Krooninen sairaus

tiivistelmä

Angiogeneesi ja syövän invasiivisuus suuresti edistää syövän maligniteetti.

Arf6 ja sen efektori, AMAP1, usein yli-ilmentynyt rintasyövän, ja muodostavat keskeisen väylän aiheuttaa hyökkäyksen ja etäpesäke. Tässä reitissä Arf6 aktivoituu EGFR kautta GEP100. Arf6 ilmentyy erittäin myös ihmisen napalaskimon endoteelisolujen (HUVEC) ja on osallisena angiogeneesissä. Tässä olemme huomanneet, että HUVEC myös hyvin ilmaista AMAP1, ja että verisuonten endoteelin kasvutekijän reseptori-2 (VEGFR2) rekrytoi GEP100 aktivoida Arf6. AMAP1 toiminnot sitoutumalla cortactin syövän eteneminen ja metastaasit. Me osoitamme, että sama GEP100-Arf6-AMAP1-cortactin reitti on olennaista angiogeneesiä toimintaa, mukaan lukien solujen migraatiossa ja putkimainen muodostumista, sekä parantamiseksi solun läpäisevyyttä ja VE-kadheriinin endosytoosin VEGF-stimuloidun HUVEC. Komponentit tämän reitin ekspressoidaan voimakkaasti patologiseen angiogeneesiin ja esto tämän reitin estää tehokkaasti VEGF- tai kasvaimen angiogeneesiä ja suonikalvon uudissuonittumisen. GEP100-Arf6-AMAP1-cortactin reitin, aktivoidaan reseptorityrosiinikinaaseissa näyttää olevan yleistä angiogeneesiä ja syövän eteneminen ja metastaasit, ja antaa uuden terapeuttisen tavoitteensa.

Citation: Hashimoto A, Hashimoto S, Ando R, Noda K, Ogawa E, Kotani H, et al. (2011) GEP100-Arf6-AMAP1-Cortactin Pathway Usein käytetyt Cancer Invasion aktivoituu VEGFR2 edistää angiogeneesiä. PLoS ONE 6 (8): e23359. doi: 10,1371 /journal.pone.0023359

Editor: Toru Ouchi, University of Chicago, Yhdysvallat

vastaanotettu: 25 huhtikuu 2011; Hyväksytty: 13 heinäkuu 2011; Julkaistu: 15 elokuu 2011

Copyright: © 2011 Hashimoto et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tuettiin osittain Grants-in-tukea opetus-, tiede-, urheilu ja kulttuuri Japanin (MESSC), Takedan Science Foundation, ja Mitsubishi Foundation. Ei ylimääräistä ulkoista rahoitusta saanut tätä tutkimusta varten. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

verisuonten endoteelin kasvutekijät (VEGFs) ovat tärkeitä tekijöitä osallistuu angiogeneesiin [1] – [4]. Perheenjäsen VEGFs eli VEGF-A, löydettiin alun perin verisuonia läpäisevä tekijä [5]; ja ensisijainen tehtävä VEGF signaloinnin liittyy tehostaminen endoteelisoluselektiivisyyttä läpäisevyys ja uudissuonivuotoihin [6]. Pieni GTPaasi, Arf6, on ollut mukana VEGF signalointi ja angiogeneesiä. On osoitettu, että ilmaus määräävän-negatiivinen muoto Arf6, Arf6 (T27N), ihmisen napalaskimon endoteelisoluja (HUVEC: t) inhiboi verisuonen endoteelin kasvutekijän reseptori-2 (VEGFR2) -välitteisen solunsisäinen signalointi, kuten Rac1 aktivointi [ ,,,0],7]. Tasaisen, tukahduttaminen Arf6 toiminnan kautta Slit2-Robo4 reitin lohkoja angiogeneesiä ja edistää verisuonten vakautta [8]. Kuitenkin mekanismi, miten VEGFR2 säätelee Arf6 aktiivisuutta, sekä mekanismeja, joilla Arf6 toimintojen angiogeneesissä, ja myös muiden näkökohtien VEGF signaloinnin ja edelleen pääosin edelleen heikko.

Pieni GTPaasi, Arf6, ensisijaisesti säätelee kierrätyksen solukalvon komponenttien ja toistaa pleiotrooppisimpien rooleja, mukaan lukien kalvo uloke ja remodeling [9], [10]. Olemme osoittaneet aiemmin, että eri rintasyövän soluissa yli-ilmentävät sekä Arf6 ja sen efektori, AMAP1; ja että yli-ilmentynyt Arf6 ja AMAP1 sitten muodostavat vankan signalointi akselin indusoimiseksi ja metastaasit [11] – [15]. Vuonna invaasio ja etäpesäkkeiden GEP100, guaniininukleotidiä mönvaihtimen Arf GTPaaseja, on ensisijaisesti vastuussa Arf6 aktivointia, ja tämä aktivointi edellyttää yhdistys GEP100 kanssa ligandiaktivoituja kasvutekijän reseptorin (EGFR) [15]. Patologinen analyysit paljastivat, että osia tämän reitin ovat erittäin ilmaistaan ​​40-80% primaarikasvainten ihmisen rinta- [12], [15]. AMAP1 toiminnot sitoutumalla cortactin syövän eteneminen ja metastaasit. Tukkeutumisen GEP100-Arf6-AMAP1-cortactin-reitin siRNA tai inhibiittorit estää tehokkaasti rintasyöpä invaasiota ja etäpesäkkeiden [11] – [13], [15]. Lue-out tämän Arf6 reitin sisältyy häiriöitä E-kadheriinin-pohjainen solu-solu kiinnikkeistä [15], indusoimalla E-kadheriinin endosytoosin (meidän julkaisemattomat tulokset).

