Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

Tissue eritteet sisältävät pienistä seerumin komplementin proteiinien ja niiden sääntelyyn vaikutukset eturauhassyöpään eteneminen ovat suurelta osin tuntemattomia. Tutkimme erityinen seerumin komplementtikomponentit koordinoinnissa aktivointi tuumorisuppressorien p53 ja WWOX (myös nimetty tai WOX1) ja kinaasien ERK, JNK1 ja STST3 ihmisen eturauhasen DU145 soluja.

Menetelmät /Principal Havainnot

DU145 soluja viljeltiin yön yli 1% tavallista ihmisen seerumia tai ihmisen seerumissa köyhdytettyä indikoidun komplementtiproteiini. Komplementin C1q- tai C6-vapaa olosuhteissa WOX1 ja ERK olivat pääosin läsnä solulimassa ilman fosforylaatiota, kun taas fosforyloitu JNK1 suuresti kertynyt ytimet. Eksogeeninen C1q nopeasti palautti WOX1 aktivointi (jossa Tyr33 fosforylaatio) alle 2 h. Ilman seerumikomplementtia C9, p53 aktivoituivat, ja hyaluronaaniin (HA) käänteinen vaikutus. Alle 6-vapaa olosuhteissa, HA aiheuttama aktivointi STAT3, tehostajan etäpesäkkeiden. Erityisesti, eksogeeninen C1q merkittävästi indusoi apoptoosia WOX1 yli-ilmentäviä DU145-soluissa, mutta ei ajoneuvon ilmentäviä soluja. Dominoiva negatiivinen ja Y33R mutantti WOX1 estetty apoptoottisen vaikutuksen. C1q ei tehostanut p53-välitteisen apoptoosin. Täydellisen sisäisen heijastuksen fluoresenssi (TIRF) mikroskopia, määritettiin, että C1 q epävakaiksi tarttuvuus WOX1 ilmentävien DU145 solujen osittaisen irrotuksen ja indusoivan muodostumista ryhmittyneet mikrovillus fokaalisen adheesion erityisesti solujen välillä. Nämä solut sitten tehtiin kutistuminen, kalvo kupliminen ja kuolema. Merkillistä, määritettynä Immuunivärjäystä eturauhasen hyvänlaatuisen liikakasvun ja eturauhassyövän osoitettiin olevan merkittävästi pienentynyt ilmaus kudoksen C1q verrattuna samanikäisiin normaalin eturauhasen kudoksia.

Johtopäätökset /merkitys

päättelevät, että komplementti C1q voi indusoida syöpäsolujen aktivoimalla WOX1 ja epävakautta soluadheesiota. Downregulation C1q parantaa eturauhasen liikakasvun ja syövän muodostumista viasta johtuen WOX1 aktivoinnin.

Citation: Hong Q, Sze C-I, Lin S-R, Lee M-H, hän R-Y, Schultz L, et ai. (2009) Komplementin C1q Aktivoi Tumor vaimennin WWOX apoptoosin indusoimiseksi Prostate Cancer Cells. PLoS ONE 4 (6): e5755. doi: 10,1371 /journal.pone.0005755

Editor: Nils Cordes, Dresdenin teknillinen yliopisto, Saksa

vastaanotettu: 04 tammikuu 2009; Hyväksytty: 05 toukokuu 2009; Julkaistu: 01 kesäkuu 2009

Copyright: © 2009 Hong et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoittajat: Tutkimus oli tukevat osittain Guthrie Foundation for Education and Research, National Science neuvosto, Taiwan (NSC96-2320-B-006-014, 96-2628-B-006-041-MY3 96-2628-B-006- 045-MY3), National Health Research Institute, Taiwan (NHRIEX97-9704BI), National Cheng Kung yliopisto merkittävään kohteeseen (C0167), ja Department of Defense, USA (BC075692) NS Chang. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Hyaluronihappo tai hyaluronaani (HA) mukana huomattavan monia solu- ja fysiologisia tapahtumia, mukaan lukien alkion kehitys, morfogeneesiä, erilaistuminen, tulehdus, loukkaantumisesta paranemista, immuunivasteen, ja syövän etenemisen ja etäpesäkkeiden [1] – [ ,,,0],4]. HA on mukana aloittamista ja etenemistä tulehdus sekä solu- ja solunulkoisia pitoisuuksia [5], [6]. Solutasolla tasoilla tulehduksen, HA rekrytoi neutrofiilit, aktivoi makrofageja ja stimuloi dendriittisolun kypsymistä. Kuitenkin seerumin HA voi vuorovaikutuksessa komplementin proteiinien. Luonnossa esiintyvät polysulfatoidut glykosaminoglykaanit, kuten hepariini, rajoittaa seerumin komplementtiaktivaatioon kautta sekä klassista että vaihtoehtoisia väyliä tulehduksen aikana [7] – [10]. Teho glykosaminoglykaanit estämisessä komplementin aktivoitumista riippuu niiden laajuus ja kannat polysulfatointi. Ellei konformationaalisesti muuttunut, ei-sulfatoitujen HA, jopa suurina pitoisuuksina (1-5 mg /ml), ei voi rajoittaa komplementin aktivaation [7], [11] – [13]. Induktio seerumin komplementin aktivaation on pidetty tärkeänä strategioita tappaa syöpäsoluja

in vivo

[14], [15]. Syöpäsolu johdettuja estäjien estää varhaisen komplementtikomponentit ovat tiedetään lisäävän syövän kasvua [16]. Expression vaihtoehtoisen reitin inhibiittorin tekijä H keuhkosyöpäsoluissa näyttää olevan kriittinen niiden säilymistä [17]. Tästä huolimatta toiminnallista roolia kunkin yksittäisen seerumin komplementin komponentin säätelyssä syövän solujen eloonjäämistä ei juuri tunneta.

