Krooninen sairaus

tiivistelmä

Spontaani CD4

+ T-solu vasteita kasvainta antigeeni NY-ESO-1 (ESO) on usein todettu potilailla, joilla epiteelin munasarjasyöpä (EOC). Jos nämä reaktiot ovat efektori ja /tai Treg tyyppi, kuitenkin, on jäänyt epäselväksi. Tässä olemme käyttäneet funktionaalisia lähestymistapoja yhdessä viime aikoina kehitetty luokan II MHC /ESO tetrameereja arvioida taajuus, fenotyyppi ja toiminta ESO-erityisiä soluja verenkierron imusolujen EOC potilaista. Olemme havainneet, että verenkierrossa ESO-CD4

+ T-solujen EOC potilailla, joilla on spontaani immuunivasteita antigeenille ovat vallitsevasti T

H1-tyypin solujen erittävät IFN-γ, mutta ei IL-17 tai IL-10, ja ei ehkäisevän . Havaitsimme tetrameeri

+ solujen

ex vivo

, joiden keskimäärä on 1:25000 muistisolujen, eli huomattavasti pienempi kuin potilailla, immunisoidaan ESO rokotteella. ESO tetrameeri

+ solut olivat enimmäkseen effektori solujen myöhemmissä vaiheissa erilaistumista ja ei ole havaittu verenkierrossa CD25-

+ FOXP3

+ Treg. Siten spontaani CD4

+ T-soluvasteita ESO syöpäpotilailla ovat vallitsevasti T

H1 tyyppi eikä Treg. Niiden suhteellisen alhainen tiheys ja kehittyneet erilaistumisen vaiheessa, voivat kuitenkin rajoittaa niiden tehoa, joka voidaan vauhdittaa immunogeeninen ESO rokotteilla.

Citation: Redjimi N, Duperrier-Amouriaux K, Raimbaud I, Luescher I Dojcinovic D, Classe JM, et al. (2011) NY-ESO-1-Specific Kiertävä CD4

+ T-solut munasarjasyövässä potilaat vallitsevasti T

H1 Type Solut huomaamaton CD25

+ FOXP3

+ Treg Compartment. PLoS ONE 6 (7): e22845. doi: 10,1371 /journal.pone.0022845

Editor: George Kassiotis, MRC National Institute for Medical Research, Yhdistynyt Kuningaskunta

vastaanotettu 25 maaliskuuta, 2011; Hyväksytty: 30 Kesäkuu 2011; Julkaistu: 29 heinäkuu 2011

Copyright: © 2011 Redjimi et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukivat Fondation de France, Cancer Research Institute ja Ludwig Institute for Cancer Research. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

CD4

+ T-solujen alaryhmiä olla tärkeä ja mahdollisesti vastapäätä rooleja kasvaimen immuunitutkimusohjelmasta [1], [2]. Tyyppi I auttaja (T

H1) T-soluja, jotka erittävät allekirjoitus sytokiini IFN-γ, suosivat CD8

+ sytolyyttinen effektorit (CTL), ja välittävät tehokkaan anti-kasvain vasteita. Sen sijaan, sääntely /estäjä-T-soluja (Treg), tunnettu

ex vivo

korkea ilmentyminen IL-2R α-ketju (CD25) ja sukulinja-erityinen transkriptiotekijän FOXP3 ja alhainen ilmentyminen IL -7R α-ketju (CD127), uskotaan estävän anti-tuumorivasteita [3], [4], [5], [6], [7]. Treg, jotka eivät erittää IFN-γ: n tai IL-2, on raportoitu olevan läsnä määrinä syöpäpotilailla verrattuna terveisiin yksilöihin [8], [9]. Koska antigeenispesifisyys Treg ei juuri tunneta, on epäselvää, kyky Treg estää anti-tuumorivasteita liittyy tai ei läsnäoloon /esiintyvyys joukossa Kasvainten antigeenispesifisten CD4

+ T-soluja.

NY-ESO-1 (ESO), tuumorin antigeeni syöpä /kives ryhmä ilmaistaan ​​usein ihmisen kasvaimissa eri histologisia tyyppejä, mukaan lukien munasarjojen syöpien, mutta ei normaalissa somaattisten kudosten [10], [11 ], on ehdokas kehittämään yleistä syövän vastaisen rokotteen [12]. ESO on erittäin immunogeeninen ja saa aikaan spontaaneja humoraalinen, CD4

+ ja CD8

+ T-solu vasteita potilailla joissa antigeeni-ilmentävien kasvainten [11], [13], [14], [15]. Lisäksi, ESO-spesifistä vasta-ainetta, CD4

+ ja CD8

+ T-solu-vasteita voidaan indusoida kautta immunisaatio ESO-rokotteiden [16]. Olemme aikaisemmin tunnistettu immunodominantille tunnistamia ESO-CD4

