Krooninen sairaus

tiivistelmä

Organic kationi /karnitiinia transporter 2 (OCTN2) vastaa solun sisäänoton antineoplastisen aineen, oksaliplatiini. Epigeneettiset muutos on mahdollinen mekanismi muuttuneen huumeisiin transporter ilmaisun syövissä, mikä muuttaa tehoa kemoterapeuttisten. Kuitenkin mekanismit OCTN2 asetus ei täysin ymmärretä. Tässä tutkimuksessa alhaisten OCTN2 HepG2 ja LS174T solut korkeudella demetyloiva reagenssilla, decitabine (DCA). Edelleen paljastaa epigeneettiset mekanismi down-regulation of OCTN2, olemme huomanneet, että Alue 1 sisällä

OCTN2

promoottorin (joka ulottuu -354-85) oli määräävä OCTN2 ilmentymisen lusiferaasireport- määrityksessä. Lisäksi, metylaatiospesifinen PCR (MSP) ja bisulfiitti genomisen sekvensoinnin osoitti, että aste yksittäisten metyloitu CpG sivustoilta tällä alueella on kääntäen korreloi tasot OCTN2 eri syöpäsoluissa. Soveltaminen DCA HepG2 ja LS174T solujen käänteinen hypermetylaation tilan

OCTN2

promoottori ja lisääntynyt OCTN2 ilme, parantaa soluunottoa oksaliplatiinin. Niinpä havaittiin, että promoottori metylaatio vastaa epigeneettisellä alas-säätely OCTN2 HepG2 ja LS174T soluja. Koska olennainen merkitys OCTN2 syöpäsolun oton kemoterapeuttisten, ja siten hoidon tehokkuuden esikäsittely demetyloivan reagenssi on mahdollinen strategia optimoimiseksi lääkehoitojen syöpiä vastaan.

Citation: Qu Q, Qu J, Zhan M, Wu LX, Zhang YW, Lou XY, et ai. (2013) Eri osallistuminen Promoottori Metylointi Expression of Organic KATIONINVAIHTOKOLONNI /karnitiini Transporter 2 (OCTN2) in Cancer Cell Lines. PLoS ONE 8 (10): e76474. doi: 10,1371 /journal.pone.0076474

Editor: Suresh Yenugu, University of Hyderabad, Intia

vastaanotettu: 16 heinäkuu 2013; Hyväksytty: 29. 2013. Julkaistu 16. lokakuuta 2013

Copyright: © 2013 Qu et ai. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat valtion stipendirahastossa Kiinasta Scholarship neuvoston (Kuvanumero- 201206370103), National Tiedesäätiö of China (nro 81273595, 81072706), tieteellistä perustaa Hunan (nro 11K073, 10JJ4020) niin kutsuttua ”863” Project (nro 2012AA02A518), NCET-10-0843 ja tutkimus Innovation Foundation of Graduate Student Hunanin maakuntaan Kiinassa (CX2011B056). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

ihmisen

SLC22A5

geeni, joka koodaa 63 kDa orgaaninen kationi /karnitiinia transporter 2 (OCTN2), sijaitsee sytokiinin klusterin kromosomi 5q31 [1], [2]. OCTN2 ilmentyy erilaisissa kudoksissa, mukaan lukien munuainen, luustolihas, sydän, paksusuoli, aivot, maksa, jne. [3] Toiminnallisia vikoja OCTN2 liittyy erilaisiin sairauksiin, mukaan lukien ensisijaisen karnitiinin puutos, Crohnin tauti, ja astma [4] – [8]. OCTN2 paitsi kuljettaa karnitiinia, mutta tunnustaa myös kliinisesti tärkeitä terapeuttisten kuten mildronate, verapamiili, pyrilamiini, oksaliplatiini, imatinibi ja kefaloridiini [9] – [13]. OCTN2 liittyy oksaliplatiinin keskittymisen ja sytotoksisuus OCTN2-HEK293 transfektoiduissa soluissa [11]. Kaksi alleelia

OCTN2

(rs2631367 ja rs2631372) voivat olla tärkeitä ennustajia ruoansulatuskanavan stroomakasvainten potilailla, jotka saavat imatinibihoidolle [12]. Nämä raportit osoittavat, että toiminnalliset viat ja /tai poikkeava ilmentyminen OCTN2 voivat vaikuttaa disposition ja sen jälkeen terapeuttista tehoa sen substraattien.

Useat raportit viittaavat siihen, osallistumista peroksisomiproliferaattoreilla aktivoituvan reseptorin alfa (PPARa) ja gamma ( PPARg) transkription säätelyyn OCTN2 eri kudoksissa. Kuitenkin alas-säätely OCTN2 on raportoitu kasvainten korkea ilmentymä PPARa ja PPARg [14] – [16]. Tuoreessa tutkimuksessa todettiin, että alentuneet OCTN2 useissa epiteelin syövän solulinjoja voitaisiin palauttaa demetyloiva reagenssilla 5-atsa- sytidiinin [17]. Nämä havainnot viittaavat siihen, että muiden koneiden kanssa yhteistyötä transkriptiotekijä verkon ilmentymisen moduloimiseksi OCTN2, kuten DNA: n metylaation.

