Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

vaikuttavat tekijät ero vasteita eturauhasen kasvaimia androgeenireseptorin (AR) akseli-suunnatun hoitomuotoja ovat huonosti tunnettuja, ja ennustajia hoidon tehon tarvitaan. Oletimme, että tehoa estämällä DHT ligandin synteesi olisi liittävät sisäisen kasvaimen androgen suhteet ilmaisevat suhteellisen riippuvuus DHT-välitteistä kasvun.

Methods

ominaista kaksi androgeeni herkkä eturauhassyöpäksenograftista mallien jälkeen androgeenien tukahduttaminen kastraatio yhdessä SRD5A estäjän dutasteridi, sekä paneelin kastraatio resistenttien etäpesäkkeiden kautta saatuja nopeaa ruumiinavaus.

tulokset

LuCaP35 kasvaimet (sisäinen kasvaimen T : DHT-suhde 02:01) dutasteridille tukahdutetaan DHT 0,02 ng /g ja pidensi elinaikaa vs. kastraation yksinään (337 vs.152 päivää, HR 2,8, p = 0,0015). In LuCaP96 kasvaimet (T: DHT 10:01), eloonjääminen ei ollut parantunut, vaikka samanlainen DHT vähentäminen (0,02 ng /g). LuCaP35 osoitti korkeampi ilmentyminen steroidi biosynteettisten entsyymien säilyttäminen DHT tasot (5 kertaa suurempi SRD5A1, 41 kertaa suurempi, 99 kertaa suurempi RL-HSD, p 0,0001 molemmille), saattamisen sisäisen kasvaimen DHT (on -30% käsittelemätöntä kasvaimet), ja ~ 2 kertainen ilmentymistä täyspitkä AR. Sen sijaan LuCaP96 osoitti korkeampaa steroidien catabolizing entsyymien (6,9-kertaa suurempi AKR1C2, 3000 kertaa suurempi UGT2B15, p = 0,002 ja p 0,0001 vastaavasti), jatkuva tukahduttaminen sisäisen kasvaimen DHT, ja 6-8-kertainen induktio täyden pituus AR ja ligandin itsenäinen V7 AR silmukointivariantti. Ihmisen etäpesäkkeitä osoitti bioaktiivisten androgeenitason ja AR täyspitkä ja AR silmukointi-variantti ilmaisu sopusoinnussa luokkaa kuin ksenografteissa.

Johtopäätökset

Luonnostaan ​​eroja pohjapinta steroidogeneesiä sekä muuttujalauseke koko pituudeltaan ja silmukoinnin-variantti AR, assosioituvat vastaus ja kestävyys ennalta reseptoriin AR ligandi tukahduttaminen. Expression of steroidien entsyymien ja AR isoformit voivat toimia mahdollisina biomarkkerit herkkyys voimakkaita AR-akselin eston ja olisi validoitava uusia malleja.

Citation: Mostaghel EA, Morgan A, Zhang X, Marck BT, Xia J , Hunter-Merrill R, et al. (2014) Eturauhassyöpä liittyviin seikkoihin Response Pre-Receptor kohdentaminen androgeenisesti Axis. PLoS ONE 9 (10): e111545. doi: 10,1371 /journal.pone.0111545

Editor: Allen Gao, UC Davis Kattava Cancer Center, Yhdysvallat

vastaanotettu: 19 helmikuu 2014; Hyväksytty: 01 huhtikuu 2014; Julkaistu: 30 lokakuu 2014

Copyright: © 2014 Mostaghel et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Eturauhassyöpä Foundation Urakehitys Award (EAM) ja Challenge Award (EAM, SP, RLV, AMM, RBM, PSN), Damon Runyon Genentech-Clinical tutkija Award C-40-08 (EAM), NIH myöntää 1K23 CA122820-01 (EAM), DOD Uusi tutkija Award W81XWH-10-1-0228 (EAM); GlaxoSmithKline (A. M. ja P.S.N.); 1RC1 CA146849 (P.S.N.); PC093509 (P.S.N.); PO1 CA 85859 (J.X., R. G., R.V., P.S.N.); NIH /NCI Pacific Northwest Eturauhassyöpä SPORE P50CA97186 (J.X., R. H., R. G., P.S.N., R.V.); ja Department of Veterans Affairs (B.T.M., S. P. ja A.M.M.). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat lukenut lehden politiikan ja ovat seuraavat ristiriitoja: A.M.M., R.B.M. ja P.S.N. neuvottelevat ja sai tutkimuksen tukea GlaxoSmithKline. Tämä ei muuta tekijöiden noudattaminen kaikki PLoS ONE politiikan tietojen jakamista ja materiaaleja.

