Krooninen sairaus

tiivistelmä

jäsenet varhaisen kasvun vaste (EGR) perheen transkriptiotekijöiden pelata erilaisia ​​toimintoja reaktiona monissa solun ärsykkeisiin, kuten kasvu, stressi, ja tulehdus. Egr3 on mennyt melko luonteva, mutta täällä käytön kautta silmälasit (strategiakumppanit arviointijärjestö Ennakoiva allekirjoitukset Eturauhassyöpä) Affymetrix koko genomin geenien ilmentyminen tietokanta me raportoimme että Egr3 mRNA on merkittävästi yliekspressoitu eturauhassyöpä verrattuna normaaliin eturauhasen kudosta (5-kertainen). Human Protein Atlas (https://www.proteinatlas.org), tietokanta kudossiruina leimattu vasta-aineita yli 11000 ihmisen proteiineja, käytettiin määrällisesti Egr3 proteiinin ilmentymistä normaalissa eturauhasessa ja eturauhassyöpäpotilaalla. Suostumuksella silmälasit tiedot, huomasimme, että Egr3 proteiini on merkittävästi lisääntynyt eturauhassyövän. Silmälasit tietokannassa on hyötyä laajaa kliinistä seurantaa varten eturauhassyövän potilailla. Analyysi Egr3 mRNA: n ekspression suhteen uusiutumisen tila osoittaa, että Egr3 mRNA: n ekspressio on lisääntynyt kasvainsolujen ei-uusiutunut näytteitä (n = 63) verrattuna normaaliin eturauhasen soluissa, mutta on huomattavasti alhaisempi uusiutunut näytteistä (n = 38), verrattuna ei-uusiutumisen. Havainnot vahvistettiin käyttämällä riippumatonta tietojoukko. Luettelo geenien korreloi tämän ainutlaatuisen ilmentymismalli määritettiin. Nämä Egr3-korreloivat geenejä rikastettu Egr sitoutumiskohdista niiden promoottorien. Geenin luettelo sisältää tulehduksellinen geenejä, kuten IL-6, IL-8, IL1B ja COX-2, joka on laaja yhteydet eturauhassyöpää.

Citation: Pio R, Jia Z, Baron VT, Mercola D, UCI NCI SPECS yhteenliittymä strategiakumppanit arviointijärjestön Cancer allekirjoituksista, Eturauhassyöpä (2013) Early Growth Response 3 (Egr3) on erittäin yliekspressoitunut Non-Relapsoiva Eturauhassyöpä mutta Ei Relapsoiva eturauhassyöpä. PLoS ONE 8 (1): e54096. doi: 10,1371 /journal.pone.0054096

Editor: Irina U. Agoulnik, Florida International University, Yhdysvallat

vastaanotettu: 13 joulukuu 2011; Hyväksytty: 10 joulukuu 2012; Julkaistu: 14 tammikuu 2013

Copyright: © 2013 Pio et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat USPHS myöntää U01 CA1148102 (NIH /NCI SPECS konsortio) ja U01 CA152738 (NIH /NCI EDRN), sekä Kalifornian yliopiston Irvine tiedekunnan Urakehitys Award (tri Z. Jia). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: D. Mercola on osakas Proveri Inc., San Diego, biotekniikan alku up yritys kehittää eturauhasen syöpään liittyvät testit. Dr. Baron on konsultti PellFiCure Pharmaceuticals, Inc., start-up yritys kehittää yhdistelmähoitoa eturauhassyövän. Ei ole kaupan tuotteita julistaa. Vireillä patenttihakemus on: Michael McClelland, Yipeng Wang, Daniel Mercola: Materiaalit ja menetelmät määrittämiseksi diagnoosi ja prognoosi eturauhassyövän. Syyskuu 2011: US 20110236903. Proveri kehittää multiplex immunohistokemia eturauhassyövän diagnoosia testi perustuu materiaalista patenttihakemuksia. Tämä ei muuta tekijöiden noudattaminen kaikki PLoS ONE politiikan tietojen jakamista ja materiaaleja. Kaikki ihmisen kudoksen array tiedot edellä tässä käsikirjoitus on saatavilla yleisölle viitattu tekstissä.

Johdanto

Varhainen kasvu vaste (EGR) transkriptiotekijöitä on pitkään ollut mukana useita soluprosessien tärkeää syövän, mukaan lukien apoptoosin, erilaistuminen, proliferaatio, kasvun esto ja tulehduksen [1] – [5]. EGR transkriptiotekijät indusoituvat nopeasti ja lyhytaikaisesti vastauksena erilaisiin ärsykkeisiin kuten kasvutekijöitä, sytokiinejä, forboliestereille (TPA) ja ionisoivan säteilyn, ja säädellä monipuolisista geenien vastauksena näihin ärsykkeisiin [1], [6] – [ ,,,0],8]. EGR-perhe koostuu Egr1, Egr2, Egr3, ja Egr4 [9], ja kaikkien perheenjäsenten sitoutuvat samaan EGR vaste DNA-elementin (ERE), GCGG /TGGGCG, kolmen konservoituneita sinkkisormi-DNA-sitovia domeeneja [10].