Kuten muissa kudoksissa, eturauhasen altistuu eritteiden verestä, joka sisältää pieniä määriä verenkierrossa komplementin proteiinien. Olipa komplementtiproteiineja ohjata eturauhasen solujen kasvuun ja liikakasvu iän ei tunneta. Täällä hyödyntämällä seerumit valittujen poistamisen komplementin proteiinien, tutkimme onko kukin yksittäinen komplementtiproteiini säätelee aktivointi tuumorisuppressoreilla ja kinaasiproteiinien ihmisen eturauhasen DU145 soluja. Nämä proteiinit sisältävät ekstrasellulaarisen-signaali säännelty kinaasi /mitogeeniaktivoidut proteiinikinaasi (ERK tai MAPK) [18], WW domain sisältäviä oksidoreduktaasi (WWOX, FOR tai WOX1) [19] – [21], p53 [22], c -Jun

N

terminaalista kinaasia (JNK1), ja signaali anturin ja aktivaattori transkription 3 (STST3) [23] – [25]. Olemme todenneet, että ilman seerumia komplementin C1q tai C6, pohjapinta tasoja aktivaation tai ydinaseiden kertymistä ERK ja WOX1 vähenivät huomattavasti, kun taas konstitutiivisen aktivaation JNK1 tapahtunut. WOX1 on tuumorisuppressoriproteiinia ja proapoptoottiset proteiini [19] – [21; arvostelut]. Mielenkiintoista, puuttuessa seerumin komplementin C9, konstitutiivisen p53 aktivaation tapahtunut. Suurimoolimassainen koko HA merkittävästi aiheuttama aktivointi STAT3 vuonna DU145, vasta kun C1q oli poissa seerumissa. STAT3 edistää eturauhassyövän hyökkäys [23] – [25]. Lopuksi, C1q yksin pystyi aktivoimaan kohdunulkoinen WOX1 tappamisessa eturauhasen syöpäsoluja. Keskustelimme todennäköinen skenaario kierrättämiseksi tai Perisellulaarinen HA ja täydentävät proteiinien säätelyssä syöpäsolujen kasvua ja kuolema aktivoimalla p53, WOX1, JNK1, ja STST3.

Tulokset

täydennyksessä C1q aktivoi tuumorisuppressoriproteiinia WWOX /WOX1 ihmisen eturauhasen DU145 solujen

selvitettävä, C1q aktivoi endogeenisiä WOX1 ydinvoiman kertymistä. Merkittäviä todisteita osoittaa, että WOX1 on tuumorisuppressori [19] – [21], [26]. Fosforylaatiota WOX1 at Tyr33 (p-WOX1) on olennainen sen apoptoottista aktiivisuutta sekä

in vitro

ja

in vivo

[27] – [31]. Kuitenkin hoidon alussa, hyperplasia ja syövän vaiheissa, on merkittävä voimistumista WOX1 ilmaisun ja Tyr33 fosforylaatio eturauhasessa, ihon ja rintojen, ja että ilmentyminen vähenee dramaattisesti maligniteetti ja etäpesäkkeiden

in vivo

[21] [29], [32]. Hiiren WOX1 /Wwox on kriittinen synnytyksen jälkeinen eloonjääminen, siltä osin kuin hiirissä, selviäisi ainoastaan ​​yhden kuukauden [20], [33]. Myös tämä proteiini on välttämätön normaalille luun aineenvaihdunnan [33]. Mekanismeja koskevat ohjaus WOX1 käyttämään prosurvival tai proapoptoottiset toimintoja voidaan vielä perustettu.

Ihmisen DU145-soluja viljeltiin yön yli, kun läsnä oli lämpöinaktivoitua naudan sikiön seerumia (10%), minkä jälkeen nälkään 1 h ilman seerumia. Nämä solut käsiteltiin sitten puhdistetulla C1q: ssa 1 tunti. Localization of p-WOX1 määritettiin immunofluoresenssimikroskopialla. Nämä nälkään soluilla oli hyvin alhainen sytoplasmisen p-WOX1 (Fig. 1A). Eksogeeninen C1q nopeasti aiheuttamaa kertyminen p-WOX1 ytimet (Fig. 1 B). Vertailun vuoksi, kun nälässä soluja viljeltiin 1%: C1q-köyhdytettyä (ΔC1q) ihmisen seerumin 1 tunnin ajan, p-WOX1 pääasiassa sijaitsi sytoplasmassa (Fig. 1 C). Käyttökuntoon ΔC1q seerumin puhdistetulla C1q nopeasti indusoi p-WOX1 kertymistä ytimet (Fig. 1 D).

