Krooninen sairaus

tiivistelmä

NCI-60 paneelin 60 ihmisen syöpäsolu-linjat yhdeksästä eri kudosten alkuperä on laajalti tunnettu biologinen, molekyyli- ja farmakologiset tutkimukset. Analyysit saatujen tietojen tutkimukset ovat tuottaneet arvokasta tietoa ymmärtämisen solun prosesseja ja kehittämään strategioita diagnosointiin ja syövän hoitoon. Tässä Affymetrix® GeneChip ™ miRNA version 1 oligonukleotidigeenisirumenetelmää käytettiin määrittämään 847 MikroRNA tuottaa lausekkeen aineisto 495 (58,4%) MikroRNA, joiden on havaittu ilmaistaan ​​ainakin yksi solulinja NCI-60-paneeli. Tarkkuus mikroRNA mittausten osittain vahvistettu käänteistranskriptio ja polymeraasiketjureaktion määrityksissä. Samankaltainen kuin yksi neljästä nykyisten NCI-60 microRNA aineistoja, viskositeettiluku uuden ilmaisun aineisto neljän muun oli vaatimaton, jolloin keskimääräinen Pearsonin korrelaatiokertoimet 0,37-0,54. Tästä huolimatta, vertailukelpoisia tuloksia eri tietoaineistoja havaittiin ryhmittely solulinjojen niiden microRNA ilmaisua, tasauspyörästö ilmaus MikroRNA viivojen ”kudoksen alkuperän, ja korrelaatio spesifisten MikroRNA kanssa kaksinkertaistaa ajan solujen tai niiden säteilyherkkyydestä. Mutaatio tila solulinjojen varten

TP53, PTEN

ja

BRAF

mutta ei

CDKN2A

tai

KRAS

syöpään liittyvien geenien havaittiin liittyä muutoksiin spesifisten MikroRNA. MicroRNA aineisto syntyy tässä pitäisi olla arvokasta työskenteleville alalla MikroRNA sekä integromic tutkimuksia NCI-60 paneeli.

Citation: Patnaik SK, Dahlgaard J, Mazin W, Kannisto E, Jensen T, Knudsen S, et ai. (2012) Expression of MikroRNA NCI-60 Cancer Cell-Lines. PLoS ONE 7 (11): e49918. doi: 10,1371 /journal.pone.0049918

Editor: Sumitra Deb, Virginia Commonwealth University, Yhdysvallat

vastaanotettu: 06 elokuu 2012; Hyväksytty: 15 lokakuu 2012; Julkaistu: 28 marraskuu 2012

Copyright: © 2012 Patnaik et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Työ rahoittivat Roswell Park Cancer Institute, Buffalo, New York, Yhdysvallat, ja Medical ennuste Institute, Hørsholm, Tanska. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat lukenut lehden politiikan ja ovat seuraavat ristiriitoja: co-kirjoittajat JD , WM ja SK ovat /olivat työntekijöitä Lääketieteellisen Prognoosi Institute, Hørsholm, Tanska, joka keskittyy kehittämiseen ja kaupallistamiseen microarray-pohjainen tekniikka käytettäväksi potilaiden hoitoa syöpään. Tämä ei muuta niiden noudattamista kaikki PLoS ONE politiikan tietojen jakamista ja materiaaleja. Yksi yhteistyössä laatijat käsikirjoituksen, Sai Yendamuri (SY) on PLoS One Editorial hallituksen jäsen. Tämä ei muuta tekijöiden noudattaminen kaikki PLoS ONE politiikan tietojen jakamista ja materiaaleja.

Johdanto

järjestelmällinen tutkimukset sarjaa solulinjojen ovat tarjonneet oivalluksia biologisista prosesseista ja niiden mekanismit , ja ovat osoittautuneet hyödyllisiksi määrittelemisestä diagnostisia ja terapeuttisia lähestymistapoja. Esimerkiksi, fosfataasi ja tensin homologi (PTEN): sta riippuvaista ja riippumattaman tuumorisuppressorigeenin mekanismeja on tunnistettu käyttäen paneelia melanooma solulinjojen [1], ja geneettiset markkerit herkkyys anti-syöpälääke, trastutsumabi (Herceptin ™) on rajattu käyttäen paneelia rintasyövän solulinjat [2]. NCI-60 paneelin 60 ihmisen tuumorisolulinjoja erilaisia ​​histologialtaan ja yhdeksän eri kudosten alkuperä kehitti National Cancer Institute (NCI) USA 1980-luvun lopulla varten seulonta syöpälääkkeet [3]. Kahden viime vuosikymmenen aikana, NCI-60-soluja on käytetty testaamiseen yli 150000 kemiallisia yhdisteitä ja luonnontuote uutteita lääkekehityksen [4]. Lukuisat tutkimukset ovat profiloitu solujen fenotyyppiset ominaisuudet, kuten kaksinkertaistumisaika, lääkevuoto-, ja säteilyherkkyydestä, ja luonnehdinta niiden genomien ja tasot RNA, proteiinien ja metaboliittien [5], [6], [7]. Tietojen analyysi integroitu useista tutkimuksista on myös saatu merkittäviä oivalluksia biologisten ja kliinistä merkitystä [8].

