Krooninen sairaus

tiivistelmä

fibroblastikasvutekijä reseptorit (FGFR: ää) aktivoidaan mutaatio ja yli-ilmentynyt virtsarakon syöpää (tasapainotusliivit), ja FGFR inhibiittorit arvioidaan parhaillaan kliinisissä tutkimuksissa BC potilailla. Kuitenkin BC solut näyttää selvästi heterogeenisyys saatujen vastausten FGFR estäjiä, ja biologisten mekanismien taustalla heterogeenisyys ei ole määritelty. Tässä käytettiin uutta estäjä FGFR: ää 1-3 ja RNAi määrittää vaikutukset estämällä FGFR1 tai FGFR3 paneelissa ihmisen BC solulinjoissa. Havaitsimme, että FGFR1 ilmentyi BC soluissa, jotka ilmaisivat myös ”mesenkymaaliset” markkereita ZEB1 ja vimentiinista, kun taas FGFR3 ilmentyminen rajoittui E-cadherin- ja p63-positiivisia ”epiteelin” alaryhmä. Herkkyys kasvua estäviä vaikutuksia BGJ-398 on myös rajoitettu ”epiteelin” BC-solut, ja se korreloi suoraan FGFR3 mRNA-tasot, mutta ei läsnä aktivoivia FGFR3 mutaatioita. Sen sijaan, BGJ-398 ei inhiboivat voimakkaasti proliferaatiota, mutta ei estää miehityksen ”mesenkymaaliset” BC-soluja in vitro. Samoin, BGJ-398 ei inhiboinut ensisijaisen kasvaimen kasvua, mutta estää tuotannon verenkierrossa olevia kasvainsoluja (CTC) ja muodostumista imusolmuke ja etäispesäkkeitä hiirissä, jotka kantoivat ortotooppisesti istutetaan ”mesenkymaaliset” UM-UC3 soluja. Yhdessä tuloksemme osoittavat, että FGFR1 ja FGFR3 on pitkälti ei-päällekkäisiä rooleja säätelyssä invaasio /etäpesäke ja lisääntymistä erillisiin ”mesenkymaalisten” ja ”epiteelin” subsets ihmisen BC soluja. Tulokset viittaavat siihen, että kasvain EMT fenotyyppi on tärkeä tekijä biologisista vaikutuksista FGFR estäjien potilailla.

Citation: Cheng T, Roth B, Choi W, musta PC, Dinney C, McConkey DJ (2013 ) fibroblastikasvutekijää reseptorit-1 ja -3 Play erilliset tehtävät asetukseen Virtsarakon syövän kasvua ja Metastasis: vaikutukset terapeuttinen kohdistus. PLoS ONE 8 (2): e57284. doi: 10,1371 /journal.pone.0057284

Editor: Chih-Xin Tang, Kiina Medical University, Taiwan

vastaanotettu: 25 lokakuu 2012; Hyväksytty: 21. 2013 Julkaistu: 26 helmikuu 2013

Copyright: © 2013 Cheng et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus rahoittivat MD Anderson Virtsarakon SPORE (P50 CA91846), The Baker Foundation, ja MD Anderson CCSG (P30 016672). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet ole kilpailevia intressejä.

Johdanto

Virtsarakon syöpä (BC) on viidenneksi yleisin syöpä länsimaissa. Virtsarakon syövät voidaan jakaa kahteen suureen alaryhmään, jotka omistavat erillisiä patologinen, kliininen ja molekyylitason ominaisuudet [1], [2]. Useimmat tasapainotusliivit (70% -80%) on huono laatu, ei-lihas- invasiivisia papillaarinen ( ”pinnallinen”) kasvaimet (NMIBCs) että harvoin edetä, joten potilaita, joilla tämä syöpä on erittäin hyvä ennuste. Toisaalta, potilaalla on lihas-invasiivisia virtsarakon syöpien (MIBCs) on huomattavasti huonompi ennuste ( 50% 5 vuoden pysyvyys) [1], [2]. MIBCs usein edetä tulla metastaattisen, ja potilailla, joilla on metastaattinen sairaus on synkkä 5 vuoden pysyvyys on alle 5%. Näin ollen tunnistetaan molekyyli mekanismeja BC invaasiota ja etäpesäkkeiden ja tunnistaa hoitostrategioita jotka kohdistuvat nämä prosessit ovat hyvin tärkeitä prioriteetteja jatkuvan tutkimuksen.

fibroblastikasvutekijä reseptorit (FGFR: ää) ovat erittäin houkuttelevia Ehdokaskohteiden molemmissa osajoukkoja tasapainotusliivit [3]. Vähintään kaksi kolmasosaa NMIBCs sisältävät aktivoivat FGFR3 mutaatioita, jotka johtavat ligandista riippumattomaan reseptorin dimerisaatiota ja perustava alavirtaan signaalitransduktion [4], [5], [6], [7], ja in vitro-tutkimukset ovat osoittaneet, että FGFR inhibiittorit estävät leviämisen normaaleissa urothelial soluihin, jotka yli-ilmentävät näitä reseptoreita [8], [9]. Vaikka taajuus aktivoivat FGFR3 mutaatioiden MIBCs on paljon pienempi (alle 25%), ja monet niistä ilmentävät korkeita FGFR3 ja muiden FGFR: ää [3], [10], [11]. Edistämisen lisäksi leviämisen, FGFR: ää ovat sekaantuneet säätelyyn epiteelin-to-mesenkymaalitransitioon (EMT), invaasio, ja ankkurista riippumaton kasvu BC soluissa [11].