Johdanto

Vaikka aluksi erittäin tehokas, androgeenien puute hoitoa eturauhassyöpään tasaisesti merkitty eteneminen kastraatio kestävä eturauhassyöpä (CRPC) aikana 18-36 kuukautta, ja seuraava mediaanielossaolosta 1-2 vuotta. [1] Vaikka androgeenireseptorin (AR) -regulated geeniekspressiota aluksi tukahdutetaan, [2], [3] transkription ohjelma säätelee AR aktivoidaan in CRPC kautta mekanismit, jotka ylläpitävät sekä ligandin ja reseptorin välittämän maksuja AR signalointi. [4] – [6] Näitä ovat jäljellä kasvaimensisäisenä androgeenit tasoilla riittävä aktivoimaan AR-ohjelma, [7] – [9] ja lisääntynyt AR toimintaa, joko laajentaa tai yliekspressio (johtaen suurempi herkkyys alhainen ligandiin tasoa) [10 ], [11] kautta tai äskettäin kuvattu ilmentymisen katkaistun ligandista riippumatonta AR silmukoitumisvariantit (AR

sv), josta puuttuu ligandia sitovan domeenin (LBD). [12] – [17] Erityisesti, tutkimukset maksimaalinen tai yhdistetty androgeenien saarto hyödyntäen steroidista tai ei-steroidista AR antagonisteja, jotka kohdistuvat AR LBD ovat vain osoittaneet pientä, joskin tilastollisesti merkitsevä paraneminen 5 vuotta eloonjäämisaste (27,6 vs. 24,7 %; p = 0,005). [18] Suorin selitys puute suuremman tehon on kyvyttömyys näiden AR antagonistien outcompete jäljellä testosteronin (T) ja dihydrotestosteroni (DHT) (joka on AR Sitoutumisaffiniteetit että selvästi suuremmat kuin synteettisten antiandrogeenit), [ ,,,0],19] tai laiminlyönti kohdistamaan AR

sv puuttuu LBD.

kliiniset vasteet uusille voimakkaita AR antagonisteja ja uusia steroidisynteesin inhibiittorit yhdistettynä näyttöä intracrine androgeenin biosynteesin eturauhassyövässä viittaa siihen, että käsitteet maksimaalisesta androgeenien saarto olisi tarkasteltava uudelleen ja puhdistettu. Tuoreessa tutkimuksessa on suunniteltu kohdistamaan useita vaiheita androgeenien biosynteesissä miehillä ei ole ADT (käyttäen hydrokortisoni, The CYP17A1 estäjä ketokonatsoli, ja steroidi 5-alfa-reduktaasin estäjä (SRD5A) dutasteridille) tuottanut merkittäviä PSA laskee useimmilla potilailla ja mediaani vasteen kesto 20 kuukautta. [20] Siten, kliininen teho ei voi vaatia AR antagonisti asettamisessa tehokkaamman tukahduttaminen ”pre-reseptori” signalointi vähentämällä AR ligandien. Tärkeää on, että tehokkuus estävä AR aktivoinnin eturauhasen syöpiä, joko vahvistamalla ennalta reseptorin lähestymistapoja tai ne suoraan kohdistaminen AR, vaihtelee huomattavasti potilaiden välillä, ja tekijät nämä ero tulokset ovat tuntemattomia. Esimerkiksi ehkäisy kokeita SRD5A estäjät merkittävästi vähensi havaitsemiseksi paikallinen eturauhasen syöpiä, mutta tämä väliintulo ei selvästikään ollut tehokas estämään syövän etenemiseen tai havaitsemiseen kaikissa ihmisissä. [21], [22] Vastaavasti viime kliinisissä tutkimuksissa uusia estäjiä CYP17A1 ja AR miehillä CRPC ovat raportoineet merkittävän potilaiden välisiä eroja tavoite vastausten [23], [24].

Tässä tutkimuksessa , pyrimme määrittämään kasvaimen ominaispiirteet, jotka vaikuttavat vasteen prostatasyövistä eston ennalta reseptorin AR signalointi, käyttäen androgeenideprivaatio yhdistettynä dual SRD5A estäjä dutasteridi. T ja DHT ovat biologisesti aktiivisia korkean affiniteetin AR ligandien. Kuitenkin 3-10 kertaa suurempia pitoisuuksia T vaaditaan käyttää samaa AR-välitteistä transkription vaikutuksia DHT. [25], [26] Siten, vähentää DHT tasot estämällä muuntaminen T DHT voi olla tehokas ennalta reseptorin menetelmä tukahduttaa kokonaislaajuus bioaktiivisten AR signalointi. Oletimme, että vaikutus SRD5A eston kasvaimen kasvu olisi liittävät sisäisen kasvaimen androgeenitason ja /tai ilmentymistä steroidi biosynteettistä entsyymien viittaavia suhteellinen riippuvuus DHT-välitteistä kasvun. Tekijät suhteellista vastetta eturauhasen kasvaimia ennalta reseptoriin androgen tukahduttaminen aineilla kuten SRD5A inhibiittorit ovat tuntemattomia, mutta voisi toimia ennustajia tehokkuus näiden aineiden eturauhasen syövän ehkäisyä, tai osana ADT pitkälle sairaus.