MikroRNA, lyhyt ei-koodaavat RNA: t, merkittävää osuutta soluprosesseissa kohdistamalla koodaavan mRNA-transkriptien estävän käännös tai aiheuttaa niiden hajoamista. Ihmisillä 2042 lajia kypsän MikroRNA on todettu kohti uusimman version (19, elokuu 2012) on miRBase mikroRNA järjestyksessä arkiston [9]. Säädeltyyn ilmentyminen MikroRNA esiintyy monia sairauksia, kuten syöpää [10], ja tämä havainto on johtanut useisiin tutkimuksiin, jotka osoittavat terapeuttista ja biologisten merkkiaineiden hyödyllisyys näiden molekyylien [11], [12]. Arviointi MikroRNA ilmaistu NCI-60 paneeli solulinjoista on osoittautunut hyödylliseksi tunnistamisessa, muun muassa biologisia rooleja erityisten MikroRNA [13], [14], mekanistinen emäkset ja biologisten merkkiaineiden potentiaalia MikroRNA huumeiden herkkyys [ ,,,0],15], [16], geneettisten allekirjoituksia sairauksiin [17], [18], ja rakenteellinen esiliinan mikroRNA säätelyverkostojen [19], [20].

ilmentymistä MikroRNA NCI-60 solut ensin määrällisesti 2007 Gaur, et al. [21] ja puhallin, et al. [22] Tutkimuksissa että vastaavasti tutkinut 241 ja 321 lajien molekyylien. Nykyisen tutkimuksen tarkoituksena oli laajentaa NCI-60 microRNA ilmentymisen profiilit kattamaan useita satoja MikroRNA, jotka on sittemmin löydetty. Vaikka tämä tutkimus on ollut vireillä kaksi muuta ryhmät ovat julkaisseet tietoja kvantifioinnissa 700 MikroRNA NCI-60 paneelin [23], [24]. Täällä, lisäksi sukupolvi ja luonnehdinta uuden mikroRNA ilmaus aineisto, kuten useita aineistoja verrataan, ja analyysit tiedolla soluproliferaatioon, mRNA ilmaisu, onkogeenimutaatiot tai säteilyherkkyydestä tutkimuksista solun line paneeli raportoidaan.

Materiaalit ja menetelmät

eristäminen RNA soluista NCI-60-Panel

kunkin 60 solulinjojen NCI-60-paneeli (taulukko S1), yksi ml pakastetut solut (1-2 x 10

6) solussa-linjakohtaiset viljelyväliaineeseen, joka sisälsi 10% dimetyylisulfoksidia saatiin Developmental Therapeutics Program (DTP) on Division of Cancer Treatment ja diagnoosi NCI. Välittömästi ennen RNA: n eristämistä, solut sulatettiin vesihauteessa 37 ° C: ssa viisi minuuttia ja kerättiin sentrifugoimalla 200 g viiden minuutin ajan huoneenlämpötilassa. Eristäminen kokonais-RNA soluista käyttäen Mirvana ™ Kit (Ambion®, Austin, TX) tehtiin satunnaistettu erissä 12-24 solulinjojen neljän päivän kuluessa 10 päivää saada soluista. RNA-pitoisuus mitattiin absorbanssi spektrofotometrillä on NanoDrop ™ 2000 väline (Thermo Scientific®, Waltham, MA).

kvantifiointi MikroRNA Reverse Transcription-PCR (RT-PCR) B

Tasot Aikuiset MikroRNA

miR-16

,

-21

,

-30a-5p

,

-106a

ja

-200b

vuonna 50 ng kokonais-RNA: ta mitattiin käyttäen TaqMan ™ microRNA käänteistranskriptio kit ja RT-PCR-määritykset (Applied Biosystems®, Foster City, CA), kuten per-protokollia valmistaja ehdottaa. Tunnistenumerot mikroRNA määrityksissä olivat 391, 397, 417, 578, ja 1800, vastaavasti. RT ja PCR-reaktioissa kaikille RNA-näytteet tehtiin yhdessä kunkin microRNA määritystä. Cycle kvantifiointi (C

q) arvot laskettiin keskiarvona C

q arvot tunnistettiin SDS-ohjelmiston (versio 2.3; Applied Biosystems®) varten kolmena kappaleena 40 syklin PCR-reaktiot, jotka suoritettiin 7900HT lämpösyklilaitteessa (Applied Biosystems®).