BGJ-398 on valikoiva estäjä FGFR: ää 1, 2 ja 3, jotka syntetisoitiin käyttäen uutta kemiallista lähestymistapaa [12]. Se esittelee IC

50: n noin 5 nM villityypin FGFR: ää ja yleisin mutantti muoto FGFR3 joka ilmaistaan ​​tasapainotusliivit (S249C) [12]. Muodostumien ominaispiirteiden yhdisteen kasvua estäviä vaikutuksia paneelissa 8 ihmisen BC solulinjoissa paljasti selvästi heterogeenisyys vastauksissa, jossa se näkyy IC

50: n 5-30 nM puolessa solulinjojen ja IC

50: n yli 1 uM puolet [12]. Havaittu heterogeenisyys on yhdenmukainen saatujen tulosten selvä kemiallisen inhibiittorin [13], mutta molekyylitason perustan tämän heterogeenisyyden jää epäselväksi. Siksi nyt vireillä olevan tutkimuksen saada parempi käsitys vaikutuksista FGFR eston BC soluissa, joiden tavoitteena on tunnistaa biologisten mekanismien ja biomarkkereita, joita voitaisiin käyttää prospektiivisesti tunnistamaan FGFR kasvaimet. Tuloksemme osoittavat selvästi, EMT liittyvät roolit FGFR3 ja FGFR1 ajo leviämisen ja invaasion jotka vaikuttavat merkittävästi kehittämiselle FGFR estäjä-pohjainen hoitoihin.

Materiaalit ja menetelmät

Kemikaalit ja reagenssit

BGJ-398 oli avokätisesti Novartis. In vitro -tutkimuksissa, BGJ-398 liuotettiin uudelleen DMSO: hon varastossa pitoisuus 10 mmol /l, ja säilytettiin -20 ° C: ssa. BGJ-398 varastossa laimennettiin väliaineessa juuri ennen käyttöä siten, että DMSO: n konsentraatio ei koskaan ylittänyt 0,1%. In vivo tutkimuksissa BGJ-398 liuotettiin 10% Tween-80.

tuumorisolulinioissa ja viljelyolosuhteet

Solulinjat saatiin University of Texas MD Anderson Cancer Center Virtsarakon SPORE Tissue Bank, ja niiden identiteetit vahvistettiin DNA-sormenjälkien avulla AmpFlSTR® Identifiler® Amplification (Applied Biosystems) tai AmpFlSTR® Profiler® PCR Amplification (Applied Biosystems) protokollia. Kaikkia solulinjoja ylläpidettiin yksikerrosviljelminä modifioidussa Eaglen MEM, jota oli täydennetty 10% naudan sikiön seerumia, vitamiineja, natriumpyruvaattia, L-glutamiinia, penisilliiniä, streptomysiiniä, ja ei-välttämättömiä aminohappoja 37 ° C: ssa, 5% CO

2-inkubaattorissa .

Eläimet

Nainen atyymisissä nude-hiirten (NCR-nu) hankittiin National Cancer Institute. Hiiret majoitettiin erityisissä patogeenivapaissa olosuhteet Animal Core Facility The University of Texas M. D. Anderson Cancer Center. Laitos on saanut hyväksynnän American Association for Accreditation of Laboratory Animal Care ja yhteisymmärryksessä olevien määräysten ja standardien Yhdysvaltain Department of Health and Human Services, USA Department of Agriculture, ja NIH. Hiiret, joita käytetään näissä kokeissa olivat 6-8 viikkoa vanhoja.

FGFR3 Mutation Analyysit

DNA eristettiin BC solulinjoja käyttämällä genomista DNA: ta (Qiagen). PCR suoritettiin monistamiseen eksonit 7 ja 10 käyttäen AmpliTaq Gold DNA-polymeraasia (Applied Biosystems) ja alukkeita 5′-CGGCAGTGGCGGTGGTG- GTG-3 ’(sense) ja 5′-AGCACCGCCGTCTGGTT GGC-3′ (antisense) ja eksonia 7 (23 ) ja 5’-CCTCAACGCCCATGTCTTT-3 ’(sense) ja 5′-AGGCAGCTCAGAACCTGGTA-3’ (antisense) ja eksonin 10 (Sigma Genosys). Seuraavat pyöräily muuttujat käytettiin: 95 ° C: ssa 10 min, sitten 35 sykliä 95 ° C 30 s, 65 ° C (eksoni 7) tai 58 ° C (eksoni 10), 30 s, ja 72 ° C: ssa 30 s, minkä jälkeen suoritettiin lopullinen inkubointi 72 ° C: ssa 10 min (23). Yhtiöimätön alukkeita ja deoksinukleotidit poistettiin käyttäen katkaravun alkalista fosfataasia ja eksonukleaasi I (US Biochemical). Tuotteet analysoitiin Big Dye Terminator Cycle Sequencing (Applied Biosystems), ja data analysoitiin Sequencing Analysis 3.0 ohjelmisto (Applied Biosystems).