+ ja CD8

+ T-solujen [16] ja luoneet liukeneva loisteputki MHC-luokan I ja, viime aikoina, MHC-luokka II /ESO peptidi tetrameereja mahdollistaa suoran havaitsemisen , fenotyypitys ja eristäminen ESO-spesifisten T-solujen [17], [18]. Käyttämällä luokan II MHC /ESO peptidi tetrameerejä arvioimaan CD4

+ T-solut potilailla immunisoitu rekombinanttisen ESO-proteiinia annettiin Montanide ™ ISA 51 ja GpG 7909, olemme osoittaneet, että rokote aiheuttama ESO-CD4

+ T-solut ovat vallitsevasti T

H1 soluja, havaitaan

ex vivo

muistior- (CD45RA

-) solut, ovat sekä keskus- muistin (CCR7-

+) ja effektori (CCR7

-) väestö ja eivät sisällä merkittäviä osuuksia Treg [16], [17], [18]. Viimeaikaiset tutkimukset ovat kuitenkin ehdottaneet, että toisin kuin ESO-CD4

+ T-solut pohjustetaan rokotuksilla, ESO-CD4

+ T-solut potilailla, joiden spontaani immuunivasteita voivat sisältää merkittäviä osuuksia Treg [19 ] ja että kohonnut osuudet kiertävän Treg syöpäpotilailla saattavat heikentää niiden kykyä vastata ESO rokotteita [20]. Näiden ongelmien, tässä tutkimuksessa, olemme käyttäneet toiminnallisia lähestymistapoja yhdessä luokan II MHC /ESO peptidi tetrameerejä arvioida ESO-spesifisten solujen kesken tavanomaisen ja Treg CD4

+ T-solujen alaryhmiä verenkierrossa olevien lymfosyyttien epiteelin munasarjasyöpä (EOC) potilailla, joilla on havaittavissa spontaaneja immuunivasteita ESO.

tulokset

arvio muistin tavanomaisten CD25

– ja sääntelyyn CD25

+ FOXP3

+ CD4

+ T-solualaryhmien verenkierrossa olevien lymfosyyttien terveiden luovuttajien ja EOC potilaiden

Yksi muisti CD4

+ T-soluja useita osajoukkoja voidaan erottaa perustuen CD25: n ilmentymistä ja CD127. Kun taas tavanomainen CD4

+ T-solut ovat CD25

-CD127

+, Treg ovat CD25

+ CD127

– ja FOXP3

+ (kuvio 1A). Kolmas populaatio, CD25

-CD127

-, sisältää äskettäin aktivoitua ja IL-10-tuottavien CD4

+ T-solujen [21]. Kun taas CD25

-CD127

+ solut ovat suurin kiertävän muisti CD4

+ T-soluja, Treg ja CD25

-CD127

– populaatiot ovat läsnä paljon pienempiä ja suurin piirtein samassa suhteessa, mikä kukin noin 5%. Koska edellinen raportit ovat osoittaneet, että Treg populaatiot voidaan lisätä verenkierrossa olevien lymfosyyttien syöpäpotilaista verrattuna terveisiin yksilöihin, vertasimme osuus CD4

+ T-solujen alaryhmiä kiertävien lymfosyyteissä EOC potilaiden terveillä luovuttajilla. Me epäonnistui kuitenkin havaita merkittäviä eroja suhteessa verenkierrossa Treg potilailla verrattuna terveisiin luovuttajien (kuvio 1 B). Vastaavasti osuus CD25

-CD127

– CD4

+ T-solut eivät merkittävästi eroa potilaiden välillä ja terveillä luovuttajilla. Karakterisoimiseksi edelleen CD4

+ T-solujen alaryhmiä kiertävien lymfosyyttien EOC potilaista, me eristää heidät

ex vivo

, virtaussytometrillä solun lajittelua, kannustanut heitä

in vitro

ja arvioinut kulttuureissa 12 päivää myöhemmin niiden kykyä erittää erilaisia ​​sytokiineja. Kuten odotettua, sekä terveillä luovuttajilla ja potilailla, CD25

– populaatiot sisälsi huomattavasti suurempia osuuksia, jotka erittävät IFN-γ verrattuna Treg (kuvio 2). CD127

+ populaatiot sisälsi suurempia määriä IFN-γ-erittävien solujen kuin CD127

– populaatioissa. Mielenkiintoista on, verrattuna terveiden luovuttajien, CD25

-CD127

– populaatiot syöpäpotilaista sisälsi suurempia määriä IFN-γ-erittäviä soluja. Sen sijaan osuus IL-17- tai IL-10-erittävien solujen ollut merkitsevää eroa terveiden luovuttajien ja potilaiden tahansa populaatioiden.