Microarray Hybridisaatio

GeneChip- ™ miRNA array (versio 1, Affymetrix®, Santa Clara, CA) alustan käytettiin määrällisesti MikroRNA yhteensä RNA eristettiin NCI-60 solut. Yksi ug RNA polyadenyloitua ja liitettiin biotinyloidulla 3DNA ™ dendrimeereissä käyttäen FlashTag ™ biotiini HSR RNA Labeling Kit (Genisphere®, Hatfield, PA). Leimattu RNA, tilavuudessa 80 ui, kuumennettiin 99 ° C: ssa 5 minuuttia ja sitten 45 ° C: ssa 5 minuuttia kuormituksen array käyttämällä materiaalia ja menetelmien kanssa Affymetrix® GeneChip ™ hybridisaatio, pesu ja Stain pakki. RNA-array hybridisaatio suoritettiin sekoittaen 60 kierrosta minuutissa 16-18 tunnin ajan 48 ° C: seen Affymetrix® 450 Fluidics Station, minkä jälkeen taulukot pestiin ja streptavidiini-fykoerytriini-konjugaattia käytettiin havaitsemiseen sitoutuneen RNA: iden on taulukot kanssa GeneChip- ™ Systems 3000Dx2 (Affymetrix®) konfokaali laser-skannaus mikroskooppia. Signaalin arvot laskettiin käyttäen Affymetrix® GeneChip- ™ komentokonsoli ohjelmistoa. Tiedot kaikista paneelit oli matala taustamelu, samanlainen jakeluun signaaleja endogeenisen RNA: ita, ja samanlainen ja pitoisuudesta riippuva signaalinjakeluun tiettyjen RNA: t, jotka olivat teräviä RNA näytteitä, ennen kuin ne leimattiin. Raaka-signaali tiedot on talletettu hakunumerolla E-MTAB-327 ArrayExpress tietokantaan Euroopan bioinformatiikan instituutin [25].

GeneChip- ™ miRNA versio 1.0 array on 11 um kokoinen 46228 koetin-täplät for 7815 DNA oligonukleotidikoettimia lukien vastaan ​​922 ei-microRNA ihmisen RNA: t, 847 ihmisen MikroRNA, ja 5856 MikroRNA 70 muiden lajien. Koettimina MikroRNA ovat bongattiin array neljänä kappaleena. Array on myös 95 epäspesifisiä antureista, kukin täplikäs jopa 94 ​​kertaa, jotka binned GC sisällön. Signaaleja näistä tausta antureista ovat tottuneet tekemään ”poissa” tai ”läsnä” tunnistus puhelut. Yhteensä 72 array hybridisaatiot suoritettiin yhdeksässä, joista kussakin on kahdeksan paneelit, kolmen päivän aikana, ja kaksi, kolme ja neljä erää käytetään ensimmäisen, toisen ja kolmannen päivän, vastaavasti (taulukko S1). Neljänä hybridisaatiot suoritettiin neljä mielivaltaisesti valitun solulinjoja arvioida teknisiä toisintaa (taulukko S1).

Microarray Data Processing

Raw datatiedostot 72 array disointeja käsitellään yhdessä käyttäen Affymetrix® miRNA QC Tool (versio 1.0.33) seuraavien vaiheiden järjestyksessä ehdottivat Genisphere®: tausta havaitseminen, tausta korjaus vankka multichip keskiarvo (RMA) menetelmää [26], kvantiili normalisointi, ja mediaani puola yhteenvetoa [27]. Laadunvalvonta ja välisten rinnakkaisten korrelaatio analyysit käytettiin tunnistamaan paras neljän toiston neljälle RNA-valmisteiden (neljä solulinjoja), jotka analysoitiin neljänä kappaleena. Tiedot loput kolme toistoa jätettiin lopullinen ilme aineisto. Tässä vaiheessa, ilmaisu data matriisi oli signaaliarvojen 7635 ihmisen samoin kuin ei-humaani-RNA: t. Arvot 324 ei-microRNA RNA: t ja 2282 MikroRNA kanssa ”poissa” havaitseminen vaatii kaikkien 60 solulinjoja poistettiin sitten Datamatriisin. Expression of RNA: iden kanssa signaaliarvojen 4x keskimääräinen välinen neljännekseen kantomatka arvot kaikille RNA: t pidettiin poissa, ja RNA: t, jonka ilmentyminen puuttui kaikista solulinjoista sitten ulkopuolelle muihin analyyseihin.