Egr1 on parhaiten tutkittu jäsen transkriptiotekijän perheen. Lukuisat tutkimukset ovat yksityiskohtaisesti sen tuumorisuppressoriproteiinia tehtäviksi ja näin ollen sen alassäätöä rinta-, keuhko-, ja glial syövät [11] – [13]. Mielenkiintoista, Egr1 on osoitettu toimivan onkogeenin eturauhassyöpää. Useita tutkijat ovat raportoineet yli-ilmentyminen Egr1 mRNA: ta ja proteiinia eturauhassyövän [14] – [15]. Kulkuri ja CR2-T-Ag hiiri malleja eturauhassyövän käytettiin tutkia edelleen toiminnallista roolia Egr1 käynnistymiseen ja taudin etenemistä. Egr1-null hiiret, jotka oli risteytettiin joko syöpä malli osoitti myöhässä etenemistä eturauhasen epiteelinsisäisen neoplasia (PIN) invasiivisia karsinooma [16].

Huolimatta hyvin tunnettu tehtävät Egr1, paljon vähemmän tiedetään muista transkriptio tekijöitä EGR perheen kuten Egr3. Useat tutkimukset yksityiskohta toiminta Egr3 vuonna hermoston kehittymistä, erityisesti lihaskäämi kehitys, sympaattinen neuroni erilaistuminen, ja vastauksena ympäristön stressiin (ääni, käsittely, ja uudet tilanteet) [17] – [20]. Egr3-hiirillä esiintyy sympaattisen dysautonomia ja voimakas sensorinen ataksia [17], [20], kun taas Egr1 puutteesta hiirillä ei ole ilmeistä käyttäytymiseen tai kehitykseen ongelma [21]. Egr3 poistogeenisillä hiirillä ei ole vielä käytetty roolin tutkimiseksi transkriptiotekijän syövän, mutta viimeaikaiset raportit ovat käyttäneet soluviljelymalleissa ja geenien ilmentyminen tietojen tutkia Egr3 toiminto useilla aloilla tärkeitä syöpää. Näin ollen, Egr3 on säädelty verisuonten endoteelisolujen kasvutekijän (VEGF) ihmisen napalaskimon endoteelisoluja (HUVEC: t) [22], [23], ja pudotus on Egr3 näissä soluissa johtaa väheneminen VEGF-indusoitua proliferaatiota, migraatiota , ja tubulogenesis [23]. Sen lisäksi, että sen rooli angiogeneesissä, useissa raporteissa on tutkittu rooli Egr3 rintasyövän, jossa se havaittiin olevan estrogeenin reagoiva geeni, jonka immunoreaktiivisuus on positiivisesti, jotka liittyvät estrogeeni α (ERa) tila, imusolmukkeiden tila, ja kaukainen etäpesäke [24], [25].

paljon työtä on vielä tehtävä, mutta on purkautumassa roolista Egr3 muissa syöpien riskiä. Perustuen tietomme Egr1 ja yhteisten DNA sitoutumisominaisuudet kaikkien EGR transkriptiotekijöiden oletamme, että Egr3 todellakin osansa joko muodostumista tai etenemistä eturauhassyövän. Me raportoimme tässä yli-ilmentyminen Egr3 mRNA: ta ja proteiinia eturauhassyöpä verrattuna normaaliin eturauhasen kudosta. Lisäksi tutkitaan yli-ilmentyminen Egr3, myös käytetty laaja eturauhasen geenien ilmentymisen aineistoja päässä University of California-Irvine SPECS ohjelma tutkia ekspressiokuviota Egr3 eturauhassyövässä potilaille, joilla tiedetään uusiutumisen asema, ja totesi, että Egr3 ilmaisu kasvainsoluissa on pienempi kasvaimissa että retkahduksen verrattuna kasvaimia, jotka eivät taudin uusiutumiseen. Tämä ilmaus kuvio: alhainen Egr3 mRNA normaalissa eturauhasessa verrattuna voimakasta ilmentymistä syövän, ja ero uusiutuminen ja ei-uusiutumisen, vahvistettiin itsenäisiin eturauhassyövän geenin ilmentyminen aineisto yliopistosta Pittsburg [26] – [28].

Käyttämällä Human Protein Atlas, myös yksityiskohtia ainutlaatuinen in-silico menetelmä tutkimiseksi yli-ilmentyminen Egr3 proteiinin eturauhassyövässä. Yhdistetty tulokset osoittavat, että Egr3 on biomarkkereiden huonosta lopputuloksesta eturauhassyöpää. Lisäksi kohortin korreloi geenien esiintyy vastaava ilmaisu kuvio, ja jäseniä tämän kohortin ovat ehdokas Egr3 geenien.