Proteiinin ilmentymistä Arf6 on selvästi vahvistunut HUVEC-viljeltynä VEGF ja hiiren takakäpälän iskemian mallia, joissa angiogeneesi on ensisijaisesti riippuvainen VEGF [7], [16]. Täällä, huomasimme, että HUVEC myös erittäin ilmaista AMAP1, verrattavissa havaitut pitoisuudet erittäin invasiivisen rintasyövän soluja. Olemme myös havainneet, että GEP100 fyysisesti assosioituu ligandiaktivoituja VEGFR2 aktivoida Arf6, ja että Arf6 sitten rekrytoi AMAP1. Kuten syövän eteneminen ja metastaasit, AMAP1 toimintoja sitoutumalla cortactin angiogeneesissä. Tämä GEP100-Arf6-AMAP1-cortactin reitti on olennaista paitsi VEGF: n indusoiman endoteelisolujen migraatiota ja putkimainen muodostumista, vaan myös VEGF: n indusoiman parantamiseksi VE-kadheriinin endosytoosin ja solun läpäisevyyttä. Komponentit tämän reitin ovat erittäin ilmaistaan ​​CD31-positiivisia suonia kanssa patologiseen angiogeneesiin ja estää tämän reitin estää tehokkaasti patologista angiogeneesiä. Tuloksemme osoittavat, että GEP100-Arf6-AMAP1-cortactin reitti, aktivoidaan kasvutekijän reseptorityrosiinikinaasit, on yleinen angiogeneesiä ja invaasion ja metastaasin noin rintasyövän soluja, ja siten tarjoaa uusia terapeuttisia kohteita ihmisen sairauksien tunnettu hyper-angiogeneesiä ja pahanlaatuisen syövän kehittymisessä.

Materiaalit ja menetelmät

Solut

HUVEC ostettiin Iwaki ja kasvatettiin endoteelisolujen kasvualustaan-2 (EGM2, Lonza) mukaan valmistajan ohje. Huomaa, että EGM2 sisältää vähäisiä määriä VEGF, pitoisuutta, joka ei ole avoinna yleisölle. MDA-MB-231 ja MCF7-soluja, saatiin American Type Culture Collection, viljeltiin kuten aiemmin on kuvattu [15]. Cos-7-soluja viljeltiin DMEM: ssä, jossa oli 10% vasikan sikiön seerumia (FCS, Hyclone).

Angiogeneesi

kvantifiointi angiogeenisten vastausten suoritettiin suunnatulla

in vivo

angiogeneesimääritys (DIVAA, Trevigen) mukaan valmistajan ohjeiden. Lyhyesti, 20 ui VEGF: ää (500 ng ml

-1) tai MDA-MB-231-soluja (5 x 10

6 ml

-1) injektoitiin angioreactor putkiin, jotka oli täytetty tyvikalvon uutteet; ja putkia, implantoitiin sitten subkutaanisesti selän alueilla nude-hiirissä. Yhdeksän päivän kuluttua putket otettiin talteen ja määrät Isolectin B4 kertynyt tyvikalvon uutteet mitattiin käyttäen monilevylukija fluoresoivaa lukija (ARVO, Perkin Elmer), sen jälkeen, kun proteolyyttisen digestion tyvikalvon. SiRNA hoitoon, RNA-dupleksit sekoitettiin AteloGene (Koken), mukaisesti valmistajan ohjeiden; ja 200 ui seosta ruiskutettiin alasivujen angioreactor putkien jotka on implantoitu hiiriin, päivänä 0 ja päivänä 4. P4-TAT-peptidin ja ohjaus SC peptidi lisättiin osaksi angioreactor putkiin ennen istutusta. Nämä tutkimukset suoritettiin Osaka Bioscience Institute, ja protokollia käytetään eläinkokeiden tässä tutkimuksessa oli hyväksynyt Animal tutkimuskomitea Osakan Bioscience Institute (Luvan numero: 07-103).