vertailu Olemassa NCI-60 microRNA Expression Tietoaineistot

Esikäsitelty microRNA ilmaisun aineistoja syntyy puhallin, et al. [22], Gaur et ai. [21], Liu, et al. [24], ja Sokilde, et ai. [23] saatiin vastaavasti käyttämällä NCI: n CellMiner ™ verkkosovellus [28], DTP verkkosivuilla, kirjoittajat, ja Gene Expression Omnibus National Center for Biotechnology Information, USA, jossa hakunumero GSE26375. Jotta aineisto on Gaur, et al., Rivi-nimet MikroRNA standardisoitiin nimiä käytetään versiossa 15 miRBase tietokannan [9] on kuvattu aiemmin [23]. Pearsonin korrelaatiokertoimet välillä transformoimattomasta microRNA mittausarvot näissä aineistot ja yksi syntyy tässä tutkimuksessa laskettiin R.

korrelaatio analyysit tasot MikroRNA ja niiden Target mRNA: iden

Raaka geeniekspression data hankitut Affymetrix® GeneChip ™ HG-U133A DNA-oligonukleotidi mikrosiruja ekspressiota varten mRNA: iden 57 60 NCI-60 solulinjoja tämän tutkimuksen voitaisiin saada käyttämällä CellMiner ™ web-sovellus. Luettelo 10392 säilyneitä mRNA: iden (ainutlaatuinen geeni symbolit) ennusti TargetScan 5.1 algoritmi [29] olevan tavoitteisiin 153 säilyneitä mikroRNA perheitä saatiin netissä https://www.targetscan.org. MRNA ekspressiotietojen oli esikäsitellyt käyttäen RMA menetelmää kanssa Affy Bioconductor paketti [30] R, saada normalisoitu ja log

2-transformoituja mikrosirujen signaalin arvoja. Suodatin laitettiin sitten säilyttää arvot ainoastaan ​​ne koettimet, joiden näytteen välillä signaaliarvojen oli ≥1. Niistä 495 MikroRNA katsoi ilmaistu tässä tutkimuksessa, 192, joka kuuluu yhteensä 121 säilytetty mikroRNA perheitä, havaittiin kohdistaminen 6465 ja 10392-mRNA: iden. Gene symbolit 6465 mRNA: iden muutettiin 10612 Affymetrix® koetin tunnisteiden avulla biomaRt Bioconductor paketti [31] R. yhteensä 117004 Pearsonin korrelaatiokertoimet välillä ekspressiotasot 192 MikroRNA ja kohde-mRNA: iden, kuten havaita 10612-koettimet olivat sitten lasketaan R. kahden otoksen t testit Benjamini-Hochberg korjaus väärä löytö määrä (FDR) 5% arviointiin käytettiin merkityksen korrelaatioista. Korrelaatiot laskettiin myös 10 satunnainen permutaatio luokan etikettien (tunnistaa solulinjojen) mRNA ilmaisun aineisto.

Muut

Limma (versio 3.10.0) Bioconductor paketti [32] käytettiin R analyysiä varten differentiaalikaavojen käyttäen log

2-transformoituja ilme arvoja. Tilastolliset analyysit ja graafinen kuvaaja tehtiin käyttäen Excel ™ (versio 12, Microsoft®, Redmond, WA), Prism ™ (versio 5.0c; GraphPad®, La Jolla, CA), ja R (versio 2.12.1). TM4 [33] MultiExperiment Viewer (versio 4.6) käytettiin hierarkkinen klusterointi analyysin optimointi lehtiä-tilaus. Ellei toisin mainita, P-arvo alle 0,05 tilastollisten testien käytettiin pitävät tilastollista merkittävyyttä. Yksityiskohtia korjausta useille testaus varustetaan analyysien tulokset, jos tällaista korjausta sovellettiin.

Tulokset

MicroRNA Expression profilointi NCI-60 Cells Käyttämällä Affymetrix® mikrosirut

GeneChip® miRNA 1,0 mikrosiruja päässä Affymetrix® käytettiin ekspression tutkimiseksi 847 MikroRNA on kokonais-RNA: 60 solulinjojen NCI-60 syöpäsolujen-line panel (taulukko S1). Tämä työ on tehty yli kolme päivää yhteensä yhdeksän erien kahdeksasta RNA-näytteet kutakin (taulukko S1). RNA käytetään ilmaisua profiloinnin saatiin pakastetut solut, samanlainen kuin edellisen tutkimuksen mikroRNA ilmentymisen NCI-60 paneelin [21]. Saanto RNA 1-2 x 10

6 solua solulinjojen vaihteli 11-60 ug (keskiarvo = 37; keskihajonta [SD] = 11).