Materiaalit ja menetelmät

LuCaP Human eturauhassyöpäksenografteista

tutkimus toteutettiin tiukasti mukaisesti suosituksia opas hoito ja käyttö Laboratory Animals of National Institutes of Health. Kaikki kokeet, joissa käytetään eläimiä suoritettiin protokollien mukaisesti hyväksymien Fred Hutchinson Centerin Institutional Animal Care Käytä komitea (tiedosto 1775). Kaikki Leikkaus suoritettiin isofluoraani anestesiassa, ja yritettiin minimoida kärsimyksen. LuCaP35 ja LuCaP96 linjat ovat potilaalle johdettu ksenograftit jotka luotiin osana University of Washington kudospankin kuten aikaisemmin on kuvattu [27], [28] ja valittiin analysoitavaksi molemmat linjat osoittavat kastraatio herkkä kasvu ennallaan uroshiirillä. Lyhyesti, LuCaP35 oli peräisin imusolmuke etäpesäke, joka on saatu 66-vuotias valkoihoinen mies, jolla CRPC. LuCaP96 johdettiin höyläysleikkaus ensisijaisen Gleason 9 eturauhasen syöpä on saatu 61-vuotias valkoihoinen mies kuukautta ennen dokumentointiin kastraatio-resistenttejä. Sekä ksenografteissa AR eksoni-DNA-sekvenssi on villityypin (tuloksia ei ole esitetty).

Male CB-17 SCID-hiirten (Charles River Laboratories, Wilmington MA) istutettiin ihon alle 30 mm

3 kasvaimen kpl . Kun kasvaimet olivat saavuttaneet keskimäärin 300 mm

3, hiiret (LuCaP35 n = 62; LuCaP96 n = 65) olivat kastroitu (Cx) ja satunnaistettiin saamaan ajoneuvoon tai dutasteridia (dut) terapia yli 8 viikkoa. Dutasteridia annettiin (PEG-monolauraatti (Sigma 460133) /1% Tween 80 (Sigma P4780)) oraalisella letkuruokinnalla 5 päivää viikossa tilavuudessa 200 ui. Kasvaimen tilavuus määritettiin seuraavan kaavan (pitkä ja lyhyt akseli pituuksia mm): pitkä x (Short∧2) /2. Kasvaimet osajoukosta hiirtä kussakin kohortissa korjattu varhain ajankohtina hoidon (kasvaimen koko ~500 mm

3; alue 7-21 päivää). Kun kasvaimet saavuttivat noin 750-1000 mg kooltaan, eläimet lopetettiin mukaan institutionaalisten protokollan ja ksenografteissa korjattu ja flash jäädytetty määrittämistä varten kudoksen androgeenien ja uuttamalla kokonais-RNA. Keskimääräinen päivien hiiristä Cx + dut ryhmät olivat olleet pois dutasteridiryhmässä aikaan kasvaimia resektoitiin oli 211 päivää varten LuCaP35, ja 96 päivää LuCaP96. Dutasteridia avokätisesti GlaxoSmithKline.

Kaikki menettelyt ihmiseen kohdistuvan hyväksyi Institutional Review Board of University of Washington Medical Center, ja kaikki aiheet allekirjoittama kirjallinen lupa. Metastasoivassa eturauhassyöpä koki nopean ruumiinavauksia johdolla University of Washington Eturauhassyöpä Luovuttaja Autopsy Program kuten aikaisemmin on kuvattu [9], [27]. Ruumiinavauksia suoritettiin 4-10 tunnin kuluessa kuolemasta. Näytteet kaikista brutto etäpesäkekasvainten sivustoja saatiin steriileissä olosuhteissa ja sivuston ja määrä luun ja ei-luun etäpesäkkeitä kirjattiin. Tuore kudos jäädytettiin nestemäisessä typessä välittömästi sadonkorjuun jälkeen ja pidettiin -80 ° C: ssa.

Steroid Mittaukset

Androgeenien tasot Ksenograftikudoksista määritettiin massaspektrometrialla (MS) käyttäen menetelmiä, olemme on kuvattu. [29] Tämä menettely johti mitattavan pitoisuuden 1 pg per näyte testosteronin ja DHT. Määrityksen sisäinen Variaatiokertoimet tuotetaan käyttäen ihmisen seerumia korkean, keskitason ja matalan alueen näytteet olivat 3,5, 3,1 ja 3,8% testosteronin ja 6,3, 4,3 ja 15,8% DHT vastaavasti.

RNA: n eristäminen, kvantitatiivinen RT -PCR ja immunohistokemia

näytteitä käytettiin RNA: n eristämistä, cDNA-synteesi ja kvantitatiivinen RT-PCR käyttämällä menetelmiä ja alukkeita olemme aiemmin kuvattu. [9], [30] immunohistokemiallinen värjäys ja pisteytys AR ja PSA suoritettiin kuten on aiemmin kuvattu [31] käyttämällä polyklonaalista anti-PSA-vasta-ainetta (DAKO, Inc.), anti-AR-vasta-aine on suunnattu N- päässä (klooni F36.4.1, Biogenex), ja anti-AR-vasta-aine on suunnattu C-pää (C-19, Santa Cruz). Negatiivinen kontrolli immunostains, korvaamalla esi immunoglobuliini samasta lajista kuin se, jossa vasta-aine on syntynyt, ei todettu reaktiotuote.