RNAi-välitteinen knockdovvn FGFR3, FGFR1 tai bFGF

UM-UC14 ja RT4 transfektoitiin pieniä häiritseviä RNA: ita (siRNA: t) kohdistaminen FGFR3 ja FGFR1 käyttämällä Oligofectamine (Invitrogen) mukaan valmistajan ohjeiden. Kohdennettu oligonukleotidit (sekvenssi) ja ei-kohdistuksen ohjaus ostettiin Ambion. Kokonais-RNA kerättiin 48 tuntia transfektion jälkeen ja analysoitiin RT-PCR: llä vahvistaa kohde pudotus. Samanaikaisesti, siRNA transfektoidut solut kerättiin 48 tuntia ja analysoitiin käyttäen soluproliferaation ja solusyklin alla kuvattuja määrityksiä. UM-UC3 ja UM-UC13 transdusoitiin lentivi- lyhyt hiusneula-RNA: iden (shRNAs) (Open Biosystems). Soluja jatkuvasti viljeltiin 5~7 päivää 10% sisältävällä MEM puromysiiniä. Kokonais-RNA kerättiin valinnan jälkeen ja analysoitiin RT-PCR: llä vahvistaa kohde pudotus. Vakaa Knockdown soluja ylläpidettiin puromysiinissä ja käytetyt MTT ja Boyden kammion hyökkäys alla kuvattuja määrityksiä.

Immunoblottausmääritys Analyysit

Solut kerättiin ~75%: sta 85% konfluenssiin ja hajotettiin. Proteiinikonsentraatiot mitattiin käyttäen Bradfordin menetelmällä (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA). Lysaatit keitettiin näytepuskurissa (62,5 mmol /L Tris-HCI (pH 6,8), 10% (paino /tilavuus) glyserolia, 100 mmol /l DTT: tä, 2,3% SDS: ää, 0,002% bromifenolisinistä) 5 minuutin ajan ja jäähdytettiin jäissä 5 minuuttia. Näytteet erotettiin 8% tai 12% SDS-PAGE-geeleissä 110 V elektroforeesin puskurissa (25 mmol /L Tris-HCI (pH 8,3), 192 mmol /l glysiiniä, 0,1% SDS) ja tämän jälkeen siirrettiin elektroforeettisesti päälle metanoli-kasteltuihin polyvinylideenidifluoridi (PVDF) siirtopuskurissa (25 mmol /L Tris-HCI, 192 mmol /l glysiiniä, 20% metanolia) 1 tunnin ajan 100 mV. Membraanit inkuboitiin estopuskurilla (TBS: 10 mmol /l Tris-HCI (pH 8,0), 150 mmol /l NaCI: a, 5% rasvatonta maitoa) 1 tunnin ajan huoneenlämpötilassa samalla ravistellen ja sitten huuhdeltiin kerran lyhyesti TBS-T: (TBS, joka sisälsi 0,1% Tween-20). Membraanit inkuboitiin primaarisilla vasta-aineilla laimennettiin 1:1000 estopuskurilla yön yli, pestiin ja inkuboitiin sitten toisen vasta-aineita (anti-hiiri- tai anti-kani-immunoglobuliinia, piparjuuriperoksidaasi yhdistynyt F (ab) 2-fragmentti hiiren) laimennettuna 1: 8000 blokkauspuskuriin 1 tunnin ajan huoneenlämpötilassa samalla ravistellen. Immunoreaktiivisia proteiineja havaittiin käyttämällä tehostettua kemiluminesenssin (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) mukaan valmistajan ohjeiden.

geeniekspressioprofilointi

geeniekspressioprofilointi suoritettiin paneelin 30 ihmisen BC solulinjoja käyttäen Illumina alustalla. Kunkin solulinjan mRNA syntyvät yhden log-kasvuvaiheessa. RNA puhtauden ja eheyden mitattiin käyttäen NanoDrop ND-1000 ja Agilent Bioanalyzer, ja vain laadukkaita RNA: ta käytettiin cRNA vahvistusta. Biotiini-leimattu cRNA valmistettiin käyttäen Illumina RNA-monistus kit (Ambion, Inc., Austin, TX), ja monistettu cRNA hybridisoitiin Illumina HT12 V4 pelimerkkejä (Illumina, Inc., San Diego, CA). Sen jälkeen, kun ne pestiin, objektilasit skannattiin Iscan (Illumina, Inc.). Signaalin voimakkuudet kvantitoitiin GenomeStudio (Illumina, Inc.), ja kvantiili normalisointi käytettiin normalisoinnista. BRB ArrayTools versio 4.2 kehittänyt National Cancer Institute [14] käytettiin analysointiin. Jos haluat tarkkailla ekspressiokuvioita erilaisesti ilmaisi geenien erityisiä geeniekspression arvoja, säädettiin keskimäärin nolla, käytettiin klusterointi kanssa Cluster ja TreeView [15].