Tekninen toistettavuus on ilmaisun profilointi menetelmä vahvistettiin tarkastelu hybridisaation tietojen neljä RNA valmisteille, yksi kutakin päässä KM12, PC-3, RPMI-8226 ja OVCAR-8 solulinjoja, jotka määritettiin neljänä kappaleena. Keskimääräinen (ja SD) 75. prosenttipisteet log

2-transformoituja mikrosirujen signaaliarvojen neljänä sarjaa varten 1779 koettimia (847 varten MikroRNA) selityksin ihmisen erityisiä oli 3,58 (0,07), 3,61 (0,12), 3,62 (0,04) ja 3,50 (0,10), tässä järjestyksessä. Sillä 95 prosenttipisteet, arvot olivat 9,60 (0,10), 9,43 (0,09), 9,66 (0,11) ja 9,60 (0,21), tässä järjestyksessä. Keskiarvo (ja SD) 12 itsensä itse Pearsonin korrelaatiokertoimet neljän solulinjojen oli 0,98 ( 0,01), 0,97 (0,01), 0,98 ( 0,01) ja 0,98 (0,01), tässä järjestyksessä. Kunkin solu- linja, neljänä hybridisaatiot suoritettiin eri päivinä, paitsi että OVCAR-8, yhdet nelinkertaisesti määritettiin samassa erässä (taulukko S1). Pearsonin korrelaatiokerroin oli 0,980 tämän parin intra-erän toistojen.

Ainakin yksi 60 solulinjojen ilmaistuna 523 (63,4%) ja 847 MikroRNA havaittavissa microarray-alustan kuten on osoitettu merkittävästi korkeampi signaalin arvot microRNA-spesifisiä koettimia verrattuna ei-mismatch koettimia vastaavien GC-pitoisuuden. Vaikka välisten rinnakkaisten korrelaatiot edellä kuvatun näyttävät erinomainen, lähempi tarkastelu paljasti, että korrelaatiot eivät olleet hyviä pienillä mikrosirujen signaaliarvojen. Tämä näkyy kuvassa S1 neljä toisiinsa jäljitellä vertailuja. Koska tämä osoitti korkea melutaso pienillä signaalin arvoihin, signaali arvoihin perustuva suodatus tehtiin tunnistamiseksi RNA: t, jotka voitaisiin katsoa tarkemmin määrällisesti. Näin ollen ilmaus RNA: iden kanssa signaaliarvojen 4x keskiarvo (18,3) on inter-neljännekseen valikoimia signaalin arvot kaikille hybridisointeja (vaihteluväli 13,3-26,3; SD = 2,7) pidettiin poissa. Kaksikymmentäkahdeksan MikroRNA ilme puuttui kaikista 60 solulinjoja kohti tätä kriteerien jätettiin muihin analyyseihin. Näin ollen, 495 (58,4%) ja 847 MikroRNA havaittavissa microarray alustan pidettiin ilmaistaan ​​ja tiedot niistä käytettiin seuraaviin analyyseihin.

korrelaatio Array- ja RT-PCR-pohjainen microRNA määrällisiä

ainakin osittain tarkkuuden varmistamiseksi array-pohjainen microRNA ekspressiomittaukset, RT-PCR: ää käytettiin määrittämään tasojen MikroRNA

miR-16

,

-21

,

-30a-5p

,

-106a

, ja

-200b

50 ng kutakin RNA valmistelujen 12 solulinjoja. Solu-linjat valittiin sattumanvaraisesti ja MikroRNA olivat mielivaltaisesti poimittiin ne, joissa vähintään puolet solulinjojen oli log

2-transformoidut mikrosirujen signaaliarvo 5. Kuten kuviossa 1 on esitetty, kaksi sarjaa määrityksiä kaikkien viiden MikroRNA oli merkittäviä korrelaatioita (P 0,01) Pearson testeissä, joissa absoluuttinen korrelaatiokerroin ≥0.70. Arvot kulmakerroin lineaarisen regressiosuoran (pienimmän neliösumman menetelmällä) vaihteli

–

0,40 (

miR-16

) ja

–

0,93 (

asennuspalveli- 21

) neljä MikroRNA, mikä osoittaa parempaa havaittavuus MikroRNA kanssa RT-PCR-määritystä. Sillä

miR-200B

, tämä on myös merkittävä kanssa viisi RNA-näytteet, joilla on huono mikrosiru signaaliarvojen (2

1.

2-2

1.

7), mutta havaittavissa RT-PCR C

q arvoja hyvän valikoiman (27,8-34,3). Sillä

miR-30a-5p

, kulmakerroin regressiosuoran oli

–

2.2, mikä viittaa parempaan havaittavuus mikrolastu alustalla.