Materiaalit ja menetelmät

eturauhasessa Näytteitä

Eturauhasen näytteet hankittiin tietoisen suostumuksen mukaan University of California, Irvine Institutional Review Board (IRB) -hyväksytyt ja HIPAA-yhteensopiva protokollia. Tissue hankinta oli osa NCI-SPECS ohjelman University of California, Irvine. Eturauhassyöpä kudokset kerättiin aikaan eturauhasen, tarkistaa patologi, ja snap-jäädytettiin nestetypessä. Tissue seuranta arkkia pidettiin tallentaa kulunut aika leikkauksesta jäätymisen (keskiarvo 2,8 tuntia). Normaali eturauhanen näytteet olivat joko pakastettu nopeasti nestetyppeen tuoreista koepalan ytimet tai snap-jäädytetty keräämisen jälkeen nopeasta ruumiinavaus ohjelman Sun Health Research Institute (Sun City, AZ), joka on SPECS konsortion jäsen. Aineisto koostuu 19 normaalin eturauhasen näytteitä 13 henkilöä (12 normaalista koepala ja 7 nopeasta ruumiinavaus) ja 108 eturauhassyöpänäytteissä 84 yksilöiden (taulukko 1). Tulos parametrit ja kliiniset tiedot sekä laaja historia oli kertynyt yli 11 vuoden ajan ja ylläpidetään SPECS relaatiotietoja pohja tietohakemiston yli 250 kohteita. Lopputulos parametri ”uusiutuminen” viittaa biokemiallisten uusiutuminen, nousu PSA-pitoisuudet ovat yli 0,2 ng /ml jälkeen ennen post-op PSA, joka oli alle kynnyksen testiä. Non-uusiutumisen tarkoittaa, että biokemialliset uusiutumisen havaittu potilaasta kliinisen seuranta-ajan kuluessa. Huomaa, että kaikki kasvain kerättiin aikaan eturauhasen, joten uusiutumisen tila määritettiin sen jälkeen, kun näytteet oli jo kerätty. Kliiniset ja demografiset arvot on koottu taulukkoon 1.

Affymetrix Gene Expression Taulukot ja Tilastollinen analyysi

RNA eturauhasen kudosnäytteitä analysoitiin Affymetrix geeniekspression taulukot. RNA valmistettiin tuore kudoksen leikkaamista kudos lohkojen kryostaatissa ja puhdistamiseksi kokonais-RNA suoraan kertynyt jääleikkeissä. Puhdistettu RNA hybridisoitiin joko Affymetrix U133 Plus2.0 tai U133A geenin ilmentymisen paneelit, ja taulukot prosessoitiin Affymetrix protokollan. Intensiteetti käytetyt tiedot tässä saatavissa julkisista lähteistä (GEO GSE17951 ja Geo GSE8218, vastaavasti).

Normalized Affymetrix intensiteetti arvoja käytettiin vertaamaan Egr3 (Affymetrix koetin ID 206115_at) ilmentyminen koko näytteissä normaalin eturauhasen ja eturauhasen syöpä kudosta. Normalisoidut arvot kahden näytteen tyyppiä verrattiin käyttäen Studentin t-testiä. Limma (Linear Models for Microarray Data) analyysi Bioconductor toteutettiin R ympäristössä havaita ilmentyvät eri geenit [29].

Jotta analysoida solutyyppispesifisyyden ilmentymisen Egr3 ja korreloivia geenejä, käytimme moninkertainen lineaarinen regressio (MLR) malli kuvaamaan suhdetta havaitun Affymetrix geenin ilmentymisen taso ja solutyypistä koostumus neljän solutyyppejä uusiutunutta ja ei-uusiutunut tapauksissa: (1) missä on leikkauspiste, on prosenttiosuus solutyypin j määritettynä paneeli patologeja, on kerroin osuuden solutyypistä, on poikkeama tai muutos solutyyppispesifiselle kun tauti pahenemisvaiheita. on indikaattori muuttuja uusiutumisen tila. jos aihe läpi uusiutuminen ja, toisin. on satunnainen virhe oletettu jakeluun. Tämä MLR mallia käytettiin sopivaksi data arvioida ilmaisun kertoimia, ja, jossa on solutyyppispesifiselle ilmaisun kerroin ja γ on ero solutyyppispesifiselle ilmaisun välillä uusiutuminen ja ei-uusiutumisen tapauksissa. Siten

β

j mittaa geenin ilmentymistä solun tyypin j ei-uusiutunutta tapauksissa ja

γ

j on muutos

β

j uusiutunut tapauksissa. MLR, β

0 on keskiarvo ilmaus kaikkien geenien kaikissa solutyypeissä ja tulos tila (RS). Siksi β

j kertoimet 0 osoittavat, että ilmentyminen geenin j tietyssä solutyypissä on pienempi kuin keskimääräinen β