DNA: n metylaatio on tärkeä epigenetic mekanismi, joka moduloi geenin ilmentymistä. CpG-dinukleotidi lähellä transkription aloituspaikat on runsaasti geenipromoottorit, ja kutsutaan CpG-saarekkeiden. Metylointi CpG-saarekkeiden liittyy tukahdutettua geenin transkription ja epänormaali DNA metylaatio voi johtaa poikkeavaan geeniekspressiota. Toisin kuin geenin mutaatio, DNA: n metylaatio voidaan palautuvasti muuttaa demetyloimalla, kuten decitabine (5-atsa-2′-deoksisytidiini, DCA) ja 5-atsa-citidine. Nämä aineet on sisällytetty DNA ja inaktivoivat DNA sytosiini C5-metyylitransferaasien [18]. Niinpä arveltu, että ero metylaatiostatuksen

OCTN2

voidaan korreloida poikkeavan ilmentymisen OCTN2 syöpäsoluissa.

Tässä tutkimuksessa tutkimme onko metylaatio CpG-saarekkeiden toimii mahdollinen mekanismi vastaa alas-säätely OCTN2 syöpäsolulinjoissa. Käyttämällä metylaatiospesifistä PCR (MSP), bisulfiitti genomista sekvensointia, ja

in vitro

metylaatio määrityksiä, olemme antaneet näyttöä siitä, että promoottori-DNA: n metylaatio on oleellinen mekanismi tukahduttamalla OCTN2 ilmentymistä syöpäsolulinjoissa. Soveltaminen demetyloivan reagenssin, joka on moduloitu metylaatiostatuksen

OCTN2

promoottorin, lisääntynyt ilmentyminen OCTN2 ja tehnyt syöpäsolujen herkempiä oksaliplatiini.

Materiaalit ja menetelmät

Kemikaalit ja reagenssit

desitabiinista, natriumbisulfaatti, hydrokinonia ja oksaliplatiini ostettiin Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). TRIzol reagenssia ja Lipofectamine 2000 saatiin Invitrogen (Carlsbad, CA).

Soluviljely ja hoito DCA

hepatoomasolulinjassa HepG2, koolonisyöpäsolulinja LS174T, glioomasolulinjaa U251, sappitiehyen syöpä solulinja QBC-939 ja Afrikkalainen vihreän apinan munuaissolulinja COS-7 saatiin American Type Culture Collection (Manassas, VA). Solulinjoja viljeltiin DMEM: ssä, jota oli täydennetty 10% naudan sikiön seerumia (FBS) 37 ° C: ssa kostutetussa inkubaattorissa, joka sisälsi 5% CO

2, paitsi QBC-939-solulinja, joka oli viljeltiin RPMI 1640 Soluja käsiteltiin DCA lopullisessa pitoisuudessa 0,5 uM tai 1 uM ja uusitaan 24 h yhden viikon ajan.

RNA puhdistus, cDNA: n synteesi ja kvantitatiivisen tosiaikaisen PCR

solun kokonais-RNA oli eristetty hoidetuista soluista käyttäen TRIzol reagenssia. cDNA syntetisoitiin 1 ug kokonais-RNA: sta käyttäen ensimmäisen cDNA-synteesin (Takara, Dalian). Kvantitatiivinen RT-PCR suoritettiin käyttämällä SYBR Green (Bio-rad) ja alukkeet on lueteltu taulukossa S1. RT-PCR suoritettiin yli 40 sykliä 95 ° C: ssa 30 s, 60 ° C: ssa 30 s, ja 72 ° C: ssa 30 s ja sen jälkeen lopullinen pidentäminen 72 ° C: ssa 2 min. Suhteellinen mRNA ilmaisun normalisoitiin housekeeping-geeni

β-aktiini

ja analyysi suoritettiin käyttäen 2

-ΔΔCt menetelmä [19].

Western blotting

Yhteensä solun proteiinit uutettiin, ja konsentraatiot kvantitoitiin BCA-proteiinimäärityksellä (Thermo Scientific, Rockford, IL). Proteiinit alistettiin SDS-polyakryyliamidigeelielektroforeesilla 10% polyakryyliamidigeeleillä ja siirrettiin PVDF-kalvolle. Kalvon koettimena joko anti-kani OCTN2-vasta-ainetta (1:400, Abcam Labs, Cambridge, MA), tai β-aktiini-vasta-aine (1:1000, Abcam Labs). Tämän jälkeen membraaneja inkuboitiin DyLight 800-leimatun kanin polyklonaalista vasta-ainetta (1:7500, KPL Inc, Gaithersburg, MD), valolta suojattuna. Värjätyt kalvot skannattiin mukaan Odyssey Infrared Imaging System (LI-COR Biosciences). Suhteet OCTN2 vastaan ​​β-aktiini laskettiin.