Pearsonin korrelaatiokertoimet (

r

), P-arvot, ja parhaiten istuva (pienimmän neliösumman) linjat on esitetty RT-PCR C

q ja log

2-transformoituja mikrosirujen signaaliarvojen MikroRNA

miR-16

,

-21

,

-30a-5p

,

-106a

, ja

-200b

(n = 12).

verrattuna olemassa oleviin NCI-60 microRNA Expression Tietoaineistot

Niistä 495 MikroRNA katsotaan ilmaistu joukko 60 solulinjojen tässä tutkimuksessa, 135 (27%), 144 (29%), 299 (60%) ja 359 (73%) oli myös määrällisesti 59 60 solulinjojen in tutkimuksissa puhallin, et al. [22], Gaur et ai. [21], Liu, et al. [24], ja Sokilde, et ai. [23], tässä järjestyksessä. Nämä neljä tutkimukset vastaavasti käyttää mukautettuja 40-mer DNA-siru, TaqMan ™ RT-PCR-määrityksissä, Agilent® 60-meeri-DNA mikrosiruja (versio 2), ja Exiqon® lukittu nukleiinihappo miRCURY ™ mikrosiruja (Dx, versio 9.2) arvioimaan lauseke 321, 241, 723 ja 955 MikroRNA, vastaavasti. Pearson korrelaatio analyysit transformoimat- ilmaisun mittaukset MikroRNA yhteisiä tälle ja puhallin, Gaur, Liu tai Sokilde tutkimusten keskiarvo (ja keskihajonta) Pearsonin kertoimien oli 0,44 (0,30), 0,47 (0,28), 0,54 (0,29) ja 0,45 (0,34), vastaavasti. Fraktiot MikroRNA Pearson kertoimella 0,75 olivat 0,18, 0,16, 0,29 ja 0,24, vastaavasti (kuva 2). Kaikissa neljässä vertailussa, korrelaatiokertoimet olivat korkeammat MikroRNA korkean signaalin arvot kuin ne, joilla on matalat arvot (tuloksia ei ole esitetty). Samanlaisia ​​analyysejä suoritettiin myös vertailla aineistoja sekä Sokilde, et al. ja Liu, et ai. muita vastaan ​​(kuva S2). Kun korreloi Sokilde aineisto kanssa puhallin, Gauri ja Liu aineistoja vastaavasti keskiarvo (ja keskihajonta) Pearsonin kertoimien oli 0,37 (0,32), 0,39 (0,33) ja 0,44 (0,30), tässä järjestyksessä. Arvot olivat 0,47 (0,31) ja 0,42 (0,22) vertailuissa Liu aineisto kanssa puhallin ja Gaur aineistoja, vastaavasti. Siten päätellen korrelaatiot nähdään nykyisten aineistoja, The ’oikeellisuuden ”on mikroRNA ilmaisun aineisto syntyy nykyisessä tutkimuksessa on samanlainen luotujen aikaisemmissa tutkimuksissa. Koska muuttujan herkkyys ja viidestä määrällisesti alustojen Näiden tutkimusten eri MikroRNA, cross-platform vertailua varten solulinjassa korrelaatioita ei suoritettu.

Kumulatiiviset jakaumat on esitetty Pearsonin korrelaatiokertoimet (

r

), jonka bin-koon 0,025 varten MikroRNA määrällisesti tässä tutkimuksessa ja tutkimuksissa puhallin, et al. [22], Gaur et ai. [21], Liu, et al. [24], ja Sokilde, et al. [23] Jakelu kertoimien kanssa ilmentymisen mittaukset Liu, et al. resampled on myös esitetty.

MicroRNA Expression ja kudosten alkuperä

arvioimiseksi jos microRNA lauseke joukossa solulinjojen liittyi kudoksen alkuperästä solulinjojen, ilman valvontaa hierarkkinen klusterointi perustuu keskimääräisiin uncentered Pearsonin korrelaatio suoritettiin käyttäen log

2-transformoituja mikrosirujen signaaliarvojen 495 ilmaistaan ​​MikroRNA (kuvio 3A). Ryhmät leukemia ja melanooma solulinjoja kokonaan erotella omaa itsenäistä klustereita. Kaikki seitsemän, mutta yksi (HCT-116) paksusuolensyöpä solulinjoja liian erillisiä yhdeksi riippumaton klusteri. Samanmuotoi- vankka klusterointi solulinjoista jäljellä kuusi kudosten alkuperää ei havaittu. OVCAR-8 munasarjasyövän solulinjalla ja NCI /ADR-RES solulinja on peräisin se [34], samoin kuin M14 melanoomasolulinjaa ja MDA-MB-435-solulinja on peräisin se [35 ], klusteroitu naapureina odotetusti. Kuitenkin, tämä ei nähty kolmannen parin homologisesta solusta-rivit NCI-60 paneelin U251 solulinjaan ja sen johdannainen, SNB-19 [36]. DNA-sormenjälkien ehdottaa, että verrattuna 94% -97% geneettinen samankaltaisuus muiden kaksi paria, tämä pari riviä on vain 81% samankaltaisia.

. Valvomaton klusterointi 60 NCI-60 solulinjoja log

2-transformoituja microarray signaali arvot 495 ilmaisi MikroRNA näkyy dendrogrammimuodossa. Erityyppiset kudosten alkuperä solulinjojen ilmaistaan ​​niiden väriä (

Pr.

, Eturauhasen). Puu on peräisin uncentered Pearson korrelaatioista, jossa keskimääräinen yhteyksiä käytetään liittämiseen klusterit. Mittakaava vasemmalla edustaa solmu-korkeuksiin.