(A, B) DU145 soluja kasvatettiin suojalasi ja viljeltiin yön 10% lämpöinaktivoitua sikiön naudan seerumin. Sitten solut nälässä seerumittomissa olosuhteissa 1 tunnin ajan, minkä jälkeen käsittelemällä kanssa tai ilman puhdistettiin C1q (1 ug /ml) 1 tunnin ajan. Lokalisointi endogeenisen Tyr33-fosforyloitiin WOX1 (p-WOX1) määritettiin immunofluoresenssimikroskopialla. (C, D) lisäksi nälässä soluja viljeltiin sitten 1%: C1q-köyhdytettyä ihmisen seerumia (ΔC1q seerumia) 1 tunnin ajan, kun läsnä on tai ei ole eksogeenisiä C1q (1 ug /ml). (E) läsnäolo p-WOX1 tumissa näkyy laskemasta -100 soluista 3 kokeita (keskiarvo ± keskihajonta).

täydennyksessä C1q aktivoi kohdunulkoinen WOX1 apoptoosin of DU145 solujen

selvitettävä, C1q aktivoi kohdunulkoinen WOX1 apoptoosin. DU145 solut transfektoitiin EGFP-WOX1 (koodattu EGFP) tai EGFP yksin elektroporaatiolla. Näitä soluja viljeltiin yön yli (10% lämpöinaktivoitua naudan sikiön seerumia), ja sen jälkeen käsittelemällä puhdistettua C1q 24 tunnin ajan. C1q parannettu WOX1 indusoiman apoptoosin ja kasvun tukahduttaminen DU145 solujen annosriippuvainen tavalla, joka käy ilmi lisääntynyt solujen populaatio on SubG1 vaiheessa ja vähentää väestön G0 /G1 vaiheessa solusyklin (kuviot. 2A ja 2B ja täydennyskuvio. S1). Kontrolleissa, C1q ei aiheuttanut apoptoosia DU145 soluissa yli-ilmentävät EGFP-vektorilla (kuviot. 2A ja 2B).

(A) DU145 solut transfektoitiin EGFP-WOX1 (koodattu EGFP) tai EGFP yksin elektroporaation , viljeltiin yön yli, ja sitten sitä käsiteltiin puhdistetulla C1q (1 ug /ml) 24 tunnin ajan. C1q parannettu WOX1 aiheuttamaa apoptoosia DU145 soluja (katso korotukset SubG1 vaiheessa). Vuonna vektori valvonta, C1q ei tehostanut apoptoosia DU145 soluissa yli-ilmentävät EGFP. (B) edustaja tietokokonaisuus 3 kokeissa esitetään pylväskaavio. Samanlaisia ​​tuloksia havaittiin transfektoimalla DU145-solujen kanssa eri määriä WOX1, minkä jälkeen käsittelemällä 1 ug /ml C1q: ssa yön yli (katso Täydentävä kuvio. S1). WOX1: EGFP-WOX1. Vector: EGFP vain. Ei ep: soluja ilman elektroporaatiota. (C) Stable transfektantteja BCC-solujen ilmaisemiseen EGFP tai EGFP-hWOX1 (ihmisen WOX1 /WWOX) perustettiin. By aikaväli mikroskopia, C1q (1 ug /ml) indusoi kuolema hWOX1 ilmentävien solujen, mutta ei EGFP-ilmentäviä soluja. Nämä hWOX1 ilmentävien solujen näyttivät läpi tyypillisiä apoptoosin, kun he osoittivat solun kutistuminen ja kalvo kupliminen on aikaan liittyvät tavalla. Edustava data näytetään 5 kokeita.

parantaminen apoptoosin C1q ei johtunut sen aktivoitumisen komplementtikaskadin sikiön seerumia, sikäli kuin seerumi oli lämpöinaktivoitua. Lisäksi, seerumittomissa olosuhteissa, eksogeeninen C1q parannettu ektooppinen WOX1-välitteistä apoptoosia (tuloksia ei ole esitetty). Nämä havainnot viittaavat siihen, että WOX1 on alavirtavaikuttajainhibiittorit C1q-välitteisen apoptoosin, ei osallistu komplementin aktivaation.

Samanlaisissa koeolosuhteissa, osoitimme, että C1q lisääntynyttä apoptoosia soluissa, jotka yliekspressoivat WOX1. Näitä olivat rintojen MCF7 (täydennyskuvio. S2), ja neuroblastooma SH-SY5Y (täydennyskuvio. S3) ja SK-N-SH-soluja (tietoja ei esitetty). Jälleen mitään vaikutusta ei havaittu käyttämällä soluja yliekspressoivien EGFP vain.

Samalla vakaa transfektantit ihon tyvisolusyöpä (BCC) ilmentämiseen EGFP tai ihmisen WWOX /WOX1 (hWOX1 koodattu EGFP) perustettiin käyttäen G418 valinta. By aikaväli mikroskopia, osoitimme, että BCC-solut, jotka ilmentävät EGFP olivat resistenttejä C1q-välitteisen solukuoleman, kun taas hWOX1-ilmentävät solut olivat herkkiä C1q (Fig. 2C). Nämä hWOX1 ilmentävien solujen ilmestyi näytteille tyypillinen morfologia apoptoosin, kuten solun kutistuminen ja kalvo kupliminen.