0, kun taas β

j kertoimet 0 osoittaa voimistunutta ilmentymistä verrattuna p

0. Samoin γ

j 0 tarkoittaa, että ilmentyminen geeni j pienenee uusiutunutta eturauhassyöpä verrattuna ei-uusiutunutta eturauhassyöpä taas γ

j 0 tarkoittaa, että ilmentyminen geeni j kasvatetaan uusiutunut eturauhassyövän verrattuna ei-uusiutunut tauti. Merkitys γ

j määritettiin t-testi, joka perustuu virhe σ

j γ

j. Tarkkuus solutyyppispesifiselle ilmaisu panoksen kertoimia, β, on validoitu [30].

Human Protein Atlas

Immunohistokemia kuvat ladattiin julkisesti saatavilla Human Protein Atlas (HPA) ( https://www.proteinatlas.org). HPA versio 8.0 on tietokanta kudoksen microarray (TMA) kuvat leimattu vasta-aineita 11250 ihmisen proteiineja [31]. Kudos mikrosiruja koostuvat kohdissa 46 normaalin ihmisen kudosten ja 20 erilaista ihmisen syövän. On enintään 24 eturauhassyövän kuvia (12 potilasta) ja 3 normaalissa eturauhasessa kuvia (3 luovuttajien) vasta-ainetta kohti, vaikka kuvan numero voi vaihdella vasta analysoitu. HPA kuvat analysoidaan olivat eturauhasen kohdat merkitty joko Egr3 (HPA006206), PSMA (CAB001451, Leica Microsystems, Wetzlar, Saksa), tai PRLH (HPA014768) vasta-aineet.

HPA kuvat analysoitiin ja merkintöjä intensiteetti kvantifioitiin kanssa Aperio ImageScope ohjelmisto (Vista, CA) (kuviot S1 ja S2). Positiivinen Pixel Count algoritmin version 9.1 käytettiin määrittämään vasta-aineen määrä sitovia ja saada pseudocolored TMA kuvia. Jotta määrällisesti merkintöjä erityisesti rakenteita kuten strooman tai kasvain rauhasrakkuloissa, intensiteetti kynnysarvot asettamat Aperio ohjelmistoa käytettiin, valmistajan mukaan ehdotuksia.

Pixel intensiteetti määritellään mittana kirkkauden pikselin, tai valon määrää läpäisee dia. Mitä pienempi intensiteetti arvo on, sitä tummempi värjäytyminen kasvaneiden absorbanssiin A = -log I

obs /I

ref, jossa I

obs ilmaisee lähetetyn valon voimakkuus ja I

ref on tulevan valon voimakkuus. Intensiteetti raja-arvot asetettu 220, 175, 100, ja -1 heikkoja, keskikokoinen, vahva, ja ”negatiivinen” pikseleitä vastaavasti. Pseudocolors sininen, keltainen, oranssi, ja punainen levitettiin negatiivinen, heikko, keskipitkällä ja vahva pikseliä vastaavasti.

Normal eturauhasen ja eturauhasen syöpä kudosta analysoitiin positiivisen pikselimäärä algoritmia. Vertailla tiheyden värjäytyminen normaalissa ja eturauhassyöpäkudoksille, NSR (useita vahvoja positiivisia pikseliä suhde) käytettiin. Lukumäärä voimakkaasti merkitty positiivinen pikseliä jaetaan kokonaismäärä positiivisten pikseleitä normalisoida kunkin näytteen alueelle harkitaan, mikä tarjoaa merkintöjä intensiteetti valitun solutyypin pinta-alayksikköä kohti kudosta.

Positiivinen pikselin count algoritmia käytettiin myös vertaamaan proteiinin ilmentymistä strooman ja epiteelin komponenttien eturauhasessa. Hiiren-ohjattu kynätyökalulla käytettiin hahmottaa 10 strooman ja 10 rauhanen alueet per TMA osassa. 10 näytteenotto alueet valittiin satunnaisesti mahdollisuuksien rajoissa kudoksen koon ja kokoonpanon.

rajoitteet johtavat kudoksen koko: koko kudos ala oli vain 1 mm halkaisijaltaan, ja reunat kunkin kudoksen osassa vältettiin koska värjäystä näillä alueilla on taipumus vaikuttaa käsittelyä TMA. Lisäksi käytimme otantaa alueilla, jotka eivät kosketa toisiaan.

rajoitteet kehosta: jotkut kudosleikkeiden sisälsi monia rauhaset, ja kun näin oli näytteenotto alueet valittiin satunnaisesti. Muut jaksoihin on paljon vähemmän rauhanen alueilla vähentämällä valinta rauhaset, jotka olivat läsnä. Sidekudosmateriaali kohdissa, toisaalta, olivat kaikki valittu satunnaisesti, koska kudosleikkeiden oli lukuisia strooman alueilla.