. CD4

+ T-solut värjättiin anti-FOXP3, -CD25, -CD45RA ja CD127-vasta-aineita, ja analysoitiin virtaussytometrialla. Expression of CD25 ja CD127 määrittelee 3 populaatioita muistin (CD45RA

-) CD4

+ T-solut: tavanomainen CD25

-CD127

+ ja CD25

-CD127

– ja Treg CD25

+ CD127

– (vasen pistekuvaajana, numerot vastaavat osuutta kustakin seikasta muistior- CD4

+ T-solut). Histogrammit osoittavat ilmentymisen FOXP3 määritellyllä muistiin CD4

+ T-solualaryhmien. B. osuus tavanomaisten CD25

-CD127

+ ja CD25

-CD127

– ja Treg CD25

+ CD127

– osajoukkoja, määritelty A muistior- CD4

+ T-solut terveiden luovuttajien (HD, n = 27), ja potilaat (P, n = 18).

Ex vivo

-sorted muisti tavanomaisia, CD25

-CD127

+ ja CD25

-CD127

– ja Treg, CD25

+ CD127

-, populaatiot terveiltä luovuttajilta (HD, n = 12) ja potilaat (P, n = 12) stimuloitiin

in vitro

ja päivä 12 viljelmät arvioitiin IFN-γ, IL-10 ja IL-17 tuotantoa, stimulaation jälkeen PMA: lla ja ionomysiinillä, on 4-h solunsisäisen sytokiinin erityksen määritys ja analysoidaan virtaussytometrialla. Dot tontteja yhden luovuttajan on esitetty A ja tiedot kaikista terveiden luovuttajien ja potilaiden on esitetty yhteenvetona B. Tilastolliset analyysit suoritettiin käyttäen standardia kaksisuuntaista

t

-testissä.

ESO-tiettyjen kiertävien CD4

+ T-solujen EOC potilaalla on spontaaneja immuunivasteita löytyy CD25-

-CD127

+ ja CD25

-CD127

– populaatiot, mutta ei CD25

+ CD127

-FOXP3

+ Treg ja erittävät IFN-γ mutta ei IL-17 tai IL-10

aiempien tutkimusten, noin 40% munasarjojen kasvaimia ilmaista ESO ja noin 30% of EOC potilaista varustettujen ESO-ilmentäviä kasvaimia kehittää erityisiä spontaanin vasta-aine (Ab) vastaukset [22]. Arvioimme Ab vastaukset ESO kohortin 110 EOC potilaista (taulukko 1) mukaan potilaiden seerumeista ELISA kuvatulla [14]. Olemme havainneet huomattavia Ab vasteita ESO 8 (7%) potilaista (kuvio 3A) on tiitterit vaihtelevat 1:500 ja 1:50000 (kuvio 3B). Potilaat, joilla on havaittavissa ESO Ab esittelyyn korkealaatuista (II, III) kasvaimen vaiheen III tai IV ja vakavien histologia (taulukko 1). 6 potilasta, PBMC: itä saatavilla analyysiä varten. Arvioimaan ESO-spesifisten solujen sisällä määritelty kiertävä muisti CD4

+ T-solujen alaryhmiä näistä potilaista, me eristää heidät

ex vivo

virtaussytometrialla solujen lajittelu, ja kannustanut niitä altaan pitkä päällekkäisten peptidien ulottuen ESO järjestyksessä, kuten on kuvattu [16]. Kaksitoista päivää myöhemmin, me stimuloi alikvootit kulttuurien kanssa ESO peptidipooli ja arvioidaan erityisiä sytokiinituottamisen solunsisäinen värjäys. Olemme havainneet merkittävä osuus tuottavien solujen IFN-γ vastauksena ESO kulttuureissa lähettämästä CD25

-CD127

+ ja CD25

-CD127

– CD4

+ T-solupopulaatioiden, mutta eikä Treg (kuvio 4A ja 4B). Sen sijaan, löydettiin vain pieni osuus, jotka erittävät IL-10 tai IL-17-vasteena ESO tahansa populaatioiden. Yhdessä nämä tulokset osoittivat, että suurin osa verenkierrossa ESO-CD4

+ T-solut näillä potilailla olivat T

H1 tyyppi IFN-γ-erittävien solujen, CD25

– sekä CD127

+ ja CD127

-, ja eivät olleet havaittavissa CD25-

+ FOXP3

+ Treg.

. Läsnäolo ESO-erityisiä Ab potilaiden seerumista määritettiin ELISA: lla. Sera alun perin arvioitiin klo 1:100 laimennusvaikutus Reso-päällystetty tai valvontaa päällystämättömän levyille. Sera pisteytettiin ESO Ab

+ jos optinen tiheys (OD) arvot saadaan rešo levyillä olivat molemmat vähintään 3 taittuu korkeampi kuin saadaan samasta näytteestä päällystämättömän levyt ja korkeampi kuin keskimääräinen + 6xSD OD saadut arvot seerumien kanssa terveiden yksilöiden reso-päällystetyillä levyillä (n = 53, keskiarvo + 6xSD = 750, tuloksia ei ole esitetty). B. sarjalaimennoksia ESO Ab

+ seerumit testattiin rešo levyillä. Seerumin tiitteri laskettiin seerumilaimennuksella saatiin 50% maksimaalisesta OD.