N

terminaalista Tyr33-fosforyloitu WW verkkotunnus WOX1 vastaa C1q aiheuttamaa apoptoosia DU145 solut

määrittää, mikä toimialueen (t) WOX1 osallistuu C1q-välitteisen apoptoosin DU145 soluja. Ihmisen ja hiiren WWOX /FOR /WOX1 koostuu kahdesta

N

terminaalista WW verkkotunnuksia, eli tumalokalisaatiosekvenssiai-, ja

C

terminaalista lyhytketjuisia alkoholidehydrogenaasi /reduktaasi (SDR) verkkotunnuksen [19-21,34; arvostelut]. Dominoiva negatiivinen-WOX1 (dn-WOX1) suunniteltiin aiemmin, jossa muutokset

N

terminaalista ensimmäinen WW verkkotunnuksen [27]. dn-WOX1 tiedetään estää apoptoottisen p53 ja estää fosforylaation endogeenisen WOX1 on Tyr33 [27]. Kun DU145 solut lyhytaikaisesti yli-ilmentynyt kanssa DN-WOX1 (EGFP tag), solut vastustanut C1q: n indusoiman apoptoosin (Fig. 3). Kontrolleissa, solut transfektoitiin EGFP-vektorilla, ja solut eivät apoptoosia vasteena C1q (tietoja ei ole esitetty tai ks. 2). Positiivisista kontrolleista, ei-transfektoituja soluja käsiteltiin staurosporiini apoptoosin (Fig. 3).

(A) DU145-solut elektroporoitiin eri määrä dn-WOX1 (EGFP tag) tai EGFP yksin, minkä jälkeen viljelemällä 24 tuntia. dn-WOX1-ilmentäviä soluja käsiteltiin C1q (1 ug /ml) yön yli, ja solusyklin analyysi suoritettiin. EGFP-ilmentäviä soluja käsiteltiin samalla tavalla (tietoja ei näytetty). Lisäksi, ei-transfektoituja ohjaus soluja käsiteltiin kanssa tai ilman staurosporiini (1 uM) yön yli. (B, C) Edustava data asetettu sekä SubG1 ja G0 /G1 vaiheet esitetään (3 koetta).

siis perustuu edellä havaintojen

N

terminaalista WW verkkotunnus WOX1 on todennäköisesti vastuussa C1q aiheuttama aktivointi WOX1 syöpäsolujen tappamiseksi. DU145 solut transfektoitiin

N

terminaalista WW verkkotunnus WOX1 (WOX1ww jossa EGFP tag) tai EGFP vain elektroporaatiolla ja viljeltiin 24 tunnin ajan. By nopeutus mikroskopia elävien solujen eksogeeninen C1q indusoi apoptoosia soluissa, jotka ilmentävät WW domeeneja (Fig. 4A). Cell kutistuminen ja ydin- tiivistyminen tapahtui noin 100-130 min altistettaessa solut C1q. Tämä on tyypillinen tapahtuma apoptoosin. Kun DU145-solut kotransfektoitiin WOX1ww ja dn-WOX1, C1q: n indusoiman apoptoosin vähentynyt (Fig. 4B). Tyr33 fosforylaatiota WOX1 on keskeisessä asemassa apoptoosin sekä

in vitro

ja

in vivo

[27] – [31]. Me muuttunut Tyr33 on Arg33 ensimmäisessä WW verkkotunnuksen [27], [35], ja todennut, että C1q eivät välittäneet apoptoosin soluissa ilmaistuna tämä mutantti proteiini (Fig. 4C). Vuonna vektorisäätö soluja, ei apoptoosia ei havaittu (kuvio. 4D). C1q-välitteistä solukuolemaa ei havaittu näissä kontrollisoluissa jälkeen enää inkuboitu yli 8-24 h, joka on samanlainen kuin edellä mainittu havainnot (Fig. 2).

(A) Elävät DU145 cells- ilmaisemiseen

N

terminaalista WW domain (WOX1ww; EGFP tag) käsiteltiin C1q (1 ug /ml), jota seurasi tallennus morfologisia muutoksia automaattisella nopeutus mikroskopia (yksi runko per 10 min). Cell kutistuminen ja ydin- tiivistyminen tapahtui noin 100-130 min altistettaessa solut C1q. (B) Kun soluja kotransfektoitiin WOX1ww ja dn-WOX1, C1q: n indusoiman apoptoosin merkittävästi vähentynyt. (C) muuttaminen Tyr33 ja Arg33 on WOX1 ei aiheuta C1q-välitteistä solukuolemaa. (D) N: o apoptoosia soluissa havaittiin EGFP: tä ilmentämään vain altistettaessa C1q. Verrattuna edellä kokeissa C1q pitoisuus nostettiin varten viiveen mikroskopia kokeita. Edustava tietojoukko näytetään 5 kokeiluja. Noin 100 solua tutkittiin lopussa Aikaintervallitallennuksen mikroskoopilla. Yhdistäminen sen kuva ilmentävään soluun vihreän fluoresenssin ja kirkkaan kentän kuva näkyy (ennen altistusta kanssa C1q).