TILASTOANALYYSI

arvioimiseksi eroja kasvaimen tilavuuden kehityskaari, ensin määritettävä muutos pistettä kasvaimen kasvun käyrät käyttäen t-testejä peräkkäin verrata kasvainten kahden päivän välein. Sen jälkeen segmentointi käyrät, sovelsimme lineaarinen sekoitettu malli määrittää hoidon vaikutusta kasvaimen kasvuun jokaisen lineaarisen jakson, jonka taantuu log kasvaimen päivänä Mittauksen, hoidon ryhmässä, ja vuorovaikutusta päivä ja kohtelustaan ​​osuus vaihtelu alkuperäisen kasvaimen tilavuus poikki hiirillä. Progression elinaika kastraatio vs. kastraatio + dutasteridia käsiteltyihin hiiriin (määritelty kasvaimen kokoa 750 mm

3) määritettiin kautta Kaplan Meier analyysin vertailu käyrät käyttämällä Mantel-Haenszel logrank testi. Ennustaa likimääräinen otoskoko kussakin hoitoryhmässä, jotka saattavat olla tarpeen havaita tilastollisesti merkitsevä vaikutus kastraation plus dutasteridille verrattuna kastraation yksin, käytimme täydellinen kotelo resampling joukolle otoskokoihin n = 10, 20, …, 200 yli 500 bootstrap rinnakkaista. Kunkin näytteen koon ja bootstrap rinnakkaisia, sovimme Coxin suhteellisen vaarat malli ja kirjataan arvioidun riskisuhde ja p-arvo.

analyysi qRT-PCR tietojen syklin keskimääräisen kynnyksen (Ct) jokaista geeniä normalisoitiin ilmentymisen housekeeping-geenin RPL13A samasta näytteestä (delta Ct). Keskimääräinen ilmentyminen RPL13A oli 15,6 +/- 0,5 (keskiarvo +/- SD) ja 14,1 +/- 0,8 LuCaP35 ja LuCap96 kasvaimet vastaavasti. Welch kaksi otoksen t-testejä käytettiin vertailla eroja androgeenitason ja eroja keskimääräisissä delta Ct: n jokaista geeniä hoitoryhmien välillä ilman korjausta useita testejä. P-arvot 0,05 pidettiin merkittävinä. Taitteen muutos laskettiin delta-delta Ct menetelmällä (fold = 2

ΔΔCt). Raaka DCT: n, ddCT n ja kertamuutoksia esitetään Supplemental tiedot.

Tulokset

Eturauhasen syöpiä vastaaminen androgeenireseptorin tukahduttaminen osoittaa luontaisia ​​eroja pohjapinta tasoilla kasvaimensisäisenä androgeenien ja steroidien geeniekspression

arvioimiseksi kasvainten ominaisuuksiin liittyvä vaste ja kestävyys AR-reittiin terapiasta, ensin määritetään kasvaimensisäisenä androgeenien ja steroidien geeniekspression kahdessa eturauhassyövän potilaan johdettu ksenograftien, LuCaP35 ja LuCaP96. Nämä linjat ilmaista AR ja PSA, (kuvio 1A) ja vastata kastraatio kanssa kasvaimen taantumiseen ja pitenemistapauksia ilman taudin etenemistä (PFS), mutta lopulta edetä kastraatio kestävä kasvu (p 0,0001 molemmille, kuviossa 1B, 1C). Erityisesti LuCaP35 ja LuCaP96 kasvaimia resektoitiin hiiristä ehjät sukurauhastoiminnan näytteillä selkeitä eroja pohjapinta tasoilla kasvaimensisäisenä androgeenien (kuva 1 D): LuCaP96 kasvaimet ovat korkeammat T ja vastaavien DHT, ja siten suuremman suhde kasvaimensisäisenä T: DHT verrattuna LuCaP35 kasvaimia, klo 10:01 ja 02:01, vastaavasti (LuCaP96 T = 10,2 ± 6,5 ng /g; DHT = 0,9 ± 0,4 ng /g; LuCaP35 T = 2,6 ± 2,0 ng /g; DHT = 1,4 ± 0,8 ng /g, taulukko S1).