Laser aiheuttama CNV

CNV suoritettiin kuten aiemmin on kuvattu [17], [18]. Päivää ennen laserin antoa, 5 mg kg

-1 P4-TAT tai SC peptidi injektoida intraperitoneaalisesti 2 kuukauden ikäiselle C57BL /6-hiiriä (CLEA Japani). Seuraavana päivänä hiiret nukutettiin pentobarbitaalilla (0,05 mg g

-1 ruumiinpainoa) ja oppilaiden laajentuneet 0,5% fenyyliefriini ja 0,5% tropikamidilla (Santen). CNV aiheutettiin kanssa 532 nm laser (Lumenis Novus Spectra). Neljä laser täplät (200 mW, 75 pm pisteen koko, 100 ms) asetettiin kummankin silmän käyttäen viilto-lamppu jakelujärjestelmä ja suojalasi kuin piilolinssin. Tuotanto kupla aikaan laserhoito, osoittaa repeytyminen Bruchin kalvon, on tärkeä tekijä saamiseksi CNV; Näin ollen, vain polttaa jossa kupla on tuotettu otettiin mukaan tähän tutkimukseen. Välittömästi sen jälkeen, laserhoito, 5 mg kg

-1 P4-TAT tai valvontaa salattu peptidiä injektoitiin intraperitoneaalisesti päivittäin 7 päivää. On koepäivänä 8, hiiret nukutettiin ja perfusoitiin vasemman kammion kautta 5 ml PBS: ää ja sen jälkeen 2 ml: lla 0,5%: FITC-leimattu dekstraani (Mr 2000 kDa, Sigma) 1% gelatiinia. Silmät enukleoidaan ja kiinnitettiin 2% paraformaldehydillä 30 minuutin ajan. Etuosan ja verkkokalvon poistettiin sitten silmäsuojus. Noin 4-6 rentouttavaa radial viiltoa tehtiin, ja loput verkkokalvon pigmenttiepiteelin (RPE) -choroidal-kovakalvon kompleksi flatmounted kanssa Vectashield Mounting Medium (Dako) ja peitettiin. Flatmounts tutkittiin mikroskoopilla (BIOREVO, Keyence) ja kuvia kunkin CNV oli digitaalisesti tallennettu. Silmät kanssa aivoverenvuotoon komplikaatioita, kuten lasiaisverenvuoto tai verkkokalvon verenvuoto aiheuttama lasersäteilyn jätettiin arvioinnin. Keskimääräinen koko CNV leesiot mitattiin sitten, ja tiedot esitetään keskiarvona ± s.e.m. jossa

n

kuten. Eläin Kokeet tehtiin mukaisesti Association for Research in Vision ja silmätautien Statement varten eläinten käyttö Oftalmologinen ja Vision Research sekä komitean eläinten käytön ja hoidon Hokkaido University.

VE-kadheriinin endosytoosin

VE-kadheriinin endosytoosin määritettiin VE-kadheriinin vasta-ainetta sitovaa menetelmää, kuten on kuvattu [19]. Lyhyesti, HUVEC, maljattiin maljan tiheydessä, olivat prestarved kanssa EGM2 ilman seerumia 4 tuntia, ja sitten inkuboimalla monoklonaalisen vasta-aineen BV6 (10 mg ml

-1), joka on n solunulkoista domeenia vastaan ​​VE-kadheriinin, 4 ° C: ssa 1 h. Pesun jälkeen pois sitoutumattoman vasta-aineen huuhtomalla solut jääkylmään EGM2, soluja inkuboitiin sitten 37 ° C: ssa 30 min läsnä ollessa tai ilman VEGF (50 ng ml

-1). Sitten solut pestiin 25 mM glysiiniä (pH 2,5), joka sisälsi 3% naudan seerumin albumiinia 15 min ympäröivässä lämpötilassa poistaa pinta-sitoutuneet vasta-aineet, ja kiinnitetään 4% paraformaldehydillä, tehdään läpäiseviksi 0,5% Triton X-100, ja alistettiin merkintöihin internalized BV6 molekyylejä käyttämällä vasta-ainetta hiiren IgG konjugoituna Alexa Fluor 546 (Molecular Probes). SiRNA hoitoon, soluja esi-inkuboitiin RNA-dupleksit 48 tuntia, ennen kuin pinnoitus. TAT-peptidi hoitoon, soluja inkuboitiin TAT peptidien 30 minuuttia 37 ° C: ssa välillä 4 h nälkään ja merkintöjen osalta BV6. Solujen lukumäärä, joilla on vähintään yksi ryhmä viisi tai enemmän haponkestävä VE-kadheriinin-positiivisia rakkuloita rakenteita laskettiin (n 300). Tulokset ilmaistaan ​​keskiarvona ± s.e.m. kolmen itsenäisen kokeen, ja staattinen analyysi suoritettiin käyttäen ANOVA.

Muut menetelmät

GST-GGA avattavasta, immunosaostus, immunoblottauksen, vasta-aineiden ja kemikaalien, cDNA: t, siRNA: t, transfektiot, putkimainen muodostumista, kemotaktisia siirtokuoppaan muuttoliike, kaksi dimentional solumigraatiota aktiivisuuden immunohistokemiallisella värjäyksellä, solun läpäisevyyttä, immunofluoresenssimikroskopian avulla, GST-PH sitova, elinkelpoisuutta ja RT-PCR on kuvattu tukeminen Materiaalit ja menetelmät S1.

tulokset

VEGF aktivoi Arf6 kautta GEP100 endoteelisoluissa

Vaikka Arf6 aktiivisuus on osallisena VEGF-signaloinnin ja angiogeneesiä, sitä ei ole vielä esitetty, onko VEGF aktivoi Arf6. Olemme havainneet, että stimulointi primäärisestä viljelmästä HUVEC VEGF todellakin indusoi aktivointi endogeenisen Arf6 (kuvio 1A). Tämä aktivointi oli ohimenevää, oli korkeimmillaan 1 min ja sitten laski, kuten havaittiin muiden pienten GTPaaseja [20]. HUVEC ilmaista pääasiassa VEGFR2 joukossa VEGFR-perheen jäseniä. Tyrosiinifosforylaatiota VEGFR2 tapahtui 1 min, oli korkeimmillaan 3 min ja laski 10 minuutin kuluttua stimulaation (kuvio 1A).