C1q /WOX1 indusoiman apoptoosin vahvistettiin edelleen internukleosomaalisen DNA fragmentaatioanalyysillä käyttäen agaroosia geelielektroforeesilla. Tulokset osoittivat katkaistun DNA tikkaat kuten aiheuttama C1q in WOX1 ilmentäviä DU145 ja SH-SY5Y-soluissa (kuvio. 5 ja täydentävä Fig. S4). Sopivissa ohjaus soluja, jotka ilmentävät EGFP tai ei mitään, C1q ei aiheuttanut DNA pirstoutuminen (Fig. 5 ja täydentävä Fig. S4).

(A) DU145 soluja elektroporoitiin cDNA ekspressiokonstruktien of WOX1, DN-WOX1 ( DN) ja /tai p53: a. 24 tuntia myöhemmin solut altistettiin C1q 8 tunnin ajan. Sopivissa valvonta, solut tehtiin elektroporaatio väliaineen (Sham) tai ilman elektroporaatiota (Cont). Ei DNA: n fragmentoituminen osoitettiin nämä tarkastukset. C1q lisäsi DNA pirstoutuminen soluissa, jotka ilmentävät WOX1, mutta ei p53. C1q tukahdutti p53 /WOX1-kohonnut DNA pirstoutuminen. dn-WOX1 esti solukuoleman aiheuttama p53. (B) Intensiteetti DNA pirstoutumista kvantifioitiin Photoshop, ja tulosten keskiarvot esitetään pylväskaavio olivat kahdesta kokeesta. ”Sham” kontrolli (ilman C1 q hoito) pidetään 0%.

C1q ei lisää p53-välitteisen apoptoosin

Olemme osoittaneet, että kasvainten p53 fyysisesti vuorovaikutuksessa WOX1 ja molemmat proteiinit voivat aiheuttaa apoptoosin synergistisen tavalla [26], [27], [30]. Tärkeää on, WOX1 stabiloi p53 ja estää sen hajoamisen [30]. Me määritelty rooli p53 ja WOX1 in C1q-säänneltyjä solukuolemaa. Kun DU145 solut lyhytaikaisesti yli-ilmennetään kanssa p53, C1q ei merkittävästi lisännyt laajuutta DNA pirstoutuminen (kuviot. 5A ja 5B). Yhdistelmänä sekä p53 ja WOX1 kasvatti DNA pirstoutuminen. Kiehtovan, C1q tukahdutti DNA pirstoutuminen p53 /WOX1 ilmentäviä soluja. Suostumuksella aiempien havaintojen [27], DN-WOX1 osoitettiin estävän p53-välitteinen DNA: n fragmentoituminen (kuviot. 5A ja 5B).

Ectopic WOX1 indusoi muodostumista aihekokonaisuuksien mikrovillus välillä DU145 soluissa ja C1q Parantaa klusterin muodostumista

Tutkimme solun morfologisten muutosten aiheuttamia kohdunulkoinen ilmaisutapoja EGFP tai EGFP-WOX1 in DU145-soluja plus vaikutusta C1q. Time-lapse mikroskoopilla osoitti, että C1q aiheuttama kutistuminen ja kalvo kupliminen on WOX1 ilmentävien DU145 ja BCC-solujen hoidon aikana 2-4 h tai pidempään (kuviot. 2C ja 4A). Kun DU145 solut yli-ilmennetään EGFP ja viljeltiin yön yli, nämä lepäävät solut tarttunut ehdottomasti kannessa lasipinnan, määritettynä yhteensä sisäisen heijastuksen fluoresenssi (TIRF) mikroskopialla (Fig. 6A). TIRF kuvantaminen mittaa proteiinin dynaaminen tapahtumia solukalvon ja solun tukirangan alueilla [36], [37]. Mielenkiintoista on, että lyhytaikaisesti yli-ilmentynyt EGFP-WOX1 indusoi pistemäinen muodostumista solun pinnalla, ja nämä punctates, joka sisältää EGFP-WOX1, olivat enimmäkseen ryhmitelty solujen välillä (Fig. 6B, katso nuolenpäät). Suurennettuna, nämä punctates olivat todellakin mikrovillusten joita tarvitaan fokaalisen adheesion (Fig. 6C). Erityisesti, monet näistä WOX1 ilmentävien solujen tarttunut kiinni kannen lasin pintaan pääasiassa perisellulaarinen mikrovillusten niiden ventraalinen alueet irrotettiin pinnasta. Hoidon aikana 1 h, C1q huomattavasti muodostumista aihekokonaisuuksien mikrovillus välissä soluissa (kuvio. 6B; katso nuoli). Tämä toiminta näyttää horjuttaa soluadheesion varten tapahtuva kutistuminen, kalvo kupliminen ja lopulta kuolemaan. Suostumuksella meidän viime raportissa [38], WOX1 voi liittyä solun pinnan hyaluronidaasia HYAL-2.