MTT Analyysit

Cells ( 5 x 10

3) maljattiin 96-kuoppalevyille ja annettiin kiinnittyä 24 tunnin ajan, ennen kuin niitä inkuboitiin kanssa tai ilman kasvavia konsentraatioita BGJ-398: ssa 48 tuntia tai 5 päivää. MTT (3- (4,5-dimetyylitiatsol-2-yyli) -2,5-difenyylitetratsoliumbromidi) määritykset käytettiin mittaamaan solujen suhteellinen määrä, joka perustuu muuntaminen MTT formatsaaniksi elävissä soluissa. Viisikymmentä ui MTT liuotettiin PBS: ään (50 ug /ml) lisättiin kuhunkin kuoppaan ja levyjä inkuboitiin 3 tunnin ajan. Sitten väliaine poistettiin ja 100 ui DMSO: ta lisättiin kuhunkin kuoppaan solujen hajottamiseksi ja liuottamiseksi formatsaanikitei-. Standardi Mikro-levylukijaa käytettiin määrittämään absorbanssi (600 nm). Kukin kokeelliset tiedot piste edustaa keskiarvoja saadaan kuusi rinnakkaista ja kukin koe suoritettiin vähintään kahdesti.

Reaaliaikainen käänteiskopioijaentsyymi- PCR Analyysit

Solut kerättiin 75%: sta 85% konfluenssiin ja kokonais-RNA eristettiin käyttäen Mirvana ™ miRNA Isolation Kit (Ambion, Life Science, CA). FGFR: ää ja muita geenejä etujen analysoitiin Taqman-pohjainen reaaliaikainen PCR (ABI PRISM 7500; Applied Biosystems). Vertaileva CT menetelmää käytettiin määrittämään suhteellinen geenin ilmentymisen kunkin kohdegeenin; syklofiliinistä geeni käytettiin sisäinen kontrolli normalisoitu määrä monistettavissa RNA: ta. Taqman-alukkeita hankittiin valmistuksessa (Applied Biosystem, CA) seuraavasti: E-kadheriinin; Hs00170423_m1, TP63; Hs00978343_m1, ZEB1; Hs00232783_m1, vimentiinistä; Hs00185584_m1, FGFR1; Hs00915142_m1, FGFR2; Hs01552926_m1, FGFR3; Hs00179829_m1, FGFR4; Hs01106908_m1, bFGF; Hs00266645_m.

Cell Cycle Analyysit

Solut maljattiin 6-kuoppaisille levyille ja niitä ylläpidetään 10% FBS MEM: ssa 24 tuntia. Sitten solut altistettiin eri pitoisuuksia BGJ-398: ssa 48 tuntia tai kasvatettu vielä 24 tuntia (päästä ~75%: sta 85% konfluenssiin) analysoida vaikutuksia FGFR3 tai FGFR1 pudotus. Solut kerättiin trypsinisaatiolla ja pelletoitiin sentrifugoimalla. Sitten pelletit suspendoitiin uudelleen PBS: ään, joka sisälsi 50 ug /ml propidiumjodidia, 0,1% Triton X-100, ja 0,1% natriumsitraattia. Propidiumjodidia fluoresenssi mitattiin fluoresenssi-aktivoitujen solujen lajittelu (FL-3 kanava, Becton Dickinson, Mountain View, CA) käyttäen instrumentin kaarianalyysin ohjelmisto.

Boyden jaosto Invasion Analyysit

Invasion kammiot sisältävä Matrigel kuorrutettu polyetyleenitereftalaatti kalvoja 8 um huokosia hankittiin BD Science in 24-kuoppalevyformaatissa. Solut (2,5 x 10

5) vapautui kudosviljelypulloista käyttämällä EDTA (1 mmol /l), sentrifugoidaan, suspendoidaan seerumivapaassa ja sijoitetaan ylempään osastoissa hyökkäystä kammioista. Kolmekymmentä prosenttia naudan sikiön seerumia kasvualustaa sijoitettiin alemman osastoihin kuin kemoattraktantti ja hyökkäyksen määritykset suoritettiin 48 tuntia. Kukin solulinja maljattiin kolmena kappaleena. Tutkia soluinvaasion altistumisen jälkeen BGJ-398 solut, jotka eivät olleet tunkeutuneet poistettiin ja solut alemmalla pinnalla suodattimen värjättiin Diff-Quick-(American Scientific Products, McGaw Park, IL). Invasiivinen aktiivisuus mitattiin laskemalla solut, jotka olivat vaeltaneet alemmalle puolelle suodattimen. Arvioida hyökkäyksen jälkeen hiljentäminen FGFR1 tai bFGF, kalvot poistettiin inkuboinnin jälkeen 48 tuntia 37 ° C: ssa ja värjättiin propidiumjodidilla (Sigma-Aldrich) ilman solujen poistamiseksi ylemmän kalvojen pinnoille. Suodattimet asetettiin lasilevyille ja analysoitiin konfokaalimikroskopialla 100-kertaisella suurennuksella. Tasojen painopiste oli säädetty niin, että solut, jotka eivät olleet tunkeutuneet voidaan erottaa hyökkäsi solut ja laskettiin 8 riippumattoman aloilla. Invasiivinen aktiivisuus mitattiin laskemalla suhde tunkeutuneet sen noninvaded soluihin.