(A) edustaja FFPE näytteitä kustakin ksenografti värjättiin hematoksyliinillä ja eosiinilla (H 750 mm

3) hiirissä, jotka kantoivat LuCaP35 (B) tai LuCaP96 (C) ksenograftit. Ehjä mies SCID-hiiriin istutettiin ihonalaisesti 30 mm

3 kappaletta ilmoitettu ksenografteista. Kun kasvaimet olivat saavuttaneet -300 mm

3, hiiret jaettiin satunnaisesti kirjoilla osaksi kohortteja, jotka olivat joko vasemmalle ehjät (nro CX) tai kastroitava (Cx). P-arvot käyrän vertailut muodostettiin käyttäen Mantel-Haenszel logrank testi. (D) Mean ja keskihajonta kudoksen testosteronin (T, musta palkki) ja DHT (harmaa palkki) tasot mitattiin massaspektrometrillä kasvaimissa osoitetun ksenograftin (siirrostettiin ehjä hiiret). (E) Suhteellinen ilmentyminen transkriptien osoitettujen steroidien geenien laskettiin delta DCT-menetelmä (kertainen muutos = 2∧ddCt). Geenit ilmentyvät differentiaalisesti LuCaP35 vs. LuCaP96 kuluessa suuruusluokkaa on merkitty sisällä harmaat viivat. Merkittäviä eroja (Welch t-testillä; p 0,05) on merkitty mustalla piireissä; valkoiset ympyrät osoittavat geenejä, jotka eivät olleet merkittävästi erilaisia ​​välillä LuCaP35 ja LuCaP96 (kaikki annetut arvot Täydentävä Data 2) .Upward kolmiot osoittavat erittäin differentiaalisesti ilmentyvien geenien nimenomaan mikä lisää T (AKR1C3, 40-kertainen) tai lisääntynyt DHT tasot (SRD5A1, 5,0-kertaiseksi ; 17BHSD10 4,8-kertainen, RLHSD, 99-kertainen). Alaspäin kolmiot osoittavat erittäin differentiaalisesti ilmentyvien geenien nimenomaan välittävien DHT hajoamista (AKR1C2, 7-kertaiseksi, UGT2B15, 3000-kertainen).

tunnistamiseksi mekanismeja, jotka auttavat pohjapinta monia sisäisiä kasvaimen T ja DHT pitoisuuksia, arvioimme kasvain-spesifisen ilmentymisen transkriptien koodaava ensisijainen entsyymejä, jotka liittyvät steroidien synteesin ja hajoamisen (kuvio S1). Vaikka monet steroidien geenit ilmaistaan ​​LuCaP35 kuluessa suuruusluokkaa niiden ilmaisun LuCaP96 (kuvio 1 E), useita eroja sopusoinnussa eri kasvain androgeenireseptorin profiilit olivat läsnä. Erityisesti geenien ilmentymiseen LuCaP35 oli yhteneväinen androgeenituotantoa ja ylläpito DHT tasot, jotka osoittavat korkeampaa steroidien biosynteettisten geenien kuten STAR (10-kertainen) ja HSD3B1 (10-kertainen), korkeampi geenien ilmentymistä välittävien DHT tuotanto (SRD5A1 , 5-kertainen, 17BHSD10 4,8-kertainen, RLHSD, 99-kertainen), ja alemman geenien ilmentymistä välittävien DHT hajoamista (AKR1C2, 7 kertaa pienempi; UGT2B17, 3000 kertaa pienempi). Sen sijaan, geeni-ilmentymisen LuCaP96 oli yhdenmukainen valmistus ja huolto T, huomattavasti korkeampi AKR1C3 (40-kertainen; yhdenmukaisia ​​kasvu T tuotannon androsteenidionin), yhdessä alhaisempi SRD5A1 (ensisijainen vastaava entsyymi muuntamiseksi T DHT neoplastisissa eturauhasen kudosta) [32] ja korkeampi DHT kataboliaa entsyymit AKR1C2 ja UGT2B17. (Cycle kynnysarvot ja kertamuutoksia kaikkien geenien kuviossa 1E on esitetty taulukossa S2). Koska nämä kasvaimet kasvatettiin geneettisesti identtisiä hiiren isännät, nämä tiedot tunnistaa luontaisia ​​kasvain-vaihtelua androgeenien metabolisen ohjelmissa huipentui selvästi kasvaimensisäisenä eroja AR ligandipitoisuuksia.

Pre-reseptorin androgeenireseptorin reitin suppressio kastraatio plus SRD5A esto osoittaa kasvain vaikutusindikaattoreilla viivästyttämään etenemisessä CRPC

Koska 5-10 kertainen vaikutus DHT harjoittaa ja aktivoimalla AR verrattuna T, [25], [26] strategioita kohdistaminen DHT vähentäminen estämällä metabolia T DHT voi olla tehokas ennalta reseptorin tapa tukahduttaa yleistä suuruus AR signalointi. Sen määrittämiseksi, onko kasvain liittyviä eroja pohjapinta suhde kasvaimensisäisenä T: DHT vaikuttaisi kliininen vaste tekijöille kohdistaminen muuntaminen T DHT, käsittelimme kohorttien hiirillä LuCaP35 ja LuCaP96 kasvaimia kastraatio yksin tai kastraatio sekä dual SRD5A estäjä dutasteridi. Ehjä mies SCID hiiriin ihon alle istutettiin 30 mm

