksia.

Materiaalit ja menetelmät

kudosnäytteitä

institutionaalinen Review board heprealaisen University-Hadassah Medical Center hyväksynyt tämän tutkimuksen (IRB protokolla 0500-12-HMO). Arkistomateriaalia ennen vuotta 2000 hyväksyttiin käyttöön Institutional Review Board Heprealaisen University-Hadassah Medical Center, jossa luopumista tietoon perustuvan suostumuksen mukaisesti Israelin valtion lain Genetic Information, 2002. Kaikki arkistointiin yksilöihin, joita käytetään tässä tutkimuksessa saatiin institutionaalisten biorepository at Hadassah Medical Center. Kaikki tutkimuksessa näytteet olivat ennen vuotta 2000, ja kaikki olivat de-tunnistaa. Tämä oli retrospektiivinen tutkimus sarjassa 50 parafinoidut eturauhassyöpänäytteissä: 38 alkaen eturauhasen, 6 radikaalien cystoprostatectomy ja 6 höyläysleikkaus eturauhasen (TUR-P). Tämän kokoelman, kahdeksan näytteet pois tutkimuksesta teknisten ongelmien vuoksi kudoksen käsittely jättää 42 primaarikasvainten eri vaiheissa lopullista arviointia (taulukko 1). Kahdeksan uutta etäpesäkeleesioita 8 eri potilailla, luuytimen (3), imusolmukkeet (2) ja luun (3) analysoitiin erikseen. Yksi näyte kustakin potilaan analysoitiin ja yksikään potilaista sai neoadjuvant hoitoa.

immunohistokemia

Kanin polyklonaalinen vasta-aine on suunnattu N-päähän SEPT9_i1 on aiemmin tuotettu [15] ja edelleen tunnettu siitä (kuvio 1A ja 1 B). Immunohistokemiallinen värjäys suoritettiin käyttäen samaa protokollaa kaikille kudoksissa. Lyhyesti, 4 um formaliinilla kiinnitetyt, parafiiniin upotetut leikkeet poistettiin parafiini, vedettömät ja antigeenin haku suoritettiin 25 mM sitraattipuskurissa, pH 6 kuumentamalla 125 ° C: ssa 3 min decloaking kammioon (biocare Medical). Leikkeitä inkuboitiin anti-SEPT9_i1 vasta-aineen 1: 2000 laimennus yön yli 4 ° C: ssa.

HEK-293T-ihmisen alkion munuaissoluja transfektoitiin ohimenevästi Flag-SEPT9_i1 rakentaa tai tyhjän vektorin (EV). (A) Koko solu-uutteet valmistettiin ja analysoitiin 4-20% SDS-PAGE ja immunoblottaus (IB), jossa vasta-aineita Flag (1: 2000), SEPT9_i1 (1: 3000), esi-seerumia (1: 3000) tai SEPT9_i1 vasta-aine (1: 3000) esi-inkuboida 10 uM immunogeenin peptidin 4 tuntia. (B) Sama solu-uutteiden tehtiin immunosaostus (IP) käyttäen anti-Flag-vasta-aineen ja immuneprecipitates tehtiin 4-15% SDS-PAGE: lla ja sitten immunoblotattiin anti-Flag tai anti-SEPT9_i1 vasta-aineita. (C) edustaja SEPT9_i1 värjäys ihmisen eturauhassyövän yksilöitä. Pisteet 0: ei SEPT9_i1 värjäytymistä, 1: alhainen SEPT9_i1 värjäystä 2: keskipitkän SEPT9_i1 värjäys ja 3: korkea SEPT9_i1 värjäystä. Suurennus x200, Mittakaavapalkki 50 pm.