Archorage Independent Growth Pitoisuus

UM-UC3 ja UM-UC13 villityypin tai bFGF /FGFR1 vaiennetaan solut maljattiin 1 x 10

4 solua per kuoppa 6-kuoppalevyillä oli täydennetty 10% FBS: ää sisältävällä MEM: 0,6% agaria. Solujen annettiin kasvaa 2 viikkoa. Kuvat otettiin käyttäen Olympus IX käännetyn faasikontrastimikroskooppia. Kokonaismäärät pesäkettä satunnainen view (100 x) ja keskimääräinen halkaisija pesäkettä satunnainen view (100 x) määritettiin käyttäen SliderBook kuva-analysaattoria.

Orthotopic vierassiirrekokeissa

Ihmisen BC solulinja UM-UC-3 oli transdusoitu lentivirusvektoria lusiferaasia koodaava (luc) ja punainen fluoresoiva proteiini (RFP; mCherry) kuten aiemmin on kuvattu [16]. Sen jälkeen kun vakaa transduktio kanssa luc-RFP toimittaja, solut lajiteltu Fluoresenssi solulajittelu- (FACS) käyttäen imu- High-Speed ​​lajittelija (BD Biosciences). Lusiferaasiaktiivisuus kvantifioitiin in vitro käyttäen D-lusiferiinin (150 ug /ml), ja IVIS bioluminesenssi järjestelmän (Xenogen Co.). Aiheuttavan kasvaimia nude-hiirissä, subkonfluenteista viljelmät merkitty UM-UC3 poistettiin trypsiinillä, sekoitettiin 10% FBS: ää MEM, sentrifugoitiin 1200 rpm: ssä 5 min, pestiin PBS: llä ja suspendoitiin uudelleen HBSS: ään. Sitten solut injektoitiin ortotooppisesti virtsarakon seinämän pitoisuutena 5 x 10

5/50 ui käyttäen alempaa laparotomy. Hiirillä, joilla on etäpesäkkeitä lopetettiin 5-8 viikkoa sen jälkeen, kun kasvainsolujen injektion, imusolmuke ja etäispesäkkeitä leikattiin irti, leikattiin pieniksi paloiksi käyttäen skalpelleilla, altistettiin 1% trypsiiniä 20 minuuttia, sentrifugoitiin (1200 rpm, 5 min), ja viljeltiin 10% täydennetty MEM. Jälkeen FACS lajittelu, kierrätetystä soluja subconfluently viljeltiin ja injektoidaan uudestaan ​​pitoisuudessa 2 x 10

5/50 ui HBSS kuten edellä on kuvattu. Siten kasvainsolujen kierrätys suoritettiin kolme kertaa, jotta voidaan valita erittäin metastaattinen UM-UC3 subpopulaatio joka kehittyy etäpesäkkeitä ~75% hiiristä. Meidän hoito kokeilussa pistetään 4

th sykli kierrätettyä UM-UC3 pitoisuutena 2 x 10

5/50 ui. Hiiret, joilla havaittavissa kasvaimen kasvua aikaan ensimmäisen kuvantaminen (5 päivää injektion jälkeen) jaettiin satunnaisesti kahteen ryhmään (n = 7 /ryhmä).

In vivo Bioluminescence Imaging

Bioluminescence kuvantaminen oli viettää joka IVIS 100 kuvantamisjärjestelmä kanssa Living Image ohjelmisto (Xenogen) kuten kuvattu muualla [16]. Lyhyesti, eläimet nukutettiin ennen kuvantamisen 2,5% isofluraania /ilmaseoksen ja injektoidaan s.c. 15 mg /ml lusiferiini kaliumsuolaa PBS annoksella 150 mg /kg kehon paino. Digitaalinen harmaasävyinfor- eläin kuva otettiin ja pseudocolored kuva päällystettiin edustavat tasaisempaa jakautumista havaittu fotonien nousemassa aktiivinen lusiferaasin. Signaalin voimakkuus kvantitoitiin summana kaikkien havaittujen fotonien alueella kiinnostavaan sekunnissa, erikseen laskenta kukin primaarikasvaimen ja kukin metastaattisen päällä.

kokoelma primaarikasvainten ja verenkierrossa olevia kasvainsoluja (CTC) B

Neljäkymmentä päivää injektion jälkeen, kun eläinten kontrolliryhmässä tuli kuolemaisillaan, hiiret nukutettiin isofluraanilla kuten edellä on kuvattu. Mitata määrä CTC maksimaalinen määrä verta (600-1200 ui) kerättiin sydänpunktiolla käyttäen 1 ml: n ruisku, 22 gaugen neula, ja hepariini-päällystetty keräysputkien kuten aiemmin on kuvattu [17]. Sitten hiiret lopetettiin hiilimonoksidilla. Kasvaimet leikattiin, ja näytteet joko formaliinilla ja upotettiin parafiiniin, upotettiin OCT (Miles, Inc.), tai jäädytetty nopeasti nestemäisessä typessä ja säilytettiin -80 ° C: ssa RNA: n ja proteiinin uuttamalla. Edelleen veren käsittelyä, punasolut lyysattiin kahdesti 5 minuutin ajan 1 ml: lla ACK-hajotuspuskuria (Invitrogen), ja sentrifugoitiin 5 minuutin ajan 1200 rpm: ssä Eppendorf-putkissa. Pelletti lopulta hajotettiin ja käsitellään edelleen koko RNA: n eristämistä käyttämällä Mirvana ™ miRNA Isolation Kit (Ambion, Life Science). Real-time PCR-analyysi, PCR-tekniikalla (Vaihe yksi; Applied Biosystems) käytettiin yhdessä TaqMan® Gene Expression Analyysit (Applied Biosystems). Absoluuttinen kvantitointi käytetään muodostamaan syklin kynnys (CT) arvot ihmisen tiettyjä HLA-C-aluketta (Hs00740298_g1) kullekin näytteelle. RT-PCR-analyysi verinäytteet (kolmena kappaleena) ajettiin yhdessä standardin isolaattien (0, 2, 20, 200, 2000, ja 20000 UM-UC3 solua 100 ul hiiren verta). CT-arvot standardien käytettiin luomaan standardikäyrä UM-UC3 CTC, ja määrä CTC kutakin verinäytettä laskettiin vastaavasti.