solunelinkykyisyysmääritys

Cancer solulinjoja käsiteltiin 1 uM DCA tai 0,1% DMSO: yhden viikon ajan. Tämän jälkeen solut ympättiin 96-kuoppaisille levyille tiheydellä 2 x 10

4 /kuoppa, ja altistettiin oksaliplatiini eri pitoisuuksina (0, 0,3, 1, 3, 10, 33, 100 tai 330 uM) ja 48 h. Solujen elinkelpoisuus mitattiin MTS-määritys (Promega, Madison, WI) ja IC

50-arvot laskettiin käyttäen SPSS 13.0 versiota.

metylaatiospesifinen PCR (MSP) ja bisulfiittimodifiointi-Sequencing PCR (BSP)

ennustaa alueilla runsaasti CpG dinukleotideissä lähellä

OCTN2

transkription aloittaa sivusto, käytimme metyyli-Primer ohjelmisto (https://www.urogene.org/methprimer/) mukaan seuraavat kriteerit: pituus CpG-saarekkeen 100 emäsparin, havaittu /odotettu CpG suhde 0,6 ja prosenttiosuus G plus C 50%. Haimme

OCTN2

genomisen sekvenssin josta 1,5 kb ylävirtaan ja 2 kb alavirtaan transkription aloituskohdasta (TSS). Mukaan ennustettu CpG-saarekkeiden MSP ja BSP alukkeet suunniteltiin, ja ne luetellaan taulukossa S1. Genomi-DNA syöpäsolulinjojen eristettiin ja DNA bisulfiittimodifikaatio suoritettiin, kuten on kuvattu [20]. Bisulfiitti muunnetun DNA otettiin talteen Wizard DNA Clean Up System (Promega) ja käsiteltiin 5,5 ui NaOH: ta saostettiin sitten etanolilla. Saostunut DNA suspendoitiin uudelleen veteen, ja sitten monistetaan MSP tai BSP alukkeita. PCR-ehto oli seuraava: 94 ° C 5 minuutin ajan, mitä seurasi 40 sykliä 94 ° C 30 s, pariutuminen lämpötila (taulukko S1) 30 s, 72 ° C: ssa 60 s, ja lopuksi 72 ° C: ssa 5 min. Monistetut DNA-fragmentit ajettiin 2% agaroosigeeleillä ja värjättiin etidiumbromidilla. BSP tuotteet puhdistettiin DNA-puhdistuspakkausta (Takara, Dalian) ja insertoitiin pGEM-T-easy-vektoriin (Promega). Viisi klooneja jokaista solulinjaa valittiin satunnaisesti ja sekvensoitiin. Metyloidut sekvenssi

OCTN2

tarkastettiin linjaus MethBLAST.

plasmidin muodostaminen ja

in vitro

metylaatiomääritystä

mukaan ennustettu CpG saaret genomisen sekvenssin, jaoimme promoottori kolmeen alueeseen. Kolme aluetta, joka sisältää erilaista CpG-saarekkeiden monistettiin (alukkeet on lueteltu taulukossa S2) ja insertoitiin pGL4.17-vektoriin (Promega). Nämä rekombinantteja, pGL4.17-alue1, region2 ja Region3 varmistettiin automatisoidulla sekvensoinnilla. Vastaavat plasmidi linearisoitiin

Xho

I ja alistettiin

in vitro of the metylaatiomääritystä kuten kuvattu edellisessä työssä [21]. Metylointi tehtiin sitten digestoitiin

Kpn

I ja liitettiin pGL4.17 vektoriin. Nämä uudet sisältävät rekombinantit metyloitu promoottorialueissa nimettiin pGL4.17-mRegion 1, pGL4.17-mRegion 2 ja pGL4.17-mRegion 3, vastaavasti.

Transient Transfektio ja Luciferase Report Pitoisuus

COS-7-solut ympättiin 24-kuoppaisille levyille tiheydellä 10

5 /kuoppa 500 ul: aan DMEM ja 10% FBS: ää. 8 tunnin kuluttua solut transfektoitiin rakennettiin lusiferaasi-vektorit (0,2 ug /kuoppa) käyttäen Lipofectamine 2000 pGL4.17 -vektori, josta puuttuu promoottori toimi negatiivisena kontrollina. Sisäinen valvonta vektori PRL-TK (0,02 ug /kuoppa) käytettiin normalisoimaan lusiferaasiaktiivisuus. 8 tunnin kuluttua kukin kuoppa transfektoitujen solujen pestiin kahdesti sitten 100 ui toimittaja lyysipuskuria lisättiin solujen hajottamiseksi. Kukin ryhmä oli kolmena rinnakkaisena ja toistettiin yli kolme kertaa. Dual lusiferaasiaktiivisuus (suhteellinen valo yksikkö, RLU) määritettiin luminometriä.