Anti-kani HRP-konjugoitu vasta-aine (Vector Labs) käytettiin havaitsemaan primaarista vasta-ainetta. Lasit kehitettiin diaminobentsidiinillä (DAB) ja vasta- värjättiin hematoksyliinillä.

kvantitatiivinen arviointi immunovärjäyksen ja pisteytys

Kaikki objektilasit tarkistettiin kaksi riippumatonta tutkijat (RG ja EP), jotka olivat sokaissut kaikkien kliinisten ja patologinen tiedot. Värjäytymisen intensiteetti pisteytettiin 0 (ei lauseke), 1 (heikko), 2 (kohtalainen) ja 3 (voimakas). Olemme myös suorittaa tietokoneistetun kuva-analyysin käyttäen ARIOL-SL50 automatisoitu skannaus mikroskooppi ja kuva-analyysi-järjestelmän (Applied Imaging) arvioida intensiteetti näytteen värjäystä, olennaisesti kuten [19]. Dioja skannattiin ja kaikki kasvainten alueet oli merkitty. Kustakin kasvain 10 erillistä aloilla, satunnaisesti valittua, analysoitiin ja normalisoitiin mukaan valmistajien asetus (Hersight moduuli). Tulokset analyysin esitetään normalisoitu keskiarvo intensiteetin laskettuna ARIOL-SL50 ohjelmisto.

Ohimenevä transfektio, proteiini uuttamalla, immunopresipitaatiomäärityksiä, ja immunoblottausanalyysillä

Ihmisen alkion munuaisen (HEK 293T ) soluja ympättiin 70% konfluenssiin 6 cm: n levyillä ja transfektoitiin 3 ug: lla plasmidi ekspressoi Flag-SEPT9_i1 proteiinia tai tyhjän vektorin (EV), käyttäen Geneporter transfektioreagenssia (Gene Therapy Systems, Inc., San Diego, CA) kuten aiemmin on kuvattu [15]. Koko solu-uutteet valmistettiin ja proteiinin pitoisuudet määritettiin käyttäen bikinkoniini- happoa proteiinimääritys (Pierce, Rockford, IL) kuten aiemmin on kuvattu [15]. Immunosaostus suoritettiin käyttäen Ezview Red ANTI-FLAG Affinity gel (Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO), ja noudattamalla valmistajan ohjeita. Proteiinit analysoitiin sitten SDS-PAGE ja immunoblottaus vasta-aineiden kanssa, kuten näkyy kuvioissa. pohjimmiltaan, kuten aikaisemmin on kuvattu [15]. Ensisijainen vasta-aineet olivat kanin polyklonaalinen vasta-aine SEPT9_i1, joka on aiemmin tuotettu [15], ja sen vastaava esi-immuuni seerumi tai Flag (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). Toissijainen vasta-aine piparjuuriperoksidaasiin konjugoitua vuohen anti-hiiri tai kani (Jackson Immuno-, West Grove, PA).

Tilastolliset analyysit

Tarkempi tilastoista Tutkimuksen näyte käytettiin tiivistää osallistujan ominaisuudet. Bivariate Spearmanin korrelaatio analyysit arviointiin käytettiin suhdetta ”potilaiden ominaisuudet” ja tarkoittaa. Monimuuttuja lineaarista regressioanalyysiä, lopputulos oli keskimääräistä SEPT9_i1 värjäytymisen intensiteettiä. Riippumaton olivat muun muassa ikä ja Gleason pisteet. Oikaistu β ja SE laskettiin. Paras malli määritettiin harkitsee oikaistun R

2. Kaikki testit olivat kaksisuuntaisia ​​ja tilastollinen merkitsevyys määritettiin

P

arvo 0,05. Analyysit suoritettiin käyttäen PASW Statistics 17.0 for Windows.