Tulokset

suhde E-kadheriinin ja PAF /FGFR Expression UC Solut

Analysoimme ilmaus 4 FGFR: ää ja hallitseva syöpään liittyvän ligandia (FGF-2 /perus FGF) mRNA-tasolla paneeliin 30 UC solulinjoissa koko genomin ilmaisun profilointi (Illumina platform). Expression of FGFR3 korreloi suoraan ilmentymistä p63 [18], [19] ja E-kadheriinin [20] (Fig. 1A), mikä osoittaa, että FGFR3 ilmaistaan ​​”epiteelin” osajoukko BC soluja. Toisaalta, ilmaus FGFR1 korreloivat enemmän suoraan ”mesenkymaalisten” markkeri vimentiinista (Fig. 1A). Käytimme kvantitatiivisen tosiaikaisen käänteistranskriptaasi-PCR (RT-PCR) määrittämiseksi täsmällisemmin kuviot ilmaus ”epiteelin” ja ”mesenkymaaliset” markkereita koko paneelin solulinjoissa. Tulokset näkyvät kuviossa 1B, jossa järjestimme BC solulinjat kaikissa paneelit mukaan niiden suhteellinen ekspressio kanoninen ”epiteelin” merkki E-kadheriinin (Fig. 1 B, ylempi vasen paneeli) [20]. Ilmaisu E-kadheriinin korreloivat suoraan ilmentymistä p63 ja käänteisesti ilmaus ZEB1 ja vimentiinista, mikä osoittaa, että ”epiteelin” ja ”mesenkymaalisten” markkereita ilmaistaan ​​pitkälti kuin limittäin BC linjat (Fig. 1 B) . Vain kaksi solulinjojen (1A6 ja UM-UC18) koekspressoitiin ”epiteelin” ja ”mesenkymaaliset” markkereita (Fig. 1 B).

. Korrelaatio FGFR1 ja FGFR3 kanssa kanonisen EMT markkereita. mRNA-tasot mitattiin käyttämällä koko genomin mRNA: n ilmentymisen profilointiin (Illumina platform). Lämpö kartta kuvaa ilmaus FGFR1, FGFR3, FGF2 (bFGF), p63 (TP63), E-kadheriinin (CDH1), Slug (SNAI2), ja vimentiinistä. B. kvantitatiivinen analyysi EMT merkki ilmaisun. Suhteellisten tasojen ”epiteelin” markkereita E-kadheriinin (CDH1) ja p63, ja ”mesenkymaaliset” markkereita ZEB1 ja vimentiinin mitattiin kvantitatiivisen tosiaikaisen RT-PCR: llä.

Sitten mitataan ilmaisu of FGFR: ää 1-4 ja FGF-2 kvantitatiivisen RT-PCR (Kuva. 2A). Vahvistaminen geeniekspressioprofilointi tuloksia, FGFR1 ilmentyi pääasiassa solujen ”mesenkymaaliset” alaryhmä (UM-UC3, UM-UC13, T24, BV ja UC12) (Fig. 2A ylhäällä vasemmalla), kun taas FGFR3 ilmentyminen keskittynyt sisällä ” epiteelin ”solut, joissa RT4 jolla on korkein ilmaus seuraa UM-UC14, SW780 ja RT112 (Fig. 2A, ylhäällä oikealla). FGFR2 myös näytti olevan jonkin verran rikastettu ”epiteelin” ja FGFR4, että ”mesenkymaaliset” solut, vastaavasti, mutta niiden ekspressiotasot olivat paljon alhaisemmat kuin tasot FGFR3 tai FGFR1 (keskiarvo 36 sykliä verrattuna 30 PCR-sykliä), yhdenmukaisia ​​aiempien havaintojen [10]. Lopuksi, ”mesenkymaaliset” solut ilmensivät korkeampia FGF2 (bFGF) kuin ei ”epiteelin” solut (Fig. 2A). Olemme vahvistaneet, että FGFR3 ilmentyminen rikastettu ”epiteelin” ja FGFR1 ja bFGF ilmentymistä rikastettu ”mesenkymaalisten” solulinjoja proteiinitasolla immunoblottauksella (kuva S1). Käyttäen nonparametric korrelaatio analyysit, olemme vahvistaneet, että FGFR3 ilmentyminen korreloi voimakkaasti ja suoraan ilmentyminen E-kadheriinin (Spearman r = 0,8155, p 0,0001, Fig. 2B), ja käänteisesti ilmaus ”mesenkymaaliset” markkereita (Fig. S2). Sitä vastoin ilmaus FGFR1 ja bFGF voimakkaasti ja suoraan korreloi ilmaus ZEB1 (Spearman r = 0,799, p = 0,0001 FGFR1 ja r = 0,6198, p = 0,008 varten bFGF) (Fig. 2B). Lisäksi bFGF ja FGFR1 ilmaisun korreloivat suoraan keskenään odotetusti (Fig. 2B). Sitten tutki havaitut erot mRNA ilmaisun käännetty ero ilmentymisen proteiinin tason osajoukko solulinjojen immunoblottauksella. Olemme havainneet, että FGFR3, mutta ei FGFR1 on ilmaistu epiteelin UM-UC14, RT4 ja RT112 soluja, kun taas FGFR1 mutta ei FGFR3 on ilmaistu mesenkymaalisten UM-UC3, UM-UC12 ja UM-UC13. FGF-2 ilmentyi kaikissa 6 solulinjoissa, mutta mesenkymaaliset solut ilmensivät enemmän FGF-2 kuin epiteelisolujen ”solut tekivät. Yhdessä nämä tiedot tukevat ajatusta, että FGFR3 ja bFGF /FGFR1 todennäköisesti toimisi ei-päällekkäistä epiteelin ja mesenkymaaliset alaryhmiä BC soluja.