(A) Kun DU145 transfektoitiin EGFP ja viljeltiin yön yli, nämä solut tarttunut ehdottomasti kannessa lasi pinta, määritettynä TIRF mikroskoopilla mittaamiseksi vihreän fluoresenssin solukalvon ja solun tukirangan alueilla (600-kertainen suurennus). Epi: epifluoresenssilla. (B) Sen sijaan, lyhytaikaisesti yli-ilmentynyt EGFP-WOX1 aiheuttama muodostumista punctates, kuten ilmestyi klustereita, solun pinnalla (katso nuolenpäitä; 600-kertainen suurennus). C1q lisäsi merkittävästi pistekeratopatiaa muodostumista, erityisesti solujen välillä (katso nuoli). Kohonneita numerot punctuates ovat noin 3-6-kertaisesti. (C) Hankeryhmien punctates, joissa on paljon EGFP-WOX1 ilme, ovat todellakin mikronukkalisäkkeiden solun pinnalla (600-kertainen suurennus mikroskoopilla ja 3x digitaalinen suurennus).

C1 q on ilmaistu arkistointia eturauhasen kudosnäytteitä ja merkittävästi vaimentua vuonna liikakasvun ja syöpä- eturauhaskudoksiin

edellä havainnot viittaavat siihen, että serum- tai kudos johdettuja täydennys C1q voivat aiheuttaa WOX1 aktivointi

in vivo

, mikä rajoittaa syöpä etenemistä. Vaikka muutokset ihmisen

WWOX

geeni esiintyy yleisimmin eturauhasessa ja rintojen [20], [21], [34], tutkimme ilmaus C1q vuonna arkistointia eturauhasen kudoksissa jälkipuinti potilaista. Immunofluoresenssimikroskopialla totesimme, että verrattuna samanikäisiin eturauhaskudoksiin, C1 q on merkittävästi vaimentua hyvänlaatuisen eturauhasen liikakasvun (BPH) ja eturauhassyövän (kuviot. 7A ja 7B, 100-kertainen suurennus). Suurennettuna, C1q osoitettiin ilmaista pohjapinta ja epiteelisolujen arkistointia eturauhasen kudosnäytteitä, ja C1q on colocalized p-WOX1 näissä soluissa (kuvio. 7C).

(A) Prostate kudokset, kuten normaalissa eturauhasessa, BPH ja eturauhasen syöpä, värjättiin spesifistä vasta-ainetta vastaan ​​C1q ja sitten johdetun loisteputki vasta-aineella. Tumat värjättiin DAPI (100-kertainen suurennus). (B) C1 q on merkittävästi vaimentua BPH ja eturauhasen syöpä, verrattuna samanikäisiin eturauhaskudoksiin (

p

0,0001, n = 5; Opiskelijan

t

testi). Kun ei-immuuni seerumi käytettiin lähteenä primäärinen vasta-aine, mitään signaalia ei havaittu (tuloksia ei ole esitetty). (C) C1 q on ilmaistu pohjapinta ja epiteelisolujen arkistointia normaalin eturauhasen rauhaset (400-kertainen suurennus). Sekä C1q ja p-WOX1 ovat colocalized näissä soluissa. Tumat värjättiin DAPI. Samanlaisia ​​tuloksia havaittiin kanssa arkistointia rauhanen solut BPH. Verrattuna normaaliin eturauhasen kudosten, valotusaikaa ottamiseen kuvia BPH nostettiin. Mittakaava, 100 pm.

Serum täydentävät C1q ja C6 ovat edellytys pohjapinta fosforylaatioon ERK ja WOX1 vuonna DU145 soluissa

tutkinut, downregulation C1q

in vivo

voi vähentää aktivoinnin tuumorisuppressoreilla

in vitro

, jolloin saadaan parempi eloonjäämisen eturauhasen syöpäsoluja. DU145-soluja viljeltiin yön yli seerumittomissa olosuhteissa, kun läsnä on 1% normaalia ihmisen seerumia, tai 1% ihmisen seerumia, joissa ehtyminen C1q, C6, C7, C8, tai C9. Western blottauksella, huomasimme, että molemmat ΔC1q ja ΔC6 seerumit voinut tukea ilmentämällä WOX2 (isoformia WOX1) ja p-ERK in DU145 soluissa (kuviot. 8A ja 8B), mikä viittaa siihen, että seerumin C1q ja C6 komponentit ovat välttämättömiä ilmentämiseen näiden proteiinien. Vertailun vuoksi komponentti C7, C8 ja C9 eivät tukeneet ilmaus WOX2 ja p-ERK (kuviot. 8A ja 8B). Expression of ERK, WOX1, MEK1 ja p53 ei ollut vaikuttanut merkittävästi edellä mainitun viljelyolosuhteissa (kuviot. 8A ja 8B, tietoja ei ole esitetty MEK1).