Tulokset

pääpiirteet osallistujille, joiden näytteitä käytettiin tutkimuksessa on kuvattu taulukossa 1. Mediaani-ikä oli 65 vuotta, mediaani PSA on 5,9 ng /ml, ja suurin osa oli Gleason viereen ≥ 7. Me värjättiin kaikki potilaat näytteitä käyttäen SEPT9_i1-spesifistä vasta-ainetta [15]. Ensin tunnettu spesifisyys SEPT9_i1 vasta-ainetta. Flag-merkitty SEPT9_i1 konstrukti ilmennettiin väliaikaisesti HEK-293T-soluissa ja altistetaan immunoblottaus vasta-aineita lippu, SEPT9_i1 ja SEPT9_i1 läsnä ollessa immunogeeni peptidi [15] sekä esi-seerumia (kuvio 1A). Lippu ja SEPT9_i1 vasta-aineet saatetaan reagoimaan yhden 70 kDa: n vyöhyke, joka vastaa Flag-SEPT9_i1 proteiinia, kun taas esi-seerumi ei osoittanut yhtään reaktiivisuutta (kuvio 1A). Lisäksi immunoreaktiivisuus SEPT9_i1antibody lähes kokonaan poistettiin, jolloin immunogeenin peptidi lisättiin (kuvio 1A). Lisäksi immunosaostettiin lajien Flag-vasta tunnustettiin myös anti-SEPT9_i1antibodies (kuvio 1 B). Nämä tulokset edelleen vastattava spesifisyyden tuotetun anti-SEPT9_i1antibodies.

Ei-neoplastisia eturauhasen havaitsimme näkyvä SEPT9_i1 sytoplasmista värjäytymistä useimmissa tyvisoluissa kun onteloerityssolut olivat negatiivisia (kuvio 1 C). Stromasoluja värjäystä sekä neoplastisten ja muiden neoplastisten alueilla oli vaihteleva. Kasvainsolujen muuttuja värjäytymisen intensiteetti, joka yleensä on sytoplasminen kuitenkin joissakin tapauksissa oli ydin. Värjäytymisen intensiteetti kasvainsolujen oli joissakin tapauksissa muuttuja. Näissä tapauksissa pisteet siirrettiin perustuu runsain värjäytymisen intensiteettiä. Sitten kukin näyte sijoitettiin 0-3 ilmentymisen taso SEPT9_i1 (kuvio 1C). Sitten korreloivat SEPT9_i1 värjäytymisen intensiteetti kliinisiä piirteitä ja todettu vahva ja merkittävä korrelaatio SEPT9_i1 ekspressiotasot ja Gleason (

P

= 0,01, taulukko 2). On monimuuttuja lineaarista regressioanalyysiä varten yhteydestä potilaan ominaisuuksien ja tarkoittaa SEPT9_i1 värjäytymisen intensiteetti, Gleason oli ainoa itsenäinen ennustava tekijä (RR 2,0, 95% CI 0,15-3,85,

P

= 0,035). Me kerrostunut SEPT9_i1 värjäytymisen intensiteetti joko käyttämällä visuaalinen pisteytys (kuvio 2A) tai tietotekniikan kuva-analyysi automaattisella kuva-analyysi-järjestelmän (ARIOL-SL50) (kuvio 2B) mukaan Gleason pisteet. Siellä oli huomattavasti korkeampaa SEPT9_i1 värjäystä kuin Gleason oli suurempi (kuvio 2).

Mean SEPT9_i1 värjäytymisen intensiteetti ± SE kunkin Gleason ryhmä (pisteet 5: 3 potilasta, pisteet 6: 8 potilasta, pisteet 7: 19 potilasta, pisteet 8: 3 potilasta, pisteet 9: 6 potilasta ja pisteet 10: 2 potilasta) laskettiin käyttäen joko visuaalinen pisteytys (A) tai automaattiset kuva-analyysi kanssa ARIOL-SL50 (B).

seuraava analysoitu metastaattinen eturauhassyöpä yksilöitä eri paikoissa kuten luun (3 näytettä), luuytimen (3 näytettä) ja imusolmukkeiden (2 näytettä). Kaikki etäpesäkeleesioita olivat vahvasti positiivisia SEPT9_i1 värjäytymistä (kuvio 3). Kaikkiaan korkea ilmentyminen SEPT9_i1 korkean asteen eturauhassyövän ja eturauhassyöpäetäpesäkkeet viittaa siihen, että SEPT9_i1 on ehdolla markkeri syövän etenemiseen.

Metastaattinen eturauhassyöpä vaurioita luuytimestä, imusolmuke ja luun immunovärjättiin SEPT9_i1 . Vasen paneelit ovat alhaiset (x100) suurennos (LM) (asteikko bar 100 m) ja oikea paneeli ovat korkeat (x200) suurennos (HM) (asteikko bar 50 pm). Huomaa korkea SEPT9_i1 värjäytymistä kaikissa etäpesäkkeitä.