B

. Heat-kartta, jossa on pseudo-väri mittakaavassa alapuolella, Z skaalata microarray signaali arvot 60 solu- linjat sarjaa kahdeksan MikroRNA jokaisella on alhaisin P-arvot kokeessa differentiaalikaavojen solu-linjojen tietyn kudoksen alkuperän verrattuna kaikkiin muihin solulinjojen. Molemmat solulinjat ja MikroRNA ryhmitellään kudoksen alkuperän. Z skaalaus tehtiin pitkin rivejä (by microRNA).

Tunnistaa MikroRNA differentiaalisesti ilmaistut solulinjojen tietyn kudoksen alkuperä verrattuna kaikkiin muihin solulinjojen, empiirinen Bayes valvottu t- tilastot ja Benjamini-Hochberg korjaus FDR 5% käytettiin. Ryhmien solulinjojen keskushermoston syöpä (n = 6), paksusuolen syöpä (n = 7), leukemia (n = 6), melanooma (n = 9), munasarjasyöpä (n = 7) ja munuaissyöpään (n = 8), vastaavasti, osoittivat ero ilmentyminen 83 (17%), 37 (7%), 137 (28%), 74 (15%), 14 (3%) ja 3 (0,6%) ja 495 MikroRNA läsnä koko aineisto. Ei ilmentyvät eri MikroRNA voitaisiin tunnistaa ryhmissä solulinjoista peräisin rintojen (n = 6), NSCLC (n = 9) tai eturauhasen (n = 2) syöpä vaikka ryhmillä oli 10 (2%), 24 (5% ) ja 4 (0,8%) MikroRNA jota varten P-arvot olivat 0,05 ilman säätämistä varten vääriä löytö. Lämpö-kartat kuvioissa 3B ja S6 esittää ilmentymisen kahdeksan MikroRNA kunkin yhdeksään ryhmään solulinjoista, jolla on pienin P-arvot. Detaljitilastot 72 koko MikroRNA annetaan taulukossa S2.

MicroRNA Expression ja säteilyherkkyydestä

Amundson, et al. ovat tutkineet gammasäteily herkkyys 59 60 solulinjojen Tämän tutkimuksen määrittää seitsemän erilaista säteilyä selviytymisen parametrit [37]. Muuttujia ovat SF2, SF5 ja SF8, osa solupopulaation, joka selviää altistumisen jälkeen 2, 5 ja 8 Gy säteilyn, vastaavasti. Voit tarkistaa, onko NCI-60 solulinjoista voidaan valikoituja kahteen säteilylle herkkä ja kestävä ryhmät samankokoisia, kuten on tehty huumeiden herkkyys (esim [6], [38], [39]), joka on parametriton menetelmää käytettiin arvioitaessa Gaussin ydin tiheydet säteilyn vastetiedot jälkeen loki

2 transformaatio ja z-pisteet normalisointi. Bimodaalinen jakelu samoin kokoinen herkkiä tai resistenttejä ryhmien ei havaittu mitään seitsemästä säteilyn eloonjäämisen parametrit (kuva S3). Säteily parametrit pidetään näin ollen jatkuvia muuttujia ja Pearsonin korrelaatio analyysit log

2-muunnettuja parametrejä arvot log

2-transformoituja microRNA ilmaisu arvot tehtiin. Vaikka merkittäviä korrelaatioita absoluuttisen Pearson kerroin 0,5 ei nähty neljälle säteilyherkkyydestä parametreja, ne olivat läsnä 30 (6%), 27 (5%) ja 33 (7%) ja 495 ilmaisi MikroRNA tämän tutkimuksen for SF2, SF5 ja SF8, vastaavasti (kuva S4). Kuitenkin korrelaatiot kaikkien kolmen parametrit riippui enemmän kuusi erittäin säteilyherkästä leukemian solulinjoja NCI-60 paneeli. Kun leukemia linjat jätettiin korrelaatio analyysit, ilmaus yksikään 495 MikroRNA korreloi absoluuttinen Pearson kerroin 0,5 johonkin kolmesta säteilyherkkyydestä parametreja. Tulokset olivat samankaltaisia, kun microRNA ilmaus aineistoja Liu, et al. ja Sokilde, et ai. analysoitiin (kuvio S4). Kuten luetellaan taulukossa S3, 10, neljä ja 14 MikroRNA että aineistot nykyisen tutkimuksen, Liu, et al., Ja Sokilde, et ai., Vastaavasti, oli absoluuttinen Pearson kerroin 0,4 vähintään yhden SF2, SF5 ja SF8. MikroRNA

let-7i

,

miR-142-5p

ja

miR-193B

olivat yhteisiä tuloksia kolmen aineistot.