(A, B) DU145-soluja viljeltiin yön yli seerumivapaassa (SF) olosuhteissa, tai 1% tavallista ihmisen seerumia (NHS) tai NHS köyhtynyt C1q (ΔC1q), C6 (ΔC6), C7 (ΔC7), C8 (ΔC8), tai C9 (ΔC9). Merkittävä väheneminen isoformin WOX2 ilmentymistä havaittiin DU145 soluihin viljellään ΔC1q tai ΔC6 seerumin (versus SF valvonta;

p

0,001; Opiskelijan

t

testi), kun taas ΔC7, ΔC8, tai ΔC9 seerumissa oli vähemmän tehokas. Aktivointi tai fosforylaatio ERK (p-ERK) oli riippuvainen läsnäolo C1q tai C6 seerumin (versus SF valvonta;

p

0,001; Opiskelijan

t

testi). Edustava joukko tietoja 3 kokeesta. Pylväiden osoittavat keskimäärin 3 kokeita. (C) Edellä soluja kasvatettiin myös kannessa lasi identtisissä seerumin olosuhteissa. Immunofluoresenssimikroskopialla, seerumi ilman C1q tai C6 voinut tukea ilmentämällä WOX2 (

p

0,0001, kun vs. SF tai NHS; Opiskelijan

t

testi). Noin 200 solua määrällisesti erikseen alla fluoresenssimikroskopiaa, ja laajuus fluoresenssi vähennettiin (tai normalisoitu) peräisin negatiiviset kontrollit (solut värjättiin sekundaarinen vasta-ainetta ainoastaan). Tumat värjättiin DAPI. (D, E) Sama soluja, kuten on esitetty (A), värjättiin p-WOX1-vasta-aineen ja missä määrin proteiinin ilmentyminen kvantifioitiin. (F) jälleen, samat kokeet toteutettiin Western-blottauksella. Alle C1q-vapaa olosuhteissa (ΔC1q seerumi), pohjapinta aktivointi WOX1 oli merkittävästi vähentynyt (-50% vähennys;

p

0,001 päässä verrattuna SF ja NHS; Opiskelijan

t

testi; n = 3).

vahvista edellä mainittujen havaintojen immunofluoresenssimikroskoopilla toteutettiin. Soluja yllä kokeen kasvatettiin suojalasi identtisissä seerumin olosuhteissa, kiinnitettiin sitten, ja värjättiin erityisiä fluoresenssi vasta-aineita. Jälleen olemme päättäneet, että ilman seerumia C1q ja C6, WOX2 ilmentyminen oli merkittävästi vaimentua vuonna DU145 soluissa (Kuva. 8C). Lisäksi, kun DU145-soluja viljeltiin seerumia ilman C1q tai C6, tasot p-WOX1 olivat merkittävästi vähentyneet DU145-soluissa, verrattuna muihin viljelyolosuhteet, kuten määritetään immunofluoresenssimikroskopialla (kuviot. 8D ja 8E). Nämä havainnot varmistettiin vielä Western-blottauksella, joka paljasti downregulation p-WOX1 alle C1q-vapaa olosuhteissa (Fig. 8F). Näissä olosuhteissa, p-WOX1 oli läsnä pääasiassa sytoplasmassa DU145-soluja. Ei apoptoosia ei havaittu näissä soluissa aikana 24 tunnin viljelmässä, määritettynä morfologiaa ytimien värjättiin DAPI.

täydennyksessä C9 ehtyminen edistää p53 tumakertymään, ja hyaluronaaniin stimuloi tumasta

WOX1 fyysisesti vuorovaikutuksessa p53 sekä

in vitro

ja

in vivo

, ja saattavat aiheuttaa apoptoosin synergistisesti [21], [26], [27], [30]. Vaikka eksogeenisen C1q voinut nostaa p53-välitteisen apoptoosin (Fig. 5), tutkimme vaikutus seerumin komplementin C1q ja C6 tehostamisessa pohjapinta tasoilla p53 tumakertymään tai aktivoitumista. Kun DU145-soluja kasvatettiin 1% normaalia seerumia tai seerumissa ilman C1q tai C6, kertyminen p53 ytimet väheni verrattuna seerumittomissa olosuhteissa (Fig. 9A ja 9C). Merkillistä, ilman seerumia C9, p53 kertynyt ytimet (Fig. 9B ja 9C), mikä viittaa siihen, että seerumin komplementti C9 on voitava rajoittaa p53 aktivaation. Alle C9-puutostiloja, eksogeeninen korkean molekyylipainon HA aiheuttama tumasta p53 sytoplasmaan (Fig. 9B ja 9C). Sen sijaan, HA palauttaa p53 tumakertymään alle C6-vapaa olosuhteissa (Fig. 9A ja 9C).

DU145 soluja viljeltiin yön yli kussakin merkitty seerumista ehtyminen tietyn komplementtiproteiini. p53 lokalisointi soluissa määritettiin immunofluoresenssimikroskoopilla. (A) Koska komplementin C6 (ΔC6 seerumi), p53 pääosin läsnä solulimassa. Korkean molekyylipainon koko HA (50 ug /ml) indusoi tumakertymään p53-hoidon aikana 1 tunnin ajan. (B) Koska seerumin C9 (ΔC9 seerumi), p53 oli enimmäkseen sijaita missä ytimet, ja HA: n (50 ug /ml) indusoi tumasta 1 tunnissa. (C) määrittämiseksi tumalokalisaatio p53, noin 200 solua laskettiin. Näkyy pylväskaaviona on keskimäärin tulosten muodostavat kaksi kokeiluja. (D) In ​​negatiivisia kontrolleja, solut värjättiin Texas Red-konjugoidulla sekundaarisella vasta-aineella vain. SF seerumin vapaan; NHS, normaalin ihmisen seerumia.