3 kpl LuCaP35 tai LuCaP96 kasvaimia. Sen jälkeen kasvu -300 mm

3, hiiret kastroitu ja satunnaistettiin ajoneuvon tai dutasteridille tapahtui suun kautta 8 viikon ajan.

kasvaimen volyymit LuCaP35 kasvaimia merkittävästi tukahdutti yhdistelmällä kastraation plus dutasteridin vs. kastraatio yksin (kuvio 2A). Kasvaimen kasvu oli kolme erillistä vaihetta hoidon aloittamisesta: lyhyen ajan jatkuvasta kasvusta (päivinä 0-14), pitkittynyt vaihe kasvaimen regressio tai stabiliteetin (päivinä 14-75) ja loppuvaiheessa kasvaimen uudelleen kasvuun ( päivinä 75-200). Paremmin kvantitoimiseksi vaikutusta dutasteridin vertasimme kasvaimen tilavuus liikeradat kastraatio vs. kastraatio plus dutasteridille ryhmiä käyttäen lineaarista sekamallia kumpaankin jälkikäsittely vaihe. Dutasteridi plus kastraatio vähensi prosentin kasvu kasvaimen tilavuuden päivässä verrattuna kastraatio yksin alkuperäisen ”on-hoito” vaiheen (3,2% [95% CI 2,7-3,7] 0,9% [95% CI 0,2-2,0]; p p 0,0001). Kuitenkin hoidon keskeyttämisen jälkeen, dutasteridi saaneilla kasvaimia osoitti nopeampaa prosenttia uudelleen kasvu päivässä (1,1% [95% CI 0,9-1,3] 2,3% [95% CI 1,8-2,9]; p 0,0001), mikä viittaa siihen, hoidon jatkamisen vaadittaisiin pitämään terapeuttista tehoa.

Mean kasvainten tilavuudet hiirillä LuCaP35 (A) ja LuCaP96 (B) ksenograftit. Ehjä mies SCID hiiriin ihon alle istutettiin 30 mm

3 kpl osoitetun ksenograftin. Kun kasvaimet olivat saavuttaneet ~300mm

3, hiiret kastroitu ja satunnaisesti kirjoilla osaksi ikäluokat hoidettiin joko ajoneuvon (Cx) tai dutasteridi (Cx + dut) 8 viikon ajan (merkitty mustalla viivalla edellä x-akseli). Kasvaimen volyymit kuvataan kussakin testiryhmässä ilmoitettuina päivinä lähettää ilmoittautuminen (Cx, mustat neliöt; Cx + Dut, valkoiset ympyrät).

Sen sijaan kasvainten tilavuudet LuCaP96 kasvaimia ei tukahduttaa lisäksi dutasteridia kastraation (kuvio 2B), jossa ei ole muutosta riskisuhde (HR) PFS (HR 0,9, p = 0,97, ei esitetty). Tutkia, kuinka paljon ei-merkitsevä ero johtui eläinten lukumäärä, me bootstrapped alkuperäisestä datan 500 kertaa ja totesi, että vaikka n = 170 hiirtä hoitoryhmään, vaatimaton (HR 1,4), mutta tilastollisesti merkittävää parannusta selviytyminen havaittiin vain 50% toistojen, mikä viittaa siihen, todennäköisyys havaita kliinisesti merkittävä hoitovaikutus on suurempi tutkimuksessa oli alhainen. Kaiken kaikkiaan nämä havainnot osoittavat, että esi-reseptorin androgeenireseptorin reitin tukahduttaminen kastraatio plus SRD5A esto voi hidastaa etenemistä kastraation kestävä kasvu. Mutta tämä vastaus ei ole yleinen, vaan näyttää olevan kasvaimen tyyppi-spesifisiä, ja siihen liittyy niiden kasvainten, joilla androgeenin metabolisen entsyymin profiili ylläpitävän kasvaimeen DHT tasoilla, kuten LuCaP35 sijaan T-hallitseva kasvaimen, kuten LuCaP96.

Tuumorikoko hoitoa aloitettaessa vaikuttaa pitkällä aikavälillä vastaus androgeenireseptorin tukahduttaminen plus SRD5A esto

tarkastella edelleen kasvainten ominaisuuksiin liittyvä vaste edeltävälle reseptoriin AR reitin esto, päätimme onko vastaus hoitoon liittyi kasvaimen kokoisista hoidon aloittamista. Vaikka tutkimuksen tarkoituksena oli aloittaa hoito kasvaimen tilavuuteen -300 mm

3, logistiikka eläinkokeiden johti mitattavissa vaihtelua kasvaimen koon tutkimuksen alkaessa. Olemme mielivaltaisesti ryhmitelty kasvaimia osaksi kohortteja 250 mm

3, 250-400 mm

3, ja 400 mm

3 klo ilmoittautuminen ja verrattiin vaikutus kastraation vs. kastraation plus dutasteridille kussakin ryhmässä . On huomattava, että merkittävää parannusta mediaanielinajassa opetetaan dutasteridia koko LuCaP35 kohortti (152-337 päivää, HR etenemisen 2,8 [95% CI 1,4-4,6], p = 0,0015; kuvio 3A), näyttivät pääasiassa iskusta kasvaimia, jotka olivat pienimmät ( 250 mm

3) aikaan ilmoittautuminen (HR progression 7,3 [95% CI 2,2-30], p 0,0015, vs. kastraatio yksin kuvio 3B). Sen sijaan yhdistelmä kastraation plus 8 viikon dutasteridin ei tilastollisesti vaikutusta PFS kasvaimissa mittaamalla 250-400 mm

3 tai 400 mm

3 klo ilmoittautuminen (ei kuvassa); kuitenkin, tämä saattaa heijastaa vähentynyt liittyvä virta post-hoc alaluokkiin ryhmien.