Tilastollinen analyysi

Kaikki tiedot ilmaistiin keskiarvona ± keskihajonta. Tilastolliset analyysit tehtiin yksisuuntaisella ANOVA merkitys seurasi post-hoc testi SPSS 13.0 ohjelmistolla. Data vertailuja

p

arvo on alle 0,05 (

p

0,05) pidettiin huomattavan erilaiset.

Tulokset

OCTN2 mRNA ja proteiini tasoilla erilaisissa Cancer Cell Lines

solun kokonais-RNA ja proteiini uutettiin syöpäsolulinjoista ja OCTN2 ilmentyminen mitattiin Kvantitatiivinen RT-PCR ja Western blottauksella, vastaavasti. Korkein ilmentymä OCTN2 oli QBC-939, jonka jälkeen U251, LS174T ja HepG2 solut (Fig. 1). Ilmaukset OCTN2 in QBC-939 ja U251-solut olivat huomattavasti korkeampi kuin U251, LS174T solut (

p

0,05).

(A), analyysi mRNA tasojen OCTN2 syöpäsolulinjoissa. Kokonais-RNA syöpäsoluissa puhdistettiin TRIzol reagenssi cDNA-synteesin ja mRNA tasot OCTN2 analysoitiin Kvantitatiivinen RT-PCR. (B), analyysi-proteiinin tasojen OCTN2 syöpäsoluissa. Yhteensä proteiinit uutettiin ja proteiinin tasot OCTN2 analysoitiin western-blottauksella. Suhteellinen mRNA: n ja proteiinin normalisoitiin P-aktiini. Ilmentyminen HepG2 asetettiin 1. Kaikki mRNA: ta ja proteiinia analyysi suoritettiin kolme kertaa. Merkittävä ero HepG2 tai LS174T solu on merkitty tähdellä (*,

p

0,05) tai numero merkki (#,

p

0,05), tässä järjestyksessä.

vaikutukset DCA on Expression of OCTN2 syöpäsolulinjoissa

tutkia poikkeava ilmauksia OCTN2 eri syöpäsolulinjoissa johtui promoottorin metylaation, käsittelimme syöpäsolun linjat DCA ja määritetään palautettu ilmaus OCTN2. Kuviossa. 2, DCA erittäin säädelty suhteellisen OCTN2 mRNA ja proteiinin ilmentyminen in HepG2-soluissa 0,5 uM (1,38-kertainen, 1,61-kertainen) ja 1 uM hoito (1,52-kertainen, 2,07-kertainen) (

p

0,05), verrattuna kontrolliryhmään. Samoin hoito DCA johtaa lisäystä OCTN2 tasojen LS174T soluissa. Kuitenkin, DCA ei muuttanut ilmentymistä OCTN2 in QBC-939 ja U251-solut, jotka oli jo korkea OCTN2 ekspressiotasot.

(A), analyysi mRNA tasoilla OCTN2 in DCA-käsitelty syöpäsolulinjoilla. Hoidon jälkeen 0,5 ja 1 uM DCA, kokonais-RNA syöpäsoluissa puhdistettiin TRIzol reagenssi cDNA-synteesin ja mRNA tasot OCTN2 analysoitiin Kvantitatiivinen RT-PCR. (B), analyysi-proteiinin tasojen OCTN2 in DCA-käsitelty syöpäsolulinjoilla. Yhteensä proteiinit uutettiin ja proteiinin tasot OCTN2 analysoitiin western-blottauksella. Suhteellinen mRNA: n ja proteiinin normalisoitiin P-aktiini. Esitetyt tiedot edustavat keskiarvoa ± S.D. Kolmen riippumattoman kokeen. Merkittävä ero kontrolliryhmän 0,1% DMSO on merkitty tähdellä (*,

p

0,05; **,

p

0,01).

OCTN2 Perimän Sequence Satamat Kolme CpG Islands

Haimme

OCTN2

genomisen sekvenssin sijainti CpG dinukleotidejä käyttäen metyyli-pohjamaali ohjelmisto. CpG dinukleotidit löydettiin laajasti lähellä TSS (Fig. 3A). Sijainnin mukaan intensiteetti CpG dinukleotideissä, havaitsimme kolmen oletetun-CpG-saarekkeiden sijaitsee

OCTN2

genomisen sekvenssin. CpG saarekkeen 2 sijaitsee lähellä UTR ja eksonin 1, CpG saari-3 sijaitsee introni 1, ja CpG-saarekkeen-1 sijaitsee vastavirtaan TSS (Fig. 3A).