, aktivointi Arf6 ja tyrosiinifosforylaatio VEGFR2 kun VEGF stimulaation HUVEC. B, kerasaostumiseen GEP100 kanssa VEGFR2 kun VEGF stimulaation HUVEC, analysoitiin anti-GEP100 immunosaostuksella (IP) ja anti-VEGFR2 immunoblottaus. PI, pre-immuuni seerumi. C-D, toiminta Arf6 (C), ja Erk ja Akt (D) HUVEC transfektoitu siRNA varten GEP100 tai merkityksettömiä sekvenssit (IRR) kun VEGF stimulaatiota. E, Yhteissaostusta VEGFR2-V5 ja sen tyrosiinifosforylaation-mutantteja (951F, 1175F ja 1214F) ja HA-GEP100 ilmaistuna Cos-7-soluissa, analysoitiin anti-HA (GEP100) immunosaostuksella ja anti-V5 (VEGFR2) immunoblottaus. F, aktivointi Arf6-HA VEGFR2-V5 tai sen mutantteja (951F, 1175F ja 1214F) kun VEGF stimulaation Cos-7-soluissa, joissa ei-koodattu GEP100 cDNA samanaikaisesti transfektoitujen. A-F, 10 ng ml

-1 VEGF käytettiin stimulaatio 1 min (+) tai osoitetut ajat, kun taas kontrollit sisälsivät soluja ilman stimulaatiota (0 min tai -). Arf6 toimintaa arvioitiin GST-GGA avattavasta menetelmällä (A, C, F). Yhteensä, kokosoluliuotteista (20 ug). A-D, HUVEC viljeltiin matalan seerumin (0,5% FCS) väliaine 16 h ennen stimulaatiota. Nämä kokeet suoritettiin vähintään kaksi kertaa ja edustavat luvut on esitetty.

Vaikka signalointireittejä alavirtaan VEGFR2 on tutkittu laajasti [21], mikään niistä ei voi tulkita mekanismeja Arf6 aktivoinnin. Lisäksi, enemmän kuin yhden tyyppinen GEF voi aktivoida Arf6 [22], [23]. Sitten pyrittiin määrittämään GEF (t) ensisijaisesti vastuussa tämän VEGF-indusoidun Arf6 aktivointia. GEP100 sitoutuu tyrosiinifosforyloidulla EGFR [15]. Testasimme GEP100 sitoutuu myös tyrosiinifosforyloitunutta VEGFR2, ja totesi, että VEGFR2 saostuu uudestaan ​​kanssa GEP100 in HUVEC endogeenisesti, kun soluja stimuloitiin VEGF (kuvio 1 B). Sitten pudotti GEP100 jonka siRNA menetelmällä HUVEC, ja totesi, että tämä Knockdown pitkälti poisti VEGF-indusoidun aktivaation Arf6 (kuvio 1C ja kuvio S4). Nämä tulokset viittaavat siihen, että GEP100 on ensisijaisesti vastuussa VEGF: n indusoiman aktivaation Arf6 in HUVEC.

VEGF-signalointia tiedetään aktivoivan Erk ja Akt [21]. Hiljentäminen GEP100 ei vaikuta aktivoitumista Erk ja Akt in HUVEC (kuvio 1 D). Nämä tulokset yhdessä Edellä kuvattujen tulosten spesifisyyden varmistamiseksi GEP100 VEGF signalointi, ja osoittavat, että VEGF signalointireitin, joka aktivoi Arf6 on riippumaton aktivoivan Erk ja Akt in HUVEC. Lisäksi aktivointi Erk ja Akt molemmat tapahtuvat 10 minuutin kuluttua VEGF stimulaation, joka on paljon hitaampaa kuin aktivoinnin Arf6.

Mode GEP100 sitoutumisen ligandi-aktivoitu VEGFR2

tutkimme seuraavaksi tarkkaa mekanismia, jolla ligandiaktivoituja VEGFR2 työllistää GEP100. PH verkkotunnus GEP100 sitoutuu tiettyihin fosforyloitua tyrosiinit EGFR [15]. Ensin tutkitaan, onko tämä PH domain sitoutuu myös fosforyloidun tyrosiinien VEGFR2. Tämän vuoksi meidän ilmaistu V5-merkinnällä VEGFR2 Cos-7-soluissa, ja niiden lysaatit vedetty alas