Kaplan-Meierin kuvaajia ilman taudin etenemistä (määritellään kasvaimen kokoa 750 mm3) kaikissa LuCaP35 käsitellyt kasvaimet kastraatio yksin (Cx) vs. kastraation + dutasteridia (Cx + dut) (A) ja kasvaimet kirjoilla osaksi kohtelun kasvaimia 250 mm

3 (B). P-arvot käyrän vertailut muodostettiin käyttäen Mantel-Haenszel logrank testi. Mean kasvaimen tilavuus kasvukäyrät ilmoitetuilla vuorokautta aloituspaikkojen LuCaP35 kasvaimissa kirjoilla osaksi kohtelun kasvaimia 250 mm

3 (C), välillä 250-400 mm

3 (D), ja 400 mm

3 (E). Dutasteridiryhmässä jatkettiin 8 viikon ajan (merkitty mustalla viivalla edellä x-akseli) on kastraatio + dutasteridiryhmässä.

tarkastus kasvaimen tilavuuden käyrien ehdotti estävä vaikutus Dutasteridin säilyi jopa lopettamisen jälkeen terapia kasvainten 250 mm

3 ilmoittautuminen (kuvio 3C). Sen sijaan kasvaimen kasvua tukahdutettiin suhteessa kastraatio kasvaimissa 250 mm

3 ilmoittautuminen (kuvio 3D, 3E), mutta vain silloin, kun kasvaimet olivat hoidon aikana. Lopettamisen jälkeen, kasvaimen koko näissä ikäryhmät kiinni kasvaimiin käsitelty kastraatio yksin, niin että lopulta eroa eloonjäämisen havaittu. Lähtöaineena kasvaimen ei liittynyt hengissä LuCaP96 käsitellyt kasvaimet dutasteridilla (ei kuvassa).

systeeminen androgeenireseptorin tukahduttaminen plus SRD5A esto vähentää merkittävästi kasvaimen DHT tasot verrattuna androgen tukahduttaminen yksin

Määritä onko ero vaikutusta SRD5A eston kasvaimen kasvuun näkyy erilainen tukahduttaminen kasvaimensisäisiä androgeenien, mittasimme T ja DHT tasot kasvainten resekoituun hoidon jälkeen. Sekä LuCaP35 ja LuCaP96 kasvaintyypeissä, kasvaimen DHT tasot mitattiin 3-21 päivää (merkitty kaksipäinen nuolilla kuviossa 4A ja 4B) olivat huomattavasti alhaisemmat kastraatio plus dutasteridia vs. kastraation yksin ryhmiä, joissa arvot LuCaP35 tukahdutetaan 0,40 ± 0,56 ng /g 0,02 ± 0,04, p = 0,007 ja LuCaP96 0,10 ± 0,08 ng /g 0,02 ± 0,01, p = 0,005 (yhteenveto taulukossa S1).

Tissue testosteroni (T , mustat palkit) ja DHT (harmaat palkit) mitattiin massaspektrometrillä vuonna LuCaP35 (A) ja LuCap96 (B) kasvaimia resektoitiin koskemattomista hiiristä (nro Cx), ja hiirille on kastraatio yksinään (Cx) tai kastraatio + dutasteridia (Cx + dut) varhaisessa ajankohtina (d3-21, samalla hoidon, osoitetaan kaksipäinen nuolet), tai kastraatio vastustuskykyisten uudelleen kasvua (määritelty 750 mm

3). P-arvot lasketaan Welchin kaksi otoksen t-testiä (p 0,05 pidettiin merkittävinä). Yhden tähdet osoittavat tilastollisesti merkittävää eroa DHT tasojen Cx vs. Cx + dut käsiteltiin näytteitä d3-21 hoidon. Double tähdet osoittavat merkittävää eroa DHT tasojen Cx vs. Cx + dut käsiteltyjen näytteiden jälkeenkin kastraation-toistuvat uudelleen kasvuun. Mikään muu vertailuja Cx vs. Cx + dut käsitelty ryhmät olivat merkittäviä. Expression of täyspitkän (FL) AR ja AR variantin 7 (ARV7) katkaistun silmukointivariantti mitattiin LuCaP35 (C) ja LuCaP96 (D) aikaan kasvaimen uudelleen kasvun 750 mm

3. Transkriptioekspressiokuvio mitattiin qRT-PCR: llä ja normalisoitiin ilmentymisen housekeeping-geenin RPL13A kussakin näytteessä, jolloin saadaan delta syklin kynnys (DCT). Suhteellinen ero ilmaisun eroksi hoitoryhmien laskettiin delta DCT menetelmällä (fold muutos = 2∧ddCt). P-arvot lasketaan Welchin kaksi otoksen t-testiä (p 0,05 pidettiin merkittävinä).