Keskustelu

Korkea SEPT9_i1 ilmentymisen todettiin useissa maligniteetteja mukaan lukien leukemia [20] ja rintasyövän [11]. Tässä tutkimuksessa osoitimme, että SEPT9_i1 proteiinin ilmentyminen liittyy merkittävästi Gleason (kuviot 1 ja 2 ja taulukko 2). Kunnes näinä päivinä, Gleason luokittelu ja pisteytysjärjestelmä edelleen yksi tehokkaimmista ennustavat tekijät eturauhassyövän [21]. Tärkeintä on, merkittävä voimakas SEPT9_i1 värjäytymistä nähtiin etäpesäkkeitä eturauhassyövän adenokarsinooma eri sivustoja (kuva 3). Nämä tulokset viittaavat siihen, että SEPT9_i1 proteiinin ilmentyminen voimakkaasti korreloi kasvaimen aggressiivisuus ja etenemiseen. Vastaavasti, Stanbery et ai. osoittivat, että korkea SEPT9_i1 proteiinin ilmentymistä pään ja kaulan okasolusyöpää oli yhteydessä huonoon kliiniseen tulokseen [22]. Lisäksi he huomasivat, että korkea ilmentyminen SEPT9_i1 korreloi sekä pitkälle T ja N vaiheessa [22]. Yhdessä nämä kliiniset tiedot tukevat aikaisempia tutkimuksia, jotka osoittivat roolin SEPT9_i1 kasvaimen synnyssä [15, 23-25].

Aktiivinen valvonta on yksi hyväksyttyjä menetelmiä käytetään vähentämään potilaiden hoitoon alhaisen riskin eturauhassyövän . Tällaisia ​​potilaita seurataan digitaalinen peräsuolesta lääkärintarkastus, säännöllinen veren PSA arviointeja ja toista eturauhasen koepaloja, ja joissakin viime protokollia valikoiva kuvantamisen avulla moniparametrisissä endorectal MRI [26]. Hoito sitten tarjotaan niille, joilla merkkejä etenemisen. Valitettavasti useat raportit osoittavat, että merkittävä osa (noin 30%) miehillä alhaisen riskin eturauhassyövän luokitellaan väärin ja täytyy saada välitöntä lopullista hoitoa [27]. Kuitenkin tällä hetkellä ei ole tarkka malli ennustaa, ne potilaat, joilla on alhainen riski taudin tulisi hoitaa välittömästi ennen niiden edistymisen seurannan aikana [28]. Koska SEPT9_i1 proteiinin ilmentyminen korreloi voimakkaasti kasvainprogression ja etäpesäkkeiden ehdotamme SEPT9_i1 uutena merkkiaine, joka voi erottaa toisistaan ​​vähäriskiset versus suurempi riski eturauhassyövän paremmin potilaiden valinnan aktiivisen seurannan ohjelmista. Tietenkin lisätutkimuksia perusteltua testata tätä hypoteesia.

Yksi rajoituksista Tutkimuksemme on puute pitkäaikaista kliinistä tuloksen verrattuna patologinen värjäytymisintensiteettiä SEPT9_i1. Toinen rajoitus on suhteellisen pieni määrä potilaita meidän kohortissa vaikka se riitti tilastollisesti merkitseviä.

Johtopäätökset

Kaikkiaan meidän data osoittaa selvästi, että SEPT9_i1 ilmentyminen eturauhassyövässä liittyy vahvasti tehokkain patologinen ennustava tekijä, Gleason pisteet. Lisäksi korkea SEPT9_i1 ekspressiotasot havaittiin kaikissa eturauhassyövän adenokarsinoomametastaaseja viittaa siihen, että SEPT9_i1 on rooli kasvaimen invasiivisuus ja etenemiseen. Lisätutkimuksia tarvitaan määrittämään sovellettavuus SEPT9_i1 Immunovärjäyksen kliinisessä ympäristössä.

Kiitokset

Tätä työtä tukivat Dr. Miriam ja Sheldon G. Adelson Medical Research Foundation (AMRF).