(A), laskennallinen analyysi osoitti kolmen oletetun CpG saarilla OCTN2 genomisen sekvenssin metyyli-pohjamaali ohjelmisto kuvatulla

Materiaalit ja menetelmät

. (B), MSP-analyysi-CpG-saarekkeiden ja OCTN2 1 uM DCA käsiteltyjen ja ei-käsiteltyjen syöpäsolulinjoilla. MSP suoritettiin spesifisiä alukkeita monistamaan kohde-CpG-saarekkeiden jakeet ja ajettiin 2% agaroosigeelissä. Kaikki MSP ja BSP analyysi toistettiin kolme kertaa. U: metyloimaton sekvenssi; M: metyloitu järjestyksessä.

metylaatiostatuksen CpG saarilla OCTN2 MSP

Selventämään lisäksi metylaatiostatuksen CpG saarilla

OCTN2

eri syöpäsolujen linjat, analysoimme kolme CpG-saarekkeiden MSP, joka erottaa metyloitua DNA: ta YK-metyloitua DNA: ta. Kuviossa. 3B, CpG-saarekkeen-1 (CpG1) oli täysin metyloitu HepG2-soluissa, osittain metyloitu LS174T ja U251-solut, ja un-metyloitavaa QBC-939 soluja. Osittain metyloidut tuotteet CpG-saarekkeen-2 (CpG2) löydettiin LS174T ja QBC-939-solut, mutta nämä olivat metyloitumattomina HepG2 ja U251-solut. Lähes kaikissa solulinjoissa, CpG-saarekkeen-3 oli enemmän metyloituja tuotteita kuin metyloitumaton. Kuviossa. 3C, käsittelyn jälkeen DCA, metyloitumattomina tuotteiden CpG1 lisättiin HepG2, LS174T ja U251-solut. Tämä havainto osoittaa, että DCA voi aiheuttaa de-metylaation CpG1. Samanlainen tulos havaittiin sisällä CpG2. DCA hoito lisäsi un-metyloidut tuotteet CpG3 HepG2-soluissa, mutta ei aiheuttanut merkittäviä muutoksia muissa soluissa.

vaikutus Metyloidut ja Un-metyloitu Promoottori Alueiden transkriptio aktiivisuus OCTN2 käyttämällä

in vitro

Luciferase Reporter Assay

Voit selvittää metyloitu CpG-saarekkeiden pelata olennainen rooli alas-säätely OCTN2 rakensimme lusiferaasireportterista plasmideilla, joissa joko YK-metyloituja tai denaturoitua alueilla (Fig. 4). Muodostimme plasmidit transfektoitiin COS-7-soluissa, ja käytettiin arvioimaan transkriptionaalista aktiivisuutta. Verrattuna pGL4.17 (Control), pGL4.17-alue1 näytetä merkittävästi lisääntynyt lusiferaasiaktiivisuus 102,5-kertainen (

p

0,01), kun taas lusiferaasiaktiivisuus peräisin pGL4.17-region2 ja Region3 olivat vain kasvoi 11,4-kertaiseksi ja 3,5-kertainen (

p

0,05). Tämä tulos osoittaa, että alue1 ulottuu -354-+85 emäsparin on keskeinen rooli promoottorin aktiivisuutta. Kiinnostavaa kyllä, ainoastaan ​​lusiferaasiaktiivisuus un-metyloitu Region-1 oli suurempi kuin sen metyloitu vektori (29,7-kertainen,

p

0,01). Un-metyloitu Alueet-2 ja -3 eivät osoittaneet merkittäviä eroja lusiferaasiaktiivisuudessa verrattuna niiden vastaavien metyloidut alueilla. On mahdollista, että metylaatio statukset Region-2 ja -3 sisältävä CpG-saarekkeen-2 ja -3, vastaavasti, ovat merkityksettömiä

OCTN2

ilme. Siten nämä havainnot osoittavat, että lisääntynyt metylaatio voi estää promoottorin aktiivisuutta Alue-1.

Valmistettu pGL4.17 lusiferaasi vektori, joka sisältää metyloimattomia ja metyloituja promoottorialueet transfektoitiin COS-7-solujen PRL-TK kontrollivektorilla. Neljäkymmentäkahdeksan tuntia myöhemmin solut pestiin ja määritettiin lusiferaasiaktiivisuus. Suhteellinen lusiferaasiaktiivisuus mitattiin kolmena rinnakkaisena. Esitetyt tiedot edustavat keskiarvoa ± S.D. Kolmen riippumattoman kokeen. Merkittävä ero käsittelyssä ryhmästä pGL4.17 on merkitty tähdellä (*,

p

0,05; **,

p

0,01). Merkittävä ero ryhmästä metyloitu alueen samalla alueella on merkitty ruutumerkillä (#,

p

0,05).

määritys DNA metylaatio profiilit OCTN2 by BSP

arvioimiseksi metylaatio profiilia CpG sivustoja Region-1, bisulfiitti genomista sekvensointia erilaisissa syöpäsolulinjoissa suoritettiin. Kuviossa. 5A, genominen sekvenssi OCTN2 promoottori näytetään ja CpG sivustoja oli merkitty. Yksi metyloitu sekvenssi

OCTN2

ulottuu -325–92 emäsparin HepG2-soluissa tarkastettiin linjaus MethBLAST ja on esitetty kuvassa. 5B. Muut metyloidut sekvenssit LS174T, QBC-939 ja U251-solut on esitetty kuvassa S1, S2 ja S3. Kuviossa. 5C, Metylointia profiilit osoittivat, että hinnat metyloitu CpG sivustoja (mCpG /yhteensä CpG numero) olivat 72,2% ja 60,0% vuonna HepG2 ja LS174T soluja, tässä järjestyksessä, joka on paljon suurempi kuin metylaatio hinnat mitataan QBC-939 (20,0%) ja U251 (11,1%) soluista. Lisäksi kun 1 uM DCA hoitoa HepG2, määrien metyloitu CpG sivustoja laski 13,3% (Fig. 6). Koska hypermetyloitunut CpG sivustoista OCTN2 pelastetaan DCA hoitoa HepG2 ja LS174T soluja, nämä löydökset antavat suoraa näyttöä, että yksittäiset metyloitu CpG sivustoja promoottori voi tarkasti säätelemään OCTN2.