in vitro

kanssa PH verkkotunnuksen GEP100, fuusioitu glutathione-

s

-transferase (GST). Huomasimme, että GST-GEP100 PH domain vetää alas ligandiaktivoituja VEGFR2-V5, kun PH domeeneja ARNO tai fosfolipaasi Cδ eivät (kuva S1). VEGFR2 on 6 suuria tyrosiinien, fosforyloitu kun VEGF stimulaatio: Tyr951, Tyr996, Tyr1054, Tyr1059, Tyr1175 ja Tyr1214 [21] (katso kuva S2). Syntetisoimme nämä tyrosiini peptidit niiden fosforyloitua muotoa, ja totesi, että GST-GEP100 PH domain sitoutuu fosforyloitu Tyr951 peptidi, mutta ei muita fosforyloidun peptidien (kuva S3). Lisäksi GST-GEP100 PH domain ei sitoudu ei-fosforyloitua Tyr951 peptidi (kuva S3). Olemme vahvistaneet fosforylaatiota Tyr951 kun VEGF stimulaation HUVEC (kuva S5).

Näiden tulosten perusteella, me sitten tuotti mutantti muoto VEGFR2-V5, jossa Tyr951 muutettiin fenyylialaniinin (951F) ja ilmaisi Cos-7-soluissa yhdessä hemagglutiniini (HA) hännitetty GEP100, ja totesi, että tämä mutantti ei saostetaan samanaikaisesti HA-GEP100 (kuvio 1 E). Kontrollina, olemme vahvistaneet, että villin tyypin VEGFR2-V5 kerasaostetaan HA-GEP100 (kuvio 1E). Lisäksi mutaatiot muissa tyrosiinien, kuten Tyr1175 ja Tyr1214, osaksi fenyylialaniinin (1175F ja 1214F, vastaavasti) ei vaikuttanut coprecipitation (kuvio 1E). Sitten ilmaistiin VEGFR2-V5 tai sen mutantteja yhdessä Arf6-HA ja GEP100 COS7-soluissa, ja mitattiin toiminta Arf6-HA käyttämällä GST-GGA avattavasta menetelmä [24]. Olemme havainneet, että 951F mutantin VEGFR2-V5 ei aktivoituvat Arf6-HA vasteena VEGF, kun taas 1175F ja 1214F mutantit, samoin kuin villin tyypin VEGFR2-V5, indusoivat Arf6-HA aktivaation (kuvio 1 F). Nämä tulokset osoittavat, että VEGFR2 fyysisesti assosioituu GEP100 aktivoida Arf6 kun VEGF stimulaation: yhdistys, joka vaatii sitovia fosforyloidun Tyr951 VEGFR2 ja PH verkkotunnuksen GEP100. Olemme myös vahvisti, että Tyr951-fosforyloitua muotoa VEGFR2 saostuu uudestaan ​​kanssa GEP100 alkaen HUVEC endogeenisesti, kun VEGF stimulaation (kuva S2).

Vaatimus Arf6 in VEGF: n indusoiman putkimainen muodostumista ja muuttoliike

Tubular (tai kapillaarimaisen) verkoston muodostuminen HUVEC viljeltiin

in vitro

on yksi tunnusmerkki käsittelee tarpeen angiogeneesin [1], [2]. Tutkia osallistumista Arf6 VEGF-angiogeneesiä, me sitten testattiin vaikutuksia Arf6 siRNA. Knockdovvn Arf6 on merkittävästi heikentynyt VEGF: n indusoiman putkimainen muodostumista, verrattuna kont- merkitystä RNA-dupleksit (IRR) (kuvio 2A ja kuvio S4), vaikuttamatta solujen elinkykyä (kuvio 2B). VEGF: n indusoimaa solujen muuttavien aktiivisuus on toinen tunnusmerkki angiogeenisten toiminnan [25]. Arf6 siRNA hoito poisti VEGF: n indusoiman trans-siirtotoimien lähes täydellisesti, mikä arvioitiin käyttämällä muunnettua Boyden kammioissa [26] (katso kuva 2C). VEGF: n indusoiman kaksiulotteinen siirtotoimien, arvioi haavan paranemista määritys [27], oli myös lähes kokonaan estänyt Arf6 siRNA käsittely (kuvio 2D).

HUVEC, hoidettiin siRNA varten Arf6 tai merkityksetöntä sekvenssit ( IRR), alistettiin putkimaisen verkon muodostumista määrityksessä, kun läsnä oli 10 ng ml

-1 VEGF (A), joka elinkelpoisuuden määritys (B), ja joka migraatiokokeessa käyttämällä modifioitua Boyden kammion (C) tai käyttämällä haavan paranemista määritys (D) läsnä ollessa ja puuttuessa VEGF (10 ng ml

-1). A ja D, määritykset suoritettiin yli kaksi kertaa, ja edustavia lukuja esitetään. B, yli 1 x 10

4 solut sijoitettiin jokaisessa määrityksessä. C, tiedot esitetään solujen lukumäärä havaittiin kohti mikroskooppinen kenttä (x 20), joka transmigrated Boydenin kammion suodattimen. Kuusi kenttää laskettiin jokaisessa määrityksessä. Virhe palkit osoittavat keskimääräistä ± sem, n = 3. * p 0,05.