Muisti tavanomaiset, CD25

-CD127

+ ja CD25

-CD127

– ja Treg, CD25

+ CD127

-, populaatiot lajiteltiin

ex vivo

CD4

+ T-solujen ESO Ab

+ potilaiden ja kannustanut

in vitro

uima-allas on pitkä päällekkäisten peptidien ulottuu koko pituudeltaan ESO järjestyksessä. A ja B. 12. päivä viljelmät arvioitiin IFN-γ, IL-10 ja IL-17 tuotantoa 4-h solunsisäisen sytokiinin fluoresenssi-stimulaation jälkeen puuttuessa tai läsnä ollessa ESO-peptidi-. Pistekuvioita yhdelle potilaalle on esitetty A ja saadut kaikille potilaille esitetään yhteenveto B. C ja D. Päivä 12 viljelmät värjättiin DR52b /ESO

119-143 (NA017, NA093 ja NA097) tai DR4 /ESO

119-143 (NA304) tetrameerit ja anti-CD4 mAb, ja analysoitiin virtaussytometrialla. Pistekuvioita yhdelle potilaalle esitetään C ja data kaikille potilaille esitetään yhteenveto D.

Assessment of ESO-spesifisten T-solujen CD4

+ alaryhmiä käyttämällä luokan II MHC /ESO peptidi tetrameerit

Yksi varoitus kokeellisen asetusta käytettiin edellä oli, että vaikka ESO-erityisiä soluja havaittiin perustuu niiden kyvystä nimenomaan erittää IFN-γ vastauksena ESO, Treg erittyy vähän IFN-γ jopa upon stimulointi PMA /ionomysiinillä (kuva 2). Voittamiseksi asettamien rajoitusten havaitseminen ESO-CD4

+ T-solujen perustuvat toiminnalliset analyysit, olemme viime aikoina kehittäneet liukeneva loisteputki MHC-luokan II tetrameerejä että sisältämään -epitoopilla ESO, joka vastaa peptidille 119-143 [17 ], [18]. Olemme osoittaneet, että luokan II MHC /ESO

119-143 tetrameerien värjätä ESO-CD4

+ T-solujen verenkierrossa olevien lymfosyyttien potilaiden immunisoidaan ESO rekombinanttirokote korkea hyötysuhde ja spesifisyys, joka mahdollistaa niiden suoran visualisoinnin keskuudessa polyspesifinen CD4

+ T-soluviljelmissä. Koska 4 potilailla, joilla on spontaani immuunivasteita ESO ilmaistuna MHC-luokan II alleelit, joita varten sopivia tetrameerejä oli saatavilla (DR52b ja DR4), arvioimme ESO-spesifisten T-solujen Näiden viljelmien tetrameerivärjäyksellä (kuvio 4C ja 4D). Olemme havainneet merkittäviä osuuksia ESO tetrameerin

+ solujen kulttuureissa CD25-

-CD127

+ väestöä kaikista potilaista sekä niillä, CD25

-CD127

– populaatiot (3 potilaat huomattavasti useammin verrattuna CD25

-CD127

+ jakeet). Kuitenkin kaikissa tapauksissa, emme onnistuneet havaitsemaan huomattava osa tetrameerien

+ solujen Treg kulttuureissa. Lisäksi CD25

+ CD127

-FOXP3

+ Treg ehkäisevä CD4

+ T-solujen on myös kuvattu joissakin tutkimuksissa muun väestön [21]. Arvioida, riippumatta niiden fenotyyppi, ESO-CD4

+ T-solut näkyvät tukahduttava toimintoja, me eristetty ne viljelmistä tetramer- tai IFN-γ-ohjattu solujen lajittelu ja arvioida niitä toiminnallisesti vaimennusta määrityksessä kuvatulla [23], [24]. Kuten odotettua, FOXP3

+ Treg väestön samanaikaisesti arvioitiin sisäisen valvonnan tehokkaasti tukahdutti kasvua vastesoluja. Sen sijaan, ESO-spesifisten solujen eristetty sekä CD25

-CD127

+ ja CD25

-CD127

+ viljelmät FOXP3

– ja ei ehkäisevän (kuvio 5).