. Expression of FGFR: ää 1-4 ja PAF suhde E-kadheriiniekspressiota. Suhteellinen mRNA-tasot mitattiin kvantitatiivisen tosiaikaisen RT-PCR: llä. Solulinjat kussakin paneelissa on järjestetty suhteessa E-kadheriinin ilmentymisen (pienimmästä suurimpaan, vasemmalta oikealle, ks. 1 B). B. scatterplots kuvaa suhteita FGFR1, bFGF, FGFR3, ja EMT merkki ilme. Nonparametric korrelaatio analyysit käytettiin arvioimaan suhteita FGFR3 ja E-kadheriinin (CDH1) lauseke, FGFR1 ja ZEB1 ilmaisun, bFGF ja ZEB1 ilmaisun, ja bFGF ja FGFR1 ilme. Korrelaatiokertoimet ja p arvot näkyvät kuvassa.

Effects of BGJ-398 soluproliferaatioon

Aiemmat tutkimukset todettiin, että FGFR inhibiittorit estävät leviämisen joissakin ihmisen BC in vitro [ ,,,0],12], [13]. Siksi testattiin vaikutuksia BGJ-398: n proliferaatioon 17 BC solulinjoissa luonnehtia laajuus heterogeenisyys lääkeaineen herkkyys. Inkuboimme soluja kasvavien pitoisuuksien kanssa BGJ-398: ssa 48 tuntia ja mitatun sytotoksisuus ja kasvun pysähtymisen käyttäen MTT-määrityksissä. Havaitsimme 5 solulinjoja (UM-UC14, SW780, RT4, RT112 ja UM-UC1), jotka olivat huumeiden herkkiä määrittelemien ≥50% kasvun esto huumeiden pitoisuuksina 1 umol /l tai pienempi (kuvio. 3A vasemmalle paneeli ja dataa ei esitetty). Voit määrittää suhteellinen osuus kasvun pysähtymisen ja solukuolemaa näille vaikutuksille, me alttiina UM-UC14 ja RT4 solujen kasvavien pitoisuuksien BGJ-398 48 tuntia, ja sitä mitataan solukierron pysähtymisen ja apoptoosin propidiumjodidivärjäys ja FACS-analyysiä. Molemmissa solulinjoissa kasvavien pitoisuuksien BGJ-398 suurensi prosenttiosuudet soluja G1 vaiheeseen ja yhdensuuntaisia ​​pienenee prosenttiosuudet solujen S-vaiheessa. Erityisesti prosenttiosuudet solujen G1 vaihe kasvoi 47,5% ja 54%: sta 74,2% ja 69,1%, kun taas prosenttiosuudet solujen S-vaiheessa laski 33,5% ja 25%: sta 2,7% ja 8,8% vuonna BGJ-398- altistuvat UM-UC14 ja RT4-solujen, vastaavasti (Fig. 3A). Toisaalta, BGJ-398 ei indusoinut apoptoosia joko solulinjassa pitoisuuksina alle 10 uM (tuloksia ei ole esitetty). Siksi BGJ-398 saa aikaan ensisijaisesti sytostaattinen vaikutuksia BC soluissa in vitro.