Mielenkiintoista, kun taas T tasot LuCaP35 kasvaimissa pysyivät tukahdutetaan kummassakaan hoitoryhmässä (kuvio 4A, mustat palkit), DHT tasot LuCaP35 kasvaimissa toistuvia jälkeen yhdistelmähoidon (keskimäärin 211 päivää lopettamisen jälkeen dutasteridin) olivat samankaltaisia ​​kasvaimia toistuvia jälkeen kastraation yksin (0,54 ± 0,46 ng /g ja 0,61 ± 0,63 ng /g, vastaavasti; harmaat palkit). Sen sijaan DHT tasot LuCaP 96 kasvaimissa toistuvia jälkeen yhdistelmähoidon (keskimäärin 96 päivän kuluttua lopettamisen dutasteridille) pysyivät tukahdutetaan kuukauden päättymisen jälkeen dutasteridia (kuvio 4B, 0,04 ± 0,04 ng /g verrattuna 0,53 ± 0,46 ng /g kastraatio yksin ), kun taas T tasoilla osoitti merkittäviä saattamisen jälkeen joko kastraation yksin tai jälkeen yhdistetyn hoidon (1,34 ± 0,89 ng /g ja 0,79 ± 0,71 ng /g, vastaavasti, ja taulukko S1). On huomioitava, että puoliintumisaika dutasteridi hiirillä on alle 2 päivää, [33] vastainen on jäljellä vaikutus SRD5A estoa steroidien pitoisuuksiin 96 vs. 35 kasvaimia aikaan resektio. Kasvaimen androgen tasot LuCaP35 kasvaimia aikaan uudelleen kasvua ei liittynyt kasvaimen kokoa ilmoittautuminen (tuloksia ei ole esitetty).

taipumusta käyttökuntoon DHT tasojen LuCaP35 ja T LuCaP96 on yhdenmukainen luontainen vaihtelu androgeenien metabolisen ohjelmissa suositaan DHT vs. T tunnistettu käsittelemättömän kasvaimissa (kuvio 1 E). Lisäksi suhteellinen ilmentyminen steroidien geenien LuCaP35 vs. LuCaP96 kasvaimia toistuvia kastraation jälkeen vs. kastraation plus dutasteridille oli hyvin samankaltainen kuin ekspressiokuvioita havaittiin käsittelemättömissä kasvaimissa (kuvio S2). Yhdessä nämä tiedot osoittavat, että dutasteridi esti tehokkaasti DHT tuotanto kummassakin kasvaintyypeissä, ja että LuCaP35 kasvaimen kasvu on altis tehostetun ennalta reseptorin tukahduttaminen DHT saavutetaan yhdistämällä kastraation plus SRD5A esto, kun taas LuCaP96 ei ole.

systeeminen androgeenireseptorin tukahduttaminen plus SRD5A esto liittyy kasvaimen tyypille ominaisia ​​eroja induktio täyspitkä AR ja AR silmukoitumisvariantit

kastraatio kestävä eturauhasen kasvaimia usein ominaista lisääntynyt ilmentyminen täyspitkän AR ( AR

FL), ja äskettäin on raportoitu, lisääntynyt ilmentyminen AR

sv että puuttuu LBD ja näin ollen antaa konstitutiivisia ligandista riippumatonta AR aktiivisuutta. Erot AR

FL ja AR

sv tasot voivat edistää vaihtelua kasvaimen kasvua vasteita Ennalta reseptoriligandilla tukahduttaminen. Siksi arvioimme ilmaus AR

FL ja vallalla AR

sv tunnistettu ihmisen CRPC näytteissä, AR

V7 (joka koodaa samaa proteiinia kuin AR

V3) in LuCaP35 ja LuCaP96 kasvaimia toistuva jälkeen ADT ja dutasteridin [13], [14], [16], [17], [34].

verrattuna kasvaimiin resektoitiin koskemattomista hiiristä, LuCaP35 kasvaimet toistuva jälkeen kastraatio tai sen jälkeen kastraation plus dutasteridia osoittivat 2.0-kertainen nousu ilmaus AR

FL, eikä kasvu AR

V7 (kuvio 4C, ja taulukko S3). Sitä vastoin, kun taas LuCaP96 kasvaimia toistuvat kastraation jälkeen yksin osoitettiin samankaltaisiksi 1,9-kertaisesti lisääntyneen ilmentymisen AR

FL, ne myös osoittivat merkittävää 10-kertainen ekspression lisääntymisen AR

V7 (kuvio 4D).