ESO-spesifisiä soluja eristettiin peptidi-stimuloitujen CD25

-CD127

+ ja CD25

-CD127

– CD4

+ T-soluviljelmissä (kuvio 4), jonka tetramer- opastettu (NA017) tai IFN-γ-ohjattu (NA114) virtaussytometria solulajittelussa ja laajennettu

in vitro

. Tuloksena polyklonaalinen viljelmät sisälsivät 80% ESO-erityisiä soluja. A. ESO-polyklonaalisia kulttuureissa samoin kuin polyklonaalisia kulttuureihin ESO

– osa ja kontrolliviljelmien on

in vitro

-expanded tavanomainen muisti CD4

+ T-solut (M) ja muistin Treg ( MTreg), eristetty

ex vivo

terveistä yksilöistä, värjättiin FOXP3-spesifinen mAb, ja analysoitiin virtaussytometrialla. Numerot pistekuvioita vastaavat fluoresenssin keskimääräinen intensiteetti (MFI) FOXP3 värjäystä. B. tukahduttava aktiivisuus ESO-erityisiä ja ohjata polyklonaalinen väestön arvioitiin rinnakkaisviljelemällä CFSE-leimatun tavanomainen CD4

+ T-soluja, klo vastaaja: vaimennin suhde 01:01, kun läsnä on säteilytettyjä monosyyttien ja PHA. Pistekuvioita osoittavat CFSE-laimentaminen profiili puuttuessa testi väestöstä (vasemmalla) ja kun läsnä on ilmoitettua testin populaatioissa. Numerot histogrammit vastaavat prosenttiosuus jakamattoman soluja. Vastaavat tulokset lasketaan% vaimennus on esitetty kaikissa testatuissa populaatioissa.

Ex vivo

arviointi ESO-tiettyjen kiertävien CD4

+ T-soluihin käyttäen luokan II MHC /ESO tetrameerit

vahvista jakelua ESO-spesifisten solujen CD4

+ T-solujen subsets potilailla, joilla on spontaani immuunivasteita sekä arvioimaan niiden mittasuhteet ja fenotyyppiin me värjätään koko kiertävää CD4

+ T soluja DR52b

+ potilaat

ex vivo

ESO tetrameereillä yhdistettynä mAb suunnattu markkereita, jotka luonnehtivat selvä eriyttäminen vaiheissa CD4

+ T-soluja. Kuten on esitetty aikaisemmin [17], ESO tetrameeri

+ solut eivät olleet havaittavissa CD4

+ T-soluja terveiltä luovuttajilta. Sen sijaan ne havaittiin selvästi

ex vivo

verenkierrossa muistiin CD4

+ T-solut potilailla (kuvio 6A). Tetrameeri

+ solujen kiertävien CD4

+ T-solut potilaista oli tasaisesti CD25

– ja havaittiin keskuudessa CD127

+ ja CD127

– populaatiot, mutta eivät olleet havaittavissa joukossa CD25

+ CD127

– Treg (kuvio 6B). Niinpä samanlainen kuin mitä olemme aiemmin havaittu potilailla immunisoitu rekombinantti ESO rokote, suora

ex vivo

värjäyksen ESO tetrameereillä vahvisti puute huomattava osa ESO-CD4

+ T-solujen verenkierrossa Treg potilailla, joilla on spontaani immunologisia vasteita antigeenille. Taajuus verenkierrossa ESO tetrameerien

+ solut potilaiden spontaani vastauksia, oli, että keskimäärin on 1:25000 viisi taittuu pienempi kuin todettu rokotetuilla potilailla (kuvio 6A) [17]. Kuitenkin ESO tetrameeri

+ soluja, jos potilaalla on spontaaneja vasteita sisälsivät alemmat osuudet CD127

– soluja verrattiin rokotettujen potilaiden (kuvio 6B). Lisäksi, toisin kuin jälkimmäinen, joka sisälsi keskimäärin, noin vastaavissa suhteissa CCR7-

+ ja CCR7

– soluja, samoin kuin suurin osa CD27

+ soluja, ESO tetrameerin

+ solut potilailla, joilla on spontaani vastaukset olivat enimmäkseen CCR7-

– ja sisälsi määrinä CD27

– soluja, sopusoinnussa eriytetympää fenotyypin (kuvio 6C). Lopuksi sulkea pois sitä mahdollisuutta, että valinta ESO Ab

+ potilaat voivat valinnut potilaille, joilla on vähän tai ei ollenkaan ESO-erityisiä Treg, arvioimme

ex vivo

CD4

+ T-solut ESO Ab

– DR52b

+ potilailla (n = 23). Kuitenkin emme onnistuneet havaitsemaan merkittäviä määriä ESO tetrameerin

+ näillä potilailla (dataa ei esitetty).