Serum komplementin C1q: n ja C6 ehtyminen indusoi konstitutiivisen JNK1 aktivaation

Olemme osoittaneet, että JNK1 fyysisesti vuorovaikutuksessa WOX1, ja että sitoutuminen on lisääntynyt stimuloitaessa soluja UV-valolla tai anisomysiini (aktivaattori JNK1)

in vitro

[27]. Mielenkiintoista on, että dopaminerginen neurotoksiini 1-metyyli-4-fenyyli-pyridinium (MPP

+) vähentää sitoutumista WOX1 kanssa JNK1 rotalla aivojen [31]. JNK1 lohkot apoptoottisen funktion WOX1

in vitro

[27], kun taas toiminnallinen antagonismi

in vivo

ei tunneta. JNK1 ja isoformit osallistuvat stressin ja apoptoottisen vastauksia, solujen lisääntymistä, ja monenlaisia ​​sairauksia [39]. Vaikka edellä esitetyt tulokset osoittivat, että täydennys C1q ja C6 tukenut aktivoituminen WOX1 (Fig. 8), nämä proteiinit ennustetaan estää JNK1 aktivointia, ja ehtyminen C1q ja C6 seerumeista aiheuttaa JNK1 aktivointia. Samanlaisissa koeolosuhteissa, kun DU145-soluja kasvatettiin ΔC1q tai ΔC6 seerumia, konstitutiivinen JNK1 aktivointi on tapahtunut, määritettynä sekä Western-blottauksella (kuvio. 10A) ja immunofluoresenssimikroskopialla (Fig. 10B).

(A) DU145-soluja viljeltiin seerumittomassa (SF) olosuhteissa, tai 1% NHS, ΔC1q tai ΔC6 seerumi 16-24 tuntia. Koska C1 q ja C6, spontaani JNK1 aktivointi tapahtui (versus SF valvonta;

p

0,001; Opiskelijan

t

testi), määritettynä Western-blottauksella. Edustava joukko dataa näytetään 3 kokeita. (B) Samanlaisia ​​tuloksia havaittiin immunofluoresenssimikroskopialla, mikä osoittaa merkittävää JNK1 aktivointia tai tumakertymään alla seerumin C1q- ja C6-vapaa olosuhteissa (vs. SF;

p

0,001; Opiskelijan

t

testi, n = 3). ΔC9 seerumia ei ollut vaikutusta. Noin 200 solua laskettiin kustakin kokeessa. (C, D) ei ollut STST3 aktivaation DU145 soluissa kaikissa ilmoitettu seerumin olosuhteissa. Under C1q-vapaissa olosuhteissa, HA: n (50 ug /ml) tehokkaasti indusoi STAT3 fosforylaatiota soluissa hoidon aikana 1 tunnin ajan. Noin 200 solua laskettiin kustakin kokeessa (n = 3).

Koska C1 q, HA indusoi STST3 fosforylaation DU145 soluissa

STAT3 aktivointi on kriittinen rooli eturauhasen syöpäsoluinvaasiota [23] – [25]. HA osallistuu myös syövän invaasio, mikä viittaa siihen, että HA aktivoi STST3 edistämiseen syövän etäpesäkkeiden. Samoin DU145 soluja viljeltiin yön yli erilaisissa seerumitonta tai -present olosuhteissa. Nämä solut altistettiin sitten HA: ssa 1 tunnin ajan. Aktivoitumatta STAT3 havaittiin käyttäen normaaleja tai täydentävät-köyhdytettyä seerumit (Fig. 10C ja 10D). Erityisesti, ilman C1q, HA indusoi STAT3 aktivaation DU145-soluissa (kuvio. 10C ja 10D), mikä tarkoittaa, että HA voi lisätä etäpesäke C1q-vajaiden syöpäsolujen säätelemällä STAT3 fosforylaation ja estävä aktivaatio p53 ja WOX1. Kaikki edellä mainitut kokeet tehtiin käyttämällä lääketieteellisestä HA Lifecore. Samanlaisia ​​tuloksia havaittiin käyttämällä lääketieteellistä laatua Healon (tuloksia ei ole esitetty). Nämä HA valmisteet ovat vapaita proteiinikontaminaatiota.

Keskustelu

Ihmisen seerumi komplementtikaskadin on perinteisesti pidetty voimakas humoraalinen immuunijärjestelmää, joka suojaa hyökkääviä mikro-organismeja. Kuitenkin, toiminnallisia ominaisuuksia kunkin yksittäisen komplementtikomponentin ovat suurelta osin tuntemattomia. Tässä tutkimuksessa olemme osoittaneet ensimmäistä kertaa, että C1 q on ilmaistu eturauhasen. Merkillistä, C1q ilmentyminen vähenee merkittävästi eturauhasen hyvänlaatuisen liikakasvun ja eturauhassyövän.