(A), genomisen sekvenssin ulottuu -325–92 emäsparin promoottori Region-1

OCTN2

. Kahdeksantoista CpG Kohteet sijaitsivat ja merkitty. (B), bisulfiitti genomisen sekvensoinnin analyysi Region-1

OCTN2

HepG2-soluissa. Bisulfiitti modifioitu DNA monistettiin BSP kuten kohdassa

Materiaalit ja menetelmät

ja sitten sekvensoitiin. Tähti edustaa metyloitu CpG sivustoja. (C), DNA: n metylaatio profiileja yksittäisen metyloitu CpG-dinukleotidien neljä syöpäsolulinjoissa. Sen jälkeen BSP, viisi kloonia satunnaisesti valittu ja sekvensoitiin. Metyloidut sekvenssit tarkastettiin linjaus MethBLAST. Avoin ja suljettu ympyrät edustavat metyloimattomia tai denaturoitua sytosiinit, vastaavasti.

(A), bisulfiitti genomisen sekvensoinnin analyysi DCA-käsiteltyjen HepG2-soluissa. Käsittelyn jälkeen DCA, DNA uutettiin ja suoritettiin bisulfiittimodifikaatio. Bisulfiitti modifioitu DNA monistettiin BSP kuten kohdassa

Materiaalit ja menetelmät

ja sitten sekvensoitiin. Tähti edustaa metyloitu CpG sivustoja. (B), DNA: n metylaatio profiileja yksittäisen metyloitu CpG-dinukleotidejä DCA-käsiteltyjen HepG2-soluissa. Sen jälkeen BSP, viisi kloonia satunnaisesti valittu ja sekvensoitiin. Metyloidut sekvenssit tarkastettiin linjaus MethBLAST. Avoin ja suljettu ympyrät edustavat metyloimattomia tai denaturoitua sytosiinit, vastaavasti.

Effects of DCA tehostaminen herkkyys syöpäsolujen oksaliplatiinista

edelleen ymmärtää, jos metylaatiotilan

OCTN2

geeni vaikuttaa herkkyys syöpäsolujen oksaliplatiini, syövän soluja, jotka on esikäsitelty DCA seurasi altistus oksaliplatiini. Solujen elinkelpoisuus arvioitiin ja IC

50-arvot laskettiin. Kuviossa 7., kun solut altistettiin oksaliplatiiniannoksella 3, 10, 33 ja 100 uM, solujen elinkelpoisuuden DCA-käsiteltyjen HepG2 ja LS174T oli laski verrattuna DMSO-käsiteltyihin soluihin (

p

0,05 ), mutta eivät muuttuneet U251 ja QBC-939 soluja. Kuviossa. 7B, IC

50-arvot DCA-käsiteltyjen HepG2 ja LS174T solut laski 51,6% ja 44,8% (

p

0,05), tässä järjestyksessä, verrattuna DMSO-käsiteltyihin soluihin, mutta pysyivät ennallaan in QBC-939 ja U251-solut. Siksi on mahdollista, että DCA herkistää HepG2 ja LS174T solujen oksaliplatiinille lisäämällä OCTN2 ilmaisun ja sisäänoton parantamiseksi oksaliplatiinin.

Syöpä soluja esikäsiteltiin 1 uM DCA 1 viikko, kylvetään 96- levyt 1 x 10

4 solua /kuoppa 100 ui DMEM ja 10% FBS: ää. 8 tunnin kuluttua solut altistettiin oksaliplatiini eri pitoisuuksina (0,1, 0,3, 1,0, 3,3, 10, 33, 100 tai 330 uM) 48 tunnin ajan tuoreessa elatusaineessa. Solujen elinkyky määritettiin MTS-soluun lisääntyvien määrityksessä kit. Kukin konsentraatio määritettiin kolmena kuoppiin. Esitetyt tiedot edustavat keskiarvoa ± S.D. Kolmen riippumattoman kokeen. (A), solujen elinkelpoisuuden kussakin pitoisuudessa oli näkyvissä. Merkittäviä eroja DMSO hoito on merkitty tähdellä (*,

p

0,05). (B), IC

50-arvot laskettiin SPSS 13.0 ohjelmistolla. Esitetyt tiedot edustavat keskiarvoa ± S.D. Kolmen riippumattoman kokeen. Merkittäviä eroja ei-käsitellyistä soluista on merkitty tähdellä (*,

p

0,05).