CD4

+ T-solujen DR52b

+ terveen luovuttajan (HD) ja potilaat, värjättiin

ex vivo

kanssa DR52b /ESO

119-143 tetrameereja ja spesifinen mAb CD45RA, CD25, CD127, CCR7- ja CD27 ja analysoitiin virtaussytometrialla. A. Dot tontteja yhden HD ja yksi EOC potilas on esitetty. Numerot pistekuvioita vastaavat prosenttiosuutta tetrameerin

+ solujen joukossa CD45RA

– muisti soluja. Tiedot kaikista EOC potilaille, joilla on spontaani immuunivasteita ESO (S) on esitetty verrattuna taajuus (keskiarvo ± SD) ESO tetrameerin

+ solujen jälkeisissä rokotteen näytteissä potilailta, jotka ovat saaneet rekombinantin ESO rokote (V) [17]. B. Dot tontteja osoittavat ilmentymisen CD25 ja CD127 yhteensä muisti soluissa ja tetrameerin

+ solut yhdestä EOC potilaalle. Data, joka vastaa osuuden tavanomaisesti, CD25

-CD127

+ ja CD25

-CD127

– ja Treg, CD25

+ CD127

-, populaatiot tetrameeri

+ soluja kaikille EOC potilaille (S) on koottu ja verrataan sitä osuutta (keskiarvo ± SD) näiden populaatioiden rokotteen aiheuttaman tetrameerin

+ soluja (V). C. Dot tontteja osoittavat ilmaisun CCR7- ja CD27 yhteensä muisti soluissa ja tetrameerin

+ solut yhdestä EOC potilaalle. Data vastaa sitä osuutta CCR7-

+, CCR7-

-CD27

+ ja CCR7

-CD27

– populaatiot tetrameeri

+ solujen kaikille EOC potilaille (S) on yhteenveto ja verrattuna osuus (keskiarvo ± SD) näiden populaatioiden rokotteen aiheuttaman tetrameerin

+ soluja (V). Tilastolliset analyysit tehtiin käyttäen tavallista kaksisuuntaista

t

-testissä.

Keskustelu

Strong immuunivaste syöpäkudokset ovat mahdollisesti pystyy estämään taudin etenemistä. Koska nämä vastaukset usein suunnattu ei yksinomaan vastaan ​​kasvainta antigeenejä, vaan myös erilaistumista tai muita omia antigeenejä, on mahdollista huomattavasti vahingoittaa normaaleissa kudoksissa, vankka immunoregulatooristen verkot ovat käytössä [25]. Erityisesti CD4

+ CD25

+ FOXP3

+ Treg, auttavat ylläpitämään kudoksessa homeostaasin ja Itsetoleranssiprosessi, uskotaan olevan tärkeä rooli vaimentaa syövän vastaisen immuniteetin. Aiemmat tutkimukset ovat raportoineet lisääntynyt mittasuhteet Treg verenkierrossa ainakin osa potilaista, joilla oli kiinteä kasvain [8], [9] sekä kertymistä CD25

+ FOXP3

+ Treg at tuumorikohdat [8], [26], erityisesti myöhemmissä vaiheissa taudin, ja ovat perustaneet korrelaatio niiden esiintymistiheys ja kliinisiin tuloksiin [3]. Pohjassa Näiden havaintojen lähestymistapoja eliminoimiseksi Treg on suunniteltu, ja on jo arvioitu kliinisissä yhteyksissä, vaikka ne ovat sidoksissa riski valjastamiseen auto-reaktiivisuus [27], [28], [29].

tässä tutkimuksessa olemme käsitelleet läsnäoloa ja jakelu CD4

+ T-solut ovat spesifisiä kasvaimen antigeeni ESO, syövän /kiveksen ryhmä [10], [30], [31], sisällä kiertävä CD4

+ T-solujen osajoukkoja EOC potilaista. Käytimme yhdistelmä toiminnallisen lähestymistapojen ja MHC luokan II tetrameerejä sisältää Immunodominantin peptidi, ESO

119-143, että olemme viime aikoina kehittäneet [17], [18]. Emme ei havaittu huomattavia eroja osuuden Treg keskuudessa kiertävän lymfosyyttejä EOC potilailla verrattuna terveiden luovuttajien. Samoin löysimme mitään merkittävää kasvua osuus kaikista verenkierrossa CD4

+ CD25

-CD127

– T-solut, populaatio, joka sisältää äskettäin aktivoitua CD4

+ T-solujen ja on ehdotettu sisältävän IL-10-erittävien Tr1 solujen terveiltä luovuttajilta [21], mutta ei ollut arvioitu syöpäpotilailla ennen tätä tutkimusta. Näin ollen vaikka muutoksia verenkierron Treg osasto voi todellakin esiintyä joillakin syöpäpotilailla, löysimme mitään suuria muutoksia ryhmämme EOC potilaita. On huomionarvoista kuitenkin, että potilaat arvioidaan tässä tutkimuksessa olivat saaneet ensilinjan kemoterapiaa, mikä voi tilapäisesti alentaa Treg [32], vaikka niitä arvioitiin eri aikoina, mutta vähintään kuukauden, hoidon päättymisestä. Kuitenkin arviointi immuniteetti tämän väestön suhteen anti-tuumorivasteita, on eniten merkitystä suunnittelussa immuuni-hoitoja.