Katsaus otettiin kunkin näytteen sattumanvaraisesti valittu käytetään varmistamaan, että näytteet käytetään analysointiin olivat edustavat koko jaksossa.

tulokset laskettiin keskiarvo ja määrittämiseen käytetty merkittäviä eroja verrattuna normaaliin eturauhasen kudosta.

Egr3-korreloivat Genes

Pearson korrelaatiokerrointa (R ) ja siihen liittyvä todennäköisyys ja kaltevuus laskettiin R ympäristön korrelaation ilmaisun kunkin geenin Affymetrix array alustan ilmentymisen Egr3. Geenit kanssa

p

arvot ≤0.001 perustuu Pearsonin korrelaatio analyysi ja Pearsonin korrelaatiokerrointa ≥0.45 valittiin määritellään Egr3-korreloivat geenejä. Egr3-korreloi geenien tärkein SPECS Affymetrix U133 Plus2.0 aineisto (127 eturauhasessa), joita käytetään tässä tutkimuksessa, ja Egr3 korreloi geenien lisäksi SPEKSISSÄ geenin ilmentymistä aineisto (136 eturauhasessa), joka perustuu Affymetrix U133A alustan, laskettiin . Päällekkäiset geenit välinen aineistoja, jotka täyttivät merkitys raja-arvot otettiin lopullisen luettelon Egr3-korreloivat geenejä. Kaltevuus regressiosuoran käytettiin myös luonnehtia, että kukin korrelaation Egr3 ilmaisun ja on esitetty taulukossa S1.

Statistical Simulation

Useat simuloinnit tehtiin, jotta voitaisiin arvioida random esiintyminen. Yleensä esiintymistiheyden ehdokas koetinsarjojen luokkaansa verrattiin esiintymistiheyden mukaan satunnaisessa yhtä monta koetinsarjojen muusta array, eli kaikki koetinsarjojen ilman ehdokas koetin sarjojen R ohjelmoida. Satunnainen valinta toistettiin 10000 kertaa ja keskimääräinen satunnainen esiintymistiheys verrattuna havaitun taajuuden ehdokkaan koetinsarjojen käytettiin luomaan todennäköisyys sattumanvaraista.

transkriptiotekijä Binding Site ja Gene Network Analysis

Genomatix (München, Saksa) Matlnspector ohjelmistoa käytettiin määrittämään transkriptiotekijän sitoutumiskohdat promoottorialueille 1500 emästä ylävirtaan 1000 emästä alavirtaan transkription aloituskohdasta (tSS-). Transkriptiotekijän sitoutumiskohtia (paino matriisit) kirjasto ja selkärankaisten yleinen ydin promoottorielementeistä (0,75 /optimoitu) matriisiryhmää käytettiin laskettaessa sitoutumiskohtia jokaisen promoottori. Perustuen Matlnspector taustalla malli esiintymiä V $ EGRF (Transfac huomautus varten selkärankaisen Egr perheenjäsenet Egr1, Egr2, Egr3, CKROX, ja WT) sitoutumiskohdat, 10000 × simulaatio suoritettiin R ympäristössä vertailla tausta prosenttiosuus (62,7%) V $ EGRF sitoutumiskohdat määritettynä Matlnspector havaittuun prosenttiosuus (99%).

p

-arvon = kuinka monta kertaa odotettu oli suurempi kuin havaittu /10000 käyttäen Genomatix. Simulointi

p

-arvo tarjoaa arvion vääriä löytö.

MetaCore (Thomson Reuters, New York, NY) koulutusjakso analyysin ohjelmisto käytettiin analysoimaan yhteyksiä Egr3-korreloivat geenejä. Transkriptiotekijän rikastamiseen analysointi ja proteiinien toimintaa rikastamiseen analyysiä laskettiin MetaCore käyttäen väärää löytö määrä (FDR) 0,05 ja taustan malli raportoitu proteiini-proteiini- tai proteiini-DNA vuorovaikutuksia. Kaikki

p

-arvot raportoitu MetaCore analyysi tulevat suoraan MetaCore laskelmat perustuvat hypergeometrisen jakeluun. Web-pohjainen geeni ontologian ohjelma DAVID [32], [33] (https://david.abcc.ncifcrf.gov/home.jsp) käytettiin myös analysoimaan toiminnallisia yhteyksiä Egr3-korreloi geenien.