Korkeita AMAP1 ilmaisun HUVEC ja osallistuminen GEP100 ja AMAP1 in VEGF: n indusoiman angiogeenisen toiminta

AMAP1 on alavirtavaikuttajainhibiittorit varten Arf6, ja toimii syövän eteneminen ja metastaasit [12]. Useimmat pahanlaatuiset rintasyöpäsoluissa korkea invasiivisen toiminnan poikkeuksellisen yliekspressoivat sekä Arf6 ja AMAP1 proteiineja, kun taas weakly- tai ei-invasiivisen rintasyövän solut ilmentävät vain vähäisiä määriä näitä kahta proteiinia [11], [12]. HUVEC-soluja tiedetään ilmaista Arf6 korkealla tasolla [7], jota havaittiin olevan lähes vastaava kuin havaittu erittäin invasiivinen MDA-MB-231-rintasyöpäsoluissa (kuvio 3A). HUVEC myös ilmaista AMAP1 erittäin korkealla tasolla, mikä on myös verrattavissa MDA-MB-231-soluja (kuvio 3A).

, Expression of Arf6 ja AMAP1 proteiinien HUVEC ja sen vertailu kuin invasiivisia ( MDA-MB-231) ja ei-invasiivisia (MCF7) rintasyöpäsoluja, immunoblottauksella 20 ug kokosoluliuotteista käyttämällä vasta-aineita, kuten on ilmoitettu. β-aktiini käytettiin kontrollina. B-E, HUVEC, käsiteltiin siRNA: t ja GEP100, AMAP1, cortactin tai merkityksettömiä sekvenssit (IRR), alistettiin putkimainen muodostumista määrityksessä (B), muunnetut Boyden kammion määrityksessä (C), haavojen määritys (D) tai solun elinkelpoisuus määritys (E), kuten kuviossa 2. AMAP2 siRNA: ita otettiin mukaan toiselle (B, E). Nämä määritykset suoritettiin vähintään kaksi kertaa, ja edustavia lukuja esitetään. Virhe palkit osoittavat keskimääräistä ± s.e.m., n = 3. * p 0,05.

seuraava tutki GEP100 ja AMAP1 osallistuvat VEGF: n indusoiman angiogeenisen toiminta

in vitro

. Knockdovvn GEP100 ja AMAP1 kunkin vaikutti merkittävästi VEGF: n indusoiman putkimainen muodostumista, ja esti lähes täysin VEGF: n indusoimaa solujen muuttavien toimintaa (kuvio 3B-3D ja kuvio S4), vaikuttamatta solujen elinkykyä (kuvio 3E). Kontrollina myös pudotti AMAP2 [28] (katso kuva S4), läheinen isoformin AMAP1, ja eivät havainneet estävää vaikutusta putkimainen muodostumista (kuva 3B).

Vaatimukset cortactin ja sen yhdessä AMAP1 in VEGF: n indusoiman angiogeenisen toiminta

AMAP1 toimintoja muodostamalla kompleksi cortactin in invasiivisen rintasyövän solujen [12], [13]. Olemme havainneet, että AMAP1 muodostaa kompleksin cortactin myös HUVEC, ja tämän kompleksin muodostuminen lisääntyi merkittävästi, kun soluja viljeltiin VEGF (kuvio 4A). Lisäksi cortactin siRNA tehokkaasti esti VEGF: n indusoiman angiogeenisen toiminta

in vitro

, vaikuttamatta solujen elävyyden (kuvio 3B ja 3E).

, kerasaostumiseen cortactin kanssa AMAP1 in HUVEC viljeltiin 10 ng ml

-1 VEGF, analysoitiin anti-AMAP1 immunosaostus ja anti-cortactin immunoblottaus, kuten on osoitettu. PI, pre-immuuni seerumi. B-D, HUVEC, viljeltiin, kun läsnä on P4-TAT (P4) tai sekoitetun solun läpäisevä peptidin (SC) 10 uM (C, D, F) tai pitoisuuksina kuten on osoitettu (B, E) ja 1 h ennen analyysi, saatettiin putkimaiseen muodostumista määrityksessä (B), muunnetut Boyden kammion määrityksessä (C), haavoja määritys (D) ja solunelinkykyisyysmääritys (E), kuten kuviossa 2, läsnä ollessa peptidien. Kerasaostumiseen cortactin kanssa AMAP1 näissä soluissa analysoitiin kuten edellä (F). Yhteensä, kokosoluliuotteista (20 ug). Nämä määritykset suoritettiin vähintään kaksi kertaa, ja edustavia lukuja esitetään. Virhe palkit osoittavat keskimääräistä ± sem, n = 3. * p 0,05.

aiemmin suunniteltu solun läpäisevä peptidi, nimittäin P4-TAT, joka estää AMAP1 ja cortactin sitova, ja siten estää syövän invaasio ja etäpesäkkeiden [13]. P4-TAT, mutta ei kontrolli salattu TAT-peptidi (SC), esti VEGF: n indusoiman angiogeenisen toimintaa

in vitro

, kuten putkimainen muodostumista ja migraatiota annoksesta riippuvalla tavalla, vaikuttamatta solujen elinkykyä ( Kuvio 4B-4E). Olemme vahvistaneet, että P4-TAT, mutta ei SC, lohkot endogeeninen sitoutumisen AMAP1 kanssa cortactin in HUVEC (kuvio 4F). Nämä tulokset osoittavat, että AMAP1 toimintojen kautta kompleksin muodostumisen cortactin on HUVEC, ja tämä kompleksin muodostuminen on välttämätöntä VEGF: n indusoiman angiogeenisen toimintaa.