. Effects of BGJ-398 solun proliferaatiota lääke-herkkiä soluja. Vasemmassa paneelissa, soluja inkuboitiin 48 h, kun läsnä on ilmoitettua pitoisuuksien BGJ-398, ja solujen kasvu mitattiin MTT: n väheneminen. Mean ± SEM, n = 6. keskimmäinen ja oikea paneeli, UM-UC14 tai RT4 soluja inkuboitiin osoitettujen konsentraatioiden BGJ-398 ja prosenttiosuudet solujen kussakin solusyklin neljänneksessä kvantitoitiin propidiumjodidivärjäys ja FACS-analyysi . Mean ± SEM, n = 3. B. Herkkyys antiproliferatiivisia vaikutuksia BGJ-398 korreloi FGFR3 ilme mutta ei läsnä aktivoivia FGFR3 mutaatioita. Taso kasvun eston havaittiin 48 tunnin kuluttua altistumisesta 1 uM BGJ-398 (mitattuna MTT määritykset) korreloi suhteellisen tason FGFR3 (vasen paneeli) tai FGFR1 (oikea paneeli) mRNA: n ekspression paneelin 17 ihmisen BC solulinjat .. C. vaikutukset FGFR3 knockdown soluproliferaatioon. Vasen paneeli: UM-UC14 tai RT4 soluja transfektoitiin ohimenevästi joko ei-kohdistuksen (NT) tai FGFR3 erityisiä siRNA: t ja solujen kasvua mitattiin 48 tunnin MTT vähentäminen. Keskiarvo ± SEM, n = 6. Center ja oikea paneeli: UM-UC14 tai RT4-solut transfektoitiin väliaikaisesti joko ei-kohdistuksen (NT) tai FGFR3-spesifisiä siRNA: t ja prosenttiosuudet solujen kunkin vaiheen solusyklin kvantitoitiin propi- jodidi värjäystä ja FACS-analyysiä. Mean ± SEM, n = 3. Laske paneeli: tehokkuus FGFR3 hiljentäminen mitattiin kvantitatiivisen RT-PCR ja immunoblottauksella.

jälkeen tutkittiin suhdetta BGJ-398 herkkyys ja läsnäolo aktivoivan FGFR3 mutaatioita. Käyttämällä eksonin sekvensointi tunnistimme 5 solulinjojen sisällä paneeli, joka sisälsi aktivoivat FGFR3 mutaatioita (UM-UC6, UM-UC14, UM-UC15, UM-UC16 ja UM-UC17) (Fig. S3). Silmiinpistävän, vain yksi FGFR3-mutantti solulinjoja (UM-UC14) oli myös BGJ-398 herkkä. Toisaalta, havaitsimme hyvä korrelaatio FGFR3 mRNA ilmaisun ja huumeiden herkkyys (Spearman r = 0,7247 p = 0,01) (Fig. 3B vasen paneeli), vaikkei ollut mitään korrelaatiota herkkyyttä BGJ-398 ja FGFR1 lauseke (Spearman r = -0,2931 p = 0,2536) (Fig. 3B oikea paneeli).

Koska ei-päällekkäisiä malleja FGFR1 ja FGFR3 ilmaisu, tulokset viittaavat siihen, FGFR3 on entistä merkittävämmässä roolissa kuin FGFR1 ajo leviämisen ihmisen BC soluja. Suoremmin testata tätä hypoteesia, käytimme RNAi kaataa FGFR1 tai FGFR3 että BGJ-398-herkkää UM-UC14 ja RT4 solujen ja mitataan vaikutuksia soluproliferaatioon käyttämällä MTT määrityksiä. Kvantitatiivinen RT-PCR paljasti pudotus hyötysuhde 50% ja yli 80% on RT4 ja UM-UC14-soluissa, jotka on transfektoitu FGFR3-spesifinen siRNA: t, vastaavasti verrattuna soluihin, jotka oli transfektoitu ei-spesifisten siRNA ohjaus, ja nämä tulokset on myös vahvistanut proteiini taso immunoblottauksella (Fig. 3C alempi paneeli). Vastaavat vaikutukset soluproliferaatioon olivat hyvin samanlaisia, että leviämisen väheni lähes 50% vuoden RT4 soluissa ja yli 80%: in UM-UC14 transfektoitu FGFR3 siRNA (Fig. 3C vasen paneeli). Solusyklin analyysit vahvistivat, että FGFR3 Knockdown lisääntynyt prosenttiosuudet solujen G1 vaiheessa ja vähensi jakeet solujen S-vaiheessa (Fig. 3C keskus /oikea paneeli), sopusoinnussa MTT tulosten ja aiemmin havaitut vaikutukset BGJ-398 [ ,,,0],12]. Sen sijaan knockdovvn FGFR1 ei ollut merkittävää vaikutusta proliferaatioon (Fig. S4).

Effects of BGJ-398 Invasion

Vaikka ”mesenkymaalisten” UM-UC3 ja UM-UC13 soluissa ilmaistaan ​​suhteellisen korkea FGFR1, ne olivat resistenttejä anti-proliferatiiviset vaikutukset BGJ-398 (Fig. 4A vasen paneeli). Koska invaasio, muuttoliike, ja etäpesäkkeiden ovat ominaisia ​​piirteitä ”mesenkymaalisten” kasvainsolut [20], tutkimme vaikutuksia BGJ-398 hyökkäystä UM-UC3 ja UM-UC13 soluissa, käyttäen kahta ”epiteelin”, BGJ-398 -kestävistä solulinjoja (UM-UC6 ja UM-UC9) kontrolleina. Olemme altistuneet solut kasvavien pitoisuuksien BGJ-398 ja mitattiin hyökkäystä käyttämällä muunnettua Boyden kammioita.