ulkoinen Validation Dataset

julkisesti saatavilla GEO aineisto GDS2545 käytettiin ulkoisena validointi Egr3 ja Egr3-korreloivat geenien tunnistettu SPECS aineisto. GDS2545 koostuu 18 näytettä normaalin eturauhasen luovuttajista, 63 näytettä normaalin eturauhasen vieressä kasvain, 65 näytettä ensisijainen eturauhassyövän, ja 25 näytettä metastaattisen eturauhassyövän. Kaikki näytteet hybridisoitiin on Affymetrix U95A paneelit. Chandran et ai. [27] ja Yu et al. [26] raportin Affymetrix Egr3 ilmaisun arvoja lisätietojen ja taulukoissa geeniekspression arvoja. Egr3-korreloivat geenin analyysi suoritettiin käyttäen tätä aineisto. Top 150 Egr3-korreloivat koetinsarjojen arvioituna Pearsonin korrelaatio

p

-arvo koostuu 121 ainutlaatuinen geenejä, joita verrattiin 80 ainutlaatuinen Egr3-korreloi geenien tunnistettu SPECS DataSet saatiin limityksellä 43 ainutlaatuisia geenejä. 10000 × simulaatio suoritettiin R ympäristössä määrittää todennäköisyyden päällekkäisyyden esiintyvät sattumalta (

p

= 0,0001).

Cell Culture

M12 ihmisen eturauhassyövän soluja ylläpidettiin seerumittomassa RPMI L-glutamiinia, 10 ng /ml epidermaalista kasvutekijää, 0,1 uM deksametasoni, 5 ug /ml insuliinia, 5 ug /ml transferriiniä, 5 ng /ml seleeniä, 0,05 mg /ml gentamysiini ja 2,5 ug /ml amfoterisiini B: tä, kuten on kuvattu [34].

Stable knockdovvn Egr3 ilmentäminen M12 solut

M12 solut maljattiin päivää ennen transfektiota tiheydellä 750000 solua /hyvin 6-kuoppalevyille, antibioottia free kasvua väliaineessa, joka sisälsi 2% naudan sikiön seerumia. Solut transfektoitiin 3 ug shRNA sekoituskoodin plasmidi (shSCR) tai shEgr3 plasmidi (SA Biosciences, Valencia CA), 6 ui Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad CA) valmistajan ohjeiden mukaisesti. Puromysiinin (1 ug /ml), lisättiin kolme päivää myöhemmin ja transfektoitujen solujen valinnan. Yhden solun klooneja eristettiin käyttäen standardimenetelmiä. Stabiilisti transfektoidut solut (shSCR-M12 ja shEgr3-M12) sitten pidettiin M12 kasvualustaan, jota oli täydennetty puromysiinin.

Western blot -analyysi

Solut pestiin kahdesti fosfaattipuskuroidulla suolaliuoksella ja lyysattiin RIPA puskuri läsnä ollessa proteaasi-inhibiittoreita. Lysaattia sonikoitiin lyhyesti, ja kirkastettiin sentrifugoimalla 13200 rpm: ssä 4 ° C: ssa. Proteiinipitoisuus määritettiin käyttäen BioRad Protein Assay. Proteiinit alistettiin SDS-PAGE-elektroforeesilla, jota seuraa siirto PVDF-kalvolle. Membraanit blokattiin 5% maitoa (w /v) Tris-puskuroidussa suolaliuoksessa, joka sisälsi Tween-20 0,5% (TBST) 2 tuntia. Egr3 vasta-ainetta (sc-191 Santa-Cruz Technology, Santa Cruz CA) inkuboitiin yön yli 4 ° C: ssa, mitä seurasi 3 pesua TBST: ssä. Membraanit inkuboitiin HRP-konjugoitu vasta-aineita 1 tunti huoneenlämmössä (RT). 3 pesun jälkeen TBST, kalvoja inkuboitiin HyGlo-HRP Kemiluminesenssiin Kit (Denville tieteellinen, Metuchen NJ). Membraanit tislattiin ja uudelleenseulottiin anti-aktiini-vasta-aineita (Santa-Cruz).

Kvantitatiivinen RT-PCR

Kokonais-RNA uutettiin shSCR-M12 (sekoituskoodin kontrolli) tai shEgr3-M12-soluihin käyttämällä RNeasy Plus (Qiagen, Valencia CA) ohjeiden ja suspendoitiin uudelleen veteen. RNA eheys arvioitiin elektroforeesilla formaldehydiä agaroosigeelissä. Yksi ug RNA: ta muutettiin cDNA: ksi käyttäen Quanta qScript cDNA Super-mix (5 min 25 ° C: ssa, 30 min 42 ° C: ssa, 5 min 85 ° C: ssa) termosyklerissä. Reaaliaikainen qPCR suoritettiin ABI Prism 7900HT (Applied Biosystems, Life Technologies, CA) käyttäen vakioparametrit. Kukin näyte ajettiin neljä rinnakkaista kanssa dissosiaatiokäyrä analyysiin. Erot mRNA-tasot analysoitiin käyttäen 2

-ΔΔCT menetelmällä. GAPDH normalisointiin käytettiin näytteitä. Alukesekvenssit on esitetty kuviossa S4.