Association of MikroRNA kanssa onkogeenimutaatiot

mutaatiostatus 24 onkogeenien tunnetaan 59 60 solulinjojen tämän tutkimuksen [40]. Joidenkin geenien –

BRAF

,

CDKN2A

(

P16

),

KRAS

,

PTEN

, ja

TP53

– onkogeeninen mutaatiot esiintyä 10 solulinjojen, joka mahdollistaa vertailun mikroRNA ekspressiotasoja ryhmien välillä mutanttien ja villityypin solu- linjat. Käyttämällä empiirinen Bayes moderoitu t-tilastot ja Benjamini-Hochberg korjaus FDR 5%, MikroRNA

miR-29b

ja

miR-769-3p

havaittiin olevan vain kaksi MikroRNA että oli ilmennetty eri välillä 47 mutantti

PTEN

ja 12 villityypin

PTEN

linjat (P 0,01 molemmille MikroRNA). Vastaavalla analyysissä MikroRNA

miR-34a

ja

miR-34a *

(

miR-34a-3p

) todettiin olevan vain kaksi MikroRNA jotka olivat eri tavalla ilmaisi välillä 43 mutantti

TP53

ja 16 villin tyypin

TP53

linjat (P 0,01 molemmille MikroRNA). Ero ilmentyminen neljän

PTEN

– tai

TP53

-associated MikroRNA on kuvattu kuviossa 4.

BRAF

geenin, jonka 11 solulinjoja mutaatioita , 40 MikroRNA oli ilmennetty eri, jossa

miR-146a

ja

miR-509-3p

yli-ilmennetään ja

miR-149

ja

MR-192b

ali-ilmentynyt eniten (taulukko S5). Tämä suuri määrä eri tavoin ilmaistuna MikroRNA voi olla, koska kahdeksan 11

BRAF

mutantti solulinjoja ovat melanooma solulinjoja. Ei ilmentyvät eri MikroRNA tunnistettiin tällaiset analyysit varten

CDKN2A

(33 mutantti solu-linjojen) tai

KRAS

(11 mutantti solu-linjat).

Dot tontteja mediaanit ja inter-neljännekseen vaihteluvälit on esitetty ilmaus MikroRNA

miR-29b, -34a

,

-34a *

ja

-769-3p

59 NCI-60 solulinjat ryhmitellään mutaatio asema

PTEN

tai

TP53

geenejä.

Korrelaatio tasot MikroRNA ja niiden Target mRNA: iden

merkittäviä korrelaatioita ilmentymisen MikroRNA ja mRNA: t havaittiin 3483 (3%) ja 117004 pareina MikroRNA ja niiden kohde-mRNA: iden, kuten ennusti TargetScan algoritmi. 3483 paria koostui 167 MikroRNA ja 1232 tavoite mRNA: iden ainutlaatuinen geeni symboleja. Niistä 3483 merkittäviä korrelaatioita, 1997 (57%) olivat negatiivisia ja 1486 (43%) oli positiivisia (kuva S5). Sen sijaan, keskiarvo ja SD varten useita merkittäviä korrelaatioita nähty 10 satunnainen permutaatio mRNA ilmaisun aineisto siirtyä solulinjassa tunnisteet olivat 21,3 ja 6,6, vastaavasti. Jossa Benjamini-Hochberg korjaus FDR alle 5%, keskiarvon ollessa 174 odotettiin. Lisäksi arvot 117004 korrelaatiokertoimet saatu mRNA ilmaisun aineisto olivat merkittävästi erilaiset Wilcoxonin summa testit (P 2 x 10

-16) niistä on saatu millä tahansa 10 permutoiduista aineistoja.

keskustelu

ilmentyminen 847 MikroRNA NCI-60 paneeli ihmisen tuumorisolulinjoja tutkittiin tässä tutkimuksessa käyttämällä Affymetrix® GeneChip- ™ miRNA 1.0 DNA oligonukleotidigeenisirumenetelmää tuottaa aineisto 495 MikroRNA tunnistettu ilmaistu vähintään yksi 60 linjaa paneelin. Siten tutkimus laajentaa microRNA kattavuus kolme neljästä nykyisten NCI-60 ilme aineistoja. Nämä sarjat olivat itsenäisesti luotu käyttämällä erilaisia ​​korkean suorituskyvyn alustoilla – yksilölliseen 40-mer DNA-siru, TaqMan ™ RT-PCR, Agilent® 60-mer DNA-siru, tai Exiqon® lukittu nukleiinihappo miRCURY ™ microarray – arvioida tasot 321, 241, 723 tai 955 MikroRNA vastaavasti [21], [22], [23], [24]. Kuten on kuvattu kuvioissa 2 ja S2, korrelaatio mikroRNA ekspressiomittaukset yksi viidestä aineistot on vaatimaton, keskimääräinen Pearson kertoimet vaihtelevat 0,37-0,54.