osallisuus Arf6 signalointireitin angiogeneesissä

jälkeen tutkittiin GEP100-Arf6-AMAP1-cortactin reitin osallistuu patologiseen angiogeneesiin

in vivo

. Tätä varten ensin vahvisti, että CD31-positiiviset patologisen alusten [16] ovat voimakkaasti positiivisia GEP100 ja AMAP1 (kuvio 5A). Vasta-aineet Arf6 sovellettavissa immunohistokemia ei ollut saatavilla. Sitten testataan GEP100 siRNA: t ja P4-TAT. Tämän, angioreactor putkien [29], ladattu VEGF tai MDA-MB-231-soluja, istutettiin nude-hiiriin, ja 9 päivää myöhemmin määrät Isolectin B4 kertynyt putkien sisällä mitattiin. MDA-MB-231-solujen tiedetään tuottavan useita angiogeenisten tekijöiden [30]. Annon GEP100 siRNA: iden, pre-sekoitettu AteloGene [31], hiiriin istutettiin nämä angioreactors esti niiden angiogeneesiä annoksesta riippuvalla tavalla, kun taas merkityksetön RNA duplex ei (kuvio 5B ja 5D). P4-TAT, mutta ei SC, inhiboivat myös tätä angiogeneesiä annoksesta riippuvalla tavalla (kuvio 5C ja 5E).

, immunohistokemia granulaatiokudoksen ja arpikudoksen osia käyttämällä mainituilla vasta-aineilla. Bars, 100 pm. B-E, vaikutukset GEP100 siRNA: iden ja P4-TAT (P4) angiogeneesiin mitattiin käyttäen angioreactors implantoitu nude-hiiriin, jotka sisälsivät tyvikalvon tiivisteet ja VEGF (500 ng ml

-1) tai MDA-MB-231-soluja (1 x 10

5-solut); ja määrät Isolectin B4 kertynyt tyvikalvon uutteet mitattiin inkubaation jälkeen 9 päivää. siRNA: t, sekoitetaan AteloGene pitoisuuksina, kuten on osoitettu, injisoitiin hiiriin päivinä 0 ja 4. TAT-peptidejä lisättiin angioreactors ennen istutusta, ilmoitettuina pitoisuuksina. Merkityksetön RNA duplex (IRR) tai sekoitettua peptidiä (SC) käytettiin kontrolleina. Virhe palkit osoittavat keskimääräistä ± s.e.m., n = 8. * p 0,05. F-G, Effect of P4-TAT on CNV muodostumiseen. Edustavia micrographs CNV leesiot korioidaalisissa flatmounts peräisin eläimestä käsitelty P4-TAT tai SC. Punainen katkoviiva osoittaa, missä määrin CNV leesiot täytetty FITC-dekstraani. Mittakaava, 100 pm. Kvantitatiivinen analyysi keskimääräisen CNV koko näkyy G. Virhepalkit osoittavat keskimääräistä ± sem, n = 70 77 * P 0,05.

Lisäksi tutkittiin vaikutuksia P4-TAT suonikalvon uudissuonittumisen (CNV), joka on tärkein syy näön menetyksen potilailla, joilla on ikään liittyvä silmänpohjan rappeuma [32], käyttämällä laserindusoidun suonikalvon uudissuonittumisen hiirissä [17], [18]. P4-TAT tai SC peptidiä injektoitiin intraperitoneaalisesti hiiriin joka päivä päivää ennen laserhoito loppuun saakka kokeen. Valitsimme intraperitoneaalitestissä hallinnon sijaan pistetään suoraan silmiin, jotta vahinkoa silmät viimeksi mainitulla menetelmällä. P4-TAT oli myös tehokkaita estämään CNV (kuvio 5F ja 5G).

osallisuus Arf6 signalointireitin endoteelin läpäisevyys ja VE-kadheriinin endosytoosin

päätehtävä VEGF signaloinnin liittyy edistämisessä endoteelisolujen läpäisevyyden ja verisuonten vuotoa. VEGF signalointi indusoi endosytoosin VE-kadheriinin, ja tämä endosytoosin on ratkaiseva parantamiseksi endoteelisolujen läpäisevyyden [33], [34].