Reporter Assay

Ihmisen IL8 promoottorin (emäkset -262–55) kloonattiin pGL3 lusiferaasiplasmidin ja ohjaus PRL-SV40 Renilla lusiferaasiplasmidin oli ystävällinen lahjoitus tri Carlotta Glackinin (City of Hope, Los Angeles, CA) ja on kuvattu Li et al. [35]. IL6-pGL3 lusiferaasiplasmidia sisälsi IL6 promoottori oli lahja tri Steve Cole (UCLA, CA), ja on kuvattu Eickelberg et ai. [36]. ShSCR-M12-solujen ja shEgr3-M12-solut maljattiin tiheydellä 20000 solua /kuoppa valkoinen 96-kuoppalevylle päivänä ennen transfektiota, ja kasvatettiin antibiootti-free, fenolipunaista kasvualustaa. Solut transfektoitiin IL6-pGL3 tai IL8-pGL3 plasmidit ja Renilla lusiferaasi-plasmidia (normalisoimaan tehoa transfektion ja solujen määrä). FuGene transfektioreagenssi (Promega, Madison, Wisconsin) käytettiin kohti valmistajan ohjeiden kanssa 160 ng pGL3 plasmidi, 40 ng PRL plasmidia ja 0,6 ui FuGene. Kaksi päivää myöhemmin, Dual-Glo Luciferase Reagent (Promega) lisättiin kasvualustaan ​​(01:01 tilavuus /tilavuus) ja inkuboitiin 10 min RT: ssä. Levyt luettiin käyttäen Dynatech ML-3000 luminometriä. Reaktio sammutettiin lisäämällä Dual-Glo Stop Glo-reagenssia, joka myös käynnistää Renilla lusiferaasireaktion, 10 minuutin ajan RT: ennen käsittelyä. Suhde Firefly on Renillan luminesenssin laskettiin jokaiselle hyvin.

Tulokset

solutyyppispesifiselle RNA ilmentyminen Egr3 lisääntyy Eturauhassyöpä

Analysoimme Affymetrix koko genomista ilmaisu tietoja normaalissa ja syöpä- eturauhasen kudoksen onko Egr3 ilmentyy differentiaalisesti. Affymetrix U133 Plus2.0 geenien ilmentyminen aineisto koostuu 19 terveessä eturauhasessa (saatu 13 luovuttajien) ja 108 eturauhaskasvainnäytteissä (saatu 84 eturauhassyöpäpotilaalla; useita näytteitä samasta potilaat olivat läsnä geenien ilmentyminen tietokokonaisuus). Potilaan demografiset tiedot 84 syöpäpotilaiden ja 13 normaalista kudoksesta luovuttajien on yhteenveto taulukossa 1. Analyysi normalisoidun ilmentymisen datan 127 eturauhasessa osoitti, että Egr3 (koetin sarja 206115_at) on huomattavasti-ilmaistuna eturauhassyövässä verrattuna normaaliin eturauhasen kudosta. Mean ilmentyminen eturauhassyövässä on 5,35 kertaa suurempi kuin normaalissa eturauhasessa kudosten ja opiskelijan t-testiä (

p

= 2 x 10

-15) vahvisti, että tämä ero on erittäin merkitsevä. Analyysi mediaani ilmaisun arvojen paljastaa myös merkittäviä eroja Egr3 ilmentymisen välillä normaalissa eturauhasessa ja eturauhassyöpänäytteissä (tuloksia ei ole esitetty). Histogrammi Egr3 ilmentymisen kaikissa potilailla on esitetty kuviossa 1. Egr3 ilmaisu arvot näkyvät Affymetrix intensiteetti arvojen sijaan piirrettiin log2 asteikolla paremmin näyttää niiden välillä. Koska keskimääräinen iät kasvain tapauksissa erilainen kuin normaali tapauksissa (taulukko 1), Affymetrix ilmaisu ero Egr3 verrattiin luettelon aiemmin määritetty ikään liittyvien muutosten Jia et ai. [37] perustuvat vertailuun ilmentymisaineistoapukeinojen 15 normaalin eturauhasen biopsianäytteissä joiden keski-ikä on 54 vuotta niitä varten 13 nopeaa koepalanäytteistä joiden keski-ikä on 84 vuotta. Niistä 3400 koetinsarjojen saatiin merkittäviä eroja havaittu tässä vertailussa, koetin sarjat Egr3 kuulumattomana. Nämä tulokset osoittavat, että lisääntynyt ilmentyminen Egr3 ei liity iän eroa tavallisista luovuttajista ja eturauhassyöpäpotilailla ja liittyy yhden tai useamman ominaisuuden spesifinen kasvain eturauhasessa.