Keskustelu

Tässä tutkimuksessa havaitsimme, että hypermetylaation sisällä

OCTN2

promoottori vastaa alas-säätely

OCTN2

HepG2 ja LS174T soluja. Olemme juuri havainneet astetta metylaation yksittäisten metyloitu CpG sivustoja promoottorialueen MSP ja BSP, joka korreloi käänteisesti ilmentymisen OCTN2 eri syöpäsoluissa. Lisäksi DCA esikäsittely HepG2 ja LS174T-solujen määrä nousi oksaliplatiinia solukuolema kautta OCTN2 demetylaation.

keskeinen rooli DNA: n metylaatio on herättänyt paljon kiinnostusta mahdollisena mekanismi taustalla poikkeava ilmentymä onkogeenien, tuumorisuppressorin geenejä ja DNA: n korjaukseen geenien karsinoomasoluja. Viimeaikaiset havainnot osoittavat rooli DNA: n metylaation säätelyssä ilmentymisen kuljettajat, kuten SLC22A1, A2, A3 (Lok1, OCT2, Oct3), SLC22A18, SLC5A8, Ntcp, Oatp1b2, BSEP, ABCG2, ABCG5 /G8 [22] – [ ,,,0],27]. Mekanismin ymmärtämiseksi, jolla OCTN2 ilmentyminen on tukahdutettu HepG2 ja LS174T-soluja, käsittelimme näitä solulinjoja demetyloiva reagenssin DCA ja havaittu lisääntyminen OCTN2 mRNA: ta ja proteiinia tasot HepG2 ja LS174T-soluja, kun taas mitään muutosta tapahtunut QBC-939 ja U251-solut. Tuoreessa tutkimuksessa todettiin myös, että alhaisia ​​OCTN2 korotettiin DCA inhimilliseen papillomavirus16 E6- ja E7- ilmentävien keratinosyyteissä [17]. DCA estää DNA metyylitransferaasi entsyymejä (DNMTs) ja edelleen turmelee eheyden metylaation jälki, mikä johtaa häiriintymisen epigeneettiset allekirjoituksia ja geenin ilmentymisen säätelyyn [28]. Siten nämä havainnot viittaavat siihen, että säätelyä alaspäin OCTN2 HepG2 ja LS174T solut voivat johtua poikkeava promoottori metyloinnin.

Analysoidaan kolmen oletetun CpG saarilla

OCTN2

, havaitsimme, että CpG-saarekkeiden näytetään eri metylaatio tiloja eri syöpäsoluja, ja että hypermetylaation voitaisiin vähentää DCA. Siksi pyrimme mitkä CpG saari on keskeinen rooli säätelyssä OCTN2 ilmaisua. Vuonna lusiferaasireportterigeenin määritys, ainoastaan ​​promoottorialueen-1 ulottuu -354-85 bp osoittivat lisääntynyttä promoottorin aktiivisuutta. Lisäksi metylaatio Region-1, joka jäljittelee metylaatiovyöhykkeiden soluissa, esti täydellisesti promoottorin aktiivisuutta. Tämä tulos antaa todisteita siitä, että alue 1 on mahdollista määräävä OCTN2 ilmaisun, koska hypermetylaatiota Alue-1 inhiboi transkriptionaalista aktiivisuutta OCTN2 on LS174T ja HepG2-soluissa.

bisulfiittimodifiointi genomisen sekvensoinnin osoittaa tarkasti yksittäisten metyloitu CpG sivustoja sisällä promoottori Region-1, joka oli merkittävästi hypermetyloitunut HepG2 ja LS174T verrattuna QBC-939 ja U251-solut. Aste DNA: n metylaatio oli korreloi käänteisesti ilmentymistä OCTN2 näissä syöpäsoluissa. Nämä havainnot voi kohtuudella selittää alempia OCTN2 HepG2 ja LS174T soluja verrattuna ilmentymisen QBC-939 ja U251-solut. Lisäksi DCA käänteinen metyloinnin CpG sivustoja Region-1 HepG2-soluissa sopusoinnussa kasvua OCTN2 ilme.

Metyloidut CpG dinukleotidissä promoottori Region-1 ilmentymisen inhiboimiseksi

OCTN2

luultavasti kahteen mekanismiin. Ensinnäkin monet transkriptiotekijän sidonnat voidaan estää metyloituja CpG dinukleotidien sisällä

OCTN2

promoottori. Analysoimme promoottori Region-1

OCTN2

mukaan TFSEARCH ohjelmisto (https://www.cbrc.jp/research/db/TFSEARCH.html), ja totesi, että konsensus sitoutumiskohtien transkriptiotekijän spesifisyys proteiini 1 (SP1) ja myelooinen sinkkisormipolypeptidiin 1 (MZF-1) päällekkäin joitakin keskeisiä CpG sivustoja (Kuva S4). Edelleen on käynnissä tutkia, onko metylaatio spesifisten CpG sivustoja lohkoja nämä transkriptiotekijät. Toinen mahdollinen mekanismi on poikkeava säätely-DNA-metyylitransferaasi entsyymien ja metylointi riippuvainen rekrytointi nukleoproteiinikompleksien tekijät, kuten metyyli-CpG sitovan proteiinin MeCP1 ja MeCP2 [29] – [31]. Tutkimme miten hypermetyloitunut CpG sivustoja OCTN2 värvätäkseen metylaatio liittyviä proteiineja ja tukahduttaa ilmaisun OCTN2.