Sitten tutkittiin, onko GEP100-Arf6-AMAP1-cortactin reitin on myös mukana endoteelin läpäisevyys ja VE-kadheriinin endosytoosin. VEGF lisää läpäisevyyttä ehjä HUVEC kaksi kertaisesti mitattuna parasellulaarista liikkeen dekstraanimolekyylejä [19], [35] (katso myös kuvio 6A). Sitten tutkittiin vaikutuksia siRNA: iden osalta GEP100, Arf6 ja AMAP1 sen läpäisevyys. Varten siRNA: t olisivat tehokkaita tässä määrityksessä, siRNA hoito on aloitettu 36 tunnin ajan, ennen kuin solut uudelleen maljataan kammioiden muodostamiseksi konfluentteja yksisolukerroksiin. Huomasimme, että HUVEC, hoitaa näillä siRNA jo näytteille korkea läpäisevyys ilman VEGF, ja eivät vastaa VEGF stimulaation muuttamaan läpäisevyyden (kuvio 6A). Me seuraavaksi mitataan määrien endosytoosin VE-kadheriinin, plasmamembraanista sytoplasmaan. VEGF kiihtyy VE-kadheriinin endosytoosin useiden taittuu ehjä HUVEC [19] (katso kuva 6B ja 6C). Kuten on läpäisevyys, HUVEC käsitelty GEP100, Arf6 tai AMAP1 siRNA, kaikki näytteillä korkeat VE-kadheriinin oton ilman VEGF, ja ei vastannut VEGF (kuvio 6B ja 6C). Ehjä HUVEC näytteille VE-kadheriinin-pohjainen solu-soluliitos korkea eheys, kun taas VEGF stimulaatio herättää niiden epäsäännöllinen, sekavaa morfologia [19] (katso myös kuvio 6B). Olemme havainneet, että VE-kadheriinin-pohjainen solu-solu-liittymien tulee sekava jopa ilman VEGF stimulaatiota, kun solut on käsitelty näillä siRNA: ita (kuvio 6B). Näissä kokeissa merkitystä ja AMAP2 siRNA: ita, käytettiin negatiivisina kontrolleina. Nämä tulokset viittaavat siihen, että menetys näiden proteiinien häiritsee solujen muodostamaan ehjä solu-solu-kiinnikkeistä, ja soluja, joilla on tällaisia ​​sekavaa solu-solu-kiinnikkeistä ei enää herkkiä VEGF: n sääntelyä.

HUVEC, käsiteltiin siRNA: t ja Arf6, GEP100, AMAP1 tai merkityksetön sekvenssin (IRR) (A-C), tai P4-TAT (P4) tai SC-peptidi (D-F), alistettiin läpäisevyyden määritys mittaamalla parasellulaarista liikkeen FITC-dekstraania (Mr 40 kDa) (A, D), ja joka VE-kadheriinin oton määritystä seuraamalla endosytoosin solun pinnan VE-kadheriinin molekyylejä (B, C, E, F). A-C, solut esikäsiteltiin siRNA 36 h ennen pinnoitus. D-F, TAT peptidejä lisättiin konfluentteja kulttuurin ja inkuboitiin 30 minuuttia ennen analysointia. VE-cad, vihreä; ytimet, sininen. Asteikko palkit edustavat 10 um. Virhe palkit osoittavat keskimääräistä ± s.e.m., n = 3. * P 0,05.

testataan P4-TAT. Toisin kuin siRNA-käsittelyt on kuvattu edellä, P4-TAT voidaan lisätä suoraan soluviljelmiin, jotka ovat kasvaneet yhteen ja muodostavat jo normaalissa, ehjä solu-solu kiinnikkeistä. Olemme havainneet, että lisäämällä 10 uM P4-TAT Konfluenttien kulttuuriin estää VEGF-välitteistä parantamiseksi solun läpäisevyyden, samalla kun se ei vaikuta läpäisevyys VEGF: n puuttuessa (kuvio 6D). Samoin, P4-TAT esti VEGF: n indusoiman endosytoosin VE-kadheriinin, mutta se ei aiheuta internalisaation VE-kadheriinin soluissa viljeltiin ilman VEGF (kuvio 6E ja 6F). VEGF: n indusoiman morfologiset muutokset solun soluliitos myös esti P4-TAT (kuvio 6E). Nämä vaikutukset P4-TAT olivat annoksesta riippuvaisia, ja ohjaus SC peptidi ei esiintynyt tällaisia ​​inhiboivia vaikutuksia (kuvio 6D-6F). Yhdessä voimme päätellä, että GEP100-Arf6-AMAP1-cortactin reitti on olennaista VEGF säätelyyn endoteelisolujen läpäisevyyden ja VE-kadheriinin endosytoosin. Tuloksemme osoittavat myös, että osa tämän reitti voi olennaisesti olla mukana muodostumiseen ehjä endoteelisolujen solu-solu-kiinnikkeistä, kuten solujen elatusaineeseen sisältää jo vähäisiä määriä VEGF: ää.

Keskustelu

angiogeneesi ja syövän invaasio osuus useita yhteisiä ominaisuuksia [36]. Olemme osoittaneet aikaisemmin, että GEP100-Arf6-AMAP1-cortactin reitti käytetään invaasion ja metastaasin monien rintasyöpäsolujen; ja tässä asiakirjassa, osoitamme, että tämä polku on käytetty myös angiogeneesiä, mukaan lukien rintasyöpä angiogeneesissä ja suonikalvon uudissuonittumista. Yliekspressio Arf6 ja AMAP1 proteiineja on tarpeen tehokkaan toiminnan tämän väylän invaasio ja etäpesäkkeiden [11], [12]. Sekä Arf6 ja AMAP1 myös ekspressoituu korkeina tasoina endoteelisoluissa, kuten nähdään erittäin invasiivisen rintasyövän soluissa.