Affymetrix ilmentyminen on piirretty lineaarinen asteikko, jossa anti-log

2 kunkin potilaan Egr3 ilmaisua arvo on piirretty y-akselilla. Katkoviiva at 1292 merkitsee keskimääräistä Egr3 voimakkuuden arvo kaikilla näytteillä.

Validation proteiinitasolla ulkoisella Data Set

Vaikka Egr3 on säädelty mRNA-tasolla se voi olla Egr3 proteiinin taso, joka on tärkeä tehtävä Egr3 eturauhassyövässä. Täydentämään geenien ilmentyminen tietojen käytimme

in silico

lähestymistapaa, jossa analysoidaan Egr3 proteiinin tasot eturauhasessa. Human Protein Atlas (HPA) on kokoelma kudoksen microarray tietojen 20 eri syöpien ja 46 normaaleissa kudoksissa (https://www.proteinatlas.org). Kudosmorfologiatutkimukset ja proteiinin ilmentymisen kaavoja HPA potilaan näytteet varmistettiin board-sertifioitu patologi. HPA antaa viitteitä proteiinin ilmentymistä syövän verrattuna normaaliin kudokseen kanssa. HPA levykkeet noudettiin edelleen kvantitatiivisen analyysin. Käytettävissä oleva eturauhasen kudosta immunohistokemiallisesti kuvia Egr3 värjäystä koostua 20 eturauhassyöpänäytteissä 11 potilasta ja 3 terveessä eturauhasessa 3 luovuttajilta.

Käytimme Aperio ImageScope positiivinen pikselimäärä algoritmi määrittää voimakkuuden Egr3 värjäyksen ( HPA006206). Pseudocolors sovellettiin, kuten on kuvattu menetelmät ja on esitetty kuviossa 2. Vaikka vain neljä raja-tasot käytetty, pseudocolored kuvat osoittavat selvästi, että Egr3 värjäytymisen intensiteetti erotettiin epiteelin sisältävän rauhasrakenteet muista ominaisuuksista, kuten strooman (kuvio 2), mikä osoittaa, että yksinkertainen kynnystystä menetelmä riittävästi erotettu rauhas elementtejä kaikki muu. Strooman oli enimmäkseen vailla Egr3 värjäystä. Sekä normaalin ja kasvaimen näytteitä, vallitseva anti-Egr3 värjäyskuvio oli tasaisesti epiteelin. Sisällä epiteelisolut, Egr3 värjäytyminen havaittiin cytosol- kalvon osille ja heikosti tumassa.

A-B: HPA normaalin eturauhasen, potilaiden 2098 ja 2472, vastaavasti. C-D: HPA eturauhassyöpänäytteissä, potilaiden 3303 ja 3744, vastaavasti. Kaikki ylimääräinen käytettävissä HPA tapaukset näkyvät täydentää tietoja. E: histogrammi vahva positiivinen pikselin suhde (NSR) normaalille ja eturauhassyövän potilailla.

Vaikka transkriptiotekijöiden voidaan olettaa paikallistaa pääasiassa tumaan, tämä värjäyskuvion ei ole ainutlaatuinen Egr3 vuonna Human Protein Atlas. Esimerkiksi katsoimme värjäytymisen hyvin tutkittu transkriptiotekijä, c-fos. Värjäystä c-fos (HPA018531) on enimmäkseen ydin-, mutta myös näkyy soluliman-kalvo lokalisointi neljä kymmenestä eturauhassyöpäkudoksille että värjätty positiivisia c-fos.

On myös mahdollista, että Egr3 lokalisointi on muutettu patologisten tilojen, kuten on asianlaita transkriptiotekijän ja kasvaimen p53, esimerkiksi. Todellakin, villityypin p53 kerääntyy sytoplasmassa kasvainsolujen tulehduksellinen rintasyöpä tai neuroblastooma, mikä sen funktionaalisen inaktivaation [38] – [40]. Se voisi olla mielenkiintoista, että tulevaisuudessa, vahvistaa sytoplasman /kalvo lokalisointi Egr3 ja sen merkityksestä.

määrällisesti Egr3 värjäystä valitsimme keskimäärin 10 rauhanen ja 10 strooman alueilla kunkin potilaan näytteestä. Kukin 10 alueet rajattiin hiirellä-ohjattu osoitin siten, että vain alueet puhtaan histologinen ominaisuus kuten rauhaset ja rauhanen kaltainen kasvain muodostelmia olivat mukana. Ohjelmisto tunnustettu rauhanen lumenia ja pseudolumen uskollisesti ja sulki pikseliä näiden alueiden kunhan huolellisuutta sulkea ontelon roskat. Tuloksena Egr3 värjäytymisen intensiteetti arvot kaikkien 10 aloja kasvainten ja strooman normalisoitiin erikseen. Tämän vaiheen määrä heikkoja, keskipitkän ja voimakkaasti värjätään pikselit olivat painotettu (heikko = 1, keskikokoinen = 2, voimakas = 3).