Arvioimalla ESO-vasteita kiertävien CD4

+ T-solu alijoukkojen EOC sairastavien potilaiden spontaani immuunivaste, lajiteltu

ex vivo

ja kannustanut

in vitro

ESO peptidejä, havaitsimme merkittävä osuus tuottavien solujen IFN-γ vastauksena ESO, mutta ei IL-10- tai IL-17-erittävien solujen, mikä osoittaa, että suurin osa ESO-CD4

+ T-soluja T

H1 efektoreja. Koska tutkimus on erityisesti osoitettu T

H1 soluja ja Treg in EOC, rajoitimme analyysin tärkeimmät sytokiinien, nimittäin IFN-γ, IL-10 ja, koska raportoitu suhdetta Treg ja T

H17 soluista IL-17. On kuitenkin kiinnostaa, tulevissa tutkimuksissa käsitellä muiden sytokiinien tuotantoa, kuten IL-4 tai IL-13, ESO CD4

+ T-soluja. Mukaisesti siihen tulokseen, että ESO-CD4

+ T-solut eristettiin viljelmistä ovat efektorisolujen, ne eivät osoittaneet merkittäviä ehkäisevästä toimintoja. Lisäksi emme havaitse ESO-erityisiä soluja kiertävä Treg potilaita, joilla on spontaani immuunivasteita antigeenin värjäämällä, MHC-luokan II /ESO tetrameerejä määriteltyjen tavanomaisten ja Treg CD4

+ T-solualipopulaatioissa eristetty

ex vivo

virtaussytometrialla solun lajittelua sekä suoralla

ex vivo

värjäytyminen tetrameereillä. Ristiriidassa tietomme, aiemmat tutkimukset ovat raportoineet eristämistä ESO-CD4

+ T-solujen tukahduttava toimintoja kiertävien lymfosyyttien: lla, edenneen melanooman [19], [33]. Näin ollen vaikka meidän tiedot eivät sulje pois olemassaoloa ESO-erityisiä Treg, ne merkitsevät sitä, että viimeksi mainittuja ei yleisesti todettu kiertävän CD4

+ T-solujen EOC potilaista. On myös huomionarvoista, että, vastaa meidän tuloksia, tutkimukset hiiren malleissa ovat tutkineet läsnäolo Treg in antigeenispesifisten T-solujen tetrameerien ja ei havainnut tetrameeri-sitova Treg [34], [35].

käyttäminen MHC-luokka II /ESO

119-143 tetrameerien

ex vivo

, voisimme suoraan vertailla ESO-CD4

+ T-solut spontaanisti syntyvien potilailla, näiden aiheuttama kautta rokottaminen rekombinantti ESO proteiini (Reso) annetaan yhdessä Montanide ™ ja CpG [16]. On huomionarvoista, että ennen viimeaikainen kehitys luokan II MHC /peptidi tetrameerejä, on ollut vaikea arvioida, antigeenispesifisten CD4

+ T-solujen

ex vivo

johtuen niiden yleensä alhainen taajuus. Tämä on todellakin ensimmäinen raportti tunnusomaiset CD4

+ T-solujen spesifinen syövän /kiveksen antigeeni syöpäpotilailla, joilla on spontaani immuunivaste

ex vivo.

Huomasimme, että taajuus CD4

+ T-solut spesifinen ESO oli merkitsevästi pienempi potilailla, joiden spontaani immuunivasteita verrattuna todettua rokotetuilla potilailla. Lisäksi fenotyyppi luonnossa aiheutuvien ESO tetrameerin

+ soluja oli enemmän eriytetty, verrattuna niiden rokotteen aiheuttama kollegansa, jotka sisältävät määrinä CCR7-

– ja CD27

– soluja. Aiemmat tutkimukset tutkia korrelaatiota laadun muisti CD4

+ T-solujen aikaansaamia vasteita taudinaiheuttajia tai rokotteiden ja niiden fenotyyppi, ovat ehdottaneet, että suojaava muistivaste ei tulisi sisältää ainoastaan ​​effektorit (CCR7-

-) mutta muistisolujen aikaisemmissa erilaistuminen vaiheissa, nimittäin keskusmuistia (CCR7-

+) ja siirtymäkauden muistin (CCR7-

-CD27

+) T-solujen [36], [37]. Tämän ratkaisun, tulokset viittaavat siihen, että ESO-CD4

+ T-solujen aiheuttamaa kautta immunisointi syöpäpotilaiden Reso rokote on todennäköisesti paitsi määrällisesti vaan myös laadullisesti parempia kuin aikana syntyneisiin spontaaneja immuunivasteita, mikä edelleen kannustaa käyttämään ESO-rokotteiden potilailla joissa ESO-ilmentäviä kasvaimia.