Koska keskeistä roolia OCTN2 syöpäsolun oton ja siten hoidon tehokkuuden oksaliplatiinia, metylaation

OCTN2

voidaan käyttää kohteena parantaa terapeuttista tehoa. Käsiteltiin 1 uM DCA, HepG2 ja LS174T solut tulivat herkempiä oksaliplatiinia, mutta ei QBC-939 ja U251-solut. Lisäksi DCA käsitellyissä soluissa, lisääntynyt ilmentyminen OCTN2 siirrettävä suurempi oksaliplatiinin otto ja sytotoksisuus kuin ei-DCA käsitellyt solut. Vaikka DCA suurina pitoisuuksina aiheuttaa maailmanlaajuisen genomi- epävakautta ja sytotoksisuutta, DCA pieninä pitoisuuksina vaikuttaa lähinnä estämään DNMT sijaan aiheuttaa solukuoleman [32]. Siten DCA oli samanaikaisesti oksaliplatiinin, ja tuloksena palauttaminen OCTN2 ilmaisun tehostetun omaksumista ja tehoa oksaliplatiinin.

Johtopäätös

Yhteenvetona me paljasti epigeneettiset mekanismi alassäätöä on

OCTN2

erilaisissa syöpäsoluissa. Promoottori alue ulottuu -354-+85 oli määräävä OCTN2 ilmaisua. Aste metyloitu CpG sivustojen alueella on kääntäen korreloi tasot OCTN2 syöpäsoluissa. Soveltaminen demetyloiva agentti, DCA, käänteinen hypermetylaation tilan

OCTN2

promoottori ja lisääntynyt OCTN2 ilmaisun, mikä johtaa parantunutta sisäänottoa oksaliplatiinia aiheuttavan syöpäsolujen olevan herkempiä oksaliplatiinille. Koska olennainen merkitys OCTN2 syöpäsolun oton ja siten hoidon tehokkuutta useiden kemoterapeuttisten, esikäsittelyyn demetyloivan reagenssi on mahdollinen strategia optimoimiseksi lääkehoidon syöpiä vastaan.

tukeminen Information

Kuva S1.

Metylointi profiilit ympäri transkription aloituspaikan on

OCTN2

in LS174T soluissa. DNA uutettiin ja suoritettiin bisulfiittimodifikaatio. Bisulfiitti modifioitu DNA monistettiin BSP ja sekvensoitiin kuten kohdassa

Materiaalit ja menetelmät

. Tähti edustaa metyloitu CpG sivustoja.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0076474.s001

(TIF) B Kuva S2.

Metylointi profiilit ympäri transkription aloituspaikan on

OCTN2

in QBC-939 soluja. DNA uutettiin ja suoritettiin bisulfiittimodifikaatio. Bisulfiitti modifioitu DNA monistettiin BSP ja sekvensoitiin kuten kohdassa

Materiaalit ja menetelmät

. Tähti edustaa metyloitu CpG sivustoja.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0076474.s002

(TIF) B Kuva S3.

Metylointi profiilit ympäri transkription aloituspaikan on

OCTN2

in U251-soluissa. DNA uutettiin ja suoritettiin bisulfiittimodifikaatio. Bisulfiitti modifioitu DNA monistettiin BSP ja sekvensoitiin kuten kohdassa

Materiaalit ja menetelmät

. Tähti edustaa metyloitu CpG sivustoja.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0076474.s003

(TIF) B Kuva S4.

Transkriptiotekijän sitoutumiskohdan analyysi promoottorialueen

OCTN2

mukaan TFsearch ohjelmisto. Paljastaa mekanismi, jossa metyloitua CpG sivustoilta estävät

OCTN2

transkription, me kartoitettu oletetun konsensussekvenssejä transkriptiotekijät. CpG sivustot ovat punaiset viivat. Putatiiviset konsensussekvenssit on merkitty katkoviivoilla.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0076474.s004

(TIF)

Taulukko S1.

Alukkeet Quantitative RT-PCR, MSP ja BSP.

doi: 10,1371 /journal.pone.0076474.s005

(PDF) B Taulukko S2.

Alukkeet rakentamiseen lusiferaasin reportterivektoreita.

doi: 10,1371 /journal.pone.0076474.s006

(PDF) B

Kiitokset

Olemme kiitollisia Dr . Jie Liu ja Dr. Helen Renaud, joka tarjotaan kielen apua.