Yhdessä nämä tulokset osoittavat potentiaalia luokan II MHC /ESO tetrameereja yksiselitteiseen havaitsemiseen, kvantifiointi ja fenotyypitykseen ESO-CD4

+ T-soluja, ei vain rokotuksen jälkeen, mutta myös arvioida immuunivasteet luonnollisesti syntyvät potilailla, joissa antigeeni-ilmentäviä kasvaimia. Mitä pidemmälle Tämän lähestymistavan soveltamista varten luonnehdinta CD4

+ spesifisten T-solujen ESO ja muissa elimissä antigeenejä verenkierrossa ja tuumorikohdat syöpäpotilaita, sekä pitkin luonnollinen taudinkulku ja hoidon aikana, tulevat todennäköisesti lisäämään merkittävästi tietämyksen syventämiseksi roolinsa ja panoksensa immuniteetin syöpää.

Materiaalit ja menetelmät

Patient ja terveen luovuttajan näytteet ja arviointi ESO-spesifejä vasta-aineita

Sera ja ääreisverenkierron mononukleaariset solut (PBMC) kerättiin EOC potilaista nähty CLCC René Gauducheau ja terveistä yksilöistä kirjallisesta tietoon perustuvan suostumuksen ja hyväksynnän Institutional Review Board (Comité de Protection des personnes Ouest IV – Nantes). Vasta-aine (Ab) vastaukset ESO arvioitiin ELISA: lla, kuten aiemmin on kuvattu [14], [16], käyttämällä yhdistelmä-ESO-proteiinia (rešo) tuotettiin E. coli.

Ex vivo

fenotyyppinen arviointi CD4

+ T-solujen alaryhmiä ja virtaussytometria solulaji

CD4

+ T-solut rikastettiin positiivinen valinta PBMC terveiden yksilöiden ja EOC potilaita magneettinen solulajittelussa (Miltenyi Biotec ), värjättiin monoklonaalisia vasta-aineita (mAb) spesifinen CD4 (BD Biosciences), CD8 (BD Biosciences), CD45RA (BD Biosciences), CD25 (Beckman Coulter), CD127 (eBioscience) ja FOXP3 (eBioscience), kuten, ja analysoitiin virtaussytometrillä käyttämällä LSRII (BD Biosciences). Sillä

ex vivo

virtaussytometrialla solujen lajittelu, rikastettu CD4

+ T-solut värjättiin anti-CD4, -CD8, -CD45RA, -CD25 ja -CD127 mAb. Sen jälkeen gating CD4

+ CD8

-CD45RA

– lymfosyytit, solut erotettiin muistiin CD25

-CD127

+, CD25

-CD127

– ja CD25

+ CD127

-Treg väestön korkea puhtaus ( 97%) käyttäen FACSAria (BD Biosciences).

In vitro

stimulointi ja toiminnallinen arviointi CD4

+ T-solujen alaryhmiä

Yhteensä CD4

+ T-solujen tai

ex vivo

lajitellun muistia tavanomainen ja Treg CD4

+ T-solujen populaatioita stimuloitiin

in vitro

joko altaan pitkä päällekkäisiä peptidejä, jotka kattavat ESO-sekvenssi [16] tai anti-CD2 /3/28-päällystettyihin mikrohelmiin (Miltenyi Biotec), kun läsnä on säteilytettyjä autologisia APC ja viljeltiin, kun läsnä oli ihmisen rekombinantti-IL- 2 (Chiron). Päivä 12-14 viljelmät arvioitiin 4-h solunsisäisen sytokiinin värjäystä määritys käyttäen mAb spesifisiä IFN-γ (BD Biosciences), IL-10 (BD Biosciences) ja IL-17 (eBioscience), stimulaation jälkeen joko ESO peptidin uima-allas tai PMA: lla (100 ng /ml, Sigma Aldrich) ja ionomysiinillä (1 ug /ml, Sigma Aldrich), kuten on osoitettu, ja analysoitiin virtaussytometrialla (LSRII).

luokan II MHC /ESO peptidi tetrameerivärjäyksellä

fluoresoiva HLA-DR52b /ja HLA-DR4 /ESO

119-143 tetrameerien muodostettiin kuten aiemmin on kuvattu [17], [18]. ESO-stimuloiduissa CD4

+ T-soluviljelmiä inkuboitiin tetrameerien lopulliseen konsentraatioon 3 ug /ml 1 tunnin ajan 37 ° C: ssa ja värjättiin sitten CD4-spesifinen mAb, ja analysoitiin virtaussytometrialla (LSRII). Sillä

ex vivo

luettelo ja fenotyypitykseen tiettyjen solujen, yhteensä CD4

+ T-solut rikastettiin PBMC magneettiset solulaji annettiin levätä yön yli, inkuboitu tetrameereillä (3 ug /ml) 2 tuntia 37 °